JMJD6

摘要：除了效力之外，良好的可开发性特性是生物药物的一个关键属性。在药物开发过程的早期选择和筛选这些属性可以节省资源并避免昂贵的后期失败。在这里，我们回顾了可以为生物制剂早期评估的一些最重要的可开发性属性。这些包括生物制剂来源的影响、其生物物理和药代动力学特性，以及它可以被重组表达的程度。我们进一步介绍了可以在发现过程的不同阶段利用的计算、体外和体内方法和技术，以识别具有潜在缺陷的分子，从而促进选择最优化的药物领先分子。最后，我们反思了注射用与口服生物制剂最相关的可开发性参数，并展望了生物制剂开发中预期出现的一般趋势。 引言 将生物制剂从早期发现带到市场化产品是一项极其昂贵的努力，平均投资因临床开发中的高淘汰率而进一步增加。虽然生物制剂的临床成功最终取决于其在人类患者中的安全性和有效性，但这些终点的潜在属性包括从药物效力、特异性、免疫原性、药代动力学到体内和储存期间的生物物理行为等各个方面。此外，随着更先进的生物制剂，如双特异性抗体和抗体-药物偶联物在管线中，化学、制造和控制（CMC）以及监管方面可能成为商业成功的关键，当生物制剂必须以一致的高质量重复生产时。这些性能指标通常被称为生物制剂的“可开发性”。在这篇综述中，将介绍生物制剂的不同可开发性参数，并讨论如何使用计算、体外和体内方法来评估和优化这些参数（见图1）。当这些方法得到最佳应用时，可开发性属性的评估和改进可以降低淘汰率，同时提高可制造性，使生产更高质量、成本更低的生物制剂成为可能，从而造福全球患者。 图1. 生物制剂开发过程中用于评估可开发性属性的抗体来源、发现策略、体外测定和计算方法的示意图概述。抗体可以是天然或合成来源，通常使用各种展示技术或免疫策略，或这些的组合来发现。此外，抗体也可以从患者群体中获得。在抗体开发过程中，可以应用各种体外测定结合计算方法，用于机器学习和分子动力学，以评估抗体的可开发性属性，并选择具有最佳可开发性概况的候选物。 抗体来源 抗体和抗体片段构成了最大的生物制剂群体。抗体通常来源于血浆、杂交瘤、或重组细胞系，并源自天然（动物或人类）或合成序列。来源和起源都可能影响抗体的可开发性概况。天然抗体是从天然、非工程化序列中衍生的，通常来源于（免疫的）动物或患者群体，到目前为止是最常见的抗体来源。这些抗体天生具有从生物体衍生的好处，并且已经经历了体内的亲和成熟和自我耐受，这通常导致良好的可开发性概况。然而，在临床使用方面，人类和动物来源的抗体存在明显差异。前者构成了具有低免疫原性风险的抗体，而非人类来源的抗体可能会在患者中引起严重的免疫反应，这取决于它们源自哪种动物。可以通过几种方式降低免疫原性风险。例如，可以对抗体进行人源化，或者使用转基因动物进行人类免疫球蛋白（例如，兔子或小鼠）进行免疫。免疫活动来源的抗体的一个潜在限制是，它们主要针对抗原的最免疫原性表位。这可能限制了表位多样性，并可能阻止发现对重要但低或非免疫原性抗原表位的结合剂。此外，不适当的免疫策略可能会阻止发现针对与免疫宿主内表达的目标高度同源的目标的抗体，因为自我耐受。 为了避免这些限制，其他类型的抗体越来越受欢迎，即合成抗体，因为它们允许发现针对任何目标的结合剂。这些抗体可能来自合理设计的重组抗体库，通常通过体外展示技术发现。使用这种方法可以对抗体库进行大量控制。例如，可以移除已知对结合相互作用有害的某些氨基酸残基，可以调整可变区域的长度，可以尝试新格式，并且可以创建超越自然的可变性的抗体库。结果，这允许它们用于更大的目标空间。然而，合成抗体通常有一个缺点，即没有经过体内成熟，并且来源于自然起源。因此，它们可能潜在地携带意外的可开发性问题，例如不希望的多反应性、免疫原性、聚集倾向和差的表达概况。尽管如此，结合复杂的展示技术和先进的计算工具，这些风险可以最小化。 展示技术的进步 在过去的几十年中，展示技术允许创建大型和多样化的抗体和其他蛋白质和肽群体，从中可以分离出具有期望目标结合特性的个体变体。然而，产生抗体药物的要求不仅仅围绕抗体的结合特异性或亲和力。其他因素可以影响领先候选抗体能否被开发成有效、可制造、安全和稳定药物的可能性。例如，抗体在高浓度配方时聚集的倾向、非特异性相互作用的程度以及抗体的药代动力学可能导致领先分子在开发过程中失败。 在使用展示技术时，可以从人类和非人类供体的B细胞中重排抗体基因产生抗体群体，从合成抗体基因构建，其中在寡核苷酸合成期间引入了变异，或两者的结合。可开发性问题可能不论起始来源而出现，甚至“自然”，免疫衍生的抗体也可能遭受生物物理负债。还表明，专注于提高亲和力的领先抗体的工程可以产生具有较差生物物理属性的亲和力增强变体。例如，Buchanan等人。鉴定了一个未配对的半胱氨酸，Dobson等人。使用氢氘交换来鉴定在聚合前初始二聚化中被保护的疏水残基（VH互补决定区（CDR）1中的W30和F31，以及VH CDR2中的L56）。或者，可以使用结构（或结构模型）来鉴定用作Bethea等人（VH CDR3中的F99、H100和W100a）和Dyson等人（VH CDR2中的S52、F54和R57）的疏水或带正电荷的斑块。基于这些方法，可以生产和评估具有改善生物物理特性的个体变体。在某些情况下，通过鉴定问题区域（例如，疏水斑块），生产个体变体，并评估这些变体以改善生物物理特性，可以解决克隆的可开发性问题。 历史上，在最初的发现、亲和性优化和选择抗体药物领先分子用于临床前开发之后，才会考虑可开发性问题。越来越多地，药物开发者在发现过程中更早地评估生物物理特性，意识到这将避免后期时间和金钱的损失。与其等待筛选数十到数百个输出克隆体的生物物理特性，不如能够创建大型展示变体库，并直接选择具有良好生物物理特性的克隆体，这将极大地促进寻找具有最佳属性的抗体变体。 选择技术的力量，最好的例子是噬菌体展示，已被应用于选择具有更高热稳定性的克隆体，通过将克隆体库暴露于高温下，并选择保留与蛋白A或蛋白L的结合，这需要正确的折叠。其他人则将抗体库置于酸性条件下，以再次识别结合热力学稳定性和抗聚集展开状态的克隆体。 虽然选择低热稳定性的克隆体将有助于识别聚集倾向，但可能有一些具有正常熔解温度的克隆体，其生物物理问题仅在抗体被浓缩时才显现出来（例如，为了皮下给药而需要的10-100毫克/毫升）。因此，需要额外的选择方法。噬菌体展示的基本原理（将编码基因与其展示产品耦合）也已被应用于使用杆状病毒、核糖体、 酵母、以及更高真核生物，如哺乳动物细胞的展示系统。特别是哺乳动物展示似乎提供了比其他系统更多的优势。 使用哺乳动物展示系统表明，具有不同生物物理特性的密切相关的克隆体可以根据展示水平被区分。首先由Parthiban等人描述的基础哺乳动物展示系统，通过将抗体基因整合到单一基因组位点来实现转录标准化。因此，展示水平由抗体本身的属性决定，而不是可变的转录活性。与基于分泌的系统相比，表达的抗体通过跨膜域保留在细胞表面，并在内质网或细胞表面达到高局部浓度。因此，抗体暴露于高浓度下，具有较差生物物理属性的克隆体可能会在如此高的表面浓度下聚集，聚集体可能被细胞的质量控制机制去除。反过来，这导致这种容易聚集或“粘性”克隆体的展示水平较低。 然后，通过哺乳动物展示检测生物物理属性的能力允许从变体库中选择具有改善的可开发性概况的克隆体。在实践中，创建了库，并选择了展示水平最高的克隆体。多参数流式细胞术允许同时筛选最佳生物物理属性，同时保留抗原结合，从而允许解决参与目标结合的旁位残基，以改善生物物理属性，同时保留目标结合。这样一个系统的力量通过创建具有优越生物物理属性和与亲本抗体（bococizumab）相比降低的免疫原性的抗PCSK9抗体变体得到了证明。这些和其他实验因此展示了如何对体外展示技术进行微调，以从头开始发现具有改善的可开发性概况的抗体。 生物物理特性表征 无论使用哪种策略进行抗体发现，通常有多个早期阶段的候选物，从数十个到数千个不等，这些必须减少到只有一个候选物用于细胞系开发和制造。为了选择最佳候选物，除了它们的功能属性外，越来越注重治疗性抗体的生物物理特性表征，这使得可以在药物开发过程的早期去除具有较差可开发性属性的抗体。有多种可开发性测定方法可以促进这种选择，这些方法已被报告在不同程度上与临床阶段抗体的淘汰率相关。 抗体药物的一个关键特性是它们的高特异性，由高目标结合和低非目标和非特异性结合定义，这对降低异常药代动力学和快速抗体清除的风险很重要。为了评估非特异性结合，通常使用酶联免疫吸附测定（ELISA），这通常涉及与多个非目标的结合，如单链DNA、双链DNA、脂多糖（LPS）、胰岛素和扇贝血蓝蛋白（KLH）。为了提高灵敏度，可以使用多特异性粒子（PSP）测定38，该测定涉及通过流式细胞术检测复杂抗原混合物（例如，来自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的可溶性膜蛋白）或定义的蛋白质试剂（例如，卵清蛋白）与固定在蛋白A包被的珠子上的抗体的结合。类似于PSP测定，其他测定也使用复杂抗原混合物，包括杆状病毒粒子、整个细胞和细胞裂解物（多特异性试剂，PSR）。PSR已被证明与交叉相互作用色谱（CIC）相当相关。因此，研究非特异性相互作用的另一种方法是色谱法。在CIC中，通过它们的相对保留时间检测非特异性蛋白质相互作用。一种相关的色谱法，即站立单层色谱法（SMAC），则检测单克隆抗体与柱子之间的非特异性相互作用。例如，肝素色谱法被描述用于通过增加的细胞表面相互作用来识别具有异常药代动力学的抗体，导致过度的胞吞作用。除了特异性外，SMAC测量还识别了增加的沉淀和聚集可能性的抗体。非特异性结合也可以由表面疏水性引起，通常使用疏水相互作用色谱法（HIC）进行量化。 另一个关键特性是抗体药物的高胶体稳定性和低自相关和聚集倾向，这对于用于皮下注射的浓缩液体配方尤其重要。已经报告了几种用于评估抗体自相关性的测定方法，包括静态和动态光散射。虽然这些测定方法已被证明非常有价值，但由于它们需要高浓度和纯度的抗体，因此它们与早期开发不兼容。因此，已经开发了替代测定方法，包括自相互作用色谱法（SIC）、交叉相互作用色谱法（CIC）、以及通过生物层干涉测量法的克隆自相互作用，后者已被证明与SIC和CIC相关。为了实现更高的通量和使用低浓度的抗体，已经报告了两种基于纳米粒子的测定方法，亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱法（AC-SINS）和电荷稳定的自相互作用纳米粒子光谱法（CS-SINS）。AC-SINS通常在模拟生理条件的溶液中进行（pH 7.4，磷酸盐缓冲盐水），其测量结果通常与药代动力学属性相关，尽管它也已用于配方应用。CS-SINS在常见的配方条件下进行（pH 6，10 mM组氨酸）并已报告用于识别在浓缩抗体配方中具有低粘度和乳光度的抗体。 治疗性抗体的第三个关键特性是它们高折叠稳定性。考虑到配方抗体的保质期为几年的目标，获得实时稳定性数据非常耗时。为了加速稳定性分析，通常使用各种压力条件。热稳定性通常使用差示扫描量热法或差示扫描荧光法测量。除了温度，表面介导的压力可以用来评估抗体稳定性。例如，最近描述的疏水纳米粒子表面压力测定法被用于14种抗体变体，这些变体跨越了一系列溶解度值，以识别在存在空气-水界面的搅拌中高度不稳定的变体。此外，这种表面介导的压力测定法对聚集的评估与其他评估生物物理属性的方法（如温度诱导的聚集和AC-SINS）相关性很好。综合这些和其他体外测定方法，药物开发者可以选择具有可取的可开发性特性组合的抗体。然而，所有体外测定方法都需要表达抗体，有时包括纯化和配方，然后在实验室进行实验。为了能够筛选更多的抗体，降低成本、人工劳动以及对抗体蛋白的需求，计算方法现在越来越受到关注，并且存在多种计算策略来解决可开发性问题，并且还在快速发展中。 大数据、机器学习和可开发性的计算评估 在生物治疗药物发现的早期阶段，计算评估在评估生物制剂的可开发性方面发挥着重要作用，通常在这个阶段几乎没有实验数据可用。例如，应用计算评估的理想阶段是在从免疫或展示实验中获得的抗体结合剂的片段可变区（Fvs）测序后，需要选择一部分结合剂进行进一步实验（见图2）。这种选择的典型策略包括根据VH-VL亲本线对的多样性和表位/副位多样性对抗体进行聚类。在这个阶段包括可开发性评估很重要，以确保集中使用可用的实验资源，因为免疫活动通常会产生数千个潜在的命中序列。编码的抗体的大部分可能在随后的确认实验中不结合或显示出多种可开发性挑战。通过计算分析标记这些抗体有助于优先考虑实验测试的抗体（见图2）。在这个阶段的可开发性评估可以包括基于序列和结构的方法或两者的组合。 图2. 基于知识的方法和基于物理的方法用于表征抗体的生物物理属性。左图，基于知识的方法：概述了从数千个潜在命中序列中基于序列的计算预测生物物理属性的关键步骤。右图，基于物理的方法：A) 抗体结合界面以一系列构象存在，包括有结合能力以及无结合状态。部分解链的构象也以较低的概率存在。B) 不同构象表现出不同的属性，其中部分解链的构象可能聚集导致进一步解链。在C)和D)中，使用局部水合自由能将TNF-α结合抗体戈利木单抗的两种不同构象的疏水性轮廓映射在其分子表面上。两种构象显示出明显改变的疏水性轮廓，因此很可能与其他疏水分子的相互作用不同。 可开发性评估的典型组成部分应包括检测化学降解的基序，如氧化、去酰胺化、天冬氨酸异构化，以及糖基化基序和非典型半胱氨酸残基的存在。人类化百分比（或“自然性”）、潜在的聚集倾向区域和MHC II类结合免疫表位也可以使用基于序列的方法预测。近年来在抗体可变区结构预测方面的进展使得定期快速可靠的高通量建模成为可能。尽管如此，对CDR-H3的构象行为及其预测的理解的最新贡献表明，仍然需要更好的模型。现在可以利用适度的计算资源对数百甚至数千个抗体结构进行建模。这些Fv模型可以用来计算几种物理化学描述符，如等电点（pI）、电荷、疏水不平衡、VH-VL界面处的埋藏表面积以及分子表面斑块。这些描述符描述了抗体的静电和疏水属性以及它们的构象稳定性。 抗体的等电点是一个重要属性，可能以多种方式影响可开发性。它可以影响各个方面，包括与抗体纯化、配方（例如稳定性和粘度）、药代动力学属性相关的方面。通常，治疗性抗体的等电点在6到9之间。然而，一些具有相对较低（pI <6.5-7）或较高（pI >8.5-9）等电点的抗体已报告存在各种可开发性挑战。例如，Bailly等人发现，将人源化抗体的初始低pI（pI 6.3-6.7）增加到更高的值（pI >7）可以提高它们的纯化产量并减少它们的聚集倾向。此外，抗体的pI影响药代动力学、组织分布和与FcRn的结合，从而影响抗体的半衰期。通过比较新发现的确认结合剂的计算属性与临床或市场上现有抗体的属性，可以分析命中药物的类似性。 在被选为实验测试的抗体中，计算可开发性评估可以帮助识别具有最佳功能和物理化学属性组合的潜在领先分子。然而，根据个别药物发现项目的特殊情况，这些领先分子可能需要经过亲和力成熟、人源化、新型分子结构的格式化，并进一步优化以适应开发平台。这就需要使用计算蛋白工程工具来优化领先分子。如果领先分子的最终分子格式是单克隆IgG抗体，那么针对改善可开发性属性的可变区的计算工程更有可能转化为实验上可验证的结果，并且令人惊讶的是，只有少数几个突变就可以在药物候选物的CMC属性上取得实质性的改进。 一旦选择了一个或几个最佳领先分子，发现项目随后进入早期开发阶段。在这个阶段，优化的领先候选物被评估其与开发平台的适应性。计算可开发性评估现在应涉及建模全长抗体结构，以更准确地描述计算属性及其与涉及更大量材料和更大样品体积的标准开发实验的一致性。在这些阶段使用多尺度分子模拟和机器学习模型可以帮助识别早期配方过程挑战，如聚集、扩散相互作用、粘度和溶解度、物理化学降解、以及免疫原性。具体来说，使用显式溶剂分子动力学（MD）模拟可能为分子对热和其他压力的响应提供分子级别的理解。将这些模拟的范围扩大到包括配方缓冲液、盐、pH和辅料的考虑，将为生物制剂的计算配方开发铺平道路。最后，虽然大多数序列和可开发性报告都是基于生物物理模型，但正在开发从抗体序列中推断可开发性参数的机器学习方法，而无需进行结构建模。 虽然上述讨论的机器学习方法是区分任务（例如，预测变量X），但深度学习还允许“生成性机器学习”的可能性，它包括学习具有特定属性的训练数据集的抗体序列的基本特征，然后生成新的抗体序列，与训练数据集不同，但具有类似的属性（也称为特征），其中特征可能包括可开发性参数、结合参数或两者都有。有趣的是，使用模拟框架，最近表明生成学习可以探索新的结合和可开发性空间。然而，生成学习的程度以及实现此任务所需的训练数据量还有待确定。此外，到目前为止，还不存在允许生成具有多个预指定特征的抗体的抗体聚焦生成方法。大规模模拟可能有助于理解这些任务所需的最小数据复杂性。总结起来，计算在评估生物制剂的可开发性方面发挥着重要作用。 从结构和分子动力学看生物制剂的生物物理属性 抗体的结构和动态特性是工程属性（如化学修饰、抗原识别和受体结合）的先决条件。蛋白质，特别是抗体的三维结构不是静态的，而是不断波动。这些波动可能发生在不同的时间尺度上，从低纳秒时间尺度到秒。即使是罕见的构象，如果它们导致不可逆的修饰或单向平衡的一部分，例如在聚集或化学修饰中，也可能相关。此外，有几项研究使用分子动力学模拟估计抗体的热稳定性。例如，从高温模拟计算的本地接触分数已被证明与实验熔化温度相关。 为了阐明抗体的功能和属性，单一静态结构并不总是足够，因此，抗体的副位可能更适合被描述为溶液中的构象集合。这些副位集合已被描述为CDR环的协同运动和域间及肘角的重新排列。这种高灵活性和抗原结合位点，特别是CDR-H3环的构象多样性，对抗体结构预测提出了挑战。尽管在抗体结构预测方面取得了实质性进展，但在进一步处理之前，仔细评估结构模型至关重要，因为一些模型可能包含结构不准确之处，严重恶化生物物理表面属性预测。在基于apo X射线结构预测抗体结构时，需要特别注意，这些结构可能因晶体堆积效应而扭曲，因此与主要的溶液结构不对应。 通过将抗体视为溶液中的构象集合，不仅可以促进结构预测，还可以指导工程工作流程，促进可开发性负债的识别和优化生物物理属性。例如，已经表明，抗体的聚集是由低群体状态加速的（见图2A-B），这些状态在接近疏水表面和相界时变得更加频繁。与表面的疏水相互作用导致构象向更疏水的构象转变，这些构象反过来更容易聚集（见图2A-B）。同样，高温将集合转向易聚集的构象。这种效应在实验上被看作是不可逆的聚集。因此，有必要将抗体属性描述为结构的集合。分子动力学模拟提供了溶液中的这样一个集合，从而增加了负责疏水或聚集行为的构象被包含的可能性（见图2C-D）。有几项研究研究了构象集合对疏水性的影响。虽然基于疏水性尺度的更粗糙方法通常对结构差异不太敏感，但基于显式溶剂热力学的研究发现输入结构和侧链取向的关键影响。 已经表明，抗体的结合和生物物理属性可能依赖于电荷。然而，蛋白质中氨基酸的pKa值预测仍然非常具有挑战性。与蛋白质pKa计算的实证方法不同，它为单一结构分配质子化状态，恒定pH分子动力学允许在结构采样中纳入质子化变化。捕捉质子化的变化对于设计pH响应性抗体尤其重要，例如针对酸性肿瘤微环境。 因此，我们强烈建议将抗体视为溶液中的构象集合，这可以改善结构预测，并允许评估有助于开发抗体治疗的生物物理属性。 细胞试验用于可开发性评估 对于患者的免疫系统来说，治疗性生物制剂是外来分子，因此它们可能是免疫原性的。由结构特性和配方引起的免疫原性可能引发急性和长期问题，例如先天和适应性免疫激活、急性细胞因子风暴或抗药物抗体（ADA）的产生，导致药物中和和治疗效力丧失。ADA与生物制剂形成的复合物可能对患者产生有害影响，这可能与导致抗原呈递、炎症细胞因子分泌以及T细胞和B细胞激活的先天免疫反应有关。根据参与的免疫细胞类型，免疫激活可能导致或不导致ADAs。抗体免疫原性的主要驱动因素是T细胞激活和随后的细胞因子释放。这可以通过使用免疫细胞激活试验在体外解决，其中将外周血单核细胞暴露于候选生物制剂中，以揭示激活T细胞表位的存在。这些试验的一般原理如图3所示。这种类型的试验已被证明通过揭示增加的T细胞增殖和释放促炎细胞因子如IL-2和IFN-γ，与单克隆IgG抗体的临床免疫原性相关，并且已被欧洲药品管理局和美国食品药品监督管理局强调为重要工具。尽管这些工具通常用于降低临床前开发的风险，但由于药物递送的差异、给定生物制剂使用的治疗环境以及人类免疫谱系的复杂性，包括人类白细胞抗原的个体单倍型，生物制剂在患者中的免疫原性仍然难以预测。 图3. 外周血单核细胞（PBMC）免疫原性测定的示意图。A) 从健康供体中分离PBMC。B) 将分离的细胞在添加了候选生物制剂的细胞培养基中培养。C) 候选生物制剂被抗原呈递细胞（APCs）摄取并在培养中呈递给T细胞。如果生物制剂是免疫原性的，这可能导致T细胞激活和同时分泌细胞因子。D) 然后可以通过对用候选生物制剂刺激后的T细胞进行表型分析，并在培养上清中测量细胞因子水平来评估免疫原性。 IgG抗体和基于白蛋白的生物制剂在屏障内和跨屏障都具有有利的运输特性，使它们在人类中平均具有长达三周的长血浆半衰期。这是因为它们能够结合到新生儿Fc受体（FcRn），该受体主要位于多种非造血和造血细胞类型的酸性内体中。在这里，FcRn在配体通过液相胞饮作用进入细胞后遇到它们，并以pH依赖的方式与它们结合，在酸性pH下发生结合，而在中性pH下不发生结合或释放。这指导了细胞循环或转运，因此，FcRn的参与使配体免于细胞内降解，从而实现高血浓度和长的血浆半衰期。不同生物制剂经历这一过程的效率对它们的药代动力学特性和生物分布有巨大影响。这促进了建立生物物理方法来确定对FcRn的pH依赖性结合动力学，例如使用表面等离子共振、微量热泳和亲和色谱技术，目标是预测FcRn介导的运输效率。尽管这些可用的高通量生物物理方法可以提供有关在给定pH条件下的结合信息，它们通常不揭示分子如何在pH梯度中结合FcRn，因此不直接模拟细胞环境。然而，pH梯度可以通过分析FcRn亲和色谱模拟，其中使用逐渐增加的pH来解决FcRn靶向分子从与基质结合的受体的解离。尽管这些研究可以揭示有价值的信息，但应谨慎，因为它们没有考虑到FcRn嵌入在带负电的细胞膜中，并遵循涉及不同内体结构的运输途径。此外，它们没有考虑到不同类型的细胞使用FcRn进行配体运输和抗原呈递以及与Fcγ受体协同处理免疫复合物的多样性。此外，FcRn在细胞环境中与IgG和白蛋白复合物的化学计量比复杂且远未完全理解。因此，需要可靠的试验，可以用于剖析IgG和基于白蛋白的格式在FcRn独立和依赖方式下的细胞处理决定因素。这种类型的见解可以通过在发现过程中早期识别所谓的“红旗”，包括多反应性、稳定性和不利的药代动力学，来指导领先选择。这些特性来自生物物理属性，如表面电荷、电荷斑块、等电点和疏水性，影响FcRn结合、细胞运输和体内表现。因此，模拟这些特性的细胞试验至关重要，可能为计算分析提供必要的数据输入。 实际上，针对FcRn介导的细胞循环和转运的细胞试验已经存在，并被用来揭示FcRn参与格式如何被摄取和排序的见解。这些试验进一步被用来预测体内特性，例如细胞运输特性与血浆半衰期或清除率之间的相关性。试验可以包括先进的活细胞成像来追踪受体及其配体，从而获得有价值的机制见解。然而，尽管成像有用且分辨率高，但成像依赖于蛋白质标记，这可能影响整体稳定性以及FcRn结合和运输。尽管许多报告侧重于测量从细胞中运输出或穿过细胞的分子量，但也应该考虑细胞内积累和降解的速率。考虑这些参数的重要性由使用基于人类内皮细胞的循环试验（HERA）所证明，其中细胞过表达人类FcRn。HERA可以用于筛选FcRn靶向分子被摄取的能力，然后是它们从细胞内积累和/或降解中的挽救（见图4A）。值得注意的是，HERA只需要少量蛋白质，并且不需要标记，因为参数可以通过收集样品上的ELISA设置来测量。此外，试验允许操纵pH并阻断配体结合位点，以及调节受体表达水平，这使得可以根据特定需求和问题定制试验（见图4B）。这提供了广泛的用途，并且细胞读数与体内数据相关。例如，HERA筛选具有不同FcRn结合动力学的IgG1 Fc工程变体，揭示了它们在人类FcRn转基因小鼠中的血浆半衰期的预测相关性（见图4C）。在最近的一项研究中，HERA被用来解决不同IgG1 Fc含量生物制剂经历细胞循环的效率，结合转基因小鼠模型的研究，暗示了观察到的IgG1 Fc融合蛋白与具有相应特异性的单克隆IgG1抗体相比半衰期短的潜在原因。重要的是，研究还解决了循环和转运之间的差异，这可能通过将循环试验与跨孔研究相结合来揭示。后者允许量化FcRn介导的转运运输，与循环相比，这与增加的清除率相关。 图4. 人类内皮细胞循环测定法（HERA）作为体外药代动力学评估和解决FcRn靶向策略的工具。A) 通用HERA协议。(1) 稳定转染FcRn的人类微血管内皮细胞（HMEC）-1被播种，然后(2) 向两个并行的细胞板中添加结合FcRn的候选生物制剂。经过一段孵育期后，(3) 从一块板上的细胞被溶解以获得摄取样本。对于另一块板，培养基被更换为循环培养基，经过另一段孵育期后，(4) 培养基被收集作为循环样本，并且(5) 细胞被溶解以获得残留样本。所有样本中的候选生物制剂通过定制的ELISA进行定量，该ELISA专为特定检测被评估的生物制剂。B) HERA协议的变体，能够分析FcRn依赖性和非依赖性的摄取、细胞积累和FcRn依赖性循环。变体包括(1) 在温和酸性的细胞外pH下执行摄取步骤，有效地通过阻止FcRn介导的循环来促进生物制剂的细胞内积累，(2) 操纵FcRn表达或阻断与FcRn的结合以分析FcRn依赖性和非依赖性细胞积累，以及(3) 引入对FcRn结合的竞争，以反映FcRn配体结合位点上的内源性竞争及其对FcRn结合生物制剂细胞运输的影响。C) HERA数据可以用来解决候选生物制剂的结构设计对FcRn介导的细胞运输和非特异性细胞积累的影响。对于某些候选生物制剂，HERA数据可能允许计算一个与人类FcRn转基因小鼠的血浆半衰期相关的分数。 为了充分利用上述描述的细胞试验，需要考虑生物制剂的生物物理属性。例如，Fc融合结构的表面电荷可能会以FcRn依赖和非依赖的方式影响生物制剂的细胞处理。例如，抗体briakinumab和ustekinumab结合相同的目标，即IL12/23的p40亚基，但它们不同的电荷轮廓赋予了它们在人类中截然不同的半衰期。具体来说，briakinumab Fv的电荷改变了其与FcRn的相互作用。细胞研究表明，这导致briakinumab的FcRn非依赖性细胞积累，这解释了它较短的半衰期。有趣的是，同一研究发现，通过Fc工程可以改善briakinumab的半衰期，这证明了调节Fc与FcRn的核心结合可以调整Fc融合结构的不利生物物理特性。它还证明了定制细胞试验可能揭示的复杂性。这些只是许多现有示例中的一些，说明远端结构特征如何影响Fc与FcRn的结合。此外，HERA和其他细胞试验也可用于研究基于白蛋白的分子的运输，这反映了它们在体内的药代动力学特性以及穿越极化粘膜上皮细胞表面的能力。 在小鼠中进行临床前药代动力学评估 虽然细胞试验可以指导选择和设计一组有限的领先生物制剂候选物，但随后必须在可靠的动物模型中评估药物候选物的体内行为。虽然非人灵长类动物在生物学上与人类非常相似，但由于成本、可获得性和伦理问题，它们在早期开发中的使用受到限制。因此，更倾向于使用较小的动物，如小鼠。然而，这些研究应该仔细计划，并考虑到小鼠和人类之间的交叉物种结合和表达差异，例如基于抗体的生物制剂的靶标识别。例如，虽然在人类中是一种有效的血管内皮生长因子（VEGF）阻断剂，但广泛使用的抗VEGF人类IgG1 bevacizumab不能阻断小鼠VEGF，这意味着在它的开发中不能使用小鼠。此外，我们对FcRn生物学的理解揭示了在使用常规小鼠时必须考虑的主要差异。这是由于小鼠和人类FcRn的配体结合存在巨大差异，其中小鼠IgG与人类形式的结合非常弱，而人类IgG与小鼠FcRn的结合比与人类对应物更强。尽管有关野生型人类IgG1变体在常规小鼠和人类中的药代动力学相关性的报告，但经过Fc工程改造以增强与人类FcRn结合和延长半衰期的IgG1变体由于丧失pH依赖性结合，无法有效结合小鼠FcRn，导致血浆半衰期短。这些跨物种差异促使开发了转基因小鼠，这些小鼠表达人类FcRn并缺乏小鼠FcRn。这些转基因小鼠现在是评估基于人类IgG的生物制剂药代动力学的黄金标准，并且重要的是，它们产生的数据与非人灵长类动物和临床观察的数据相关。 在小鼠中进行抗体药代动力学研究的一个重要且常被忽视的方面是它们异常低的内源性IgG水平，这是由于实验动物设施需要无病原体住房所致。当然，注射的IgG和基于白蛋白的治疗剂将在存在大量IgG和白蛋白的情况下竞争与FcRn结合，它们的浓度分别约为12和40 mg/mL。这给FcRn的配体结合位点带来了竞争压力，调节了注射IgG和白蛋白的血浆半衰期。缺乏这种压力可能掩盖了候选生物制剂之间的相关差异，因此应该考虑到这一点，以便准确预测药代动力学特性。这可以通过预先注射高浓度的静脉注射IgG（IVIg）来实现。此外，最近通过创建同时表达人类IgG1-Fc的人类FcRn转基因小鼠，在小鼠中提供相关竞争环境方面取得了进展。 同样，不同物种之间白蛋白结合也存在巨大差异。例如，小鼠FcRn与人类白蛋白的结合很差，这有效地阻止了基于人类白蛋白的格式免受细胞内降解。在这些条件下，白蛋白的血浆半衰期降至与大小超过阈值的无关蛋白质相似的水平。使用人类FcRn转基因小鼠可能会纠正这个问题。此外，这些小鼠持续产生大量的内源性白蛋白，有效地为人类白蛋白引入了竞争环境。事实上，人类FcRn与小鼠白蛋白的结合比与人类对应物更有效，这增加了基于人类白蛋白的生物制剂在这些小鼠中面临的竞争压力。提供更生物学相关环境的替代品包括使用表达人类FcRn的小鼠，这些小鼠缺乏内源性白蛋白，并像研究IgG时引入IVIg一样预加载人类白蛋白，或者使用小鼠白蛋白被人类对应物替换的转基因小鼠。 生物制剂的细胞系开发和生产 大多数生物制剂是昂贵的治疗剂，直接注入患者体内。因此，它们以高效、安全和可复制的方式生产至关重要。使用哺乳动物细胞生产市场上的抗体治疗剂最为常见（www.antibodysociety.org/antibody-therapeutics-product-data），但生物制剂也可以在细菌、酵母和无细胞表达系统中生产。哺乳动物细胞培养生产通常涉及数十亿活细胞，控制和可靠地复制所涉及的复杂生物过程在大规模上是具有挑战性的。因此，大量工作投入到开发理想的生产细胞系中，这些细胞系能够稳定地表达产品超过60代，以高产量和一致的产品质量进行高度可复制的过程。由于这些努力，过去几十年生产细胞系的开发已经得到改善，从随机整合表达蛋白基因然后广泛筛选高产克隆到更有针对性方法，包括目标基因整合以实现可复制的生长和产量和插入更大的遗传元素以获得强大的高产细胞系，并结合众多细胞工程策略以获得一致的产品质量。 尽管过去几十年中，高产和稳健的细胞系开发方法已取得显著进步，但生物制剂的有效生产仍是一个持续的挑战。其中一个问题是生物制剂的复杂性不断增加，例如异源蛋白可能会给细胞带来额外的压力，甚至可能导致细胞死亡。另一个挑战是生物制剂在早期研究阶段和后期细胞系开发阶段之间经常发生的表达系统变化。早期通常更倾向于使用瞬时人类表达系统，因为它们能够轻松快速地生产出可用的产品数量，而稳定的CHO细胞系则更受商业生产的欢迎。这种变化可能导致产品产量和质量（例如糖基化、聚集、蛋白质折叠）的显著差异，这意味着在商业制造之前，需要在新的表达系统中对产品进行彻底的重新表征。在细胞系开发过程中，经常遇到产量低和产品质量变化等问题，这些问题可能会影响效力、质量和患者安全。 在药物开发过程中，越早考虑细胞系开发，成功生产的可能性就越大。众多研究表明，诸如聚集倾向等不良的生物物理特性通常与稳定细胞系中的低效生产有关，这强调了使用生物物理特性预测工具作为早期可制造性指标的重要性。通过使用稳健且灵活的细胞系开发平台，结合早期产品评估和稳定细胞系的生成，也可以增加成功生产的机会。具有可预测高产量的目标整合平台在这方面具有很大的潜力，其中生物制剂可以在相同的细胞系中从发现到商业制造。通过拥有不同糖工程细胞系的库，可以增加灵活性，从中可以研究和选择决定生物制剂稳定性、血浆半衰期和免疫原性的所需糖基化概况。然后可以直接使用提供产品所需糖基化概况的细胞系进行大规模生产。 用于口服应用的抗体 迄今为止，大多数获批的生物制剂都是作为注射剂交付的，因此这些分子进入循环系统并在其中或组织中发挥作用。然而，人们正在探索替代方法，特别是用于对抗胃肠道（GI）感染。对于这类生物制剂，可开发性方面同样重要，就像注射分子一样。然而，虽然血浆半衰期和免疫原性是静脉注射生物制剂的关键因素，但对于在GI道中发挥作用的口服可用生物制剂来说，稳定性和保质期等其他方面更为重要。此外，不同的质量参数，如产品纯度和是否存在其他蛋白质，对于口服生物制剂可能不那么重要，因为GI道通常会遇到广泛的大分子。作为如何为口服途径优化生物制剂的一个例子，Fiil等人为饲料应用设计了一个高度生物物理稳定的同二价VHH结构，并证明了它在抑制仔猪中的肠毒素大肠杆菌（ETEC）增殖方面的功能性。他们在早期设计中的关键因素是选择一个连接体，与之前用作其他口服蛋白质连接体的IgG3的更自然的铰链区相比，它在GI条件下的稳定性令人惊讶地更高。类似地，Virdi等人尝试了其他格式，如IgA样分子，这些分子也被证明在抑制仔猪GI道中的ETEC增殖方面有效。在这种情况下，推测Fc区域的结合将增加在GI道中的滞留时间，这在概念上类似于延长半衰期。 在某些情况下，可以在发现过程中或通过随后的蛋白质工程努力进一步优化生物制剂的生物物理稳定性。在纳米体的情况下，一种方法涉及细胞内选择，已被证明可以选择出更稳定的纳米体。这可以跟随实验，在筛选过程之前将纳米体暴露于高温，使具有更高再折叠能力的纳米体被识别出来，以及蛋白质工程努力，通过在相对的β链之间引入额外的二硫键，进一步稳定纳米体以抵抗高温和蛋白酶。 最后，当生物制剂需要口服时，可能会考虑使用替代表达系统，如微生物发酵、使用藻类或转基因植物，甚至通过工程细胞进行原位生产。这些系统可能会降低生物制剂的生产成本和时间，从而扩大这些分子的应用范围。 结语 最近，在生物制剂的发现和开发中发生了转变，从主要关注高亲和力和特异性结合目标、击中正确的表位并传递所需的功能，到现在也考虑可开发性方面。这种扩大的发现和多维工程思维可能会产生更好的药物候选物，并减少药物开发过程中晚期失败的数量。然而，在许多情况下，特别是对于完全新型的生物制剂，尚不清楚什么构成了良好的可开发性概况，尽管一些这样的概况（例如，上市药物类似性和治疗性抗体分析器）开始出现。随着更多的序列信息和生物物理数据公开可用，建立可开发性指导原则的任务变得更加可行。在这个领域，我们预计在发现过程的早期，计算预测将发挥越来越大的作用，因为它们允许在低（建立后）成本下进行非常高通量的分析。然而，使用计算模型可能存在一些固有的不确定性，因为现有数据集的偏差，重新评估算法以及扩展现有和构建新数据集将继续很重要。在生成这些数据集时，可能有利于包括并探索可能不被预测具有优越可开发性概况的分子。 另一个复杂性是，一些生物物理属性本质上是动态的，例如聚集和部分解链，这可能很重要，计算方法能够将其纳入预测。例如，由于结构模型并不总是准确的，考虑到这一点的模拟可能需要作为稳态模型的补充，以提高生物物理预测的准确性和可靠性。为了进一步改进计算方法，开发最优生物制剂，既需要基于知识的方法，也需要基于物理的方法。开发可靠计算模型的另一个障碍是缺乏来自在相似条件下使用相似协议和仪器对大量分子进行实验获得的自我一致和可复制的数据。生物制药行业的持续数字化转型预计将改善这一困难，并促进改进人工智能和机器学习方法的产生。最后，在行业和学术界的前竞争空间中形成协作联盟，使自我一致和可复制的数据可供机器学习使用，将是改进计算方法和模型的另一个巨大进步。 除了计算方法，我们预计生物物理方法将继续发挥作用，以评估可开发性措施。自动化、微型化和数字化是药物开发中的关键趋势。结合新的体外测定，这可能使在发现过程的早期进行更强大的和智能的筛选和表征。然而，这个领域仍然存在挑战。虽然拥有强大的发现引擎对于开发新的生物制剂可能是一个重大优势，但建立这种能力并教育人员使用先进的系统既复杂又昂贵。此外，随着药物越来越定制化和个性化，大型发现平台的多功能性和模块化需要改进，以便它们不仅优化了针对单一类型的适应症的模态。 另一个将有助于生物制剂开发的途径是产生和使用更好地反映临床环境以及生物制剂在人体中表现的动物模型。在这方面，一些重要方面包括药代动力学、免疫原性、效力和效应功能的作用。 由于生物制剂通常是复杂的分子来制造，因此表达系统和纯化方法的优化至关重要，以实现高质量材料的重复、可复制生产。这涉及到产量、折叠、翻译后修饰（如糖基化）的优化，以及宿主细胞蛋白的减少。在这里，预计糖工程将继续发挥重要作用，我们预计在发现过程的早期考虑糖基化模式（和其他翻译后修饰）可能会提高许多基于蛋白质的生物制剂的成功率。然而，在这个领域，仍然有许多未知之处，更好地建立知识和指导方针，不仅如何设计生物制剂以具有类似人类的翻译后修饰，而且具有甚至比相应的人类更好的修饰，将是重要的。 作为最后的评论，值得提及的是，迄今为止大多数生物制剂都是作为注射剂来管理的。在未来，预计更多的生物制剂将通过口服、肺途径或其他途径交付。这无疑将影响新生物制剂的开发和配方方式，并可能允许使用全新的生产系统。

中国临床肿瘤学会(CSCO)年会是我国肿瘤领域最盛大的学术会议之一。2024年9月25日至29日，第27届全国临床肿瘤学大会暨2024年CSCO学术年会在厦门隆重召开。 在9月27日的CSCO大会卵巢癌专场上，华中科技大学同济医学院附属同济医院高庆蕾教授口头报告了一项关于氟唑帕利治疗卵巢癌的真实世界研究1。该研究是首个评估氟唑帕利治疗卵巢癌的大型真实世界研究，由华中科技大学同济医学院附属同济医院马丁院士牵头，山东大学齐鲁医院、贵州医科大学附属肿瘤医院等四十余家中心共同参与，为我国自主研发的多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂——氟唑帕利在卵巢癌领域的治疗再添力证！ 2024CSCO大会现场图：高庆蕾教授进行报告 研究背景 卵巢癌是常见的女性恶性肿瘤，根据世卫组织2020年全球癌症统计报告，我国2020年新发卵巢癌5.5万人，死亡3.8万人2。卵巢癌患者临床确诊多为晚期，晚期患者5年生存率不足30%，是死亡率最高的妇科肿瘤3。氟唑帕利是中国首个自主研发的PARP抑制剂，可基于协同致死机制杀伤肿瘤细胞4，已在中国获批三个适应症，分别为：用于既往经过二线及以上化疗的伴有胚系BRCA突变(gBRCAm)的铂敏感复发性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者的治疗，铂敏感的复发性上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者在含铂化疗达到完全缓解或部分缓解后的维持治疗，以及晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者在一线含铂化疗达到完全缓解或部分缓解后的维持治疗。本次口头报告披露了氟唑帕利在真实世界中的疗效及安全性数据。 研究方法 本研究入组标准为：组织学或细胞学确诊的卵巢上皮癌、输卵管癌或原发性腹膜癌；年龄≥18周岁；研究者判定患者可以接受氟唑帕利单药或联合治疗。根据患者入组时疾病阶段，分别入组不同队列。 图1. 研究设计 研究结果 基线状态 截至2024年2月28日，本研究共入组了224例患者。患者中位年龄为57岁，83.9%的患者为上皮性卵巢癌，62.0%的患者初诊临床分期为III/IV期。224例接受含氟唑帕利单药或联合治疗的患者中，84例(37.5%)为一线维持治疗，92例(41.1%)为铂敏感复发(PSR)维持治疗，23例(10.3%)为PSR治疗(其中3例联合了抗血管生成药物)，19例(8.5%)为铂耐药复发治疗(2例联合了化疗，7例联合了抗血管生成药物；在7例联合了抗血管生成药物的患者中，2例同时联合免疫抑制剂，1例同时联合芳香化酶抑制剂)，以及6例(2.7%)其他队列。 表1. 基线状态 临床疗效 本次分析的数据截止时间为2024年5月23日，中位随访时间为8.5个月。截至分析时，70例(31.3%)患者仍在接受氟唑帕利治疗(37例一线维持，24例PSR维持，7例PSR治疗，和2例铂耐药复发治疗)；中位治疗持续时间依次为：6.7个月(四分位间距[IQR]：2.5，12.1)，4.8个月(IQR：1.9，10.9)，3.1个月(IQR：0，13.3)，1.9个月(IQR：0.7，4.6)和3.6个月(IQR：1.6，7.4)。 图2.队列中位治疗持续时间 一线维持治疗组患者的中位随访时间为8.5个月(IQR：4.9，14.3)，中位无进展生存期(PFS)尚未达到，1年PFS率为84.1%。 图3. 一线维持治疗队列无进展生存期 PSR维持治疗组患者的中位随访时间为8.7个月(IQR：4.5，15.2)，中位PFS为12.6个月，1年PFS率为55.0%。 图4. PSR维持治疗队列无进展生存期 PSR治疗组患者的中位随访时间7.9个月(IQR：3.4，15.6)，中位PFS尚未达到，1年PFS率为69.8%。 图5. PSR治疗队列无进展生存期 铂耐药复发治疗组患者的中位随访时间为6.7个月(IQR：2.2，12.5)，中位PFS为4.8个月，1年PFS率为45.5%。 图6. 铂耐药复发治疗队列无进展生存期 安全性 安全性方面，整体耐受性良好，且未观察到新的安全性信号。 研究结论 本研究是首个评估氟唑帕利治疗卵巢癌的大型真实世界研究，研究结果显示了氟唑帕利在临床应用中的疗效及安全性，为氟唑帕利在卵巢癌领域的治疗再添力证。 参考文献： 1.高庆蕾, 马丁, 等. 氟唑帕利治疗卵巢癌患者的安全性和疗效：一项全国多中心、非干预性登记研究. 2024 CSCO;ID: 18966. 2.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209–49. 3.Wong KH, Mang OW, Au KH, Law SC. Incidence, mortality, and survival trends of ovarian cancer in Hong Kong, 1997 to 2006: a population-based study. Hong Kong Med J. 2012;18(6):466-474. 4.Petropoulos M, Karamichali A, Rossetti GG, et al. Transcription-replication conflicts underlie sensitivity to PARP inhibitors. Nature. 2024;628(8007):433-441. 声明： 1.本新闻旨在发布医药前沿资讯，仅供医疗卫生专业人士参阅，非广告用途。 2.恒瑞医药不对任何药品和/或适应症作推荐。 3.本新闻中涉及的信息仅供参考，请遵从医生或其他医疗卫生专业人士的意见或指导。医疗卫生专业人士作出的任何与治疗有关的决定应根据患者的具体情况并遵照药品说明书。 撰稿：肿瘤中央医学事务部 排版：程梦真 责编：李玉莹 往期精选 |  研发创新  | 慢病创新里程碑！恒瑞首个自免创新药夫那奇珠单抗获批上市 恒瑞医药新突破！中国首个自研阿片类镇痛创新药富马酸泰吉利定获批上市 |  国际化  | 海外BD再传捷报！恒瑞医药GLP-1类创新药组合实现海外许可 恒瑞医药与默克达成合作，携手推进癌症创新疗法 |  重磅奖项  | 喜报！恒瑞医药荣获2023年度国家科技进步奖 恒瑞医药连续六年入选全球制药企业50强榜单！ |  社会公益  | “健康中国行·重走长征路”项目启动仪式圆满举行！恒瑞提供公益支持，助力健康中国 恒瑞医药集团向中国扶贫基金会捐赠3000万设立“健康帮扶基金”

摘要：大型分子抗体生物制剂因其卓越的目标特异性、药代动力学和药效学特性、安全性和毒性概况以及多样化工程的适应性，已经彻底改变了医学领域。在这篇综述中，我们重点关注临床前抗体的可开发性，包括其定义、范围以及从候选物到领先优化和选择的关键活动。这包括生成、计算和模拟方法、分子工程、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。最近，显然这些活动不仅影响领先选择和可制造性，而且最终与临床进展和成功相关。作为可开发性成功的蓝图，我们探索了新兴的可开发性工作流程和策略，包括对影响所有可开发性结果的四大分子属性的概述：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。我们还检查了风险评估和缓解策略，这些策略增加了将正确候选物带入临床的可能性。 1.引言 生物制剂的发现和开发，特别是抗体和工程化抗体模式，在过去几十年中得到了扩展，目前全球市场上有100多种抗体生物制剂，大约有1000种研究性分子正在进行临床试验。蛋白质和抗体治疗成功针对的治疗适应症包括免疫肿瘤学、心血管、感染性和自身免疫疾病，以及神经退行性适应症。此外，抗体适合工程化以增强多功能性并产生极其多样化的特性，包括多特异性靶向、增强或降低效应功能、增加半衰期。单克隆抗体可以通过选择技术、筛选和工程化设计来增加目标结合并增强可开发性特性。成功的可开发性对领先优化和选择至关重要，并确保强大的处理、稳定性、传递、给药、药代动力学（PK）/生物利用度、安全性，并且与临床成功率相关。 抗体产生和筛选后，关键的临床前可开发性活动包括分子工程、计算和模拟评估、生产、分析和生物物理特性、稳定性和强制降解研究以及流程和配方评估。我们还讨论了适当的分析方法及其使用时机。在可开发性评估中遇到的常见问题和风险，如聚集、自相互作用、疏水性、去酰胺化和氧化，进行了探讨。几个非可开发性活动对大分子发现和开发至关重要，如功能性生物测定法的开发、生物标记物开发、PK/药效学研究和体内疗效，这些可能影响领先选择。然而，这些活动不是这篇综述的重点。在这里，我们将可开发性属性定义为与分子固有属性相关或受其影响的任何事物，与影响领先选择、开发甚至安全性和有效性的靶标生物学和作用机制的效果区分开来。影响所有可开发性属性和结果的分子属性在此被组织为四大类别：1）构象，2）化学，3）胶体，和4）其他相互作用。这些分子类别或属性的定义以及用于审查它们的分析方法和关键标准的例子。最近显然，这些属性不仅影响化学、制造和控制（CMC）属性和结果，还影响给药后现象。我们还检查了可开发性风险评估和缓解策略，这些策略对每种分子都是独特的，并受到负债的性质和数量以及潜在缓解措施的影响。总体而言，这篇综述侧重于大分子或蛋白质可开发性，特别适用于液体配方的单克隆抗体（mAbs）及其工程版本，这是治疗适应症的首选大分子。 尽管其他模式，如抗体-药物偶联物（ADCs）和/或蛋白质-寡核苷酸偶联物，可能提供额外的治疗益处以及可开发性和开发挑战，但它们不在这篇综述的范围之内。 2.抗体产生 2.1.领先到领先 治疗性抗体的临床前可开发性包括使用结合和/或活性评估对产生的领先分子进行初步筛选。然后，在瞬态真核表达和纯化后，进一步筛选这些分子以进一步评估相关的物理化学特性。图1显示了与分子可开发性相关的主要临床前活动流程图，包括领先或抗体产生。虽然抗体产生本身通常不被视为核心可开发性活动，但它肯定可以影响分子属性的范围，因此影响可开发性结果。在进行可开发性评估时，考虑使用的方法是很重要的，无论是小鼠免疫（随后进行杂交瘤筛选）、噬菌体或酵母展示技术，还是合成库。不同的选择技术可能在抗体属性方面产生不同的结果。例如，噬菌体展示产生可能会增加可开发性问题的可能性，如降低溶解度、增加疏水性和增加非特异性导致半衰期差。这些结果可能源于噬菌体选择的多轮，这是为了产生高亲和力分子，但也可能在互补决定区（CDRs）中积累过多的电荷或疏水性，导致更差的可开发性结果。此外，在噬菌体展示中，非特异性结合并不像在动物免疫方法中那样是一个重要的选择压力，后者中产生的抗体被排除用于自身免疫。为了弥补这种自然选择的缺乏，可以在噬菌体展示筛选过程中手动排除疏水CDRs，或者可以采取额外的选择措施来筛选出未折叠或不稳定的可变域。 图1. 示意图突出了大分子治疗性抗体可开发性的各个发现和早期开发阶段。也列出了后期CMC开发的关键交付物。 同样，酵母展示亲和成熟通常增加了疏水性、聚集率和自相互作用倾向，因为结合像在噬菌体展示中一样被迭代最大化。然而，使用酵母展示的一个主要优点是存在真核蛋白质生产机制，需要维持翻译后修饰。此外，存在选择酵母展示变体增加热稳定性的策略。为了增加候选多样性，可能会进行多次领先产生活动，因为一种方法可能在结合、序列和可开发性配置文件方面产生高冗余。理想情况下，应该产生具有多样化结合亲和力和抗原表位的抗体，以最大限度地增加获得具有理想功效、安全性和作用机制的区分抗体的可能性。此外，从这样一个多样化的抗体池中，可以选择和/或进一步优化具有有利可开发性配置文件的抗体。抗体候选物种交叉反应性也是一个重要考虑因素，可能需要单独产生活动以生产动物研究的物种特异性替代品，特别是啮齿动物。 通过小鼠或大鼠免疫产生的抗体通常需要前期的工程化和人源化处理，这将大大增加初始候选物的筛选和特性分析的数量。总体而言，抗体的人源化提出了挑战，例如需要额外的耗时的体外筛选变体和增加的免疫原性风险。建议在解决主要负债的计算和纠正的同时，针对共识人类种系进行人源化，以避免后期需要纠正的严重负债，从而延误选择工作。主要负债被视为潜在严重的化学或物理化学负债。主要负债因素包括位置，特别是负债是否位于可变框架或更令人担忧的可变CDR区域，以及潜在的严重程度，其中流程和配方措施不太可能可接受地减轻风险，给药后的降解将显著，和/或对活性和/或功能有显著影响。应该最初排除或在计算中纠正有问题的主要序列基序，特别是那些含有游离半胱氨酸、共识天冬酰胺糖基化位点（Asn或N后跟XS/T）除保守的N297糖基化外，以及NG去酰胺化基序。 如果潜在修饰的位置在可变CDR区域并且可能影响目标结合或活性，这一点尤其正确。尽管评估人源化变体和化学负债纠正变体进一步扩大了初始筛选工作，但稍后可能会揭示具有减少免疫原性和较少负债的更可开发的候选物。如果需要多特异性格式化，则早期候选物的数量进一步增加，通常首先筛选单价、双价抗体，然后进行多特异性格式化和定制的几轮。所需的或可用的格式，例如抗原结合片段（Fab）、单链可变片段（scFv）或来自羊驼免疫的可变重链抗体片段（VHH），也是一个重要的考虑因素。除此之外，还有许多其他多特异性格式。这样大量的抗体模式工具箱，除了它们如何不对称地排列成多特异性，确实可以创建大量的构造来评估。在实践中，可开发性筛选漏斗可以从领先优化和选择中扩大和收缩，如图2所示。为了减少需要筛选的抗体变体的总数，免疫转基因、人源化动物，如Trianni小鼠，可以产生完全人类抗体并绕过体外人源化的需要。然而，需要在这一代技术中进行大量投资，并且完全人类mAbs也可以通过其他技术产生，如噬菌体展示和单一人类B细胞克隆。根据所需的效应功能和作用机制，还可以评估各种同种型，通常是IgG1或IgG4，或调节其效应功能的变体。 图2. 展示了一个假想的抗体发现和可开发性活动的各个发现阶段的示意图。最终，可能数百或数千个候选物被筛选成相对较少的、有利的候选物。然而，在这个过程中，随着从之前选择的候选物中以迭代方式创建额外的变体、结构、负债纠正或多特异性框架，选择漏斗可以扩大和缩小。在左侧（黑色字体）是可开发性活动，如筛选、工程和选择，这些活动可能会增加来自优选子集的候选物数量，如在创建人源化或校正变体时的情况。在右侧（绿色字体）是采用的可开发性分析和评估，这些评估被分为不同的层级。在这个例子中，最初的命中通过有限的分析筛选出更有利的子集，包括高通量结合/活性、纯度、Tm/Tagg和计算评估（Tier 1测定）。为了筛选出较少的候选物，应该采用扩展特性测定，包括cIEF、HIC、DSC和自相互作用（根据通量需求和材料可用性，通过kDiff和/或AC-SINS），一个短期的、单时间点的加速稳定性保持以评估完整性，如果可用的话进行颗粒分析，以及非特异性测定（Tier 2测定）。随后，最终采用完整的可开发性评估，包括强制降解、完整的纯化过程和配方稳定性评估（Tier 3）。应当注意，当从之前的候选物创建变体（如人源化、格式化或校正）时，或者甚至测试新的批次时，应该重复前一阶段的分析或层级，以便为任何潜在的领先候选物获得完整的特性集（层级1-3）。对于每个阶段，建议的蛋白质材料量可能因样品准备和分析样品需求而异。 3.领先优化和选择 3.1.候选筛选 无论产生方法和领先数量如何，分子首先需要在亲和捕获后可接受地表达并具有可接受的纯度特性。筛选分子的基本工作流程通常从杂交瘤表达开始，然后是蛋白A（ProA）捕获，主要评估结合特性以及对不到一毫克（mg）材料的有限纯度和分析测试。更可行的候选物，可能在数十到数百的规模上，然后可以转移到瞬态中国仓鼠卵巢（CHO）表达以生产mg数量，然后通过ProA捕获并筛选高通量“Tier 1”测定（图2）。这些包括尺寸排除高效或超高效液相色谱（SE-HPLC/UPLC）、毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS）、表面等离子共振（SPR）的结合/活性，以及温度依赖的熔化和聚集（Tm/Tagg）评估。虽然表达和纯化通常可以在CMC开发后期进行优化，但瞬态表达和纯化材料的初始纯度和异质性问题可以表明不稳定或折叠不良的分子。对瞬态领先进行初始纯度和异质性评估至关重要，以早期发现潜在问题，例如在表达和/或亲和纯化期间发生的聚集和剪切倾向。SE-HPLC或UPLC建议用于初始评估聚集，这是CMC释放和稳定性质量属性，可能会导致给药后的免疫原性或降低效力。与分析SEC（或SEC-MALS）偶联的在线静态（多角度）光散射可以进一步表征或确认蛋白质聚集体的性质。虽然这是在未受压力的分子上进行的，但它们可能在亲和捕获前的培养上清或低pH ProA洗脱步骤中容易聚集。可以通过变性还原cSDS直接评估抗体主链剪切，并通过非还原cSDS直接解离域，这些是CMC关键纯度和质量属性。剪切可能是酸性或碱性催化或酶性质的，而抗体域解离通常源于未形成或断裂的域间二硫键。此外，剪切产物的存在可能会导致下游聚集和颗粒形成，这不仅影响药物产品属性，而且可能影响安全性和效力。cSDS阐明的其他常见表达杂质是表达期间形成的重链二聚体或由于轻链（LC）的降解性丢失。cSDS也可以阐明并量化多特异性表达中的同源二聚体和不匹配杂质。为了进一步完善候选物，建议还筛选温度依赖的解链（Tm），这通常伴随着补充的温度依赖的聚集（Tagg）。虽然在较低的过程和储存相关温度下的聚集倾向可能或可能不会反映在更高温度下，动力学驱动的解链中，但可能存在相关性，并且有选择候选物的提议指南。这是因为溶液中的聚集是一个复杂的现象，不仅仅通过动力学Tm测量来预测。应对这些最初表达的领先或首选子集进行体外结合SPR或基于细胞的测定，以验证结合或活性特性，并应假设各种杂质属性，如聚集和剪切，可能会影响结合或活性。一旦选择了理想的候选物，应在启动一系列工程和格式化、下游表达、纯化、扩展特性以及配方和稳定性研究之前，通过完整质量谱（MS）确认其身份。3.2.额外或扩展特性 在选择最终候选物之前，需要进行额外的特性分析，以最大化选择具有理想质量和可开发性特性的良好候选物的可能性。在整个过程中，将非可开发性工作，如体外功能测定和/或动物模型研究，纳入考虑也是至关重要的。重要的是要在功能属性和可开发性属性之间取得平衡，因为改变一个属性，如亲和力，可能会影响另一个属性，如稳定性，反之亦然。通常，各种领先分子及其变体在目标结合亲和力和表位方面可能相似，以及它们在功能测定中的输出。这对于具有相似序列的人源化变体和多特异性构造尤其如此，其中共享类似的结合臂，但构造可能在链长度、方向或格式（如Fab与scFv）上有所不同。在这些情况下，额外的可开发性特性提供了一个极好的机会，根据它们的物理化学属性进一步区分这些分子。这可以在几个到几十个领先上完成，这取决于生成活动以及是否需要人源化、负债纠正和/或多特异性格式化。表1提供了扩展特性可开发性测定、它们测量的属性及其理由的全面总结。此外，这些测定也显示在图2所示的假设可开发性工作流程图中，作为“Tier 2”测定，包括温度依赖的解链（Tm），最好通过热量测定，等电点（pI）和电荷异质性，疏水性，自相互作用，亚可见颗粒评估，以及多特异性或非特异性相互作用。还包括了一个短期稳定性保持以评估完整性作为Tier 2活动。 3.3.温度依赖性解链 为了进一步评估构象稳定性，差示扫描量热法（DSC）可以作为黄金标准来准确测量熔化温度（Tm）的起始点和转变。一个足够高的Tm可能表明在较低温度下具有良好的或可接受的构象稳定性。理想情况下，抗体治疗的Tm起始点应大于50°C，远高于标准的加速储存温度40°C以及生理温度。因此，可以预期感兴趣的分子在生理条件下在构象上是完整的，并且在没有过度的温度依赖性解链的干扰下经受加速压力。如前所述，Tm也可能与在过程条件下的聚集倾向、甚至颗粒形成倾向相关，在配方稳定性上，或者在经受各种强制降解条件时。然而，情况并非必然如此，因此当试图区分候选物时，应将其他属性与Tm一起权衡。 3.4.等电点 通过毛细管等电聚焦（cIEF）对电荷异质性的表征至关重要，以验证pI是否可接受，并将适应平台纯化和配方工作。抗体通常具有基本的pI，这导致在酸性配方中由于分子间固有的电荷排斥而具有有利的胶体稳定性。然而，pI过低的抗体可能难以从电荷相似的宿主细胞蛋白（HCPs）中纯化出来，并且在低pH值的代表性配方中配方，这种pH值平衡了构象、胶体和化学稳定性，通常商业mAbs的pH值约为6。此外，电荷异质性的差异与新生儿受体（FcRn）依赖的PK半衰期和效力的差异有关。过高的pI与不良的非FcRn依赖的PK和生物利用度结果有关，并且通过选择性工程化可变框架或CDR区域进一步降低pI在某些情况下改善了半衰期。同样，过度的可变域电荷与小鼠、猕猴和人类中的快速清除有关。由于配方中高pI抗体通常表现出优异的胶体属性，同时通过电荷介导的非特异性结合和清除呈现PK风险，因此在提名领先候选物时应平衡胶体属性与组织分布和PK风险，并避免可能挑战纯化和配方活动的低pI。因此，抗体基治疗的pI范围在7-9之间是适当的。 3.5.疏水性和自相互作用 疏水相互作用色谱（HIC）是评估领先分子疏水性和异质性的常用方法。高度疏水的分子可能有增加的聚集倾向，与其它表面或分子非特异性相互作用，或自相互作用。特别是，抗体可变域CDRs中的疏水斑块可能表现为负面的可开发性结果。作为额外特性的一部分，应评估分子的自相互作用，或胶体稳定性。自相互作用可能导致高粘度，特别是对于双价抗体，这会损害诸如泵送、灌装和过滤等过程步骤以及注射性，特别是皮下注射剂的注射性。评估小规模或中等规模（1-2毫克）的自相互作用的典型方法涉及使用动态光散射（DLS）测量流体动力学半径（Rh）和扩散相互作用参数（kDiff）。与DLS一样，静态光散射（SLS）方法可用于获得第二维系数（B22），这是自相互作用倾向的另一个指标。测量zeta电位或总表面电荷也是表征潜在自相互作用的一个选项。在非常小的微克（µg）规模上，使用亲和捕获自相互作用纳米粒子光谱（AC-SINS），一种基于抗体偶联的金纳米粒子的测定，通过UV吸收移位揭示自相互作用，已经成功进行了高通量的自相互作用评估。也有报道其他基于纳米粒子的测定可以预测粘度。随着材料可用性的增加，可以在更高浓度（100毫克/毫升或更高）下直接评估（动态）粘度，以确定自相互作用是否显著。 3.6.完整性和针对性强制降解 分子如何在过程和储存期间保持完整性可以在早期筛选期间通过进行短期加速稳定性保持的小规模努力来评估，这通常涉及有限数量的材料，通过在代表性配方中将样品在40-50°C下保持一周。应使用分析SEC和cSDS来评估基本完整性特性，如聚集和剪切。此外，如果在计算中预测显示可能潜在热点的主要化学负债，它们可以通过有针对性的强制降解来评估，然后再进行正式的稳定性和强制降解评估。例如，如果CDRs的主要序列评估揭示了N-去酰胺化基序，如NS，分子可以在更全面评估之前经受高pH压力，这将需要更多的时间、材料和单独的规模扩大表达。表2中列出了许多其他可以通过计算序列或同源模型评估的化学负债。 3.7.颗粒 可见和亚可见（蛋白质）颗粒分析也是CMC开发中的关键工作，并且与聚集一样，是生物制剂的关键质量属性（CQA），可能导致不必要的免疫原性。因此，在领先选择之前对未受压力和受压力样品上的颗粒形成进行评估是有价值的。典型的表征和量化亚可见蛋白质颗粒的方法使用光遮挡、流成像和更近期的基于膜的技术。然而，颗粒形成高度依赖于过程和配方，因此在未定义、扩大规模的下游过程、灌装完成和配方活动之前进行评估有局限性。具体而言，在制造过程中遇到的剪切、泵送、混合和摇动压力很难在下游过程开发之前模仿。此外，聚山梨酯（PS）-20或PS-80的添加主要在早期CMC活动中进行评估，并用于防止由于过程和运输相关的机械和搅拌压力而引起的聚集和颗粒形成。从本质上讲，颗粒分析在领先选择和CMC进入之前区分领先候选物可能很有用，但在最终过程和配方变量不明确时，不用于评估绝对颗粒计数。如果无法进行颗粒分析，基于吸光度的简单浑浊度测定可以作为不太敏感的替代品来监测颗粒形成。此外，通过SE-UPLC在热应力样品上早期评估可溶性聚集速率或通过DSC在各种配方中评估解链倾向，可能与某些治疗性抗体的颗粒形成倾向相关。 3.8.多特异性或非特异性 最后，评估分子与过程组分、配方辅料或体内其他生物分子的粘性或相互作用倾向，这可能影响PK和生物利用度，是非常有价值的。分子可能如何非特异性地结合到其他分子可以通过多特异性试剂（PSR）和杆状病毒粒子（BvP）测定和交叉相互作用色谱（CIC）来评估。值得注意的是，临床阶段抗体的有利PSR和BvP属性与临床阶段进展相关。同样，适当地，在毒理学和1期研究之前，在人体血清中对领先分子进行短期完整性或生物基质体外稳定性研究也是适当的。 3.9.额外特性 对未受压力的领先分子进行额外的特性分析也可能是必要的，并且有价值，例如测量可集中性（至150 mg/ml及以上）、在不同配方pH值和浓度下的粘度、在不同配方pH条件下的聚乙二醇（PEG）溶解度，以及在不同配方条件下的DLS相互作用参数。如果临床或商业目标产品档案（TPP）需要高浓度配方以支持高剂量或通过预充注射器进行皮下注射，这一点尤其关键，因为这些额外的活动旨在表征高度浓度依赖的抗体或蛋白质行为。此外，特定多特异性分子（如Duobodies）的游离巯基含量可以通过反相色谱、基于荧光的定量或MS来测量，以确定二硫键在组装期间是否正确形成，或调查由于二硫键断裂可能导致的稳定性问题。 3.10.最终领先选择和CMC进入 为确认用于研究性新药（IND）支持研究的最终领先候选物，该分子应对平台纯化和配方方法有适应性，并且具有可接受的稳定性和强制降解属性。这在图2中强调为“Tier 3”活动。适当评估和缓解重大可开发性问题和负债有助于确保对过程、产品质量、临床供应和多年来临床开发的批次可比性的控制。还应考虑TPP需求和要求，以适应特殊情况，如高浓度配方或替代药物产品展示。 3.11.纯化过程 领先分子应可接受地良好表达，理想情况下应适应基于平台的纯化策略。虽然最终领先可能基于瞬时表达材料被选中，但来自稳定细胞系的材料可能在纯度和产量上表达更高，并且具有更具代表性的核心糖基化谱。经过所有平台纯化步骤（如ProA亲和、低pH灭活、阴离子交换（AEX）流穿和阳离子交换（CEX）结合及洗脱过程）后，最终领先应具有可接受的产量和纯度。在抛光过程中也常使用混合模式离子交换树脂。如果出现需要过程改进的问题，如产量和/或纯度低，这可能影响领先选择或需要重新设计分子。如果采取过程缓解策略，理想情况下，缓解措施简单且易于制造。一个例子是在过程步骤中简单添加稳定剂，如pH调整，以防止聚集或颗粒形成。 3.12.稳定性和强制降解 应在40°C下进行短期加速稳定性研究，通常在溶液中进行长达一个月的更高蛋白质浓度，以及强制降解评估，以确定分子是否具有可接受的可开发性和CMC风险。（加速）稳定性评估是为了确定分子是否具有主要完整性或异质性问题，评估蛋白质浓度依赖的行为，特别是聚集，预测液体配方的长期稳定性，并确定是否需要显著的配方优化或缓解。因为降解机制可能遵循阿累尼乌斯动力学，这项加速研究也可能预测长期的常温储存稳定性和保质期。然而，温度依赖现象，如聚集，可能是复杂的，并不遵循阿累尼乌斯动力学，然而在更高温度下加速这一过程对于在发现阶段节省时间是必要的。理想情况下，对稳定性进行评估的平台配方可以适应毒理学研究和1期剂量要求，可以轻松地向下转换，并使用常见的“通常认为安全”（GRAS）辅料，如组氨酸和蔗糖。蔗糖或类似的糖也应使用，以进一步协助稳定，特别是用于冻干保护和达到等渗性。使用蔗糖的另一个优点是，如果可开发性工作未能在液态中充分稳定分子，它适用于冻干。用于评估这些受压样品的完整性和异质性的分析方法应代表标准的CMC释放和稳定性测定，如SE-HPLC、cSDS和cIEF。此外，应进行肽图MS和结合评估，以确定是否发生特定部位的化学修饰，它们发生在哪里，以及它们对结合和活性的潜在影响。因此，在进行更彻底的配方评估之前，包括在代表性容器封闭中优化pH和辅料（通常是玻璃瓶或预充注射器（直接皮下注射的情况）），通常对潜在问题以及过程和配方工作如何缓解它们有很好的了解。例如，在更高的抗体浓度下，自结合可能导致高粘度，导致过程、稳定性和/或注射性结果差。如果存在自相互作用问题，它们可以通过降低pH的配方工作来缓解，或使用粘度修饰剂，如精氨酸，NaCl，甘氨酸，和最近，咖啡因。 用于评估化学稳定性的常见强制降解条件是低pH、高pH、生理pH和化学和/或光压力。在领先选择之前评估一些配方条件允许可开发性科学家更好地了解配方和pH依赖的行为，如果各种pH在加速、固定温度下进行评估，这也可以从强制降解条件中利用。例如，低pH、代表性配方pH、生理pH和高pH都可以在40°C下评估一周。因此，如果观察到化学负债，如剪切、去酰胺化或异构化，可以从研究结果中了解其pH依赖的行为，进一步表明负债如何影响过程、配方工作和给药后行为。此外，大多数化学负债在pH或反应物浓度方面是伪一级的，因此它们在较低的蛋白质浓度下可以评估它们的倾向。因此，这些强制降解评估揭示了如何通过配方pH或是否需要工程和/或替代分子选择来缓解问题的线索。这种方法的一个例子是评估去酰胺化机制和速率，无论是实验上还是计算上，与配方pH相比。 3.13.修正工程 尽管不理想，但在最终领先候选物上进行全面的可开发性评估，当已经投入了大量的发现时间和资源时，如果出现重大负债，如过高或过低的pI、聚集、去酰胺化或自相互作用等令人担忧的风险，可能需要进行修正工程。在确定化学或物理负债的严重性时，必须考虑其性质、位置和降解速率。此外，其对pH值、温度和抗体浓度的依赖性很重要，其对目标结合以及免疫原性或不良药代动力学等其他属性的影响至关重要。虽然负债的性质和数量在整体可开发性风险中占有重要地位，但潜在缓解措施的数量和性质也很重要。一个常见的例子是聚集，它可以通过工程纠正，但通常通过纯化去除、调节配方pH值或使用精氨酸或蔗糖等稳定剂来改善。表2中总结了主要负债、它们的常见发生方式和潜在缓解策略。 一个可能需要分子工程的常见负债是天冬酰胺去酰胺化，因为它通常是伪一级碱催化的，并且在更高的pH值下加速，包括生理pH值。常见的热点基序通过主要N、N+1序列签名（如NG、NS、NT和NN）来阐明。这些主要序列基序的存在使去酰胺化成为可能，而去酰胺化的潜力进一步因位于表面暴露区域（如CDRs）和主链灵活性和构象而增强。由于去酰胺化在更高的pH值和温度下加速，它通常不是低pH值、低温液体配方中的储存问题。然而，如果发生去酰胺化，它在生理细胞培养条件和生理pH值及温度下的给药后是不可避免的，它将在高温下持续数周。此外，去酰胺化在蛋白质中非常普遍，并且是更强大的化学降解机制之一。因此，如果可变区域（如重链（HC）-CDR3）存在热点去酰胺化位点，应进行修正，这反过来可能影响异质性、活性和功能。有实例表明，当在生理pH值和温度下观察到5-10%的去酰胺化率时，治疗分子已被选择进行修正。较低水平可以在进入开发时进行监测，但可能可以继续进行，无需修正，因为总体水平不太可能达到显著百分比。如果去酰胺化影响结合或活性，关键关键属性，修正的需求就会增加，因为这也会增加关键性。天冬酰胺去酰胺化位点也可以突变为天冬氨酸，去酰胺化产物之一，并评估目标结合以确定其影响。此外，可以将通过肽MS确定的mAb可变位点去酰胺化率与保守的Fc去酰胺化位点（即NGQPENNYK）进行比较，以确定热点去酰胺化的准确性和相对严重程度。 像去酰胺化一样，另一个常见负债是甲硫氨酸/色氨酸（Met/Trp）氧化，这可以通过强制氧化研究有效评估。轻度氧化可以氧化敏感的Met和Trp残基，而常用的化学氧化剂叔丁基过氧化氢和偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐分别倾向于特异性地氧化Met和Trp残基。如果氧化被证明相当广泛，可以尝试进行修正工程，但通常暴露的CDR Trp残基更难以纠正并保持生物活性。与去酰胺化不同，氧化风险可以通过使用抗氧化剂如乙二胺四乙酸的配方工作更容易地缓解，这些抗氧化剂与从过程或药物容器组分中浸出的金属氧化剂螯合，并且甲硫氨酸作为竞争性过氧化氢清除剂。此外，可以使用琥珀色或防紫外线玻璃瓶进一步保护液体药品免受光氧化。虽然Met/Trp氧化是CQA，需要适当的缓解，必要时应尝试进行修正，但市场上有成功的商业产品在批准的配方中没有抗氧化剂的情况下，具有反应性CDR Met氧化。 4.早期CMC开发 4.1.配方开发 在对提名的领先候选物在分子属性和潜在重大负债方面有了很好的了解之后，应进行更全面的配方开发评估。这通常发生在IND申请提交之前以及制造和灌装完成工作的发现和早期CMC界面。配方开发活动包括优化配方pH值、聚山道/表面活性剂类型和浓度，并在相关产品展示中评估诸如搅拌和冷冻/解冻等不同压力。此外，可以确认以前的可开发性工作，特别是稳定性和强制降解评估。 在考虑配方优化方法时，阐明pH依赖行为的以前的强制降解评估也可以帮助确定是否通过改变配方来减少一个负债可能会加剧另一个不需要的负债，如聚集或剪切。例如，降低配方pH值以增加胶体稳定性和减少自结合也可能促进聚集、剪切或天冬氨酸（D）异构化。同样，提高pH值可能会促进额外的负债，如N-去酰胺化。在图3中，这个概念针对各种潜在负债与pH值进行了图解。重要的抗体属性，如构象和胶体稳定性，以及聚集、剪切和去酰胺化等负债，显示为对溶液pH值的增加倾向或风险。然而，应当注意，这些现象仍然是抗体依赖的，某些负债可能根本不显著或根本不存在，特别是在可变域中。因此，最终配方应旨在平衡所讨论分子的各种分子属性和负债的稳定化。 图3. 示意图显示了潜在负债及其发生的倾向与溶液pH值的关系。箭头指示每个属性倾向增加的方向。 如果可开发性风险太大或即使在优化的液体配方中也可能无法管理，可以使用冻干法来稳定药物产品形式中的分子，但随后需要额外的加工和给药/重建期间的步骤。如果长期储存稳定性是一个问题，可以考虑在早期开发中使用冷冻液体小瓶，待3期过程和配方锁定后进行额外的配方改进或优化。然而，额外的冻融周期可能会导致不需要的并发症，如分子变性和容器封闭完整性问题。 4.2.分析开发 总的来说，冷藏液体配方是临床开发中最直接和多功能的呈现形式。支持这一点的因素有：1）只需要评估一种呈现形式，2）不需要额外的冻干或冷冻过程，3）在给药期间不需要重新组合或解冻，4）液体形式很容易适应瓶装和预充注射器容器封闭系统。然而，治疗性抗体可能容易在液体状态下在过程、储存和体内降解。因此，在领先选择之前，至关重要的是要理解治疗性抗体在溶液中的物理化学行为，以及在模拟过程、配方和类似生理条件下的不同条件下的行为。 分析方法开发和CMC释放和稳定性分析的确认，以评估关键质量属性（CQAs），是在最终领先选择后的另一个关键交付领域。通常，发现阶段使用的分析方法可以利用到早期CMC评估和确认，因为它们通常是平台驱动的。例子包括尺寸排除高效液相色谱（SE-HPLC）和毛细管十二烷基硫酸钠电泳（cSDS），可能需要一些修改或优化，但可以利用常见的分离柱、流动相、样品准备程序和毛细管。在CMC开发的后期，对杂质识别和方法验证有了更多的了解。然而，由于在CMC开发之前选择了领先，就如何检测和量化杂质和/或异质性的分析方法做出了假设。幸运的是，用于评估CQAs的分析方法可以充分检测和量化聚集、剪切、pI和电荷异质性，通常不需要广泛的优化或定制。此外，全面的发现阶段可开发性评估应评估其他分子属性，如Tm、疏水性和自相互作用，以便更好地了解治疗分子的分子属性，从而使下游开发风险更加明确。 4.3.过程开发 对于大分子生物制剂的另一个关键交付物是稳定的细胞系开发（CLD）。这可以跟在彻底表征和瞬时表达的候选物的最终领先选择之后进行，其中稳定的CLD旨在优化滴度表达，同时保持理想的纯度属性，不引入新的负债。通过这样做，开发和选择单一克隆，通常源自CHO-K1或CHO-S，优化细胞生长和活性，以产生高质量和滴度的抗体产品。CLD活动可以在风险上的多个领先候选物上提前开始，以缩短最终领先选择阶段的时间表，特别是在稳定池的细胞系生成阶段，特定基因转座酶靶向的进步可能进一步加速稳定克隆的选择。在CLD稳定克隆选择过程的后期，应专注于最终领先候选物。评估多个领先候选物用于稳定CLD生产的这种方法对于多特异性抗体特别有利，其中亚单位化学计量和正确组装可以在瞬时表达努力之外进行优化。虽然瞬时表达多特异性变体然后纯度表征可能选择具有改进组装和减少常见杂质形成的变体，如同源二聚体或半分子形成，但稳定的CLD可能在这方面进行改进或完全依赖于以合理的滴度和纯度组装所需产品，以促进下游处理工作。例如，Wang及其同事通过稳定细胞系的生成和选择最佳克隆，展示了改进的双特异性表达和减少的同源二聚体杂质。这样的高质量表达减少了下游纯化和灌装/完成活动的负担和风险，以生产可接受的产量和纯度的产品。此外，核心Fc N-糖基化异质性通常由细胞系表达参数和条件定义。稳定的CLD可以确认这是否受到控制并且是理想的异质性，但也可以确定分子变体是否影响这种异质性，如果CLD在最终领先选择之前应用于它们，特别是对于Fc工程变体。 虽然调查基本分子属性的领先候选物通常只需要亲和纯化，但通过确定的储存稳定性和强制降解研究评估的最终领先应该通过类似于制造的完整纯化过程进行纯化。如前所述，这将包括ProA亲和、低pH保持、AEX流穿和CEX结合和洗脱过程。这些纯化步骤应该将感兴趣的分子纯化到高纯度和可接受的异质性。低pH保持步骤通常在pH 3.5-4.0下进行，主要灭活内源性和偶然病毒，但也可能导致抗体剪切或聚集。或者，如果分子在低pH下不稳定，可以使用洗涤剂进行病毒灭活。AEX流穿步骤主要去除带负电荷的分子，如HCPs、DNA和RNA，这些基本纯度特性分析（如SE-UPLC和cSDS）不敏感。CEX步骤旨在完全抛光感兴趣的分子，并进一步去除聚集体、错误组装或断裂的分子，或不需要的异质性，包括过量的糖基化或电荷异质性。选择CEX树脂用于特定抗体的纯化通常是经验性的，但建议采用默认或平台方法，直到需要进一步优化。为了配方药物物质，超滤/透析（UF/DF）是一个关键活动，其中感兴趣的分子被缓冲液交换和浓缩到所需的配方，通常在添加聚山道之前。在可开发性和早期开发工作中，产品质量属性侧重于由诸如SE-HPLC/UPLC、cSDS、cIEF和颗粒分析等分析定义的散装纯度特性，特别是当决定领先分子或配方时。然而，为了提供用于动物研究、良好实验室规范毒理学研究和随后的临床研究的材料，这些研究需要在良好生产规范条件下生产的药物，其他过程和释放分析评估潜在污染物至关重要，如CHO DNA水平、生物负荷和内毒素。 5.四大可开发性属性 影响所有可开发性结果的四大属性是构象、胶体、化学和其他相互作用。许多属性，如聚集，被清楚地理解为主要由解链驱动，因此被归类在“构象”类别中。其他可开发性结果并不那么明显或容易分类。其他问题，如制造中的问题机械问题或辅料质量的问题，可能影响开发结果，但如果它们与治疗分子无关，则在这里不被视为可开发性问题。治疗分子与辅料或药物产品容器之间的问题相互作用是分子可开发性问题，因为它们与分子的固有属性有关。例如，分子可能在过滤或UF/DF操作过程中由于自结合引起的高粘度而出现过程失败。在表3中，我们总结了许多常见的可开发性和/或CQAs，这些属性影响领先选择和CMC开发，以及潜在的安全性和有效性，并将每个属性归类为四大类别之一或多个。还包括了确保成功可开发性结果的关键标准的例子。应该注意的是，虽然每个类别可以独立描述，但它们并不完全独立，因为一个属性可能影响另一个。例如，化学去酰胺化和/或氧化可能在构象不稳定或聚集中出现，反之亦然。 5.1.构象稳定性 构象稳定性属性可以影响聚集速率、DSC（或Tm）的温度依赖性解链、化学变性倾向以及不溶性颗粒的形成。CMC稳定性和释放分析分析，如尺寸排阻色谱（SEC）和亚可见颗粒分析，明显地分别评估了可溶性和不溶性聚集，这主要是由蛋白质解链驱动的，尽管它们也可能受到其他因素的影响，如天然表面静电和疏水性。聚集通常是由部分解链分子之间的共价和非共价结合混合而成的，并且依赖于pH值、温度和浓度。如果有问题，聚集的性质可以通过圆二色谱或傅里叶变换红外光谱进一步探索，以评估变性或解链时二级和三级结构的变化。此外，可以通过DSC分析解链的可逆性，以衡量配方中聚集可能的可逆性。构象稳定性也会影响除聚集和温度依赖性解链之外的许多其他结果。例如，表达或纯化产量差可能是由于表达时不完全折叠或在纯化过程中遇到的各种pH值或离子强度环境中解链所致。高度构象状态的存在可能导致通过各种方法（如HIC）确定的异质性增加。部分解链抗体形成的可溶性聚集体和不溶性颗粒不仅存在CQA问题，还存在免疫原性风险。给药后，结构不良或构象多样性分子可能导致增加的免疫原性或不良的药代动力学/生物利用度，因为在解链/聚集状态下展示的一系列表面可能触发免疫反应或简单地被快速清除。 5.2.化学稳定性/特性 化学稳定性受翻译后修饰（PTMs）的影响。如上所述，天冬酰胺去酰胺化和甲硫氨酸/色氨酸氧化是影响质量和功能属性的两种最常见的PTM。通常，位置、溶剂可及性和局部主链构象和/或灵活性支配固有的分子反应性。这些修饰和其他修饰通过质谱进行特定位点的评估，但其他方法如反相（RP）-HPLC或HIC可能有助于监测氧化的异常变化，同样，cIEF用于监测去酰胺化。还有许多其他修饰存在，如焦谷氨酸形成、非酶促的赖氨酸糖化、天冬氨酸异构化、主链剪切或断裂以及二硫键还原和错配。其他修饰，如天冬酰胺糖基化，是酶促的，受表达条件和分子固有序列及结构属性的驱动。CQAs包括许多化学修饰，特别是天冬酰胺去酰胺化、甲硫氨酸/色氨酸氧化和天冬氨酸异构化，这些修饰对成功的CMC开发至关重要，因为它们也会影响活性、安全性和有效性。在最近的一项研究中，单克隆抗体的天冬氨酸异构化与增加的免疫原性相关。此外，抗体甲硫氨酸氧化已被证明通过影响与FcRn受体的结合而对体内半衰期产生负面影响。治疗性抗体CDR区的N-去酰胺化已被证明会影响目标结合数级，保守的Fc去酰胺化（在N325）已被证明通过减少FcγRIIIa结合而影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。这一类还包括由表面特性定义的属性，如pI和疏水性，尽管这两种属性都可能导致其他不良结果，特别是聚集、自相互作用或非特异性相互作用。 5.3.胶体稳定性 胶体稳定性指的是分子非共价自结合形成“胶体”或更大复合物的能力，这些复合物影响整体溶液流变学和粘度。在这里，我们将自相互作用与聚集区分开，因为后者由（部分或完全）解链分子的复杂网络组成。像自相互作用一样，聚集可以是可逆的，但它主要是不可逆的，特别是在高阶聚集体中。因此，聚集体是长寿的，可以通过尺寸排阻色谱、分析性超速离心或甚至场流分离等色谱技术进行评估。在自相互作用或自结合的情况下，折叠的、天然的分子以高度瞬态和浓度依赖的方式可逆地结合，这不能直接通过使用分析样品量在稀薄浓度下进行的色谱技术直接检查。特别是在双价抗体中，自结合可以在更高的配方浓度下导致大的寡聚复合物。因为双价性增强了导致粘度增加的抗体寡聚化，当格式化为多特异性抗体时，自相互作用风险可能会发生变化，其中Fab价可能会改变。此外，已报道抗体自相互作用导致稳定性和溶解度降低，甚至可能发生相分离和凝胶化。在一份报告中，去除一个横跨HC-CDR1和HC-CDR2的疏水表面纠正了体外自相互作用，改善了血清半衰期和非特异性组织结合，暗示自相互作用的高倾向也可能通过相同的界面与其他分子的非特异性相互作用相关。由于自相互作用通常是由至少一个相互作用分子中的CDR残基介导的，这些残基也介导目标结合，因此在保持理想活性的同时，可能很难通过工程或突变来纠正自相互作用。此外，可能很难从结构上预测两个分子将如何自相互作用或自结合。最近，通过晶体学和建模工作，已显示抗体通过CDR装置以对称的“面对面”方式自相互作用。其他报告已经证明了Fab-Fc自相互作用，这可以通过IgG1/IgG4同种型转换来缓解。值得注意的是，配方辅料和调节配方pH已被证明在几个实例中通过减少蛋白质-蛋白质相互作用来降低粘度。由重链在表达期间的独特自相互作用驱动的重链二聚体形成，最近也被报道为可开发性问题。 5.4.其他相互作用 其他相互作用包括那些可能影响过程、药物产品或体内行为的治疗分子之间的相互作用。例如，治疗分子与过程组分、配方辅料、药物产品容器之间的相互作用，以及与表达HCPs和体内生物分子的相互作用。治疗分子可能与过程组分（如过程泵和过滤器）不利地相互作用或吸附，或帮助促进从不锈钢中渗出铁、铬、铜和镍等金属，这可能导致产品氧化和不稳定。其他常见的相互作用可能是与分析柱树脂的相互作用，如尺寸排阻HPLC，这可能使直接分析CQAs复杂化。治疗分子也可能与配方辅料不利地相互作用，尤其是聚山道，这可能导致不稳定性，如聚集体的形成或氧化降解。有趣的是，假定通过与治疗抗体的相互作用在纯化去除中存活下来的酶促HCP，已被报道可以降解聚山道，这反过来又导致了抗体稳定性和颗粒问题。如果在纯化过程中没有去除，酶促或蛋白水解HCP也可以直接降解感兴趣的抗体，除了呈现一般的免疫原性风险。其他污染风险，如脂多糖内毒素，可能通过与感兴趣的抗体的相互作用存活下来。抗体与药物产品容器的相互作用，特别是与瓶塞橡胶或注射器塞子硅涂层的相互作用，可能导致颗粒形成，通常与外来颗粒或硅油滴结合，尽管配方是这些现象的主要驱动因素。抗体相互作用或吸附可能在产品给药期间与各种附件发生，如静脉袋或泵送设备。 给药后，目标分子可能与各种生物分子特异性或非特异性地相互作用，可能导致药代动力学不良、生物利用度和效力不佳。一个例子包括去除IgG1和IgG4抗体上的电荷“斑块”，不影响pI，结果在小鼠中改善了半衰期和分布，这与体外减少非特异性结合相关（对CHO细胞和肝素）。还有其他例子，高度特异性与其他生物分子的相互作用导致了负面的临床结果，例如，抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抗体camrelizumab与血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）和其他两种分子之间的强结合相互作用，导致了强大的VEGFR2激动作用和血管瘤。值得注意的是，其他抗PD-1疗法，如nivolumab和pembrolizumab，不会导致VEGFR2激动作用，因此这种副作用是camrelizumab非特异性（激动剂）效应所独有的。虽然这些不需要的相互作用在发现阶段几乎不可能完全预测，但最近开发了各种分析方法，可能有助于预测它们发生的可能性。杆状病毒粒子测定（BvP）通过ELISA或流式细胞术评估对各种蛋白质池的非特异性结合，并已与人类的清除率相关。PSR测定是使用CHO膜提取物评估对感兴趣分子的非特异性结合的类似方法，已与其他用于预测非特异性的测定相关。肝素色谱用于将体外保留时间与小鼠和生理模型中的抗体清除率相关。在Jain及其同事的一项研究中，与这些预测非特异性测定相关的可开发性标志物对于处于开发后期的治疗性抗体有所减少。与高级临床阶段的相关性表明，这些非特异性测定可能预测影响临床终点（如安全性和有效性）的体内相互作用。这似乎引入了在IND前阶段评估复杂非特异性相互作用的新兴趋势，以增加临床成功的可能性。可开发性早已被证明对于预测CMC开发结果和制造成功特别有用。然而，由于没有文献引用将CMC失败作为临床失败的直接原因，人们普遍认为临床结果不能通过可开发性评估来预测。然而，将非特异性纳入可开发性评估及其最近与临床成功的相关性表明情况可能并非如此。事后看来，作为可开发性属性的改进多特异性与临床进展的相关性意味着临床失败可能以前是由次标准的可开发性属性引起的。其他更常用的表征工具，如HIC，可以评估疏水性，这通常与非特异性结合和整体“粘性”相关。其他报道用于评估潜在非特异性相互作用的方法是CIC和站立单层吸附色谱。如果最近显示可预测非特异性相互作用的测定尚未纳入可开发性工作流程，标准的过程和分析方法可能会提供线索。例如，治疗分子可能非特异性地结合到纯化和分析树脂上，或者通过HIC计算或实验性地显示出高表面疏水性。34 这些信息可以在决定领先时考虑。 6.计算机计算工具的进步 6.1.预测计算 近年来，使用计算工具来预测抗体的可开发性和质量属性变得越来越普遍。通常，这些工具基于序列和/或结构导出的参数，筛选和/或将初始命中或候选物筛选成更有希望的领先分子。使用抗体同源模型和计算表面属性，已经可以预测聚集、粘度、化学不稳定性、和药代动力学清除等可开发性属性。本质上，这些方法可以在表达、纯化和表征之前，将数百个候选物计算筛选成相对较小的子集。为了计算预测浓度依赖的粘度，通常评估净可变域或总抗体电荷以及表面疏水性指数。 有趣的是，Tomar及其同事根据全长同源模型获得的疏水性和静电参数，预测了16个单克隆抗体的总抗体粘度曲线。他们发现与总可变重（VH）和可变轻（VL）电荷、疏水表面积、zeta电位和令人惊讶的WALTZ聚集倾向有最大的统计显著性。在对60个IgG1单克隆抗体的研究中，抗体同源模型的分子动力学模拟将粘度与疏水性、净电荷和电荷分布相关联。此外，快速体内清除与高度带电和/或疏水性CDRs相关。在这项研究中，分子动力学模拟输出，如潜在反应性残基的溶剂可及性，也与实验色氨酸氧化和天冬氨酸异构化率相关。值得注意的是，对100多个临床阶段抗体治疗的研究表明，平均重链-CDR3长度比评估的成千上万的临床前抗体序列短，表明较短的长度被选择，因为它们导致更好的可开发性结果。在同一研究中，对于CDR区域，类似的发现被报道在疏水性斑块度量方面。许多基于网络的工具使用基于结构的表面行为计算来预测蛋白质的稳定性或可开发性概况，如治疗性抗体分析器（TAP）、SAP（空间聚集倾向）、Abpred（抗体预测数据库）用于疏水性预测，以及SAbPred（结构抗体预测数据库），包括建模、注释、人源化和可开发性预测工具。迄今为止，有许多例子表明，计算模型已经成功预测了大量抗体的聚集、粘度、化学稳定性和体内行为的实验结果。 6.2.机器学习和人工智能 在此基础之上，使用机器学习（ML）和人工智能（AI）来预测可开发性属性，如粘度和聚集倾向。序列、结构和分子动力学已被用于训练机器学习算法，然后尝试预测分子属性。最近的例子包括使用ML预测亲和力和特异性、去酰胺化、甲硫氨酸氧化、疏水性、和粘度。最近，AI被探索用于通过预测蛋白质-溶剂相互作用来揭示最佳抗体和蛋白质配方。在蛋白质结构预测方面，AlphaFold和AlphaFold2最近已商业化推出，用于预测蛋白质结构甚至其复合物。ABlooper（抗体“Looper”）被开发为一种深度学习工具，可以从抗体序列中轻松预测CDR结构。虽然它们在制药行业的使用可能并不普遍，但AI/ML的出现可能成为常规，作为最初的计算努力的一部分，在任何实验努力之前筛选和评估分子属性和相互作用。 7.结论 抗体和蛋白质治疗的可开发性是推动和推进领先候选物优化和选择进入IND支持和临床研究的关键活动。适当和彻底的可开发性研究不仅检查将代表过程和药物产品适应性潜在CQAs，而且阐明可能影响给药后安全性和有效性以及最终临床成功的分子属性。最近在计算方法和非特异性评估方面的进展也有助于简化和实现更有针对性的可开发性评估。我们提出这四大属性的大型分子抗体和蛋白质治疗作为影响所有可开发性结果的属性：1）构象，2）胶体，3）化学，和4）其他相互作用。在发现阶段可开发性和早期开发活动中对这些属性及其风险进行全面检查，提供了最好的可能性，即强大和高质量的领先候选物被提升，潜在的CMC和临床开发风险是可控的。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。