ATG7

引言 DNA 修复和自噬是维持细胞生存的两个关键生物学过程。DNA修复负责修复DNA损伤，确保基因组稳定；而自噬则负责清除细胞内多余的、受损的、错误折叠或聚集的蛋白质和细胞器，维持细胞稳态。拓扑异构酶 I (TOP1) 在DNA复制和转录中起着至关重要的作用，它通过切断DNA形成超螺旋结构，释放扭转应力。然而，TOP1与DNA形成的共价键——TOP1cc是一种有害的DNA损伤，会导致基因组不稳定和细胞死亡。TOP1cc修复主要依赖于酪氨酸DNA磷酸二酯酶 1 (TDP1) 介导的切除修复或MRE11核酶介导的DNA切割和切除修复【1】。然而，TOP1cc的修复过程与蛋白质降解途径的关系尚不清楚。自噬因子在DNA复制叉附近富集，表明自噬可能在DNA损伤修复中发挥作用。TEX264是一种保守的蛋白质，既是自噬受体，也与TOP1cc修复有关【2】。然而，TEX264是否通过自噬介导TOP1cc修复，目前尚不清楚。 近日，来自英国牛津大学拉德克利夫医院的Kristijan Ramadan研究团队在Cell杂志上发表题为TEX264 drives selective autophagy of DNA lesions to promote DNA repair and cell survival的研究论文，该研究发现了TEX264介导的核吞噬作用在维持基因组稳定性和细胞存活中发挥关键作用。 首先通过免疫共沉淀和蛋白质组学分析，研究人员发现自噬相关蛋白（如Beclin-1、TEX264、CHMP7、ATG7、SNAP29）在DNA复制叉处富集，并且这种富集在CPT（诱导DNA复制压力的化合物）处理后被显著增强，这表明自噬可能在响应 DNA 复制压力时发挥作用。接着，研究人员使用LysoIP技术分离溶酶体，并通过质谱分析其蛋白质组成。结果表明，CPT 处理后，许多DNA复制和核蛋白（如DNA聚合酶、MCM复合物蛋白、核孔复合物）被运送到溶酶体，表明溶酶体可能直接参与 DNA 损伤的清除。 进一步，研究人员发现用CPT处理后，TOP1cc水平的恢复受到mTOR抑制剂Torin的促进，而自噬抑制剂ATG7的缺失则完全阻止了TOP1cc的修复，证明自噬是TOP1cc修复的关键途径。其他自噬相关蛋白，如syntaxin 17和RB1CC1，也参与了TOP1cc的降解和细胞对CPT的存活，说明自噬修复TOP1cc的过程是一个复杂的网络，涉及多个自噬相关蛋白。使用mCherry-TOP1-GFP报告系统证实了TOP1在低剂量CPT处理后进入溶酶体，表明 TOP1cc可以直接被溶酶体降解。 通过分析γ-H2AX 和53BP1的定位，研究人员发现低剂量CPT诱导的DNA损伤主要表现为复制压力，而不是DNA 双链断裂。此外，研究人员发现ATR抑制剂VE-822强烈抑制了TOP1cc的运送，而ATM抑制剂KU-55933没有影响，这表明ATR在响应DNA复制压力和促进 TOP1cc 降解中起着关键作用。自噬抑制剂ATG7和syntaxin 17的缺失加剧了低剂量 CPT 处理后蛋白质聚集物的形成，说明自噬在防止蛋白质聚集物形成中发挥作用。 最后，研究人员发现MRE11核酶的缺失强烈抑制了TOP1cc的运送，而MUS81和TDP1的缺失没有影响，表明MRE11核酶在将TOP1cc从核内运送到溶酶体中起着关键作用。使用 LysoIP-Seq技术分离溶酶体中的DNA片段，并通过测序分析其序列特征。结果表明，溶酶体中分离的DNA片段主要来自核内 DNA，且大部分来自内含子和着丝粒区域，表明溶酶体可以清除整个TOP1cc损伤，包括其蛋白质部分和相关的DNA片段。使用 TOP1cc 特异性抗体和LysoIP等技术证实了TOP1cc在低剂量CPT处理后在细胞质中的存在。这表明 TOP1cc可以从核内被运送到细胞质，并被溶酶体降解。 图1 TEX264驱动的选择性自噬促进DNA修复和细胞存活（Credit: Cell） 总之，这项研究证明了选择性自噬在DNA修复中的进化保守作用，并表明它对维持基因组稳定性和细胞存活至关重要。此外，该发现还表明，在治疗结直肠癌患者时， TEX264的表达水平与对伊立替康等TOP1抑制剂的化疗反应相关。 参考文献 1. Pommier, Y. (2006). Topoisomerase I inhibitors: camptothecins and beyond. Nat. Rev. Cancer 6, 789–802. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/nrc1977.7. Stingele, J., Bellelli, R., and Boulton, S.J. (2017). Mechanisms of DNA–protein crosslink repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 563–573. 2. Fielden, J., Wiseman, K., Torrecilla, I., Li, S., Hume, S., Chiang, S.-C., Ruggiano, A., Narayan Singh, A., Freire, R., Hassanieh, S., et al. (2020). TEX264 coordinates p97- and SPRTN-mediated resolution of topoisomerase 1-DNA adducts. Nat. Commun. 11, 1274. https://www-cell-com.libproxy1.nus.edu.sg/cell/fulltext/S0092-8674(24)00911-5 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 TNIP1，又被称为A20结合的NF-κB激活抑制因子1（ABIN-1），能够通过与Toll样受体（TLR）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1（IL-1）和CD40等互作，抑制NF-κB的活性【1】。近年来研究发现TNIP1对NF-κB信号的抑制作用依赖于其与信号转导分子多聚泛素的结合能力，泛素结合域功能丧失（D485N突变）的小鼠会出现类似红斑狼疮的表型，与Tnip1敲除小鼠表型相似【2】。另一方面，Tnip1D485N小鼠免疫失调与NF-κB、c-Jun N末端激酶和p38α丝裂原活化蛋白激酶促炎信号的紊乱有关，而Tnip1敲除小鼠中的免疫异常表型则归因于CCAAT/增强子结合蛋白β（CEBPβ）靶基因表达上调，这表明特定结构域的Tnip1突变与基因敲除潜在地影响了不同的免疫反应调控网络【3】。 尽管通过全基因组关联研究（GWAS）已发现TNIP1变异与人类自身免疫反应异常有关，但迄今为止尚未发现由TNIP1变异直接导致的病例。此外，最近的研究发现TNIP1是一个选择性自噬的受体和线粒体自噬的负向调节因子【4,5】，然而目前尚未明确TNIP1对自噬体和线粒体选择性自噬的调控功能与疾病间的联系。 近日，澳大利亚国立大学Carola G. Vinuesa实验室领衔在Nature Immunology杂志发表了题为A TNIP1-driven systemic autoimmune disorder with elevated IgG4 的研究论文，通过全外显子组测序，作者发现两个非关联的自身免疫疾病患者中均存在非常罕见的TNIP1Q333P变异，该变异通过诱导B细胞的特定细胞亚群的扩增导致了系统性自身免疫异常。而探究其分子机制后，作者探明了TNIP1Q333P变异所介导的自身免疫反应异常是由于TLR7信号传导激活，自噬体中MyD88的募集异常，以及受损线粒体无法被自噬体清除所导致的。 作者首先在两个无关的自身免疫疾病患者中鉴定到同一个极其罕见的TNIP1错义变异Q333P，该变异位于保守的ABIN同源结构域，结构和功能预测显示该变异是有害的。临床表现上，两名患者具有不同的自身免疫性疾病特征，并伴随着体内IgG4水平上升，可见TNIP1的Q333P变异与自身免疫疾病的发生具有潜在联系，提示其在自身免疫反应调控中的重要作用。 作者随后探究了TNIP1Q333P变异对自身免疫反应的影响。首先，作者利用CRISPR-Cas9技术构建了携带Q346P同源变异的C57BL/6小鼠（vikala小鼠），虽然未出现Tnip1D485N小鼠所发生的肾小球损伤或脾肿大等异常，但vikala小鼠患有多灶性淋巴细胞性涎腺炎，表明TNIP1Q346P变异能够诱发自身免疫疾病，并且其机制与其他TNIP1变异不同。此外，TNIP1Q333P小鼠的自发性生发中心（GC）、浆细胞（PC）、与年龄相关的B细胞（ABC）和CD21−CD23−转换B细胞的比例和数量上升，表明TNIP1Q333P变异导致了与系统性自身免疫相关的B细胞亚群的扩增。 之前研究发现TNIP1能够被招募到激活的MyD88信号复合物中，且Tnip1D485N介导的自身免疫反应依赖于TLR7-MyD88，因此作者探究了TLR7-MyD88信号途径在vikala小鼠自身免疫表型中的作用。通过将vikala小鼠与MyD88或TLR7缺陷型小鼠交配，作者发现MyD88的缺失能够缓解GC B细胞的扩增，降低PCs和ABCs的频率，并减少TFH和滤泡外TH细胞以及IgG2c抗体的水平。可见，抑制TLR7-MyD88信号能够缓解vikala小鼠自身免疫反应的异常。进一步研究TNIP1Q333P变异对NF-κB和IFN1信号传导的影响，作者发现尽管TNIP1Q333P变异未影响NF-κB活性，但变异的发生使TNIP1对MyD88/TBK1所诱导的IFNβ活性的抑制作用减弱，即TNIP1Q333P变异选择性地调控了IFN1信号传导，并潜在地通过该途径影响了系统性自身免疫疾病的发生。 作者接下来研究了TNIP1Q333P选择性调节MyD88信号的机制，及其对选择性自噬的影响。结果表明TNIP1Q333P变异导致TNIP1与MyD88的共定位与互作减弱，MyD88在自噬体中的募集出现异常，TLR7发生持续激活。TNIP1Q333P突变也显著抑制了TNIP1与自噬体标记物ATG7和LC3B的共定位。此外，TNIP1Q333P突变致使TNIP1的选择性自噬受体功能发生异常，受损线粒体的清除发生紊乱。电镜下Tnip1vik/vik小鼠的唾液腺线粒体形态异常，进一步证明了TNIP1Q333P突变导致了线粒体自噬障碍。因此，TNIP1Q333P突变改变了TNIP1在细胞内的定位和功能，选择性地影响TLR7-MyD88信号的活性，诱导了线粒体自噬障碍，最终导致了自身免疫性疾病的发生。 模式图（Credit: Nature Immunology） 综上所述，本研究通过全外显子组测序在两个非关联的系统性自身免疫疾病的病人中鉴定到一个非常罕见的异质性TNIP1Q333P变异，该变异与自身免疫疾病的发生密切相关。探究其致病机制，作者证明TNIP1Q333P变异能够诱导B细胞特定细胞亚群的扩增，持续性激活TLR7信号，影响MyD88被招募到自噬体中，导致了受损线粒体无法被自噬体清除，从而引发了系统性自身免疫反应。本研究为理解TNIP1在自身免疫反应与疾病发生中的作用机制提供了重要见解。 参考文献 1. Shamilov, et al. TNIP1 in autoimmune diseases: regulation of toll‐like receptor signaling. J. Immuno. Res. 2018, 1: 3491269 (2018). 2.Nanda, S. K. et al. Polyubiquitin binding to ABIN1 is required to prevent autoimmunity. J. Exp. Med. 208, 1215–1228 (2011). 3.Zhou, J. et al. A20-binding inhibitor of NF-κB (ABIN1) controls Toll-like receptor-mediated CCAAT/enhancer-binding protein β activation and protects from inflammatory disease. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, E998–E1006 (2011). 4.Shinkawa, Y. et al. ABIN1 is a signal-induced autophagy receptor that attenuates NF-κB activation by recognizing linear ubiquitin chains. FEBS Lett. 596, 1147–1164 (2022). 5.Le Guerroué, F. et al. TNIP1 inhibits selective autophagy via bipartite interaction with LC3/GABARAP and TAX1BP1. Mol. Cell 83, 927–941 (2023). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41590-024-01902-0 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

【导读】 肝细胞癌(HCC)是重大的全球健康挑战。自噬的激活对促进肿瘤细胞的增殖和存活起着至关重要的作用。然而，HCC中调控自噬的上游调控网络和机制尚不清楚。 8月15日，福建医科大学黄爱民教授团队与海军军医大学（第二军医大学）卫立辛教授团队合作在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“HDAC2 promotes autophagy-associated HCC malignant progression by transcriptionally activating LAPTM4B”。本研究表明， HDAC2调节肝癌中的自噬过程。在肝癌组织中，HDAC2的表达升高，在肝癌患者中，高HDAC2表达与不良预后密切相关。体外和体内研究综合表明，HDAC2促进肝癌中的自噬和自噬相关的恶性进展。机制上，HDAC2在LAPTM4B（一种与溶酶体相关的蛋白质）的转录起始位点的四个不同位点特异性结合，增强其转录激活并驱动肝癌中的自噬相关的恶性进展。这些发现确立了LAPTM4B为HDAC2的直接靶基因。此外，选择性HDAC2抑制剂有效地缓解了肝癌的恶性发展。另外，对105例人肝癌样本的多变量Cox回归分析表明，HDAC2表达是肝癌预后的独立预测因子。 该研究强调了HDAC2-LAPTM4B轴在调节肝癌恶性进展中的关键作用，并指出了靶向HDAC2以预防和阻止肝癌恶性进展的潜力。 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41419-024-06981-3#Sec11 背景知识 01 自噬是一种经典的溶酶体依赖性过程，可降解受损的细胞质蛋白质、大分子和细胞器。研究证实，在肿瘤发生初期，自噬可通过促进基因稳定性和维持细胞内环境的完整性而发挥抗肿瘤作用。然而，随着肿瘤的进展，自噬通过提供能量和营养物质、刺激血管生成和促进肿瘤生长来促进恶性进展。肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，也是最致命的癌症之一。大量证据表明，自噬驱动了实体肿瘤（包括HCC）的恶性进展。大多数HCC患者在晚期被诊断出来，此时肿瘤有更大的能量需求，使自噬更加有利于肿瘤的生长。因此，抑制自噬是抗肿瘤治疗的一种有前途的策略。全面了解自噬的上游调节因子及其在HCC中的调节机制将有助于我们深入了解HCC的内在机制，并为HCC提供新的见解和潜在的治疗靶点。 HDAC2是I类HDAC酶家族的成员，对组蛋白底物具有高活性和特异性。HDAC2在人体多种组织中广泛表达，在肝脏中的表达最低。研究表明，与正常肝组织相比，HCC组织中HDAC2的表达显著升高，在HCC患者中，高水平的HDAC2表达与不良预后密切相关。早期实验发现，HDAC2负责乙酰化组蛋白H3和H4的氨基端，从而抑制下游基因的转录。据报道，HDAC2通过抑制p53并促进MYC表达来防止细胞凋亡并加速细胞周期进程，从而促进恶性肿瘤的发生。此外，越来越多的证据表明，HDAC2作为一种致癌基因，可诱导细胞周期改变并促进HCC细胞增殖，在HCC恶性进展中发挥着关键作用。许多研究还表明，HDAC2抑制剂具有显著的抗肿瘤作用。然而，HDAC2是否促进肝癌的自噬及其相关的恶性进展，以及其背后的调节机制尚不清楚。 HDAC2在HCC肿瘤细胞中促进自噬 02 为了阐明HDAC2在自噬过程中的功能，研究人员进行了一系列细胞学研究。研究人员首先在7个人类肝癌细胞系中检测了HDAC2的表达，然后建立了HDAC2沉默的HepG2和Huh7细胞以及HDAC2过表达的HCC-LM3和SNU-449细胞，证明了超过70%的沉默效率和超过三倍的过表达效率。抑制HDAC2表达导致自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG7、Beclin-1和LC3II的表达减少，同时增加了p62的表达，这一结果通过qRT-PCR和蛋白质免疫印迹实验得到证实。同样地，免疫荧光染色(IF)试验显示，HDAC2敲低导致LC3点状染色显著减少，p62表达增加，而HDAC2过表达则产生了相反的结果。透射电子显微镜(TEM)检查发现，HDAC2缺乏的肝癌肿瘤细胞中典型的自噬双膜囊泡的形成减少，而HDAC2过表达后，自噬体的数量显著增加。 这些结果支持这样的观点，即HDAC2对于维持HCC肿瘤细胞的自噬过程至关重要。 HDAC2在HCC肿瘤细胞中促进自噬 HDAC2调节LAPTM4B以促进肝癌中的自噬及其相关的恶性病变 03 随后，研究人员将稳定转染针对LAPTM4B的敲低或过表达构建体以转染HepG2细胞，并使用qRT-PCR和蛋白质免疫印迹评估转染效率。结果显示，LAPTM4B过表达上调了自噬相关基因ATG3、ATG5、ATG7、Beclin-1和LC3II的表达，同时抑制了p62的表达。相反，敲低LAPTM4B导致了相反的效果，进一步验证了LAPTM4B在HCC中调节自噬的作用。接下来，研究人员仔细评估了LAPTM4B对HCC自噬调节的潜在影响。蛋白质免疫印迹和qRT-PCR实验表明，HDAC2缺乏降低了ATG3、ATG5、ATG7、Beclin-1和LC3II的表达，并增加了p62的表达，而恢复LAPTM4B表达逆转了这些效应。此外，IF和TEM实验显示，HDAC2敲低导致LC3的斑点状染色减少，p62的斑点状染色增加，自噬小体减少，而过表达LAPTM4B则使这些效应得到缓解。 研究人员同样进一步研究了LAPTM4B在介导对HDAC2的响应、促进HCC恶性进展中的作用。敲低HDAC2的HepG2细胞表现出显著的生长受阻和克隆形成能力下降，表现为细胞倍增时间延长16.8小时和克隆簇减少78%。相反，恢复表达LAPTM4B则恢复了这两种生长参数，表现为细胞倍增时间缩短26.4小时和克隆簇增加44%。为了在体内进一步验证这些发现，研究人员建立了异种移植肿瘤模型，观察到HDAC2敲低组的肿瘤体积减少在过表达LAPTM4B后得到缓解。此外，对移植肿瘤组织切片进行IHC染色显示，由HDAC2敲低引起的自噬抑制和细胞增殖抑制在过表达LAPTM4B后得到逆转。 综上所述，这些结果表明，HDAC2通过上调LAPTM4B促进自噬和相关HCC恶性进展。 研究小结 04 总的来说，本研究表明，HDAC2在HCC组织中的表达显著上调，与较差的预后相关，独立预测HCC患者的预后。此外，HDAC2可以直接与LAPTM4B结合并激活其转录，从而增强HCC中的自噬，促进其恶性进展。关键的是，靶向HDAC2表达的特异性抑制显著逆转了HCC的不良进展。总之，这些结果表明，HDAC2通过上调LAPTM4B促进自噬和与之相关的HCC恶性进展。 【参考资料】 https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41419-024-06981-3#Sec11 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 线上｜08月22日 19:00-20:30 ▶ "RNA原位杂交在临床病理诊断及相关研究中的应用”网络研讨会欢迎您的参与！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情