CLK1

引言 P body小体（PB）是广泛存在于真核生物细胞中的核糖核蛋白（RNP）颗粒 ，其中含有各种参与翻译调控和RNA降解的RNA结合蛋白（RBP）和RNA分子，但是在细胞周期中PB的内含物如何变化以适应细胞需求仍不清楚。 近日，来自法国索邦大学的Dominique Weil和Adham Safieddine（第一作者兼共同通讯）研究团队在Molecular Cell上发表题为Cell-cycle-dependent mRNA localization in P-bodies的文章，发现PB中的RNA分子随着细胞周期是高度动态化的，但并不随着细胞质中的RNA一起变化，mRNA的PB定位是由RBP和RNA特征调控的。 研究人员首先观察了在细胞周期中PB的形态变化，发现从G1到G2期PB体积变大，接下来他们从不同细胞周期的细胞中分离纯化了PB并进行了蛋白质组分析检测其内含物，发现主要的PB蛋白随着细胞周期并不发生变化。然后他们通过RNA-seq检测了其中的RNA成分，发现PB中的RNA随着细胞周期是高度动态化的。进一步他们分析了PB中RNA的表达水平和其在细胞质中的表达水平，发现二者是部分非偶联的。接下来他们用单分子荧光原位杂交（smFISH）进行验证，在PB和细胞质中FBXO5转录本在G1S和S中期达到峰值，只不过在PB中表达量显著更高，在PB和细胞质中CLK1转录本随着细胞周期逐渐降低，在G2M期达到峰值。 接下来他们主要关注那些在G2期具有明显细胞质上调的mRNA，TOP2A的mRNA在细胞质中表达量很高，而在PB中没那么高，但是在某些细胞中大量TOP2A的mRNA在PB中累积，而在细胞质中几乎没有。他们分析发现那些具有高RNA表达和低PB定位的细胞对应G2期细胞，这时该蛋白需求量较大，因而高度表达。他们猜测在有丝分裂之后，G1早期时，残余的TOP2A mRNA会被运送到PB中，通过实验发现，在S和G2期细胞中TOP2A mRNA水平很高，但是定位在PB中的并不多，而G1期细胞具有两种模式，要么是极少要么是中度的TOP2A表达，但是在PB中明显累积。因此，细胞在退出有丝分裂之后PB会捕获一部分mRNA。 他们还利用高通量smFISH检测了细胞周期中的RNA定位，选择了94个mRNA进行检测，发现一部分要在有丝分裂到G1期转变的时候降解的mRNA会在G1期时累积在PB中。接下来他们搜索了可能影响mRNA定位的RBP，发现HuR-ARE互作会影响G2期mRNA定位于PB。然后他们分析了可能导致PB定位的mRNA特征，发现G1中期时PB中富集的mRNA特别长，并且这种长度差异主要是由于编码区域导致的。于是他们转染了不同长度的RLuc，发现如果RLuc的CDS由0.9kb延长到1.7-1.8kb会导致其在G1早期细胞的PB中显著累积更多。因此，RNA长度是导致G1期细胞PB中mRNA累积的一个关键因素。 P小体内的mRNA随细胞周期变化（Credit: Molecular Cell） 总的来说，这项研究揭示了细胞周期中PB内RNA的变化，说明PB不仅仅只是一个储存过量未翻译的mRNA的场所。 参考文献 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.molcel.2024.09.011 责编|探索君 排版|探索君 来源|BioArt End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A (DYRK1A) 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，属于CMGC蛋白激酶家族中的DYRK亚家族。DYRK1A已被证实能够调控Tau病理的进展，被认为是治疗阿尔茨海默病 (AD) 有前景的靶点。然而，现有的DYRK1A抑制剂因药代动力学性能欠佳、配体利用率低及选择性不足而陷入研究瓶颈，难以满足临床治疗需求。因此，开发拥有良好体内药代动力学特性和治疗潜力的新型选择性DYRK1A抑制剂已成为当务之急。针对上述问题，沈阳药科大学赵庆春课题组通过理性设计和系统的结构优化，鉴定出一种强效且选择性的DYRK1A抑制剂。相关工作以“Discovery of ZJCK-6-46: A Potent, Selective, and Orally Available Dual-Specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A Inhibitor for the Treatment of Alzheimer’s Disease”为题发表在Journal of Medicinal Chemistry期刊上 (J. Med. Chem. 2024, 67, 15, 12571–12600)【1】。 DYRK1A具有典型的蛋白激酶折叠构象，其ATP结合口袋呈裂隙状，主要由α螺旋组成的大亚域和以β折叠为主的小亚域构成。Gourdain等人[2]发现的双芳基-氮杂吲哚DYRK1A抑制剂效果显著，但结构中的酚羟基限制了体内应用。Chaikuad等人[3]后来发现了具有极高亲和力的甲基9-苯胺噻唑并[5,4-f]喹唑啉-2-甲酰亚胺酸酯 (EHT) 系列抑制剂，结构中的嘧啶环与酶结合口袋匹配良好。基于这些发现，研究者将1H-吡咯[2,3-b]吡啶与嘧啶片段融合，设计得到具有新型骨架的DYRK1A抑制剂 (图1A)。随后，作者通过配体亲脂效率 (LLE) 作为平衡药效和ADME性质的标准，筛选得到了3个潜在的候选物12、26和29。随后，在两种与DYRK1A具有同源性的激酶细胞周期蛋白依赖性激酶9 (CDK9) 和糖原合酶激酶-3β (GSK-3β) 上初步探讨了其激酶选择性，并根据三种蛋白结构中Leu241残基的取向不同，通过引入甲基作为位阻来进一步提高激酶的选择性，得到化合物31-33 (图1B)。 图1：(A) 新型DYRK1A抑制剂的合理设计与发现；(B) 化合物12、26和29及其相应的甲基取代衍生物31–33的结构、cLog P值、DYRK1A、CDK9和GSK-3β酶抑制活性。 在药物发现过程中，先导化合物的代谢稳定性是影响其类药性能的关键因素。因此，作者进一步评估了化合物31、32和33的人肝微粒体 (HLM) 和人血浆稳定性。结果表明，这些化合物都具有较好的人血浆稳定性，其中，化合物31和32在HLM中表现出适度的代谢，而化合物33在HLM中易发生代谢。随后，作者评估了这些化合物体外的人血浆蛋白结合率、血脑屏障通透性和细胞通透性，结果显示，这些化合物具有较高的血浆蛋白结合率和中等的细胞通透性，但只有化合物32具有较高的血脑屏障通透性。于是，作者选取化合物32进一步探索其对细胞色素 (CYP) P450酶的抑制能力，发现其对CYP2C9和CYP2C19具有较强的抑制活性，提示化合物32与这两类酶催化的代谢药物之间存在DDIs的潜在风险。同时，在对215种蛋白激酶进行选择性筛选时，发现化合物32 仅对DYRK家族和高同源性CLK家族激酶具有较高的抑制率，具有相对较高的激酶选择性 (图2)。 图2：(A) 激酶谱分析；(B) 化合物32在DYRKs和CLKs家族IC50值得测定。 在完成苗头化合物的选择和体外ADME特性评价后，作者在Tau (P301L) 293T和SHSY5Y这两种Tau蛋白高表达的细胞模型上，评价了化合物抑制Tau磷酸化的能力。Western bolting检测、荧光成像分析和细胞热稳定迁移实验表明化合物32可以直接作用于细胞中的DYPK1A，并显著抑制其介导的Tau的磷酸化 (图3)。随后，作者在Sprague-Dawley大鼠中评价化合物32的药代动性质以及血脑屏障通透性，结果显示，化合物32显示出可接受的分布、半衰期和平均驻留时间以及中等的脑组织/血浆分配系数 (Kp(brain/plasma))，表明它可以穿过血脑屏障并在大脑中积累。同时，小鼠急性毒性实验表明，单次口服给药剂量高达500 mg/kg时，未导致小鼠死亡，也没有引起体重或主要器官重量的显著变化。 图3：化合物32对Tau (P301L) 293T细胞 (A) 和SH-SY5Y细胞 (B)中p-Tau Thr212/总Tau比率的影响；(C) 化合物32对Tau (P301L) 293T细胞中活性P301L-hTau单体表达的影响; (D)SH-SY5Y细胞中化合物32处理后DYRK1A的蛋白稳定性。 最后，为评估化合物32在体内抑制Tau磷酸化的潜力，研究者建立了Okadaic acid (OA) 诱导的AD小鼠模型，通过OA 引发认知功能障碍，并采用莫里斯水迷宫测试分析化合物32对学习和记忆功能障碍的改善效果。结果表明，化合物32显著改善了小鼠的认知功能障碍，其效果与剂量呈正相关。此外，化合物32显著降低了小鼠海马和颞叶皮层中p-Tau Thr212的表达，并减少了OA引起的海马神经元损伤 (图4)。这些结果表明，化合物32作为一种新型选择性DYRK1A抑制剂，具有潜力成为抗AD药物。 图4： (A) 在为期三天的可见平台预训练中，对所有小鼠的运动能力进行了评估，以排除游泳速度存在显著差异的小鼠；(B) 化合物32处理的AD小鼠在隐形平台测试中的逃避潜伏期; (C)通过Nissl染色检测小鼠海马CA1区和齿状回 (DG) 区域中Nissl阳性细胞的表达情况; (D) 通过免疫组织化学染色检测小鼠海马CA1区和DG区域中p-Tau Thr212的阳性表达情况。 总结 总之，作者通过合理的结构优化鉴定出一种有效的DYRK1A抑制剂化合物32 (ZJCK-6-46)，其IC50为0.68 nM，具有良好的激酶选择性和适中的代谢稳定性。化合物32能有效穿透血脑屏障，降低Tau蛋白磷酸化，并在OA诱导的小鼠模型中显著改善认知功能，同时表现出较低的急性毒性和肝肾损伤风险。然而，它对CLK家族中的CLK1和CLK4有一定的抑制作用，并可能受到P-糖蛋白的外排影响。未来需要进一步研究其在阿尔茨海默病治疗中的应用潜力，并解决相关问题。 参考文献 【1】Chen, H.; Gao, X.; Li, X.; Yu, C.; Liu, W.; Qiu, J.; Liu, W.; Geng, H.; Zheng, F.; Gong, H.; Xu, Z.; Jia, J.; Zhao, Q. Discovery of ZJCK-6-46: A Potent, Selective, and Orally Available Dual-Specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A Inhibitor for the Treatment of Alzheimer’s Disease. J. Med. Chem. 2024, 67, 1234–1245. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.1c00123. 【2】Gourdain, S.; Dairou, J.; Denhez, C.; Bui, L. C.; Rodrigues-Lima, F.; Janel, N.; Delabar, J. M.; Cariou, K.; Dodd, R. H. Development of DANDYs, New 3,5-Diaryl-7-azaindoles Demonstrating Potent DYRK1A Kinase Inhibitory Activity. J. Med. Chem. 2013, 56, 9569–9585.  DOI: 10.1021/jm401049v. 【3】Chaikuad, A.; Diharce, J.; Schröder, M.; Foucourt, A.; Leblond, B.; Casagrande, A.-S.; Désiré, L.; Bonnet, P.; Knapp, S.; Besson, T. An Unusual Binding Model of the Methyl 9-Anilinothiazolo[5,4-f] quinazoline-2-carbimidates (EHT 1610 and EHT 5372) Confers High Selectivity for Dual-Specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinases. J. Med. Chem. 2016, 59, 10315–10321. DOI: 10.1021/acs.jmedchem.6b01083 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

研发进展推介、博士后招聘联系公众号（备注：单位+姓名） 2024年3月18日，李志裕教授等人在Journal of Medicinal Chemistry 上发表了题为Structure-Guided Discovery of Potent and Selective CLK2 Inhibitors for the Treatment of Knee Osteoarthritis的文章，在这篇文章中，作者等人设计并合成了一系列高效的基于吲唑类化合物的CLK2抑制剂，其中化合物LQ23对CLK2的抑制活性高于先导化合物(IC50=1.4 nM)，具有较高的CLK2/CLK3选择性(>70倍)。此外，LQ23在体内外均有显著的抗骨关节炎作用，其作用机制可能是通过抑制CLK2/Wnt信号通路，降低炎症细胞因子，下调软骨降解酶，增加关节软骨。总体而言，这些数据支持LQ23作为膝关节内OA治疗的潜在候选者，利用其独特的作用机制进行靶向治疗。骨关节炎是一种典型的退行性疾病，传统上具有不同的病因，但具有相似的生物学、形态学和临床特征。在各种类型的骨性关节炎中，膝关节骨性关节炎的发病率尤其高。骨性关节炎的疼痛和残疾严重影响患者的生活质量，已成为当今社会严重的社会和经济负担之一。目前，骨性关节炎的治疗相对有限，主要集中在抗炎药物上。然而，消炎药并不能修复软骨。因此，对治疗疾病的骨性关节炎药物(DMOADs)的需求尚未得到满足。DMOADs不仅具有抗炎作用，还可通过促进软骨细胞再生和抑制软骨分解代谢来减轻软骨损伤。研究表明Wnt信号在骨性关节炎发病机制中的核心作用，许多与Wnt途径相关的新的生物学过程和靶点已被发现。在这些靶点中，酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶CLKs被报道通过调节细胞内信号来调节Wnt途径。基于CLK2在退行性疾病和肿瘤中的重要作用，研究机构相继设计了许多不同类型的CLK2抑制剂。目前，有五种药物正在进行临床试验，用于治疗退行性疾病和肿瘤。2018年，J.Kallen的团队报告了一系列有效的吲唑类CLK抑制剂的发现。确定了吲唑1是一种高效的吲唑CLK抑制剂，作为先导化合物。随后，作者等人引入了芳香族乙炔基团，合成了一系列新型的CLK2抑制剂。在这些抑制剂中，LQ23(CLK2，IC50=1.4 nM)表现出显著的CLK2抑制活性。并且LQ23对CLK1/2/4(CLK1，IC50=2.1 nM；CLK2，IC50=1.4 nM；CLK4，IC50=3.2 nM)显示出更高的抑制效力。此外，LQ23对CLK2的选择性高于CLK3(IC50>100 nm)。随后作者等人进一步证实LQ23对蛋白激酶的选择性，结果表明化合物LQ23是一种很好的选择性CLK2抑制剂。（图1）图1 (A)化合物LQ23对CLK2、CLK3和DYRK1A的抑制活性。(B) pSRSF4、pSRSF5和pSRSF6在二甲亚砜(DMSO)或Lorecivivint (30 nM)或LQ23(10、30和100 nM)处理1小时后的蛋白表达情况。(C) pSRSF4、pSRSF5和pSRSF6在转染靶向CLK2的siRNA的软骨细胞中的蛋白表达情况接下来，作者等人评估了LQ23在体外诱导软骨细胞早期分化的能力。据报道，转化生长因子β3可刺激骨髓间充质干细胞分化为高度特异的软骨细胞。结果表明LQ23可诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞样细胞(图2A)。此外，在单层条件下用LQ23处理14天的BMSCs表明软骨细胞正在分化，这是由成熟软骨细胞特异性蛋白(II型胶原，Col IIA)的存在支持的(图2B)。提示LQ23可促进BMSCs向软骨细胞分化。图2 LQ23诱导骨髓间充质干细胞的软骨细胞分化。(A)骨髓间质干细胞(用30 nM LQ23或DMSO或20 ng/mL TGF β3处理14天)用甲苯胺蓝和阿利新蓝染色。(B)骨髓间充质干细胞(用30 nM LQ23或DMSO或20 ng/mL TGF β3处理14天)用Col IIA染色，显示成熟软骨细胞除促进软骨再生外，骨性关节炎的长期疾病治疗还需要抑制软骨的降解。因此，作者等人还评估了LQ23对软骨细胞和骨髓间充质干细胞在病理生理条件下的分解代谢的影响。当肿瘤坏死因子TNF-α(20 ng/m L)和肿瘤抑素M(OM，10 ng/m L)处理时，软骨细胞和骨髓间充质干细胞MMP3、MMP13和ADAMTS5的基因表达上调(图3A，B)。LQ23(30 NM)可显著抑制细胞因子诱导的基质降解酶的表达，包括MMP3、MMP13和ADAMTS5(图3A，B)，其效力与Lorecivivint(30 nM)相似或提高。LQ23治疗组与模型组比较，NO释放量明显减少。提示LQ23在体外对软骨降解有抑制作用。图3 LQ23保护软骨细胞和骨髓间充质干细胞免受体外分解代谢破坏。细胞因子TNF-α (20 ng/mL)和Oncostatin M (10 ng/mL)刺激软骨细胞和骨髓间充质干细胞，DMSO或Lorecivivint (30 nM)或LQ23 (30 nM)处理72 h如图4所示，LQ23和Lorecivivint均能有效抑制肿瘤坏死因子TNF-α、IL-6和IL-β在TNF-α和OM刺激的软骨细胞中的表达。同时，LQ23的抑制作用与siCLK2一致。体外实验表明，LQ23具有与Lorecivivint相当的抗炎活性。随后，在TNF-α和OM刺激的软骨细胞中，观察了LQ23对STAT3的影响。当用TNF-α和OM处理软骨细胞时，Western Blot检测到STAT3的磷酸化水平显著升高(图5)，而LQ23则呈剂量依赖性地抑制STAT3的磷酸化。提示LQ23具有较强的体外抗炎作用。图4 LQ23抑制软骨细胞的炎症反应。用细胞因子TNF-α (20 ng/mL)和Oncostatin M (10 ng/mL)刺激软骨细胞，用DMSO或Lorecivivint (30 nM)或LQ23 (30 nM)处理48 h。用qRT-PCR检测细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的基因表达图5 LQ23剂量依赖性地抑制TNF-α和OM刺激的软骨细胞中STAT3磷酸化。(A) Western blot检测TNF-α和OM刺激软骨细胞中磷酸化和总STAT3蛋白表达水平。(B)通过三次独立实验定量测定pSTAT3和STAT3的比例半月板损伤常见于膝关节骨性关节炎的MRI图像，可导致膝关节骨性关节炎。然而，修复半月板损伤的努力在很大程度上并不成功，也未能阻止导致膝关节骨性关节炎的退行性改变的进展。在大鼠炎性半月板损伤模型和大鼠前交叉韧带切断内侧半月板部分切除(ACLT+pMMx)模型上，采用生化和组织病理学方法观察LQ23对软骨再生和保护的影响。MIA可引起局部炎症、软骨退变和关节疼痛增加，或LQ23(1.5μg/kg，单次IA注射)可降低血浆中炎症细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)水平和软骨中分解代谢酶(MMP3、MMP13和ADAMTS5)水平。此外，与OA疾病严重程度相关的循环COMP水平在LQ23治疗的大鼠中自治疗后第11天起显著降低。LQ23在治疗后28天仍有效(图6A，B)。第28天苏木精-伊红(H&E)染色显示，LQ23治疗组关节形态明显改善。经LQ23治疗后，关节软骨表面光滑，细胞排列更规则，滑膜厚度减少，股骨与胫骨间隙增大(图6C)。而Lorecivivint或LQ23治疗显著降低了光镜下软骨检测评价标准OARSI评分51(图6D)，提示LQ23抑制炎症，保护软骨。图6 LQ23在碘乙酸钠(MIA)诱导的大鼠膝关节OA模型中抑制炎症，保护软骨，改善功能。注射mia的大鼠经IA注射给药后，分别给药整车或Lorecivivint (1.5μg/kg)或LQ23 (1.5μg/kg)。软骨和血浆分别于第11天和第28天采集综上所述， CLK2是开发DMOAD药物的一个与Wnt途径相关的有前景的靶点。作者团队发现了一系列新的化合物，确定了具有代表性的化合物LQ23，该化合物对CLK2具有较强的抑制活性，IC50为1.4 nM，且比CLK3具有更高的选择性。LQ23还可诱导BMSCs向软骨细胞分化。在体外，LQ23还能降低细胞因子诱导的NO生成和体内循环COMP水平，这表明LQ23可以预防OA病理条件下的基质分解。体内药代动力学数据和受试化合物在体外人体细胞中的有效性证明了LQ23的药物设计理论是合理的。这些发现强调了LQ23作为一种小分子潜在的DMOAD的前景，用于膝骨性关节炎的有效治疗。原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.3c02092声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓