UBA1

生命体与活细胞内的信息传递，依赖错综复杂的信号转导通路及相互作用网络。激酶信号通路与细胞增殖、疾病发展密切相关，具有重要的研究价值；然而，激酶又具有快速响应、级联激活的特点，给在活细胞内原位研究激酶生理功能带来了挑战。一方面，传统方式难以在活细胞内特异性地激活某一个目标激酶，精准追踪其下游信号通路，而避免对目标以外的干扰；另一方面，激酶激活后在数秒到数分钟内产生快速而广谱的下游信号转导，传统方式难以高时间分辨率且系统地发现并解析不同蛋白响应的时序信息。想象在雪山上发生雪崩时，整个过程顷刻而至，然而从微观层面上，首先有一处裂隙形成冰晶发生不起眼的位移，从源头引发邻近的积雪滑动，然后再扩散到更大范围，引起整体的雪层发生崩塌。为了看清这种扰动发生的时序和传递的路线，需要高速、高清的摄像机记录下全过程。同样在细胞信号转导通路中，开发一种高时间分辨的激酶激活与组学解析策略，能系统而有效地刻画这类复杂而动态的生命过程。2024年1月2日，北京大学、北大-清华生命科学联合中心陈鹏课题组和南方科技大学田瑞军课题组合作在Nature Chemical biology期刊上以长文形式报道了一种基于生物正交脱笼和蛋白质组学策略的活细胞激酶“脉冲追踪”技术（Decaging Kinase coupled proteomics，DeKinomics），实现了高时间分辨的激酶信号转导原位解析。值得一提的是，Nature Chemical biology期刊同期还邀请合肥工业大学李宜明教授以新闻与观点（News & Views）的形式，对该工作进行了介绍。该文章以Lighting up kinase-contacts in situ为题，评述了DeKinomics秒级分辨的技术特色以及泛素化相关的生物学发现。陈鹏课题组长期致力于发展适用于活细胞的生物正交反应，并率先提出生物正交剪切反应的概念【1】，即通过对目标蛋白关键残基的保护-脱保护，实现对其活性的原位“关-开”调控（即笼蔽-脱笼，caging-decaging）。这种方法普适性广，对蛋白结构改动小，可以最大程度还原天然蛋白的活性。在前期的研究工作中，陈鹏课题组将生物正交剪切反应运用于多种氨基酸残基的脱笼，在活细胞中实现了不同种类酶活性的原位、瞬时激活【2-4】。田瑞军课题组长期致力于开发高灵敏的功能蛋白质组学技术，用于在系统水平上揭示细胞信号转导相关蛋白修饰位点和互作的时-空调控变化。课题组开发了高通量的酪氨酸磷酸化富集技术【5】，发展了表征信号转导复合物的高选择性邻近标记蛋白质组学技术【6】和光交联化学蛋白质组学技术【7】。针对病理条件下信号转导通路，课题组通过磷酸化和复合物层面的功能蛋白组学研究，揭示了胰腺癌中的关键信号转导复合物【8】。在最新的成果中，他们将激酶瞬时激活方法与定量磷酸化蛋白质组学技术相结合，开发了激酶“脉冲追踪”技术DeKinomics，实现了活细胞中特定激酶的高时间分辨组学研究，解析了其直接内源底物及下游级联信号通路。在Dekinomics技术中，通过“遗传密码子扩展+生物正交剪切反应”的化学生物学策略，在目标激酶的活性赖氨酸位点定点插入ONP保护的赖氨酸衍生物ONPK，笼蔽激酶活性；随后利用高时间分辨的紫外光照脱除ONP保护基团，释放赖氨酸的侧链氨基，实现激酶的特异性激活；在目标激酶激活后数秒至数分钟内，固定和捕捉细胞磷酸化图景，开展磷酸化蛋白质组学分析，精准揭示激酶下游信号通路响应的时间信息。图：DeKinomics技术策略流程。通过对激酶信号通路的定量磷酸化蛋白质组学分析，该工作获得了以下结论：1）DeKinomics实现了秒级分辨率的活细胞内激酶激活；目标激酶激活数秒内即引起特异的下游磷酸化信号级联，这种响应能被磷酸化蛋白质组学精准定量。2）从DeKinomics高时间分辨的磷酸化蛋白质组学数据中，寻找响应速度最快的磷酸化位点，是鉴定目标激酶细胞内源直接底物的有效策略。3）DeKinomics适用于多种类型激酶的功能研究，包括丝氨酸/苏氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、受体酪氨酸激酶及癌症中出现的融合激酶。这些都证明了DeKinomics策略是一项普适性、精准性的激酶生物学研究技术。从DeKinomics磷酸化蛋白质组学的大数据中，挖掘激酶的内源直接底物，进行分子机制的精细探索，能揭示未知的细胞调控机制。本文中，结合近年来新发展的酪氨酸超亲体（superbinder）富集技术，研究人员在SRC激酶激活后的6000余个酪氨酸磷酸化位点中，确定了269个SRC的潜在底物，其中泛素E1连接酶UBA1的Y55位磷酸化引起了他们的关注。细胞中的泛素化修饰超过99%都是通过UBA1活化，经由泛素E2-E3连接酶最终修饰到蛋白上【9】。UBA1相当于细胞内泛素化的“总闸门”。尽管UBA1的Y55位磷酸化是目前在组学上被鉴定到最多的翻译后修饰（PhosphoPlus数据库），但该位点的磷酸化功能尚未被发掘。研究人员通过对UBA1的结构分析，Y55位点磷酸化很可能会影响UBA1结合ATP。因此，研究人员预测Y55位点磷酸化会对UBA1的催化活性造成影响，并利用实验证明了UBA1-Y55位点的磷酸化可以抑制UBA1形成E1~Ub硫酯中间体，阻碍下游E2~Ub生成。实验结果不仅揭示了UBA1活性调控的新机制，而且提示了酪氨酸磷酸化和泛素化在修饰酶层面串扰（crosstalk）的新机制：泛素化介导的激酶降解是一种激酶活性的负反馈调节机制【10】，这一机制所依赖的泛素化能够被SRC介导的UBA1酪氨酸磷酸化所抑制。除SRC外，研究人员还绘制了受体酪氨酸激酶TYRO3特异的磷酸化介导信号转导图谱，发现了TYRO3-PRKCD信号转导通路，提示了癌症靶向协同治疗的新思路。图：SRC磷酸化UBA1的Y55位点，通过影响ATP结合口袋构象来抑制UBA1的泛素连接酶活性，进而干扰泛素介导的激酶降解这一负反馈调节过程。综上，这项工作为活细胞中的激酶功能研究提供了普适性、精准性的“脉冲追踪”技术，以秒级的超高时间分辨率对特定激酶的底物和下游信号通路进行了系统解析。北大-清华生命科学联合中心陈鹏教授和田瑞军教授为本文的共同通讯作者，北京大学前沿交叉学科研究院博士生/南方科技大学博士后翁亦澄（现为上海交通大学生物医学工程学院助理研究员），南方科技大学博士后陈文东、孔倩为共同第一作者。原文链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41589-023-01497-x本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！

关注并星标CPHI制药在线   泛素-蛋白酶体是“消化”细胞内蛋白质的重要途径之一，它能调控多个重要的生命活动，如细胞增殖、分化、凋亡、DNA 修复等。近年来，人们逐渐认识到泛素-蛋白酶体系统的异常与多种不同疾病的发生密切相关，包括神经退行性疾病阿尔兹海默症、亨廷顿病、癌症、心血管和呼吸系统疾病等。在神经退行性疾病中，外源或者内源因素可以引发神经细胞内外蛋白质的错误折叠，从而影响泛素-蛋白酶体的降解功能而导致大量蛋白的异常堆积，甚至细胞死亡。而肿瘤的发生则与细胞过度增殖以及抗凋亡能力增强有关。泛素-蛋白酶体通过促进抑癌蛋白如P53的降解或者阻滞致癌蛋白降解而影响肿瘤细胞的存活。在近几十年的研究中，泛素-蛋白酶体作为一个庞大的蛋白质机器，成为科学家们研发疾病潜在有效药物的重要靶点。       泛素-蛋白酶体途径作用机制       泛素-蛋白酶体途径需要包括泛素（ubiquitin，Ub）、泛素激活酶 E1( ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素聚合酶(亦称泛素载体蛋白)（ubiquitin-carrier protein，E2）、泛素连接酶（ubiquitin-ligating enzyme，E3）、26S蛋白酶体（26S proteasomes）和去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）等相关物质的参与。       泛素-蛋白酶体途径由底物蛋白质泛素化和底物通过蛋白酶体降解2个过程组成。泛素是一条由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链。泛素通常以2种形式存在，一种是游离形式，另一种形式是与受体蛋白共价结合。泛素通过其C端与受体蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基或受体蛋白N端的α-氨基共价结合的过程称为泛素化。泛素化是一个由泛素激活酶 E1，泛素聚合酶E2 和泛素连接酶E3等介导的多酶级联反应。       泛素激活酶E1在进化中很保守，是一种 ATP 依赖的酶，通过与泛素的 C 端形成高能硫酯键而激活泛素。与E1不同，细胞内存在多种 E2。E2 与活化的泛素结合形成E2-泛素复合体，E2协助特异性 E3将活化的泛素转移到底物。泛素连接酶 E3是泛素化反应系统中数量最大、结构最多样、调控机制最为复杂的成员，它可以直接与底物或通过辅助蛋白与底物相互作用，从而决定泛素介导底物蛋白质降解的选择性。哺乳动物细胞内的E3 主要有三大类，即含HECT( homologous to E6-AP C-terminal) 结构域的E3、含环指结构( RING finger)的E3、含U-box 的E3。E3在泛素化过程中的作用主要包括3个阶段：E3与E2的相互识别与作用、E3 与底物蛋白质的相互识别与作用、E3 催化泛素与底物蛋白质的连接及泛素与泛素之间的连接。最终，泛素通过其C端与受体蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基发生共价结合，而这些泛素分子上的48位、63 位赖氨酸又可以作为修饰位点，如此，底物蛋白上可以形成多泛素链。一般地，由48位赖氨酸残基连接的4个或更多个泛素的底物蛋白质可以被 26S 蛋白酶体识别并将其降解，而由63位赖氨酸残基连接的泛素链则不参与蛋白质的降解过程，其主要与细胞内信号转导过程和 DNA 修复等相关。       泛素在泛素化修饰的底物蛋白质被26S 蛋白酶体降解之前，可以被去泛素化酶( deubiquitinating enzyme，DUB) 水解脱离下来，从而避免其与底物蛋白一道被降解，解离下来的游离形式的泛素可以被循环使用。蛋白酶体是一种巨大的具有四级结构的复合蛋白酶(约2000 kD)，具有多种蛋白水解酶的活性，其蛋白降解功能主要依赖于泛素化过程。26S蛋白酶体由20S 核心复合物( core particle，CP) 和19S 调节复合物( regulatory particle，RP，也称PA700) 组成。其中，20S是由4个同轴的、7个亚基组成的七聚体环叠而成的中空桶装结构。两侧外环由 αl-α7 亚单位组成，2 个内环由 β1-β7 亚单位组成。3 个组成型表达的β亚基( β1、β2、β5) 具有苏氨酸蛋白酶活性位点(分别为“半胱天冬酶-样”活性位点、“胰蛋白酶-样”活性位点、“胰凝乳蛋白酶-样”活性位点)，且被封闭在降解腔的内侧，从而有效阻止正常折叠的蛋白质进入降解腔。19S 调节复合物可以识别泛素化底物，去折叠底物并释放游离形式的泛素，打开 α 环上的降解通道并将去折叠的底物送入降解腔。所以，泛素-蛋白酶体介导的迅速且不可逆的特异性蛋白质降解是一个高度复杂、受到严格调控的生命过程。       泛素-蛋白酶体通路（来源文献[1]）       Ub：泛素；E1：泛素激活酶；E2：泛素载体蛋白；E3：泛素连接酶；DUB：去泛素化酶       泛素-蛋白酶体与药物研发       目前已报道的多种人类疾病与蛋白酶体通路的异常有关。经批准的蛋白酶体抑制剂也已成功用于治疗多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤等癌症，而正在开发的多个靶向泛素-蛋白酶体通路不同组分的药物，如去泛素化酶抑制剂等临床前测试药物，泛素化酶调节剂、新的蛋白酶体抑制剂等临床试验药物等也显现出更值得期待的疗效。       01蛋白酶体抑制剂目前已报道的有较好抗肿瘤效果的药物有10余种，且用于临床治疗的药物以蛋白酶体抑制剂居多。硼替佐米(Bortezomib)Bortezomib (PS-341)是首个被 FDA 批准的以泛素-蛋白酶体通路为靶点的蛋白酶体抑制剂类药物。Bortezomib 是一种硼酸二肽，它可以特异性地与20S蛋白酶体的β5亚基的苏氨酸的活性部位结合，有效抑制胰凝乳蛋白酶活性。同时，它也可以与 β1 亚基的苏氨酸的活性部位结合，抑制半胱天冬蛋白酶活性。Bortezomib是一类高选择性的可逆抑制剂，也是一种被批准用于治疗多发性骨髓瘤的药物。暴露于 Bortezomib 可以稳定 p21，p27，p53蛋白以及促凋亡Bid和Bax 蛋白，阻断细胞内 NF-κB 通路的激活，导致肿瘤细胞死亡。       Carfizomib 作为第二代蛋白酶体抑制剂类药物，于2012 年被 FDA 批准用于治疗已经使用过Bortezomib 治疗的多发性骨髓瘤患者。与Bortezomib不同，Carfizomib 属于环氧酮类化合物，具有独特的化学结构和选择性，它的环氧酮部分与苏氨酸的羟基和游离 α-氨基相互作用，以不可逆的方式形成吗啉加合物。Carfizomib 与蛋白酶体其他 β 亚基如 β1、 β2 的结合能力要弱于 Bortezomib，从而降低了对胰蛋白酶、半胱天冬酶的活性抑制。Ixazomib 是首个被批准的口服硼酸酯类蛋白酶体抑制剂。数据显示，Ixazomib 可以以“孤儿药”或者联合其他蛋白酶体抑制剂给药的方式，用于治疗多发性骨髓瘤、全身性轻链淀粉样变等其他恶性肿瘤。此外，蛋白酶体的特殊亚基类抑制剂(β1i、β2i、β5i)，也可通过与亚基的结合，以可逆或者不可逆的方式占据蛋白质降解的结合位点，抑制降解、阻滞细胞周期，从而有效抑制肿瘤的复发。       02去泛素化酶抑制剂去泛素化酶抑制剂作用于半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。现已开发的与19S蛋白酶体相关的去泛素化酶主要有UCHL5 (or UCH37)、USP14、USP7和PSMD14 (POH1)等。P5091属于噻吩类小分子抑制剂，它与P22077主要作用于USP7。研究发现，对Bortezomib治疗产生耐药性的多发性骨髓瘤患者中使用P5091，可诱导肿瘤细胞的死亡。WP-1130、b-AP15均可作用于多个去泛素化酶。多泛素化修饰蛋白的累积阻滞细胞周期，从而有效抑制结肠癌等肿瘤的发展。WP-1130与Bortezomib有协同的肿瘤治疗作用，而b-AP15更多用于治疗耐Bortezomib药性的肿瘤。作为金属蛋白酶家族成员之一的去泛素化酶PSMD14，其在细胞内水平负调控多发骨髓瘤细胞的增殖以及患者的生存率，由此，Cleave Biosciences公司设计合成了针对PSMD14的特异性抑制剂并已进入临床试验前期。       03泛素化酶调节剂E1是泛素化体系中的第一个酶。两种E1 (Uba1和Uba6)调节了下游泛素化反应。因此，调控E1活性可调节下游某些与肿瘤相关蛋白的泛素化。目前，已有多种 E1 抑制剂被报道。例如，Uba1的抑制剂PYR-41 和PYZD-4409。但已进入临床试验的只有类泛素分子NEDD8 的E1活化酶抑制剂MLN4924。抑制E1会导致泛素化底物的累积，而 E1 较差的特异性和成药性成为了发展 E1抑制剂的绊脚石。E2 抑制剂具有较强的选择性，提供了在肿瘤治疗方面更大的空间。如抑制剂CC0651 通过与CDC34 的结合而发生的构象改变阻滞了Ub 的级联反应。E3的数量约有近700个，它能够特异性识别蛋白质底物，从而使得它成为多种相关疾病的治疗靶点。人们可以通过调控底物蛋白质的 E3 来调节目的蛋白，从而有针对性地提高疗效。如MDM2是肿瘤抑癌基因p53的E3，阻断MDM2和p53 的相互作用，可以稳定 p53，从而阻滞肿瘤细胞周期，促进凋亡。Nutlin-3 是第一个以 MDM2 为靶点的 E3 抑制剂。Nutlin-3模拟并占据 p53 与 MDM2 的结合位点，从而避免 p53 被泛素标记而降解。作为另一种稳定 p53的小分子药物，RITA 通过与 p53 的 N 端结合从而抑制 p53 与 MDM2 之间的相互作用。被批准用于治疗多发性骨髓瘤(MM)、套细胞淋巴瘤(MCL)、骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes)的药物       参考资料       [1]陈禹杉,姜天霞,周鲁明,冯仁田,邱小波.泛素-蛋白酶体通路与药物研发[J].中国生化药物杂志,2016,36(12):1-6.       [2]刘扬.泛素-蛋白酶体与药物应用[J].大学化学,2019,34(07):60-66.       作者简介：小泥沙，食品科技工作者，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品及功能性食品的开发与研究。【企业推荐】智药研习社近期课程报名来源：CPHI制药在线声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼点击阅读原文，进入智药研习社~

Courtesy Getty Images A study published Tuesday in JAMA revealed a little-known syndrome with a high mortality rate has a higher prevalence than previously thought. VEXAS was first identified in 2020, and patients exhibit unexplained fevers, anemia and inflammation. The lead investigator for the study, David Beck, M.D., Ph.D., also led the team that initially identified the UBA1 gene mutation shared amongst VEXAS patients. His team utilized that knowledge to screen the blood DNA records of 163,096 consenting patients in the Pennsylvania healthcare system. The UBA1 mutation was found in nine males and two females. While these figures maintain the disease's rare status, the previous 2020 findings identified 25 men and no women in the U.S. with the condition. This new study, led by researchers at NYU Grossman School of Medicine, suggests the rare condition is more vexing than originally thought – 1 in 4,269 men and 1 in 26,238 women, over 50. Mayo Clinic rheumatologist Matthew Koster, M.D., called the findings “remarkable.” “Is VEXAS really more common than we think, with patients hiding in plain sight? And the answer is yes.” Proving the greater prevalence in men is of particular importance as that population carries the higher mortality rate. Up to half of people diagnosed with VEXAS, mostly men, die within five years. The study's participants lacked diversity – 94% were white and 61% were female, all based in Pennsylvania. The team plans to analyze more racially diverse groups and look for additional genetic causes. The team said they believe their findings will raise awareness of the disease to increase accurate diagnoses and open avenues for new therapies. Development of a simple blood test for the UBA1 mutation is also on the to-do list, to make for an easier, earlier diagnosis. Current treatments for the disease include high-dose steroids, JANUS kinase inhibitors and bone marrow transplants to control symptoms.