RSPO3

摘要：来自成人干细胞（ASCs）和多能干细胞（PSCs）的类器官是研究癌症和开发治疗方法的重要临床前模型。在这里，我们回顾了来自原始组织的和PSC衍生的癌症类器官模型，并详细说明了它们如何在不同的器官环境中有潜力为个性化医疗方法提供信息，并有助于理解早期癌变步骤、癌症基因组和生物学。我们还比较了基于ASC和基于PSC的癌症类器官系统之间的差异，讨论了它们的局限性，并强调了最近对类器官培养方法的改进，这些改进使它们成为人类肿瘤的更好代表。 1.引言 全球癌症负担每年导致近1000万人死亡，并且预计这一数字还会增加。遗憾的是，有效的癌症治疗数量未能跟上这一趋势。其中的一个原因是缺乏能够准确模拟人类肿瘤、它们多样化的形态、分子特征和微环境的体外临床前模型。数十年来，由于相对容易使用、可扩展性和低成本，2D细胞培养已成为研究癌细胞生物学和药物发现的基石。它们使我们能够在分子机制上取得开创性的工作，这些机制是肿瘤发生的，帮助确定生物标志物和药物靶点以指导患者的治疗。然而，它们的功能有限，只代表一小部分癌症——其中只有少数来自早期或癌前阶段。2D培养通常不需要与原代细胞培养相同的生存利基因子，这意味着它们已经由于基因组中的异常和畸变以及表观遗传学上的修饰而失去了对利基的内在依赖。此外，2D癌细胞系，由于长期在体外传代，会发生快速的基因漂移，导致药物反应的显著差异。此外，匹配的正常细胞系并不总是存在，使得对癌症早期阶段的研究大多依赖于基因工程小鼠。在某些情况下，基因工程小鼠和患者衍生的异种移植（PDX）模型弥补了2D细胞系的不足，但高昂的成本、技术难度和缺乏可扩展性仍然是它们的限制。 最近，3D类器官培养的出现为癌症研究提供了一种替代方法，可以弥合体外2D细胞系和体内小鼠模型之间的差距。类器官可以从两种类型的干细胞中建立：成人干细胞（ASCs）来自成人组织，具有组织特异性，或者多能干细胞（PSCs）可以是诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞。在这篇综述中，我们特别关注这些类器官模型在癌症研究中的使用，描述并比较代表肿瘤形成不同阶段的各种基于类器官的癌症模型，并讨论它们对癌症研究的贡献以及它们的局限性。 2.类器官类型 ASC和PSC类器官的衍生协议基本上不同。ASC类器官由培养基中的生长因子混合物支持，这些生长因子模仿正常干细胞稳态期间存在的因素。PSC类器官建立涉及通过逐步添加生长因子的方式进行分化，这种方式模仿胚胎发育期间的细胞信号。产生的癌症模型也具有不同的优缺点（表1），在选择适当的研究模型时应考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官是互补的方法，它们共同提供了研究几乎所有人类癌症整个肿瘤进展过程的机会（图1）。 图 1. 用于癌症模型的类器官 由成人干细胞（ASC）和多能干细胞（PSC）衍生的各种类型的癌症类器官模型及其应用。CTC，循环肿瘤细胞；CAF，与癌症相关的成纤维细胞。 3.ASC衍生的类器官和生物银行 2009年，一项开创性研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASCs中建立3D肠道类器官。细胞在Matrigel中生长，并在长期培养中维持，补充干细胞利基调节因子（noggin、R-spondin1和表皮生长因子[EGF]）。从本质上讲，这个系统旨在模拟肠道干细胞（ISCs）通常所在的利基的各个方面。在体内，肠道上皮组织被组织成数百万的隐窝绒毛结构，其中ISCs位于隐窝的基部。Wnt信号和R-spondin1作为Wnt激动剂，在支持隐窝增殖方面的重要性已经得到了很好的确立。此外，EGF通过激活Ras信号通路增强隐窝增殖。noggin抑制绒毛中的骨形态发生蛋白（BMP）信号，导致形成许多异位隐窝单元。引人注目的是，为了在培养中复制这一点，只需要添加R-spondin1、EGF和noggin就可以成功形成类器官。后续研究表明，位于Lgr5+干细胞之间的Paneth细胞提供了Wnt来源。Matrigel提供了形成3D类器官的基质成分，因为它类似于富含层粘连蛋白的肠道隐窝基部。这些类器官展示了肠道隐窝绒毛结构，包含所有肠道细胞类型，重现了来源组织的生理肠道结构。 同时，另一组开发了一种替代方法来培养肠道类器官：空气-液体界面（ALI）模型，涉及在部分空气暴露的胶原蛋白基质中培养包含上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。自这两项突破性研究以来，已经成功地适应了从一系列正常组织及其相应的癌症中培养人类ASC衍生的类器官。对协议的改进提高了类器官形成的效率，使得从小活检、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞（CTCs）中建立肿瘤类器官成为可能。结果，成为可能建立大型的人类肿瘤类器官活体生物银行（图2A，在表2中详细总结）。近年来，类器官生物银行的数量激增，作为基础研究和临床设置中宝贵的资源。类器官模型也已通过各种途径商业化，如人类癌症模型倡议、美国典型培养物收集或MilliporeSigma。这些生物银行涵盖了广泛的肿瘤模型，重现了患者肿瘤的形态和分子异质性。相比之下，许多分子亚型没有代表性2D癌细胞系。 图 2. 现有的人类癌症和癌前类器官模型 (A 和 B) 文献中描述的(A) 癌症和(B) 癌前ASC衍生类器官的类型。ALC，酒精性肝硬化；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；PSC，原发性硬化性胆管炎；PanIN，胰腺上皮内瘤变；UC，溃疡性结肠炎；TSA，传统锯齿状腺瘤；SSA，静止性锯齿状腺瘤；HP，增生性息肉。 此外，已建立了来自这些器官的癌前病变，如肠道增生性息肉、静止性锯齿状腺瘤（SSAs）/息肉、管状绒毛腺瘤、常规管状腺瘤癌前子宫内膜异位症、子宫内膜增生17 宫颈鳞状上皮化生胃肠上皮化生胃萎缩 Barrett上皮胰腺上皮内瘤变（PanIN）和一系列癌前肝病（图2B）。从携带杂合性胚系癌症易感性基因突变的个体中还生成了额外的ASC类器官（图2B；表3）。通过基于多组学的分析比较肿瘤衍生类器官和原始肿瘤组织，证实类器官在长期培养中稳定保持了亲本肿瘤的分子谱。 4.衍生ASC类器官的挑战 建立癌症类器官的当前协议已在其他地方详细总结。每个协议都是根据对器官/癌症类型的深入生物学知识以及广泛的试错研究来提高效率而开发的。图3总结了正常和肿瘤类器官培养的条件。每种癌症类型都进行了特定的修改，以帮助避免正常细胞污染，同时增强癌症干细胞的活力（在表2中总结）。尽管如此，原始混合中的正常类器官可以胜过肿瘤类器官，最终在培养中占主导地位，特别是当培养条件不能特别有利于肿瘤细胞时。前列腺胃肺结肠和胰腺癌症类器官的研究都报告了这一有问题的现象。因此，通过全外显子组测序（WES）或目标捕获面板测序验证肿瘤纯度至关重要，因为癌症类器官的形态常常与正常类器官无法区分。减轻正常细胞污染和提高协议效率的策略包括撤回一些癌症中不再需要的利基因子，因为普遍存在的致癌突变。例如，撤回Wnt3a和R-spondin1大大改善了结直肠癌（CRC）类器官的形成，而撤回EGF在创建胰腺导管腺癌（PDAC）类器官时有效，因为>80%的CRCs和>90% PDACs分别携带APC和KRAS突变。在胃癌（GC）中，添加nutlin3a，同时从培养基中去除Y-27632、A8301、EGF和FGF10也提高了成功率，样品获取方式的调整也可以产生影响。例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样增加了肿瘤纯度，并在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞污染。提高肿瘤类器官活力的其他方法包括在培养横纹瘤类器官时添加Y-27632以及在培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂。使用无血清、Afamin稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC类器官，因为标准Wnt3a条件培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。 图3. 热图显示了各种正常和肿瘤类器官培养的条件 每一列代表之前针对特定类器官类型报告的培养条件协议。彩色框表示在类器官扩增协议中使用指定的生长因子成分。大多数类器官类型都在包含AdDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX和青霉素/链霉素的基础培养基中培养，但也有一些例外。星号表示使用肝细胞培养基、GlutaMAX和Primocin，而^表示使用DMEM/F12培养基、神经基础培养基、GlutaMAX和低谷氨酸非必需氨基酸混合物。#Jung等人69在培养正常结肠类器官时添加了前列腺素E2，其中使用LY2157229代替A8301来抑制TGF-b信号。LGG，低级别胶质瘤；BLCA，膀胱尿路上皮癌；KIRC，肾透明细胞癌；MRTK，肾脏恶性横纹肌样瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；MEC，小细胞癌；ACC，腺样囊性癌；AciCC，腺泡细胞癌；SDC，唾液腺导管癌；ESAD，食管腺癌；STAD，胃腺癌；CRC，结直肠癌；PDAC，胰腺导管腺癌；HCC，肝细胞癌；CC，胆管癌；NSCLC，非小细胞肺癌；GEP-NENs，胃肠胰神经内分泌肿瘤；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；UCC，子宫体子宫内膜癌；OVC，卵巢浆液性癌；PRAD，前列腺腺癌。 即使有了这些协议修改，一些常见的癌症类型仍然难以用类器官来模拟，这表明需要进一步优化协议。有趣的是，一种称为条件重编程的替代方法，涉及辐照的小鼠成纤维细胞饲养层细胞与消化后的原代健康或癌细胞在rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）存在的条件下共同培养，允许几乎所有细胞类型来源的原代上皮细胞长期培养长达一百天，而无需遗传操作。这项技术已成功用于从非小细胞肺癌（NSCLCs）、前列腺癌和腺样囊性癌（ACC）细胞培养物生成患者衍生的细胞培养。条件重编程的前列腺和ACC癌细胞在异种移植的小鼠中产生了肿瘤，表明这可能是形成类器官率低的癌症类型的潜在替代方法。 5.ASC衍生的癌症类器官与2D癌细胞系的独特特征 5.1.利基因素和细胞-细胞/细胞-基质依赖性 ASC癌症类器官与2D癌细胞系之间的一个主要区别是，类器官仍然依赖于利基因素和细胞-细胞/细胞-基质相互作用来生存。因此，可以通过系统地撤回基本的利基因素、添加/撤回抑制剂或在无基质条件下培养，在肿瘤类器官上进行深入的功能表征。在此过程中，揭示了在癌变过程中发生的基因型-表型关联。 几项关于没有WNT下游基因突变的ASC衍生癌症类器官的研究，例如APC或CTNNB1，已经揭示了赋予Wnt/R-spondin独立的机制。这些研究为Wnt信号在塑造肿瘤内细胞状态形态多样性和异质性方面的贡献提供了见解。在正常胃类器官中双敲除CDH1/TP53导致与R-spondin独立相关的弥漫性GC表型。同样，撤回试验鉴定了PDAC类器官中独立于Wnt和R-spondin的亚群。还评估了撤回ROCK抑制剂和/或无Matrigel生长条件。一项关于GC类器官的研究表明，细胞-细胞/细胞-基质独立性与浸润性肿瘤边缘、晚期肿瘤分期和转移相关，并且与公共GC患者数据集中的总体和无病生存时间较短的转录组特征相关。从早期GC的深层黏膜中分离的肿瘤类器官比来自浅表黏膜的配对肿瘤类器官更不依赖于细胞-细胞粘附，表明同一患者的肿瘤的不同部分可能表现不同。 5.2.谱系多样性、细胞可塑性和细胞状态转换 类器官保留了来源组织的谱系多样性和细胞可塑性。例如，健康的前列腺和乳腺类器官包含能产生基底和腔系谱系的腔系和基底祖细胞。有趣的是，来自BRCA1突变携带者的乳腺上皮类器官显示出更高比例的腔系祖细胞，重现了在BRCA1突变携带者中作为癌症起始人群的腔系祖细胞的增加。单细胞RNA测序揭示了Wilms瘤衍生的类器官由三种不同的细胞类型（上皮、基质和胚细胞）组成，并且带有RSPO融合的APC野生型结肠癌细胞在Wnt撤回后仍保持其分化潜力，类似于健康的结肠类器官。撤回或补充外源性Wnt3a和R-spondin能够调节弥漫型GC或CDH1/TP53双敲除的正常胃类器官的组织学亚型规范和细胞可塑性，允许它们分别适应签戒细胞或非签戒细胞形态。这些观察结果与人类GC中的体内情况非常相似，签戒细胞在RSPO3低表达的区域中可见，非签戒环细胞弥漫形态与基质中RSPO3的表达相关。同样，PDACs在转录上可以分为两种细胞状态，更具侵略性的基底样状态和经典状态。通过单细胞RNA测序，一项研究确定了癌细胞在从经典状态过渡到基底样状态时可能经历的中间细胞状态。引人注目的是，使用患者活检和匹配的类器官的研究报告称，类器官在体外倾向于失去基底状态，这可以通过撤回培养基中的基本利基因素来恢复。用TGF-b处理的类器官被推向更具侵略性的基底样状态，而撤回TGF-b导致类器官恢复到经典状态。这些发现表明，生长条件或微环境可以调节细胞可塑性和细胞状态。不同的细胞状态随后导致不同的抗癌药物敏感性。这些结果与另一项谱系追踪研究一致，该研究将表达多色荧光蛋白的PDAC类器官移植到小鼠中，证明经典和基底样表型可以来自单个植入的细胞。因此，肿瘤的亚型受微环境的影响大于遗传学。 这项工作清楚地表明，类器官对于未来研究人类癌症中肿瘤可塑性和细胞状态转换的机制具有巨大的前景，这两个过程由于它们有限的异质性而无法在细胞系中研究。结合CRISPR-Cas9编辑将报告基因、谱系追踪和消融盒敲入癌症类器官，然后进行小鼠异种移植，可以进一步利用类器官技术评估肿瘤细胞亚群，包括癌症干细胞和癌症启动、转移和药物耐受性。例如，在患者衍生的CRC类器官中敲入EGFP和谱系追踪盒到LGR5位点证实了EGFP-LGR5+癌细胞干细胞以高效率启动肿瘤异种移植，并且肿瘤细胞采用类似于正常结肠上皮的层次结构。另外两项研究将CRISPR工程化的LGR5特异性消融盒的CRC类器官异种移植，观察杀死LGR5+癌细胞干细胞在肿瘤中的效果。在这两项研究中，LGR5+细胞的消除最初阻止了肿瘤生长，但当LGR5特异性消融关闭后，由分化谱系中再生Lgr5+细胞的人群推动了肿瘤的再生。异种移植的类器官携带可诱导的Lgr5-EGFP-Confetti报告基因，证明肝脏转移是由Lgr5细胞播种的，但转移性生长取决于Lgr5+细胞的重新出现。在异种移植的人类CRC类器官中进行的活体遗传谱系追踪系统鉴定了休眠的LGR5+p27+细胞，这些细胞赋予了可逆的药物耐受状态，该状态依赖于细胞基质界面上COL17A1的粘附。类似地，另一项谱系追踪研究表明，一种独特的CRC干细胞群体，潜伏的Lgr5+细胞，表达高水平的Mex3a，可以下调Wnt/干细胞基因程序以保护自己免受化疗，并成为治疗后的主要残留肿瘤群体。然而，另一项研究发现，负责CRC复发的残留肿瘤细胞特征是高EMP1表达，CRISPR工程化的EMP1+细胞消融防止了异种移植小鼠中转移的复发。 5.3.保留异质性和病毒基因组 癌症类器官保留原发性肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构是其另一个独特特征。在胃类器官队列中，几个案例显示了具有和不具有ERBB2或FGFR2的致癌性扩增的细胞亚群，模仿了体内肿瘤组织中观察到的区域异质性。引人注目的是，这种异质性在长期培养中得以维持。癌症类器官还显示出在长期培养中维持病毒基因组，使得能够研究与感染相关的癌症。从与Epstein-Barr病毒（EBV）相关的胃癌或鼻咽癌（NPCs）中建立的类器官能够保留EBV病毒基因组和病毒潜伏期，与大多数2D NPC细胞系已经失去了它们的EBV基因组形成对比。因此，与2D细胞系相比，癌症类器官更密切地重现了原发性肿瘤，为研究信号通路、肿瘤内异质性和与感染相关的肿瘤发生提供了强大的工具。 6.ASC衍生的类器官用于研究癌症发病机制 能够从多种器官中培养出健康的上皮细胞，为研究癌症逐步发展和理解环境致癌物暴露的影响提供了激动人心的机会。图4总结了使用正常结肠ASC类器官或癌前/早期肿瘤类器官来模拟早期肿瘤转化和肿瘤进展的研究报告示例。上皮器官的癌症是与老龄化人群相关的最常见的恶性肿瘤，但导致ASCs中体细胞突变积累的因素以及它们如何促进恶性转化尚不清楚。肠道隐窝提供了一个独特的模型，用于研究体细胞突变和克隆扩展。从肠道粘膜中建立的混合类器官培养通常是多克隆的，来源于许多腺体的集合，每个隐窝都有由亚克隆体细胞突变特征的，主要是乘客突变（图4A和4B）。ISCs在个别隐窝内竞争，最终走向单克隆性。因此，来自单个正常细胞的克隆类器官可以进行功能研究，对于理解癌症相关过程可能非常有价值。例如，从患有溃疡性结肠炎的患者中分离的克隆类器官显示出经常是双等位基因的截断突变，涉及IL-17-NF-kB途径，这与在溃疡性结肠炎组织中观察到的克隆扩展一致（图4D）。尽管这些突变在癌症中没有富集，但它们赋予了克隆类器官对IL-17A诱导的凋亡的抗性，提高了炎症环境中的细胞存活率。 图4. 结肠类器官的类型，从正常到癌前病变及其应用 (A) 正常结肠上皮包含不同异质性克隆的混合物。(B) 正常结肠类器官的长期培养导致克隆优势。克隆类器官可以长期培养，有或没有CRISPR工程化的肿瘤驱动基因突变，或暴露于细菌/药物。亚克隆培养，随后进行测序是一种可以用来询问基因组景观随时间或添加剂变化的方法，这一点通过在LS正常结肠上皮中确认基因组稳定性和在各种类器官模型中识别几种突变特征的原因得到了证明。(C) 在正常结肠类器官中重新创建特定组合的癌症驱动基因突变或进行全基因组CRISPR筛选，产生了各种癌前和肿瘤类器官模型，以及识别赋予Wnt激活和TGF-b抗性的目标。(D) 溃疡性结肠炎(UC)上皮展示了克隆扩展的概念，炎症微环境推动了抵抗IL-17途径的突变克隆的扩展。(E) 不同腺瘤类器官模型在研究癌症发病机制中的多种用途。正常类器官工程化了5个肿瘤驱动基因突变发展了微小转移，而CIN腺瘤但不是GS腺瘤类器官工程化了3个肿瘤驱动基因突变在异种移植小鼠模型中发展了巨大转移。UC，溃疡性结肠炎；LS，Lynch综合征；SSA，静止性锯齿状腺瘤；TSA，传统锯齿状腺瘤；CRC，结直肠癌；FAP，家族性腺瘤性息肉病；GS，基因组稳定；CIN，染色体不稳定性。 克隆健康类器官也可以在有无药物、感染因子的情况下进行长期培养，或使用CRISPR-Cas9基因编辑来识别固有的遗传不稳定性、表征突变特征，并识别致突变剂（图4B）。在培养的终点，可以进行最终的克隆步骤，以扩展单个克隆细胞进行测序。随后，从亲本克隆中筛选出突变，以揭示体外获得的突变。一项研究使用CRISPR-Cas9删除DNA修复基因，MLH1和NTHL1，然后进行亚克隆和WGS。他们发现，MLH1缺陷的类器官具有与错配修复缺陷的CRC一致的突变特征，而NTHL1缺陷的类器官具有与突变特征30相关的特征，这之前在一名携带NTHL1胚系无义突变的乳腺癌患者中被识别出来。 此外，将肠道类器官暴露于两种药物的组合，更昔洛韦（GCV）和莫昔芬（MMF），重新创建了在之前接受这两种药物治疗巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病的CRC患者中观察到的突变特征，表明类器官中的突变特征是由GCV诱导的，并且被MMF进一步增加。相比之下，来自携带杂合性胚系突变的Lynch综合征患者的正常胃或肠道类器官没有显示出增加的突变率，表明在第二个失活突变建立之前不存在单倍体不足。 6.1.与正常和癌前类器官共培养的微生物 通过感染微生物可以在类器官中重现突变特征。经过5个月反复腔内注射基因毒性pks+大肠杆菌的肠道类器官，这种病原体已知会在培养细胞中诱导双链DNA断裂，显示出在一部分人类CRC患者中观察到的突变特征，但在其他癌症类型中没有。这一发现暗示了过去暴露于pks+ E. coli可能是那些患者的潜在致癌因素。健康的人类类器官也被其他类型的微生物感染，包括已知与癌症发展相关的细菌和病毒。例如，人类胃类器官被幽门螺杆菌感染，这种病原体会导致胃溃疡和胃癌，导致通常在体内观察到的炎症反应和上皮增殖增加。另一项研究从正常人类口腔粘膜组织中生成类器官，并将它们分别暴露于HSV和HPV感染。这两种类器官系都显示出病毒DNA的增加，即使在传代后也得以维持，暗示持久感染。此外，iPSC和ASC模型突出了人类肝脏类器官模型在体外研究乙型肝炎病毒（HBV）感染和复制方面的潜力，未来可能用于研究与HBV相关的HCC进展。这些研究为解决微生物组在肿瘤发生中的参与提供了方法，由于缺乏适当的体外和动物模型，这一点以前探索得很少。 6.2.ASC衍生的小鼠类器官模型用于研究癌症发病机制 直接从患者样本中建立肿瘤类器官仍然是一个挑战。或者，可以从基因工程小鼠模型（GEMMs）中衍生ASC类器官，并在体外快速扩展以建立生物银行。来自人类或GEMMs的正常或早期肿瘤类器官作为研究癌症早期演变途径的良好工具（图4E）。一项共培养研究表明，小鼠Apc突变类器官分泌Notum。当这些Apc突变类器官与野生型小鼠肠道类器官共培养时，Notum通过推动野生型ISCs分化并导致Apc突变ISCs的克隆固定，抑制了野生型类器官的生长（图4E）。与这些发现一致，在小鼠中诱导Apc突变之前用Notum抑制剂处理减少了腺瘤的形成。这些研究突出了遗传小鼠模型和类器官如何协同工作并被利用，从而显著加速研究发现。小鼠类器官易于基因组编辑以诱导驱动突变，并且可以植入同种型和免疫能力的小鼠中以模拟肿瘤发生和转移。例如，为了模拟CRC的发展，携带不同组合驱动突变的小鼠类器官，无论是来自GEMMs的肿瘤/转移还是通过体外基因编辑，都被移植到同种型小鼠的盲肠壁上，用于原位肿瘤形成和转移发展。这些模型证实了TGF-b信号在肿瘤微环境中的作用，促进免疫逃逸并介导癌症转移。另一项研究生成了一种人类化的微卫星稳定的CRC小鼠模型，并确定EMP1+细胞是转移复发的起源细胞。类似地，乳腺肿瘤类器官可以从GEMM肿瘤中衍生出来，在2-3周内并原位移植形成肿瘤，重现原始肿瘤的上皮形态和药物反应。也已经开发了免疫能力的基于类器官的小鼠模型用于卵巢癌和肺腺癌。它们可能代表了与GEMMs相比，模拟癌症发病机制的更强大的平台，GEMMs可能开发起来耗时且技术上具有挑战性。 7.CRISPR-Cas9编辑ASC衍生的类器官 CRISPR-Cas9被用来在健康类器官中工程化组合驱动突变，以重新创建癌症（图4C；表4）。两项开创性研究同时证明，工程化APC、TP53、KRAS或PIK3CA和SMAD4突变的组合结果是人类肠道类器官，这些类器官在所有干细胞利基因素的独立下生长，并能够在小鼠中形成具有侵袭性癌症特征的肿瘤移植物。这些四重突变类器官的原位移植到小鼠盲肠引起了宏观的肺和肝转移。在三重敲除（APC-/-，TP53-/-和KRASG12D）人类类器官中过表达Noggin，当Noggin没有过表达时，在体内具有有限的生长潜力，导致与四重突变类器官相似的肝脏转移。由于这些类器官能够独立于所有利基因素生长，这些发现提出了利基独立可能介导转移的可能性。然而，不能排除其他未知因素。例如，患者衍生的原发性CRC和配对的转移性类器官总是显示出一致的利基因素依赖性，一些患者衍生的肝转移类器官仍然高度依赖于利基因素。染色体不稳定性也可能是一个贡献因素， 如下文更详细讨论。 已经发表了几种CRC的锯齿状肿瘤途径模型。一项研究通过工程化大染色体重排来生成RSPO融合基因，以及在人类结肠类器官中的BRAFV600E和TP53突变（图4C）。将这些人类结肠类器官异种移植到小鼠结肠中产生了锯齿状病变，重现了人类的SSAs。在类器官中除了BRAFV600E、TP53敲除和RSPO融合外，过度表达GREM1，结果在小鼠中形成了息肉状肿瘤，其组织学特征类似于传统的锯齿状腺瘤。有趣的是，与正常结肠类器官相比，RNF43-/-人类SSA类器官对RSPO的依赖性较小，为RNF43突变在锯齿状肿瘤途径中的致病作用提供了功能支持。另一项研究将正常结肠类器官与BRAFV600E突变工程化后，用TGF-b处理。TGF-b在正常类器官中触发了凋亡，但在BRAFV600E突变类器官中没有，而是诱导了上皮-间充质转化（EMT）和转录特征，模仿了在人类锯齿状肿瘤病变中观察到的特征。除了由癌症驱动基因突变引起的遗传损伤外，使用类器官还可以探索肿瘤进展过程中染色体不稳定性的作用。具体来说，工程化了五种肿瘤驱动突变（APC、SMAD4、TP53、KRASG12V和PIK3CAE545K）的正常结肠类器官能够在注射到小鼠脾脏后在肝脏形成微小转移灶（图4E）。相比之下，染色体不稳定而不是染色体稳定的腺瘤类器官，工程化了三种驱动因素（SMAD4、TP53、KRASG12V或PIK3CAE545K），在肝脏中形成了大的转移肿瘤，显示出组织学恶性。随着越来越多的癌前或早期肿瘤类器官模型的可用性，这些模型捕获了不同形式的遗传或表观遗传异常，研究人员现在有了前所未有的机会进行精细的调查，以确定有助于肿瘤发生的因子。 使用CRISPR-Cas9基因编辑在各种组织的正常类器官中成功模拟其他癌症类型的示例总结在表4中。这些包括在人类胃类器官中工程化ARID1A和TP53突变以模拟胃肿瘤；在胰腺类器官中KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4突变以模拟PDAC38；在乳腺类器官中TP53、PTEN、RB1和NR1突变以模拟管腔肿瘤；在人类导管类器官中TP53、SMAD4、NF1、PTEN和BAP1突变以模拟胆管癌；在小鼠食管类器官中Sox2过表达和p53和p16突变以模拟食管鳞状细胞癌。 全基因组CRISPR筛选也已在正常类器官中使用，以确定肿瘤发生的目标。两项研究在人类肠道类器官中进行了CRISPR-Cas9筛选，并确定了赋予对TGF-b介导的生长抑制的抗性的基本目标，这对于CRC发展至关重要。在培养中对小鼠胃类器官进行Wnt3a撤回，进行了类似的筛选，以确定以前未被重视的赋予Wnt激活的因素。总的来说，这些在正常或早期肿瘤类器官中的研究表明，多个癌症驱动基因的基因组编辑，无论是顺序还是组合，都可以模拟体内癌症发病机制。它们为这些基因在癌症进展中的基本功能提供了宝贵的见解。此外，将全基因组CRISPR筛选应用于正常类器官的成功，为将来在肿瘤类器官中识别治疗反应或抗性的遗传脆弱性提供了概念验证。 8.PSC衍生的类器官 类器官也可以从PSCs，无论是胚胎的还是诱导的，生成。人类胚胎干细胞受到伦理规定的限制，这阻碍了它们的广泛使用。相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程回到多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）。然后，细胞在3D基质中培养，使用特定的生长和信号因子引导它们朝着所需器官的细胞系发展。这一模型的主要挑战是在体外忠实地模拟所有体内生化线索，这些线索在正确的时间、位置和浓度下推动细胞分化和3D组织形成，就像在胚胎发育过程中发生的那样。最初通过使用活化素A处理人类PSCs来建立PSC衍生的类器官，以驱动内胚层身份，随后与FGF4和Wnt3a共同孵化以促进后肠分化。这一协议最终产生了表达特定肠道标记物的肠道类器官，如CDX2和KLF5。自那时以来，PSC类器官技术已广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功创建了许多PSC衍生的类器官，包括用于大脑、 胃、 肺、 胰腺、食管、肾脏、肝脏、等等。所有这些模型都为干细胞生物学和器官发育提供了重要的见解。然而，使用PSC衍生的类器官进行癌症研究的一个重要警告是，它们缺乏直接从肿瘤组织中衍生的ASC类器官在培养中保留的获得性癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们尝试将癌细胞直接重新编程为PSCs以了解肿瘤过程。然而，成功的结果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括从急性髓性白血病、 慢性髓性白血病、和幼年型单核细胞白血病。有趣的是，尽管携带相同的遗传异常，从白血病细胞衍生的iPSCs通常缺乏白血病潜力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。尽管如此，这种方法为存储白血病样本和研究患者特定突变与疾病表型之间的相互作用提供了机会。或者，将致癌突变工程化到PSC细胞中，然后诱导分化为特定器官以模拟来自胰腺、肺、胃、视网膜和大脑的癌症是另一种策略（表4）。这种方法在从PSCs生成大脑类器官方面特别成功，使用CRISPR-Cas9编辑用于工程化大脑类器官，这些类器官具有在脑肿瘤中观察到的最频繁的单次和组合突变。产生的肿瘤性脑类器官代表了不同的脑肿瘤类型，包括中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤和胶质母细胞瘤。此外，分化的PSC衍生的脑类器官被用作健康大脑替代品，以研究肿瘤-胶质细胞相互作用。通过与胶质瘤干细胞或传统的肺癌细胞系共培养，可以模拟大脑环境并分析细胞迁移和细胞-细胞相互作用，模仿胶质母细胞瘤侵袭或上皮性恶性肿瘤转移到大脑。最后，从患有癌症易感性综合征的患者的体细胞中重新编程为PSCs被用来模拟来自具有胚系APC、GNAS或BRCA1突变的患者的癌症类型（表3）。 9.使用类器官研究药物反应 体外模型相对于动物模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛选的适应性。具体来说，癌细胞系几十年来一直被用于在应用到体内模型之前评估药物效力。这由癌症细胞系百科全书（CCLE）和癌症药物敏感基因组学（GDSC）进行的研究证实。这些项目的目标是构建一个有用的数据库，以识别药物反应和癌症基因组之间的相关关联，并反过来指导个性化治疗。同样，癌症患者衍生的类器官可以适应大规模机器人药物筛选。使用患者衍生的CRC类器官的概念验证研究说明了西妥昔单抗和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官生长抑制的有效性。在癌症类器官中还进行了其他药物筛选测定，包括乳腺癌、 膀胱、头颈鳞状、肝脏、NPC、 卵巢、 胰腺、前列腺、和胃癌症类器官。其中一些体外药物反应进一步使用体内异种移植进行了验证。进行药物筛选的详细协议，从细胞分离到数据分析，已在其他地方总结。最近对协议的改进使得可以在正常、前体和肿瘤类器官中进行筛选；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性测定扩展到基于图像的高含量表型分析。在HER2过表达的乳腺癌类器官中也描述了有利的基因-药物相关性，这些类器官对阿法替尼敏感，在ARID1A突变的胃类器官中对共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶（ATR）抑制剂敏感，在MTAP突变的胰腺癌类器官中对PRMT5抑制剂有反应，40 在CHFR表观遗传学沉默的结肠癌类器官中对紫杉醇有反应。除了使用癌症类器官来确认已知的基因-药物关联外，类器官模型预测标准疗法的临床反应的能力也经过了严格的测试。一个转移性CRC和食管胃类器官的生物银行证明了患者和癌症类器官对标准治疗药物紫杉醇和5-氟尿嘧啶之间的一致反应。其他癌症类器官类型的研究也证明了它们在预测患者治疗反应方面的稳健性。此外，从同一个体建立的纵向PDAC类器官反映了逐渐获得对化疗治疗的抗性。除了预测药物反应外，几个先进的直肠癌症类器官模型在体外以及在通过内窥镜注射到小鼠直肠后显示出预测对化疗放疗的反应的潜力。值得注意的是，这些研究大多数只涉及少数患者，需要进行更大规模的相关研究和更长时间的患者随访，以验证这些患者衍生的类器官的真正预测潜力。 类器官药物筛选的另一个目标是确定新的治疗靶点。不同类器官队列的初步药物筛选研究已经取得了令人鼓舞的数据，为癌症患者提出了几种治疗策略，尽管需要在更大的癌症类器官队列中进一步验证。例如，一部分原发性肝癌类器官在接受细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂（SCH772984）治疗后显示出生长抑制，但它们对其他大多数临床相关化合物都具有抗性，这些结果在异种移植的小鼠中得到了验证。另外，儿童Rhabdoid癌症类器官模型和相应的PDX模型已经确定Neddylation作为一个有吸引力的治疗靶点。更重要的是，这项研究评估了Neddylation抑制剂MLN4924对健康组织（包括肾脏、肝细胞和小肠类器官）的毒性，强调了使用正常类器官进行毒性测试的可行性。另一项研究产生了一大型针对癌症干细胞的双靶点双特异性抗体库，并使用患者来源的CRC类器官生物库进行功能性筛选。作者还使用了配对的健康类器官来评估治疗抗体在药物筛选管道的最早阶段的毒性。该研究成功鉴定了一种针对几种表达LGR5的上皮癌症类型的潜在治疗性双特异性抗体，MCLA-158，具有EGFR和LGR5臂。尽管ASC癌症类器官是探索药物-基因相互作用的探索性模型，但具有CRISPR工程化致癌突变的ASC或PSC衍生类器官，具有低体细胞突变背景，可以精确地确定合成致死伙伴或药物（单一或组合）以针对特定基因或途径。最近，在ARID1a/TP53敲除胃类器官中对>2,000种小分子进行了高通量筛选，确定了ARID1a突变细胞对组蛋白去乙酰化酶和Survivin抑制剂的敏感性。类似地，在携带Trp53、Rb1和Pten突变以及Kras和c-Myc过表达的小鼠来源的膀胱癌类器官上进行了表观遗传药物的小分子筛选，确定了Sirt1作为治疗靶点。此外，在PSC衍生的肿瘤性脑类器官上成功进行了一小组EGFR抑制剂的药物筛选。尽管需要长达40天的治疗期，但这项研究证明了Afatinib对EGFR过度激活的GBM类器官亚群的生长抑制作用。与正常视网膜类器官相比，用卡铂、雷帕霉素或两种脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂处理PSC衍生的RB1缺陷类器官模型的视网膜母细胞瘤，提供了除人类视网膜母细胞瘤细胞系之外的替代模型，以进一步验证它们的有效性。最后，来自经过验证的转基因小鼠模型的ASC衍生类器官允许快速表征药物反应及其细胞、机制、功能和药理效应。来自代表不同GC亚型的转基因小鼠模型的肿瘤样本的胃类器官在体外显示出不同的药物治疗效果。另一项研究表明，表达RhoAY42C/+与Cdh1缺失的弥漫性GC细胞系以及来自弥漫型GCs转基因小鼠模型的胃类器官都对焦点粘附激酶（FAK）抑制剂敏感，支持FAK作为这种癌症类型的治疗靶点的相关性。这些配对的类器官-小鼠模型允许高效、无偏见、并行地测试由一组定义的基因组异常引起的药物反应。 10.使用类器官衍生的异种移植作为临床前模型 尽管PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们成本高，移植成功率低，需要长时间的培养。患者衍生的类器官异种移植模型可能为这一未满足的需求提供解决方案，并在表2中进行了总结。最简单的方法涉及将健康、癌症或基因修饰的类器官与Matrigel共注射到小鼠侧腹， 这不需要高级的外科技术来执行，并给出一个容易观察的读数。然而，皮下类器官移植的植入率可能很低，并且不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了为肿瘤生长提供必要的利基因素。为了解决这个问题，几个小组将癌症/工程化类器官注射到裸鼠的肾下囊或脾脏中，这两个都是高度血管化的环境，确保了丰富的营养、激素、生长因子和氧气供应给移植的类器官，大大增强了植入率。移植的细胞可以直接进入血液并转移到肝脏，在那里它们增殖形成次级病变，这使得它成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。然而，这个模型仍然不能复制癌症的自然肿瘤微环境。这个限制由一个研究所说明，在该研究中，依赖Wnt和R-spondin的GC类器官未能在肾下囊植入，除非它们与产生Wnt和R-spondin的、来自肠道类器官的成纤维细胞共注射。 已经开发了几种原位异种移植模型，为异种移植形成提供了更具生理学相关性的微环境。然而，它们涉及复杂和侵入性的外科手术。与肾囊或皮下空间相比，原始组织环境提供了支持类器官植入的生长因子，这一点通过在结肠环境中弥漫型GC类器官的异种移植效率增加得到了证明，最有可能是由于该位置的Wnt和R-spondin的可用性。到目前为止，癌症类器官已经被直接注射到胰腺尾部、胃浆膜和卵巢囊的NGS小鼠中，这些研究都证明了类器官重现肿瘤过程的能力。几项研究还成功地进行了小鼠类器官的原位移植到盲肠粘膜壁，这不需要外科切口。这种方法随后被改编为将患者来源的CRC类器官和正常人类结肠类器官移植到小鼠结肠中。这些方法允许对异种移植形成进行内窥镜监测，并可以应用于正常人类类器官进行体内谱系追踪。另一项研究报告说，体外药物敏感性可以在其体内原位模型中重现。总的来说，这些报告强调了基于类器官的原位异种移植模型在促进我们对相关生理环境中肿瘤发生的了解方面的高价值，为它们在转化研究和个性化治疗中的使用铺平了道路。 11.局限性与未来展望 尽管类器官技术已经彻底改变了癌症研究，并具有广泛的潜在应用，但它仍然面临技术限制。尽管来自ASC的肿瘤类器官在基因组上通常是稳定的，但也有例外。如上所述，来自肠道腺体的普通类器官在长期培养中可能会倾向于克隆优势，这影响了用于全基因组CRISPR筛选的普通类器官的使用。类器官在长期培养中也可能获得新的突变，尽管这些突变通常是亚克隆的、随机的，并且主要影响非编码区域。具有固有基因组不稳定性的类器官可能会更快地获得突变，正如一项研究所示，该研究使用了一个微卫星不稳定的肿瘤类器官。有趣的是，这种固有的不稳定性已被用来模拟肿瘤演化的早期阶段。例如，一项研究追踪了经TP53突变工程化的胃类器官中染色体拷贝数的变化，并注意到在2年的时间里逐渐出现的非整倍性。即使类器官基因组和突变谱是稳定的，表型不稳定性也可能由生长条件的变化引起。一个亚群的尿路上皮癌类器官在亲本肿瘤中显示了腔系亚型，但随后作为类器官转变为基底亚型，尽管亚克隆突变的频率没有可检测的变化。这些基底类器官在异种移植中生长时又恢复了腔系表型，表明类器官培养条件与异种移植环境是这种表型可塑性的原因。显然，对调节表型的因子的更好理解将导致类器官模型的改进。已经改良生长因子，以提高肠道类器官中的分泌系规范和肝脏类器官中的肝细胞规范。在低氧或无锚定条件下培养也可能为肿瘤类器官相对于普通类器官提供选择优势。 目前，使用类器官的高通量药物筛选大多涉及直接对肿瘤类器官有影响的药物。除非使用更复杂的共培养模型，否则单独的类器官在筛选阻断肿瘤-基质或肿瘤-免疫相互作用的药物时不会提供有用的结果。利基因子的存在可能进一步限制筛选中使用的小分子抑制剂的类型。例如，BMP和TGF-b抑制剂在常规类器官培养中是必需的，这阻止了相关激动剂在药物清单上的使用。只有在肿瘤类器官自分泌Wnt的情况下，Wnt抑制剂筛选才有可能，但它无法模拟来自肿瘤基质的Wnt来源的阻断。类器官培养中增殖性干细胞的主导地位可能会夸大它们对针对细胞周期的药物的反应。最后，培养条件和类器官大小已被证明可以改变细胞可塑性，如在PDAC和CRC类器官中所示，这反过来可能影响药物反应。因此，基于类器官药物筛选的发现将需要通过临床前研究和临床试验进行广泛验证。 迄今为止，几种类器官培养方法已经开始将微环境的一些组分，如基质细胞、血管和免疫细胞，纳入它们的类器官中，使它们在生理上更具相关性（图1和4）。与癌症相关成纤维细胞共培养的胰腺肿瘤类器官表明，来自基质的外源性Wnt供应可以增加依赖Wnt的PDAC细胞的肿瘤潜力。此外，将肿瘤类器官和自体T细胞共培养导致患者特异性肿瘤反应性T细胞的扩增，这是采用性T细胞转移的潜在临床策略。另一种方法涉及基于3D生物打印的模型，该模型由组织基质的关键组分组成，包括癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，创建了一个多层的“组装体”。引人注目的是，内皮细胞能够形成功能性的血管网络，支持肿瘤生长。对组装体的分析揭示了一个旁分泌循环，即成纤维细胞分泌的BMP在肿瘤中诱导FOXA1表达，这反过来又推动了增强子重编程，赋予肿瘤亚型可塑性。与传统的膀胱肿瘤类器官相比，组装体对化疗药物的敏感性也较低。此外，还描述了一个“器官-血管网”模型，该模型涉及将人类CRC或正常肠道类器官与修饰形式的内皮细胞共培养，这些细胞过度表达胚胎限制E26转化特异性（ETS）变异转录因子2（ETV2），形成可灌注的血管网络。有趣的是，这种共培养模型表明，与CRC类器官中预后不良和转移相关的基因上调。最后，AL方法已成功适应建立100个ALI肿瘤类器官，来自28种不同的癌症类型。另一种方法从患者肿瘤的针刺活检中生成微器官球体。将肿瘤消化成Matrigel中的悬浮细胞，然后与油混合以生成基于微流体的液滴进行后续培养和药物筛选，可在14天内得出结果。这两种模型都能保留肿瘤微环境，包括肿瘤浸润性淋巴细胞，使未来在免疫肿瘤学研究中具有潜在应用。当然，这些改进和对现有协议的调整是令人兴奋的，但模拟癌前环境又是另一个挑战。癌前细胞与基质组分之间的相互作用无疑在肿瘤发生中起作用。事实上，与L2-IL-1B小鼠的中性粒细胞共培养的小鼠Barrett食管类器官以剂量依赖性方式增加增殖和类器官生长，表明中性粒细胞对BE上皮细胞有直接刺激作用。未来，看到其他方法如何将癌前微环境纳入类器官模型将是有趣的。 用于类器官培养的试剂和协议，无论是用于癌前研究还是更普遍的研究，都需要改进和标准化，如果类器官要在临床应用中使用的话。目前，Matrigel是类器官培养协议中最广泛使用的支架，但它是动物来源的，定义不清，批次间变化，并且存在免疫原转移的风险。所有这些限制都阻止了它在临床应用中的使用。也许在低百分比基质条件下的悬浮培养技术或使用下一代设计基质将解决这个问题，并将类器官的应用扩展到临床环境。重要的是，类器官系仍然大多是手动生成的，每个实验室都使用自己的修改协议。最终，类器官衍生/增殖协议将必须标准化和自动化，以增加可重复性和可扩展性。 12.结论 鉴于迄今为止已经成功建立的健康和癌症类器官的广泛多样性，发展微流体方法以提高药物筛选的吞吐量，以及将肿瘤微环境纳入这些设备的潜力（在图5中总结），我们可能会在不久的将来看到类器官模型测试作为患者药物处方的补充。此外，类器官模型及其与动物模型的协同作用将为分析复杂的旁分泌相互作用提供手段，加速发现到癌症发展的最早步骤，从而提供发现有效的癌症预防策略的机会。 图5. 显示了癌症模型中类器官培养技术进展的时间线。与ASC衍生类器官相关的主要事件以蓝色文本列出，而与PSC衍生类器官和ALI类器官模型相关的事件分别以黄色和绿色文本显示。ASC，成人干细胞；PSC，多能干细胞；ALI，空气-液体界面；PDAC，胰腺导管腺癌。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

从分子的角度来看，肠道是一个嘈杂的地方，各种人类细胞和微生物细胞彼此之间相互沟通，从而维持一种稳健而又健康的细胞群落。 从分子的角度来看，肠道是一个嘈杂的地方，各种人类细胞和微生物细胞彼此之间相互沟通，从而维持一种稳健而又健康的细胞群落。这个细胞群落的关键是肠道干细胞(intestinal stem cell)，它们产生多种细胞类型，从而有助于保持肠道功能正常。肠道干细胞位于肠黏膜隐窝基底部，即基底隐窝是肠道干细胞的细胞库。正常情况下，位于隐窝基底部的肠道干细胞不断向隐窝顶部(肠腔方向)迁移，整个迁移过程大约3至5天，在迁移过程中肠道干细胞分化形成不同的肠粘膜细胞。 针对肠道干细胞研究近期取得的进展，小编进行了一番盘点，以飨读者。 1.Cell Stem Cell：揭示了机体肠道修复损伤组织的新型分子机制doi:10.1016/j.stem.2022.07.007肠道上皮组织会经历持续的更新并且在受损后具有特殊的再生能力；近日，一篇发表在国际杂志Cell Stem Cell上题为“Lymphangiocrine signals are required for proper intestinal repair after cytotoxic injury”的研究报告中，来自加利福尼亚大学等机构的科学家们通过研究在肠道中识别出了一种特殊组分或许在修复损伤组织上扮演着关键角色。 揭示了机体肠道修复损伤组织的新型分子机制。图片来源：Cell Stem Cell (2022). DOI: 10.1016/j.stem.2022.07.007。 本文中，研究者发现，淋巴管的内皮细胞或能产生特殊的分子，该分子对于肠道中干细胞和组织的维持和调节非常必要，这些淋巴内皮细胞能驻留在专门的干细胞生境附近，即支持干细胞再生的微环境。医学博士Ophir Klein说道，对于我们而言，理解生境以及淋巴细胞如何与干细胞交流沟通是非常重要的，解析了其中的机制或许能帮助解释支持干细胞的生态系统如何发挥作用从而为未来研究打下基础，未来或有望帮助开发修复机体损伤组织的新型治疗性策略。 为了更好地理解干细胞的活性，研究人员就想通过研究分析哪些细胞能帮助肠道上皮细胞来修复自身，尤其是淋巴内皮细胞；研究者Brisa Palikuqi说道，淋巴管与干细胞实际上非常亲近，几乎所有的干细胞区室都靠近淋巴管，由于这两种细胞类型如此接近，这或许就能让研究人员相信这些淋巴管或许在其中扮演着关键角色。淋巴管能表达多种跟银子，包括名为Rspo3基因，其被认为对于干细胞发挥功能非常重要，为了确定是否该基因在肠道干细胞调节过程中扮演重要角色，研究人员提出了消除机体中的Rspo3基因，并利用单细胞测序技术来观察肠道中的干细胞是如何在没有Rspo3基因存在的情况下产生反应的。 最开始，干细胞并不会对环境中的改变产生任何反应，随后研究人员就决定通过提供一种化疗药物来损伤该系统，该药物能在机体任何地方杀死任何增殖的细胞。当研究人员这样做时，突然间干细胞和肠道就不得不增加增殖量，从而每天替换掉更多的细胞。Rspo3基因的缺失会导致干祖细胞的数量下降，从而就会阻碍损伤后的机体组织恢复。这一研究发现或许就表明，淋巴内皮细胞是肠道生境的关键组分，同时在诸如化疗等损伤后对于肠道组织的修复非常重要。 2.Nature：重大进展！发现调节肠道上皮中干细胞的新机制doi:10.1038/s41586-022-04962-0覆盖在小肠和大肠内部的一层特殊细胞吸收营养物和水，同时阻止任何有害物质循环。这层细胞被称为肠道上皮。它每四到七天利用肠道干细胞完全自我更新。但是，科学家们仍然不知道这些干细胞究竟是如何发挥作用的。在一项新的研究中，来自荷兰癌症研究所、奥地利科学技术研究所、芬兰赫尔辛基大学、瑞典卡罗琳学院和英国剑桥大学的研究人员研究了肠道上皮中的干细胞。他们发现了一个令人兴奋的新机制，可能改变人们对什么是干细胞的理解。相关研究结果于2022年7月13日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine”。 肠道上皮只有一层细胞的厚度，并不断地更新。它遍布绒毛，这些绒毛看起来像覆盖在小肠和大肠内部的微小触角。在绒毛之间，有称为肠隐窝（intestinal crypt）的微小口袋。这个名字让人感到神秘，这很好地描述了那里到底发生了什么。论文共同第一作者Bernat Corominas-Murtra解释说，“在隐窝的底部，肠道上皮中的干细胞不断分裂。所产生的一些细胞作为干细胞留在隐窝中，其他细胞则被推向周围绒毛的顶端，在那里，它们最终分化为让肠道发挥功能的功能性细胞类型，并在几天后被丢弃。这种情况一直在人体内发生，如果这种机制崩溃，人体会遇到严重的医学问题。” 在研究小肠和大肠中的这些干细胞时，这些作者最初感到很困惑。Corominas-Murtra说，“我们通常对干细胞的看法是，干细胞是由细胞固有的生化特性决定的---类似于我们可以识别的生化标志物一样。我们发现在具有经典干细胞标志物的细胞中，许多细胞实际上从未作为干细胞发挥作用，而是被挤出隐窝并被丢弃，对肠道的长期更新没有任何贡献。我们还看到，虽然经典标志物预测小肠和大肠中的干细胞数量大致相同，但小肠中实际作为干细胞发挥作用的干细胞数量约为大肠中的两倍。” 因此，这些作者想了解是什么决定了哪些细胞真正作为干细胞发挥作用，他们吃惊地发现了一种调节隐窝中干细胞的新机制。Corominas-Murtra解释说，“我们发现，这些细胞是否表现为干细胞，完全取决于它们所处的位置。肠道上皮中的细胞不只是被它们下面的细胞分裂从隐窝向外推，就像在传送带上一样，而且还涉及到另一种运动。”这些作者发现，肠道上皮层中的细胞也积极地沿着随机方向移动---沿着传送带来回移动。这样一来，已经沿着传送带被向外推的细胞最终可以回到隐窝的底部，并在那里再次充当干细胞，进行分裂和补充肠道上皮层。 3.Cell Rep:微生物通过免疫依赖性调节肠道干细胞分化doi:10.1016/j.celrep.2022.110572近日，康奈尔大学的研究者们在“Cell Report”杂志上发表了题为“Microbes affect gut epithelial cell composition through immune-dependent regulation of intestinal stem cell differentiation”的文章，在本研究中研究者提出了一个模型，微生物模式识别途径(如IMD-AREISH)和损伤反应途径(如JAK-STAT)的平衡影响ISC的分化、上皮成分和肠道生理。 微生物通过免疫依赖性调节肠道干细胞分化影响肠道上皮细胞组成。图片来源: https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.celrep.2022.110572 肠道微生物在宿主生理中扮演着重要的角色，然而，其影响的机制仍未得到充分的研究。在本研究中，研究者证明微生物不仅影响肠道生理，而且还改变其上皮成分。微生物区系和病原体共同影响肠道干细胞(ISC)的分化。有趣的是，虽然微生物区系促进ISC分化为肠细胞(EC)，但病原体刺激肠内分泌细胞(EE)的命运和EES在中肠上皮的长期积累。重要的是，进化保守的果蝇NFKB(味觉)通过直接调节分化因子将干细胞谱系规范推向内皮细胞。相反，JAK-STAT通路促进EE对感染性损伤的命运。 为了进一步阐明微生物区系和病原体的这种差异影响，研究者应用互补基因组学方法来表征致病/非致病微生物对两条免疫途径：NFKB和JAK-STAT途径的影响。研究者发现，微生物主要刺激IMD-AREISH通路，而病原体则触发IMdRelish和JAK-STAT通路的激活。突变分析和功能遗传学实验揭示了保守的免疫途径在控制ISC分化中的重要作用。最后，通过研究这些保守的免疫通路之间的关系，研究者发现损伤介导的JAK-STAT激活拮抗了NFKB对ISC谱系的影响。 4.Nature Metabolism封面论文揭示不健康饮食引起的肠道干细胞功能改变导致肥胖和前驱糖尿病机制doi:10.1038/s42255-021-00458-9 肠道对于维持我们的能量平衡至关重要，它是对营养平衡的变化做出快速反应的高手。它在肠道细胞的帮助下设法做到这一点，而这些肠道细胞主要负责吸收食物成分或分泌激素。在成年人类中，肠道细胞每五到七天就会再生一次。肠道干细胞不断更新和产生所有类型的肠道细胞的能力对于这种消化系统的天然适应性至关重要。然而，长期的高糖和高脂肪饮食破坏了这种适应性，并可能导致肥胖、2型糖尿病和胃肠道癌症的产生。 高糖和高脂肪饮食改变了肠道干细胞的谱系分配，改变了细胞的区域特性。图片来自Nature Metabolism, 2021, doi:10.1038/s42255-021-00458-9。 在一项新的研究中，来自德国亥姆霍兹慕尼黑中心、慕尼黑工业大学和德国糖尿病研究中心的研究人员猜测肠道干细胞在这种适应不良中发挥了特殊作用。通过使用一种小鼠模型，他们研究了高糖和高脂肪饮食的影响，并与对照组进行了比较。相关研究结果近期发表在Nature Metabolism期刊上，论文标题为“Diet-induced alteration of intestinal stem cell function underlies obesity and prediabetes in mice”。论文通讯作者为亥姆霍兹慕尼黑中心的Heiko Lickert、Anika Böttcher和Fabian J. Theis。 5.Nature：开发出一种名为Red2Onco的多色报道模型来追踪肠道干细胞生境的致癌驱动重塑机制doi:10.1038/s41586-021-03605-0 肿瘤细胞和周围微环境之间的相互作用会促进肿瘤进展、转移和复发，尽管对果蝇的镶嵌分析能帮助研究人员理解这种相互作用，但在脊椎动物机体中设计出平行的研究方法依然比较困难；日前，一篇发表在国际杂志Nature上题为“Tracing oncogene-driven remodelling of the intestinal stem cell niche”的研究报告中，来自剑桥大学等机构的科学家们通过研究开发出了一种创新性的遗传小鼠模型—Red2Onco，其就能帮助检测诱发癌症的最初步骤，Red2Onco的多色标记系统能在单细胞水平上追踪第一次癌变打击后机体肠道中肿瘤的进展程度。 对癌症的研究一直受到了细胞转变成为临床可检测的阈值的限制；然而，通过恶性肿瘤的最初阶段在组织学上往往是看不见的，因为这一过程源于单一细胞，在早期阶段，一种所谓的“播种细胞”的过程能获得最初的促癌突变，这也被称为“第一次致癌打击”，同时会被正常的组织完全围绕；为了克服这种障碍，文章中，研究人员就开发了一种实验室系统来解析直到现在科学家们仍然未发现的癌前病变步骤。 研究者Bon-Kyoung Koo说道，随着诸如深度靶向性DNA测序技术的进展，如今科学家们已经注意到了与癌症相关的突变也会出现在正常组织中；而这是非常可怕的；这一转折点就像侦探一样，开始追踪第一个致癌打击。由于大多数人类癌症类型都源于上皮细胞，于是研究人员就决定建立一种遗传模型来分析小鼠机体肠道中首个致癌转化所产生的影响。这种名为Red2Onco的遗传模型是一种多色标记技术，其能帮助追踪从单一突变细胞开始的肿瘤进展过程。在Red2Onco的帮助下，研究人员发现，突变的细胞能为其邻近的非突变细胞创造一种敌对的环境，并大规模地解除对小鼠肠道组织中正常干细胞生境的调节，这是迄今为止研究人员所尝试的最让他们兴奋的方法了。 利用Red2Onco模型，研究人员就能研究两种独立的“首个致癌打击”所开启的机制，这两种“致癌打击”是两种已知能的原癌基因KRAS和PI3K，其被称为能驱动肿瘤发生的促癌因子；让研究人员意外的是，他们发现，即使在这种第一次致癌打击的情况下，突变的癌前细胞或播种细胞依然会对其邻居产生消极的影响。周围的正常组织会丢失其干细胞，这反过来有利于致癌突变干细胞及其后代的扩展；通过这种转化过程，突变细胞在肠道中的定植就会增加后期致癌的机会，这或许就会诱发癌症。 6.PNAS: miRNA靶向BMP信号可以调节肠道干细胞数量doi: 10.1073/pnas.2022583118印第安纳大学研究者在PNAS上发表了题为"A stress-responsive miRNA regulates BMP signaling to maintain tissue homeostasis"的文章。成年生物必须感知并适应环境的波动。在肠道等高周转率的组织中，这些适应性反应需要基因表达的快速变化，而这反过来可能涉及转录后基因控制。然而，肠组织特异性microRNA(MiRNA)介导的调控途径仍未被探索。在本研究中作者确定了一种转录后机制，即在正常内稳态和组织再生期间调节果蝇成体肠道组织中的BMP信号活性，从而调节肠道干细胞数量。 MIR-958在果蝇肠道组织中富集。图片链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1073/pnas.2022583118 在这项研究中，这些作者通过对果蝇肠道组织的分析，鉴定了一种肠道特异的miRNA，miR-958，并研究了它在组织稳态和再生方面的作用。他们发现miR-958调节一个直接靶点Cabut(CBT)，以调节BMP信号，而BMP信号又调节干细胞数量。他们还表明miR-958水平是应激反应的，因此作者确定了果蝇成体中肠适应性组织反应的机制。 7.Nature子刊解读！科学家深度解析肠道干细胞自我更新和分化的基本分子机制！doi:10.1038/s41556-020-00617-2近日，一篇刊登在国际杂志Nature Cell Biology上题为“Non-canonical Wnt/PCP signaling regulates intestinal stem cell lineage priming towards enteroendocrine and Paneth cell fates”的研究报告中，来自德国环境健康研究中心等机构的科学家们通过研究解开了肠道干细胞自我更新和分化的分子机制。肠道在调节机体代谢和与多种疾病相关的异常表现上扮演着关键的角色，比如影响全球数百万人机体健康的肥胖、糖尿病、结肠炎和结直肠癌；通过刺激来自肠道干细胞的特定肠内分泌细胞的形成来早期靶向作用内分泌功能障碍或许有望作为一种治疗糖尿病的再生医学疗法，基于此，详细阐明肠道干细胞系的谱系结构以及调节招募不同肠道细胞类型的特殊信号就显得尤为重要。 图片来源：Helmholtz Zentrum München 为何肠道对机体健康研究如此重要？研究者Heiko Lickert说道，作为机体的消化和最大的内分泌系统，肠道在机体能量的调节和葡萄糖平衡上扮演着重要角色，肠道的功能是由专门的细胞来完成的，这些细胞每隔3-4天就会从肠道干细胞中不断产生并更新；比如，所谓的肠道内分泌细胞就能产生20多种不同的激素，并向大脑和胰腺发送信号来调节食欲、食物摄取、胃的排空和来自胰腺β细胞的胰岛素分泌。 另外一项重要的肠道功能是通过所谓的潘氏细胞（Paneth cells）来发挥的，这些细胞能够产生防御素并保护机体抵御外来病原体的入侵；因此，肠道功能异常与多种疾病有关这就毫不奇怪了，比如慢性炎症、结直肠癌、糖尿病等影响着全球数百万人健康的疾病。文章中，研究人员深入理解了肠道干细胞如何持续更新并以前所未有的单细胞分辨率不断产生特殊的细胞类型，如今研究人员就能够描述每个肠道细胞的潜在祖细胞群，而且他们指出，每个谱系的肠道干细胞都能够产生单能性的祖细胞。 此外，研究人员还识别出了一种特定的肠道干细胞生境信号通路（Wnt/planar细胞极性通路），其能调节肠道干细胞的自我更新和谱系决策。这一点非常重要，因为肠道干细胞能够无限更新并维持肠道功能和组织的屏障，机体有着6米长的上皮组织，而且每天会产生超过1亿个细胞，此外，这些细胞能够分化为每一种细胞类型，因此，这种自我更新或谱系决策过程的失败所导致慢性疾病的风险是相当高的。 8.厦大Nature：基因不稳定导致肠道干细胞坏死诱发肠道炎症doi:10.1038/s41586-020-2127-x炎症性肠病(infammatory bowel disease，IBD)的病因包含遗传和环境之间的多因素相互作用导致。近日来自厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室、生命科学学院莫玮教授课题组和韩家淮院士课题组合作在Nature杂志上发文揭示了肠道干细胞中基因组不稳定性引发干细胞坏死，导致自发性的肠道炎症的机制，该文章题为"Gut stem cell necroptosis by genome instability triggers bowel inflammation"，研究人员发现了一种组蛋白甲基转移酶SETDB1的缺失，会介导赖氨酸9处组蛋白H3的三甲基化，从而参与IBD的发病机制。 研究人员发现，IBD患者的SETDB1水平下降，而肠道干细胞中SETDB1水平下降的小鼠会发生自发性末端回肠炎和结肠炎。SETDB1保护了基因组的稳定性，肠干细胞中SETDB1的缺失释放了对内源性逆转录病毒的抑制(在人类中，长时间重复的类似逆转录病毒的元素约占基因组的8%)。 研究人员发现内源性逆转录病毒引起的过度病毒拟态触发了z-DNA结合蛋白1 (ZBP1)依赖性的坏死，不可逆转地破坏了上皮屏障的稳态，最终促进了肠道炎症。在IBD患者中均可见到基因组不稳定、内源性逆转录病毒反应、ZBP1上调和坏死。 9.Science子刊：在免疫介导的肠道损伤中，T细胞产生的IFNγ杀死肠道干细胞doi:10.1126/sciimmunol.aay8556鉴于肠上皮每周都要更换，维持这种组织就需要由肠道干细胞驱动的快速自我更新。在包括同种异体骨髓移植在内的许多情况下，这种稳态都受到破坏。在同种异体骨髓移植（allogeneic bone marrow transplantation）后，同种异体T细胞经常以干扰素γ（IFNγ）依赖的方式攻击并杀死肠道细胞。 尽管肠道干细胞对肠道上皮维持很重要，但对免疫介导的损伤如何影响肠道干细胞及其所在的微环境的了解仍然有限。在一项新的研究中，来自美国纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心和威尔康奈尔医学院等研究机构的研究人员发现肠道干细胞区室损伤是同种异体反应性的和自体反应性的肠道免疫病理学的共有特征，可减少肠道干细胞，并损害它们在T细胞介导的损伤模型中的恢复。相关研究结果近期发表在Science Immunology期刊上，论文标题为“T cell–derived interferon-γ programs stem cell death in immune-mediated intestinal damage”。 图片来自Science Immunology, 2019, doi:10.1126/sciimmunol.aay8556。 尽管成像结果显示在健康小鼠的肠道干细胞区室附近几乎没有T细胞，但是在同种异体骨髓移植后，浸润肠粘膜中的供者T细胞主要定位于肠道隐窝固有层中。利用离体肠上皮培养物进行的进一步建模表明一旦这种肠上皮培养物与活化的T细胞共培养后，肠道干细胞发生耗竭并损害了人类肠道类器官和小鼠肠道类器官的存活，而且对效应途径的筛选鉴定出干扰素-γ（IFNγ）是肠道干细胞区室遭受损伤的主要介体。IFNγ诱导JAK1和STAT1依赖性的毒性，从而启动促凋亡基因表达程序并导致肠道干细胞死亡。携带缺乏IFNγ的供者T细胞的骨髓移植、针对肠上皮特异性地缺乏IFNγ受体（IFNγR）的受者的骨髓移植，以及对JAK信号进行药物抑制，都会使得肠道干细胞区室免受损伤。此外，利用缺乏潘氏细胞（Paneth cell）的类器官、缺乏IFNγR的潘氏细胞和缺乏IFNγR的肠道干细胞以及纯化的肠道干细胞集落开展的体外实验表明对肠道干细胞的直接靶向并不依赖于潘氏细胞微环境的损伤。 10.EMBO J：移除基因NEDD4和NEDD4L导致肠道干细胞更快产生并加快肠癌发展doi:10.15252/embj.2019102771在一项新的研究中，来自英国弗朗西斯克里克研究所的研究人员发现携带着让两个特定的肿瘤抑制基因缺失或失活的突变的良性肠道肿瘤会更快地发展为癌性肿瘤。相关研究结果近期发表在EMBO Journal期刊上，论文标题为“NEDD4 and NEDD4L regulate Wnt signalling and intestinal stem cell priming by degrading LGR5 receptor”。 这项新的研究发现如果两个基因NEDD4和NEDD4L在肠道内的良性肿瘤中缺失，那么这种良性肿瘤会导致更多的肠道干细胞产生，因而会更快地发展为更可能发生癌变的肿瘤。 图片来自EMBO Journal, 2019, doi:10.15252/embj.2019102771。 这些研究人员发现这两个基因编码的酶会抑制对细胞的生长很重要的Wnt途径。如果这两个基因发生缺失或失去功能，那么Wnt途径将变得更加活跃，这会刺激另一个称为LGR5的基因，从而产生更多的肠道干细胞。 当这些研究人员移除小鼠和反映体内肠道功能的肠道类器官中的NEDD4和NEDD4L基因时，他们发现当同时缺乏这两个基因或者缺乏这两个基因中的任何一个时，肠道干细胞就会更快地产生。当将这两个基因从良性肠道肿瘤中移除时，这些肿瘤产生更多的肠道干细胞，并且更快地发展为癌性肿瘤。 11.Gastroenterology：关键的肠道干细胞基因或能将膳食脂肪与结肠癌风险联系起来doi:10.1053/j.gastro.2019.11.031近日，一项刊登在国际杂志Gastroenterology上的研究报告中，来自罗格斯大学的科学家们通过研究发现，帮助肠道干细胞燃烧膳食脂肪的两个基因或在结肠癌发生过程中扮演关键角色。文章中，研究者阐明了小鼠机体细胞消耗脂肪的方式与基因调节肠道干细胞行为机制之间的关联。 研究者Michael Verzi教授表示，这一点非常重要，因为当肠道中存在太多膳食脂肪时，干细胞的数量就会增加，进而就会增加机体患结肠癌的易感性；人体每天都会失去数百万个肠道细胞，就好比我们失去皮肤细胞一样，肠道干细胞会经历不断地更新和肠道内壁的不断更新，但改变干细胞的功能或会引发结肠癌。 结直肠癌是美国人群中第三大常见的癌症类型，据美国癌症协会数据显示，每年大约有101，420人会被被诊断为结直肠癌患者。最近有研究表明，肠道干细胞的水平会在摄入高脂肪“西方”饮食的动物中增加，这或许就能够解释这种饮食方式增加癌症风险的原因。这项研究中，研究人员发现，HNF4A和HNF4G基因能互相协作来促进肠道内壁保持良好的功能，当这些基因被失活后小鼠就会失去肠道干细胞，这就证实了这两个基因的重要性，此外研究者还认为，这些基因能帮助干细胞燃烧脂肪从而为机体提供能量。（生物谷 Bioon.com）

肠道血液和淋巴管网络与小肠上皮密切相关，包括驻留在上皮内陷窝中的肠干细胞(Isc)。 肠道血液和淋巴管网络与小肠上皮密切相关，包括驻留在上皮内陷窝中的肠干细胞(Isc)。在过去的十年里，几个研究小组已经证明，血管内皮细胞(ECs)分泌的旁分泌因子，即血管分泌因子，对许多组织中干细胞的维持和再生具有重要作用。 血液内皮细胞(BECs)在肝、肺、骨髓和胸腺等几个器官的再生中起着核心作用。值得注意的是，淋巴管内皮细胞(LECs)通过分泌淋巴管分泌因子Reelin(RELN)与心脏再生有关。此外，干细胞与晶状体上皮细胞的相互作用调节着皮肤中干细胞的循环。然而，肠内皮细胞在ISC自我更新和再生中的作用仍不确定。 图片来源: https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.stem.2022.07.007 近日，来自加州大学的研究者们在 Cell Stem Cell杂志上发表了题为“Lymphangiocrine signals are required for proper intestinal repair after cytotoxic injury”的文章，该研究确定LECs是细胞毒性损伤后最佳肠道恢复的基本利基成分。 肠上皮经历了持续的更新，并具有在损伤后再生的特殊能力。肠干细胞(ISCs)的维持和增殖受其周围的生态位调控，主要是通过Wnt信号。然而，目前尚不清楚哪些生态位细胞在不同的损伤状态下产生信号，内皮细胞(ECs)作为ISC生态位的组成部分在动态平衡和损伤后的作用被低估。 在这里，研究者显示淋巴管内皮细胞(LECs)位于隐窝上皮细胞附近，并分泌支持上皮更新和修复的分子。LEC是小肠中Wnt信号的重要来源，因为LEC来源的Rspo3的缺失导致干细胞和祖细胞数量减少，并阻碍细胞毒性损伤后的恢复。 LEC Rspo3缺失导致TA、SCA1高表达细胞和粘液分泌细胞数量减少 图片来源: https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.stem.2022.07.007 在本研究工作中，研究者确定淋巴来源的Rsp3有助于5FU损伤后的肠道再生。然而，研究者没有观察到在动态期有条件地从淋巴管中删除Rspo3后的表型。在一项与本研究相辅相成的研究中，Goto等人探索了肠道中Rspo3的所有来源。 他们发现，当Rspo3同时从间充质来源和淋巴来源中删除时，ISC在动态平衡的维持受到显著影响。本研究还得出结论，LEC来源的Rspo3对于Lgr5+细胞消融后的肠道恢复是必不可少的。总之，本研究证明了LEC分泌的Rspo3对于细胞毒性损伤后最佳的肠道修复是必不可少的，LEC是肠道生态位的关键组件和Wnt信号的关键来源。 参考文献 Brisa Palikuqi et al. Lymphangiocrine signals are required for proper intestinal repair after cytotoxic injury. Cell Stem Cell. 2022 Aug 4;29(8):1262-1272.e5. doi: 10.1016/j.stem.2022.07.007.