PIM2

PIM Kinases have emerged as promising therapeutic targets for cancer treatment, offering new avenues for the development of targeted therapies aimed at combating tumor growth and progression. As key regulators of cell survival and proliferation, dysregulated PIM kinase signaling plays a critical role in oncogenesis, making them attractive targets for intervention in various cancer types. The exploration of PIM kinases as therapeutic targets represents a significant advancement in the field of precision medicine, with the potential to improve patient outcomes and overcome resistance to conventional cancer treatments. PIM kinases belong to a family of serine/threonine protein kinases comprising thee isoforms – PIM-1, PIM-2 and PIM-3. These kinases are involved in multiple signaling pathways implicated in cancer development, and progression, including cell cycle regulation, apoptosis and cellular metabolism. Aberrant activation of PIM kinases have been observed in a wide range of cancer types where they promote tumor cell survival, proliferation and resistance to apoptosis. Additionally, PIM kinases have been associated with poor prognosis and treatment resistance in cancer patients, underscoring their significant as potential therapeutic targets. Download Insight: The dysregulated expression and activity of PIM kinases in cancer cells make them attractive targets for therapeutic interventions. By selectively inhibiting PIM kinase activity, it is possible to disrupt key signaling pathways involved in tumor growth and survival, thereby inhibiting cancer cells proliferation and inducing cell death. Moreover, targeting PIM kinases offers the potential to overcome resistance to conventional cancer therapies, such as chemotherapy and targeted therapies, by targeting alternative survival pathways utilized by cancer cells. Preclinical studies have provided compelling evidence supporting the efficacy of PIM kinase inhibitors like AZD1208, SGI-1776 and LGH447 in inhibiting tumor growth and enhancing the sensitivity of cancer cells to chemotherapy and targeted therapies. In various cancer models, including leukemia, lymphoma, myeloma and prostate cancer, PIM kinase inhibitors have demonstrated potent anticancer activity and favorable safety pro These promising preclinical findings have paved the way for the evaluation in PIM kinase inhibitors in clinical trials. Clinical trials evaluating the safety and efficacy of PIM kinase inhibitors in cancer patients are underway, with encouraging preliminary findings reported in some studies. While challenges, such as dose-limiting toxicities and patient selection criteria need to be addressed, early clinical data suggests that PIM kinase inhibitors have the potential to be valuable addition to cancer treatment repertoire. Continued research efforts are focused on optimizing dosing regiments, identifying predictive biomarkers, and exploring combination therapies to maximize the therapeutic benefits of PIM kinase targeting therapies. The global market of PIM kinase targeted therapies have also witnessed some collaborations and license agreement coming to light, presenting the determination of researchers to bring these therapies into the clinical. Examples include the license agreement that Inflection Biosciences signed with AUM Biosciences to conduct the development of IBL-302, also known as AUM302, a first-in-class triple inhibitor of pan-PIM, pan-PI3K and mTOR kinases, presently in IND-enabling trials for neuroblastoma and cancers with PI3KCA mutations. Additionally, AUM302 was granted the Rare Pediatric Disease Designation from the FDA in January 2023 for the treatment of neuroblastoma, which came right after the agency designated it as an orphan drug for the same indication in November 2022. These designations signify recognition of its anticancer activities in neuroblastoma, presenting it as a promising clinical candidate to treat this rare cancer type. Looking into the future, the prospects of PIM kinase targeted therapies market for cancer looks promising, with ongoing research aimed at refining treatment strategies and expanding the therapeutic range. Advances in drug discovery technologies are facilitating the development of next-generation PIM kinase inhibitors with improved potency, selectivity and pharmacokinetic properties. Additionally, the identification of biomarkers predictive of response to PIM kinase inhibitors may enable more personalized treatment schedules, enhancing clinical outcomes and minimizing adverse effects. Furthermore, exploring the potential of combination therapies involving PIM Kinase inhibitors with other targeted agents, immunotherapies, conventional chemotherapy or radiation therapy holds promise for overcoming resistance mechanisms and improving treatment efficacy. Collaborative efforts between universities, hospitals and cancer research centers will be essential to advance the clinical development of PIM kinase inhibitors. In conclusion, PIM kinase targeted therapies represent attractive therapeutic targets for cancer treatment, offering the potential to disrupt key cancer signaling processes. Preclinical and early clinical data support the efficacy of PIM kinase inhibitors in inhibiting tumor growth and enhancing treatment response in various cancer types, primarily hematological cancers. With research underway for optimizing the dosing and treatment strategies, PIM kinase targeted therapies are poised to transform the landscape of cancer treatment.

▲8月15-16日 NDC2024生物医药创新者峰会 扫码立即报名  注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表平台立场。任何文章转载需得到授权。 意大利作为欧洲生物医药制造传统强国，在制药领域具有独特的技术、产品和庞大的研发体系，尤其是在抗肿瘤、抗精神病等药物的制造技术与产品在国际处于领先地位。2018年意大利正式赶超德国成为欧盟最大的制药国，产业规模达312亿欧元（德国300亿欧元），占全球医药市场份额约3%。Menarini集团作为意大利最大的医药企业，在欧洲制药公司中更是位居前列，同时还是全球TOP50的药企。 药融云数据库：公司基本信息 从药融云数据库获悉，成立于1886年的Menarini是意大利一家专注于心血管疾病、炎症镇痛、胃肠道疾病、肿瘤和代谢疾病的制药公司，总部设在佛罗伦萨，2022年统计的全球范围内员工高达17700多名，9个研发中心，且其附属公司、分销商和特许经营公司遍布全球140个国家。公司旗下有三个部门，分别是Menarini Ricerche，Menarini Biotech和Menarini Diagnostics。其中，Menarini Ricerche美纳里尼研究中心负责从新项目的创建到药物注册的所有研发活动；Menarini Biotech美纳里尼生物科技专注于心血管疾病、炎症镇痛、胃肠道疾病、肿瘤和代谢性疾病领域；Menarini Diagnostics美纳里尼诊断拥有遍布全球的附属合作伙伴和分销网络，专注于糖尿病、血液学、临床化学、尿液分析和免疫学，为专业医疗人员提供医疗诊断所需的科技方案。  自20世纪九十年代以来，Menarini迅速扩展了国际业务，1992年通过收购Berlin-Chemie进入德国和中东欧市场；2011年收购英维达（Invida）集团，巩固Menarini在亚太市场的地位；2020年通过收购生物制药公司Stemline Therapeutics进入美国肿瘤市场。Menarini并未上市，所以无法评估其市值，根据官网披露的信息，公司2022年度收入41.55亿欧元，分品类来看，药品类营收高达94%，5%的营收来自诊断学，其余营收来自其他业务。 专注肿瘤学和传染学 Menarini重点关注肿瘤学和传染学，其产品线专注于创新药物和技术，包括用于血液肿瘤和实体瘤的小分子和生物制剂。同时还投资于诊断学，以开发高速和高精度的仪器，用于临床化学、糖尿病、免疫学、血液学、组织学和即时护理等各个领域的诊断。 01 肿瘤学 Menarini能够识别和开发专门针对肿瘤独特分子或遗传特征的癌症治疗方法，从而为患者提供更高的疗效、更高的安全性，从而获得更好的预后。 1、Tagraxofusp（获批商品名：Elzonris）是一种静脉注射的CD123定向细胞毒素，2018年获批用于治疗成人和2岁以上儿童BPDCN（母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤）患者，是首个获批治疗BPDCN的药物，同时也是首个获批的CD123靶向药物。最早由Stemline Therapeutics研发，2020年Menarini收购该公司后获得该产品。在欧洲，2021年1月，EMA批准Tagraxofusp作为成人BPDCN患者一线治疗的单药疗法。 CD123是存在于多种恶性肿瘤中的靶点，包括BPDCN，它包含重组融合到截短的白喉毒素（DT）有效载荷的人IL-3，经过工程改造，使得IL-3取代天然DT受体结合结构域。Tagraxofusp的IL-3结构域将细胞毒性DT有效载荷引导至表达CD123的细胞。内化后，Tagraxofusp不可逆地抑制蛋白质合成并诱导靶细胞凋亡。Elzonris的上市是BPDCN患者临床治疗向前迈出的重要一步，CD123在BPDCN和许多其他血液恶性肿瘤中表达，Elzonris是一种CD123靶向疗法，该药的批准将为BPDCN患者提供一种新的护理标准。Tagraxofusp目前针对急性髓系白血病、慢性粒单核细胞白血病和骨髓纤维化的研究进行到临床试验2期。 2、2023年1月，FDA批准Elacestrant（Orserdu）用于既往接受过至少一线内分泌治疗后疾病进展的ER+、HER2-、ESR1突变的绝经后女性或成年男性晚期或转移性乳腺癌患者。在美国和欧洲由Menarini的全资子公司Stemline Therapeutics将Orserdu商业化，这也是FDA批准的首个口服SERD（选择性雌激素受体降解剂），在此之前，阿斯利康的氟维司群(fulvestrant)是唯一获批上市的SERD靶向药，但是只能肌肉注射。 Elacestrant 是一种选择性雌激素受体降解剂（SERD），经评估可作为雌激素受体阳性 （ER+）/HER2-晚期或转移性乳腺癌患者的每日一次口服治疗，也在转移性乳腺癌疾病的几项临床试验中进行研究，单独或与其他疗法联合使用。ELCIN是一项评估elacestrant对雌激素受体阳性（ER+）、人表皮生长因子受体-2阴性（HER2-）晚期/转移性乳腺癌患者疗效的临床试验2期研究，这些患者既往接受过一种或两种激素治疗，且既往未接受过细胞周期蛋白依赖性激酶靶向酶CDK4和CDK6抑制剂（CDK4/6I）治疗。 ELEVATE是一项临床试验1b/2期研究，评估elacestrant联合PI3K/AKT/mTOR通路抑制剂（alpelisib和依维莫司）和细胞周期通路抑制剂（palbociclib、abemaciclib和ribociclib）的安全性和有效性。2023年12月发布的报告结果显示这些疗法与之前研究一致的可预测安全性。目前正在评估药代动力学并确定每种组合的推荐临床试验2期剂量。 ELECTRA正在评估elacestrant联合abemaciclib治疗ER+、HER2-乳腺癌患者，临床试验1b期研究将确定该组合在患者中的推荐临床试验2期剂量，而不考虑转移部位。临床试验2期研究将评估该组合在患有ER+/HER2-晚期或转移性乳腺癌伴有脑转移的患者中的益处，因为这两种化合物都已证明具有穿过血脑屏障的能力。2023年12月报告的结果包括临床试验1b期的三个剂量队列，三个队列已经完成且没有患者出现剂量限制性毒性。 3、Nexpovio（塞利尼索）于2019年获得FDA批准，用于治疗患有复发性难治性多发性骨髓瘤（RRMM）的成年患者，这些患者之前接受过至少四种治疗，并且其疾病对其他几种形式的治疗具有耐药性。EMA于2021年3月在欧洲批准Nexpovio与以下药物联合治疗：（1）硼替佐米和地塞米松用于治疗至少接受过一种既往治疗和联合治疗的成年多发性骨髓瘤患者。（2）地塞米松用于治疗成人多发性骨髓瘤患者，这些患者既往接受过至少四种治疗，并且其疾病对至少两种蛋白酶体抑制剂、两种免疫调节剂和一种抗CD38单克隆抗体无效，并且在最后一次治疗中显示出疾病进展。 药融云数据库：药品基本信息 Nexpovio 是一种核输出蛋白1（XPO1）抑制剂。XPO1可将多种蛋白质从细胞核转运到细胞质，包括肿瘤抑制因子、癌基因和参与控制细胞生长的蛋白质，它经常被过度表达，其功能在几种类型的癌症中失调。通过抑制XPO1蛋白，肿瘤抑制蛋白在恶性细胞的细胞核中积聚，并降低驱动细胞增殖的致癌基因产物的水平，这最终导致细胞周期停滞和癌细胞凋亡而死亡。 4、SL-701是一种现成的全身（皮下）免疫疗法，旨在指导免疫系统攻击某些恶性肿瘤（包括脑癌）的靶点。由三个短肽（IL-13Rα2、EphA2和Survivin）组成，靶向胶质瘤相关抗原并设计用于产生抗原特异性CD8+T细胞应答。目前正在研究SL-701用于治疗复发性多形性胶质母细胞瘤，该研究进行到临床试验2期。 5、MEN1703是靶向PIM（PIM1、PIM2、PIM3）和FLT3激酶的双激酶抑制剂。FLT3内部串联重复（FLT3-ITD）是急性髓系白血病（AML）患者最常见的遗传病变之一，与预后不良相关。PIM激酶被认为是FLT3抑制剂耐药表型的主要驱动因素之一，它们在复发样本中的抑制作用恢复了细胞对FLT3抑制剂的敏感性。MEN1703的活性谱也保证了在AML患者中进行化合物研究，而不考虑FLT3畸变。目前正在研究MEN1703作为成人复发性/难治性AML患者的潜在治疗药物，该研究进行到临床试验2 期。 6、MEN1611是一种有效的、选择性的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂，具有新颖的化学结构，靶向α、β和γ异构体，同时保留δ异构体。PI3K/Akt通路调节多种细胞过程，如增殖、生长、凋亡和细胞骨架重排，各种类型的癌症被认为对PI3K/Akt通路信号传导“上瘾”，因此抑制PI3K是对抗癌症的有效治疗策略。 目前正在研究MEN1611作为PIK3CA突变、K-RAS、N-RAS和B-RAF野生型转移性结直肠癌患者的潜在治疗方法，这些患者对伊立替康、奥沙利铂、5-FU和含抗EGFR的治疗方案无反应。也在研究MEN1611作为PIK3CA突变、HER2阳性、晚期或转移性乳腺癌患者的潜在治疗方法，这些患者基于抗HER2的治疗无反应。 7、MEN1309是一种ADC，由全人源IgG1抗体通过可裂解的连接子与细胞毒性剂（美登素衍生物，DM4）偶联而成，具有抗肿瘤活性，目前正在研究作为实体瘤患者的潜在治疗方法。靶抗原CD205在多种实体癌细胞和血液癌细胞中高度表达，一旦MEN1309结合其靶标，MEN1309/CD205复合物在抗原表达细胞中快速内化，在那里它可以发挥其细胞毒性活性。 8、FELEZONEXOR（SL-801）是一种新型的口服小分子可逆XPO1抑制剂，目前正在开发作为实体瘤患者的潜在治疗方法。 9、SL-901是一种口服小分子PI3K和DNA-PK抑制剂，已证明对PI3Kα/δ和PIK3C2β具有活性。SL-901已显示出针对多种肿瘤类型的临床前活性，目前正在进行针对实体瘤患者的研究进行到临床试验1期。 10、2024年1月5日，美纳里尼集团与其全资子公司Stemline Therapeutics，和临床阶段的人工智能（AI）驱动的生物科技公司英矽智能达成一项授权许可协议。美纳里尼将获得ISM5043的全球独家开发和商业化权益，这是由英矽智能人工智能平台辅助设计和开发的一种靶向KAT6的新型小分子抑制剂，有望被用于ER+/HER2-乳腺癌和其他癌症的治疗。 02 抗感染药物 Meropenem+Vaborbactam（美罗培南+韦博巴坦）是碳青霉烯类和新型硼酸β-内酰胺酶抑制剂A类和C类丝氨酸β-内酰胺酶的固定剂量组合，专门用于抑制耐碳青霉烯类肠杆菌（CRE），包括产生肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）的细菌。美罗培南通过抑制必需青霉素结合蛋白（PBPs）的活性而抑制肽聚糖细胞壁合成，从而发挥杀菌活性。韦博巴坦与β-内酰胺酶形成共价加合物，对β-内酰胺酶介导的水解稳定。美罗培南/韦博巴坦已被美国和欧盟批准用于治疗复杂尿路感染（cUTI），包括急性肾盂肾炎。在欧洲，它也被批准用于治疗复杂的腹腔内感染（cIAI）和医院获得性细菌性肺炎（HABP），如呼吸机相关细菌性肺炎（VABP）。 德拉沙星是一种阴离子氟喹诺酮类药物（FQ），与其他氟喹诺酮类药物相比，具有更好的特性和安全性。它通过平衡抑制细菌DNA复制、转录、修复和重组所需的细菌拓扑异构酶IV和DNA回旋酶（拓扑异构酶II）发挥作用。目前已在美国和欧盟获批用于治疗成人急性细菌性皮肤和皮肤结构感染（ABSSSI）；在美国用获批于治疗社区获得性细菌性肺炎（CABP）；2021年4月，在欧盟被批准用于治疗CABP。 奥利万星是一种半合成的糖肽类抗生素，其半衰期较长，可在3小时内静脉滴注单剂量（1200 mg）。它有三种作用机制：（1）通过与肽聚糖前体的茎肽结合，抑制细胞壁生物合成的转糖基化（聚合）步骤；（2）通过与细胞壁的肽桥接片段结合，抑制细胞壁生物合成的转肽（交联）步骤；（3）破坏细菌膜完整性，导致去极化、透化和快速细胞死亡。目前已在美国和欧盟获得批准，用于治疗成人急性细菌性皮肤和皮肤结构感染（ABSSSI），同时也在开发一种新的奥利万星制剂，新型制剂有利于药物溶液的重组，并可在更短的时间内给药。 在国内有多款产品获批 2023年6月底，Menarini旗下第二代非镇静性的长效抗组胺药物力敏能（比拉斯汀片）获国家药品监督管理局（NMPA）批准上市。进入中国市场十余年，Menarini在中国医药市场的份额逐年增加，在多个治疗领域收到了广泛的认可和应用。同时Menarini也在不断加大对中国市场的投资力度，将创新药物引入中国，在华布局产品管线涵盖多个领域，在未来相信其可以更好的挖掘中国市场发展潜力。 图源：国家药品监督管理局 参考： NMPA/CDE； 药融云数据，www.pharnexcloud.com； FDA/EMA/PMDA； 相关公司公开披露（除标注外，正文图片均来自企业官网）； https://www.menarini.com/en-us/； https://finance.sina.com.cn/roll/2023-08-18/doc-imzhqzti6005039.shtml； https://www.mordorintelligence.com/zh-CN/industry-reports/italy-pharmaceutical-market； https://mp.weixin.qq.com/s/PNPVIwdboRzwcou3of_vjg； https://mp.weixin.qq.com/s/niAR84Wx7z0EwZZK8xvYNw；等等。 【关于药融圈】 药融圈PRHub旨在帮助生物医药科技型企业进行品牌推广及商务拓展服务，针对客户的真实需求制定系统化解决方案，通过“翻译-降维-场景化”将客户的品牌信息以直白易懂的方式被公众知悉，同时在流量渠道覆盖100万+垂直用户基础上实现合作目的，帮助合作伙伴完成从品牌开始到商务为终的闭环营销服务。我们已经完成了数十场线下1000人规模的生物医药研发类会议，涵盖小分子新药，大分子新药，改良型新药，BD跨境交易等多个领域，服务了百余家上市/独角兽/生物技术/制药企业。

近日，在nature communications杂志上发表了题为“Predicting locations of crytic pockets from single protein structures using the PocketMiner graph neural network"的文章，ProcketMiner模型将人类单一结构域蛋白质可能形成口袋的比例从52.1%扩大到了80%以上。作者开发了一个图神经网络PocketMiner工具，可以预测分子动力学模拟中口袋可能打开的位置。将PocketMiner应用于来自39个经过实验确认的隐蔽口袋的数据集中，表明它能准确识别隐蔽口袋(ROC-AUC:0.87)，比现有方法快1000倍以上。作者[1]系统评估了分子动力学模拟是否概括了已知的隐蔽口袋；[2] 验证了给定起始结构，可以预测在MD模拟期间该结构中将在何处形成隐蔽口袋；[3] GVP-GNN同时准确预测了模拟中和实验结构中隐蔽口袋形成的位置；[4] 并用该模型将人类单一结构域蛋白质可能形成口袋的比例从52.1%扩大到了80%以上。代码：https://github.com/Mickdub/gvp/tree/pocket_pred网页版：https://pocketminer.azurewebsites.net/大多数隐蔽口袋是通过筛选抑制剂和解决结构中的hit而偶然发现的。另外一种是用分子动力学模拟发现的，模拟提供了蛋白质在溶液中采用的原子级别详细结构集合，通常揭示了可以药物设计模板的隐蔽口袋。然而，MD计算成本太高，无法筛选大量靶点寻找隐蔽口袋。CryptoSite是监督机器学习算法的一个杰出代表，它以蛋白质结构作为输入，预测配体结合的隐蔽口袋。CryptoSite经过训练可以识别氨基酸残基，即使相对较小的数据集，CryptoSite也能在分类氨基酸残基是否会参与隐蔽口袋方面实现了良好的准确度(ROC-AUC=0.83)。输入特征来如果来自模拟数据的情况下，实现这种性能需要大约1天的时间来运行单个蛋白质。如果不使用模拟数据的话，会降低预测性能为(ROC-AUC=0.74)。A. 蛋白质平衡态下的不同结构，包括实验衍生的缺乏隐蔽口袋的结构(左边，PDB ID 1JWP)和具有打开隐蔽口袋的结构(右，PDB ID 1PZO)。隐蔽口袋内测的残基以红色条显示。B. PocketMiner依靠一些列信息传递在残基之间交换西信息并生成可以预测隐蔽口袋形成的位置编码。在左侧，显示了几何向量感知机(GVP)层转换后输入到输入图中的结构特征。节点特征包括backbone的二面角以及以及正向和反向单位向量。边的特征包括残基之间距离的径向基编码和它们之间的alpha-碳之间的单位向量。在中间，展示了输入图如何通过消息传递层进行转换，这些消息传递层会根据其邻居的节点嵌入及其边嵌入影响残基的嵌入。在右侧，展示了输入图中的节点嵌入用于预测另一个GVP变换后的隐蔽口袋的似然。在右下角展示了对A中所示蛋白质理想化的预测。01 已知的隐蔽口袋在模拟中迅速open很少有研究系统地评估分子动力学模拟是否概括了已知的隐蔽口袋。作者对MD发现隐蔽口袋的能力进行了系统评估。同时也可以作为机器学习模型的训练数据。作者对已知apo或无配体起始结构的16中蛋白质进行了无偏自适应采样MD模拟，其中11对具有配体结合残基，这些残基在apo结构中比在holo结构中靠的更近(即，它们需要打开运动才能形成口袋)。对于每种蛋白质，使用特定特征的FAST算法运行了2us的自适应采样模拟。具体来说，从apo结构发起了10次并行模拟，然后构建了马尔可夫状态模型(MSM)的构象集合和优先结构用于下一轮模拟(即，优先考虑具有大口袋的状态)。此过程重复四次以生成5个“swarms”模拟，每个模拟包含400ns的聚合模拟(10个模拟长度为40ns)。令人惊讶的是，发现绝大多数隐蔽口袋仅在40ns的10次并行模拟中打开。如果模拟结构的口袋体积达到或超过holo晶体结构口袋的体积，则口袋被认为是open。作者还发现模拟中形成的隐蔽口袋主要位于已知的配体结合隐蔽位点，最大的口袋体积变化发生在配体结合位点。总而言之，观察到的快速的口袋打开表明，对于大多数较小的蛋白质，适量的模拟数据可能足以发现隐蔽的口袋。此外，这一发现表明，经过训练以预测小模拟时间窗口(即40ns)内隐蔽口袋形成的机器学习模型也能够识别无配体实验结构中的隐蔽位点。图2 从Closed apo结构开始的模拟中，隐蔽口袋迅速打开AMPA受体蛋白GluR2亚基在Apo(灰色，PDB：1MYO)和Holo(蓝色，PDB：1N0T)构象中的结构叠加表明，环和螺旋必须移动才能形成隐蔽的口袋。B来自MD模拟的结构从Closed的apo构象开始，在结合位点有一个口袋，其体积超过holo结合位点口袋(橙色)。在模拟AMPA受体的GluR2亚基时，C. MSM加权小提琴图表明配体结合位点超过了holo中看到的体积，仅10个平行模拟，每个模拟40ns。通过将每个Ligsite网格点分配给最近的单个残基并将分配给所有隐蔽口袋残基的体积相加来计算隐蔽口袋体积。灰色”X“表示apo结合位点隐蔽口袋体积，蓝色表示holo体积，黑点表示每一轮模拟所有帧的MSM加权平均体积。D. MSM加权的15种不同蛋白质模拟的隐蔽口袋体积分布表明，即使10次短模拟通常也足以达到holo结构的隐蔽口袋体积。作为holo的一部分口袋体积分布10次短模拟的体积以橙色显示，而5轮自适应采样分布以白色显示。02 图神经网络准确预测模拟中口袋的时间演化给定起始结构，可以预测在MD模拟期间该结构中将在何处形成隐蔽口袋。尽管MD模拟时随机的，并且从同一结构出发的两个模拟不会遵循完全相同的时间演化，作者通过Ligsite算法模拟每个结构的口袋体积，验证了同一起始结构启动的40ns模拟产生相似的标签，绝大多数残基始终打开或始终保持关闭。即足够长的模拟将对相似的口袋opening event采样。37种蛋白和2400个长度至少40ns的独立MD模拟，根据每个40ns窗口的起始结构中的每个残基在接下来的40ns模拟中是否在任何时候参与一个隐蔽口袋来生成标签(图A)。训练的GVP-GNN和3D-CNN都学会了根据起始结构准确地分类给定地残基是否会在模拟中形成一个隐蔽的口袋。图神经网络在新模拟中准确预测了口袋的形成的位置A. 使用MD模拟通过跟踪隐蔽口袋(以红色显示)形成的位置来生成训练标签。如果在模拟中的任何一点残基附近形成了一个隐蔽的口袋，则残基被标记为正例(以青色显示)。作为说明，作者展示了TEM β-内酰胺酶蛋白，它在单个MD模拟中在两个独立的位点(即horn口袋和omega loop口袋)形成隐蔽口袋。每个open事件都将附近的残基标记为正例，因此该窗口的训练标签反映了两个open事件，每个口袋周围的残基都被标记为正例。然后将起始结构送到图神经网络，预测隐蔽口袋将在何处形成。B. Precision-recall curves C. Receiver operating curves当给定蛋白质的天然折叠状态结构时，无需计算中间状体(例如，使用MD模拟)就可以识别隐蔽口袋形成的位点。03 隐蔽的口袋数据集揭示了forward和reverse的motion作者评估了模型从实验验证的配体结合隐蔽口袋中检测出隐蔽口袋形成位点的能力。作者发现许多口袋是通过closing motions形成的，而不是opening motion形成的。对于这些"reverse" 口袋，结构元素开始时相距很远，因此在apo结构中几乎没有口袋，但聚集在一起形成lid或wall，形成一个配体可以在其中结合的空腔[图D]。大多数口袋主要由单一类型的motion形成。在forward和reverse的口袋中，观察到四种常见的结构重排。loops可以分开以为进入的配体创造空间，或夹紧在配体上方形成壁(wall)或盖子(lid)(图A)，其次，二级结构元素可以通过平移和/或旋转移动(图B)。第三，二级结构元素可以改变或形成loops(图C)。第四，域间motions可以为配体结合创造空间(图D)。图4. PocketMiner的验证数据集包含导致隐蔽口袋形成的各种构象变化04 PocketMiner准确预测来自无配体晶体结构的配体结合隐蔽口袋鉴于GVP-GNN准确预测了模拟中隐蔽口袋的形成位置，接下来的任务用来回答这种网络架构是否可以用于预测实验结构中隐蔽口袋形成的位置。从之前的训练集中提取所有蛋白质，并根据Ligsite口袋体积的局部变化和fpocket成药性得分生成训练标签。使用fpocket标签方案，因为成药性评分不仅考虑了口袋的几何形状，还考虑了口袋的化学环境。仅使用Ligsite产生的标签、仅fpocket产生的标签以及两种标签组合来训练GVP-GNN(即，网络使用一种标签方案训练多个epochs，然后切换到从其他标签学习几个epochs)。尽管之前的研究发现Ligsite和fpocket很难正确排列那些口袋结合口袋，我们的标签是基于Ligsite口袋体积的变化或在MD模拟过程中残基附近的最大fpocket成药性评分。然后，评估了使用这些标签训练的模型是否可以区分配体结合隐蔽位点的残基和不形成隐蔽口袋的残基。最终的PocketMiner模型，在区分形成隐蔽口袋的残基和不形成隐蔽口袋的残基方面取得了非常好的性能(ROC AUC:0.87)。对总共24个形成配体结合隐蔽口袋的apo结构、4个超刚性蛋白质和7个作为广泛配体筛选主题的蛋白质进行了预测。在测试集中，总共有563个残基形成隐蔽口袋，1283个残基不形成隐蔽口袋。在形成隐蔽口袋的apo结构中，模型预测在实验隐蔽位点形成隐蔽口袋的可能性很高(下图A)，在几类open隐蔽口袋中实现了稳健的性能(图C)，相反，模型预测所有超刚性蛋白质形成隐蔽口袋的概率较低，并正确地将低预测分配给不太可能从具有广泛配体结合的蛋白质形成隐蔽口袋的区域。特别的，发现PocketMiner预测刚性蛋白质和不结合配体的位点中的错误较少，这表明PocketMiner可能是更有用的筛选工具。05 PocketMiner预测了人类蛋白质组中数以千计的隐蔽口袋鉴于其能够准确快速地预测隐蔽口袋地位置，PocketMiner可用于大量蛋白质结构中搜索隐蔽口袋。为了识别整个人类蛋白质组的隐蔽口袋，将PocketMiner应用于10000个人类基因。对于每个基因，优先使用高分辨率、实验确定的结构，但在没有可用的实验结构时使用AlphaFold预测结构作为替代结构。作者将结构分为三类：具有基态口袋的蛋白质、仅具有隐蔽口袋的蛋白质以及两者都没有的蛋白质。每个结构都根据计算其最大的Ligsite口袋体积和其最高的PocketMiner预测进行分箱。尽管在基态结构中缺少口袋，但仍然数千种蛋白质预测了隐蔽口袋(我们组中29.4%的蛋白质，图A)，将单一结构域的蛋白质可能形成口袋的比例扩大到了80%以上。较少数量的单结构域蛋白质缺乏基态和隐蔽口袋(18.5%)。大量预测的隐蔽口袋表明，即使在其天然折叠结构中不存在明显的小分子结合位点，对蛋白质进行药物筛选也可能是富有成效的。理想情况下，人们会在一组具有治疗意义的蛋白质上使用PocketMiner，确定哪些蛋白质可能具有隐蔽口袋，然后模拟该蛋白质的结构动力学以识别其结构整体中采用的可药物结构。A. 虽然将近一半的蛋白质在其自然、折叠状态下没有口袋，但预计这些蛋白质中的大多数都有一个隐蔽的口袋。小麦色表示天然结构中含有口袋的人类蛋白质的数量；在其天然结构中缺乏口袋但可能形成红色隐蔽口袋的蛋白质；以及灰色表示缺乏基态和隐蔽口袋的蛋白质。B. 显示了参与癌症相关Jak/Stat信号通路的蛋白质。C. PIM2激酶的晶体结构包含一个正构结合位点，但不显示任何变构口袋。D. PocketMiner预测变构位点处的隐秘口袋。E. 模拟再现了PocketMiner预测的一个隐蔽口袋。在模拟中，一个环向后剥离，在PocketMiner精确定位的位置显示一个隐蔽口袋(以青色表示)。带有隐蔽口袋(橙色)的模拟PIM2结构覆盖在apo PIM2结构(灰色)上。参考文献[1] Predicting locations of crytic pockets from single protein structures using the PocketMiner graph neural network.[2] Hendlich, M., Rippmann, F. & Barnickel, G. LIGSITE: automatic and efficient detection of potential small molecule-binding sites in proteins. J. Mol. Graph Model 15, 359–363 (1997).[3] Le Guilloux, V., Schmidtke, P. & Tuffery, P. Fpocket: An open source platform for ligand pocket detection. BMC Bioinformatics. https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1186/1471-2105-10-168 (2009).[4] Cimermancic, P. et al. CryptoSite: expanding the druggable proteome by characterization and prediction of cryptic binding sites. J. Mol. Biol. 428, 709–719 (2016).