NANOG

1月14日，上海交通大学研究团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了研究论文，题为“AGD1/USP10/METTL13 complexes enhance cancer stem cells proliferation and diminish the therapeutic effect of docetaxel via CD44 m6A modification in castration resistant prostate cancer”，本研究中，研究人员发现AGD1 在前列腺癌干细胞（PCSCs）和外泌体中的表达上调。下调 AGD1 可通过抑制其干性增强去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛治疗的敏感性，反之亦然。RNA 下拉结合质谱（MS）、免疫共沉淀（co-IP）和 RNA 免疫沉淀（RIP）实验表明，AGD1 与 METTL13 和 USP10 结合，形成复合物，通过 USP10 诱导的去泛素化促进 METTL13 蛋白的积累。MeRIP 实验和 SELECT 实验揭示，METTL13 通过 m6A 甲基化转录控制 CD44 的 mRNA 降解。此外，这一过程激活了 pSTAT3/PI3K-AKT 信号通路。研究还表明，降低 AGD1 表达可增强多西他赛在 CRPC 中的治疗效果。总之，本研究表明AGD1 通过 USP10/METTL13 介导的 CD44 mRNA 降解增强肿瘤生长和转移，从而介导前列腺癌干细胞的干性和凋亡，并促进去势抵抗性前列腺癌对多西他赛治疗的耐药性。 1月14日，上海交通大学研究团队在期刊《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表了研究论文，题为“AGD1/USP10/METTL13 complexes enhance cancer stem cells proliferation and diminish the therapeutic effect of docetaxel via CD44 m6A modification in castration resistant prostate cancer”，本研究中，研究人员发现AGD1 在前列腺癌干细胞（PCSCs）和外泌体中的表达上调。下调 AGD1 可通过抑制其干性增强去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛治疗的敏感性，反之亦然。RNA 下拉结合质谱（MS）、免疫共沉淀（co-IP）和 RNA 免疫沉淀（RIP）实验表明，AGD1 与 METTL13 和 USP10 结合，形成复合物，通过 USP10 诱导的去泛素化促进 METTL13 蛋白的积累。MeRIP 实验和 SELECT 实验揭示，METTL13 通过 m6A 甲基化转录控制 CD44 的 mRNA 降解。此外，这一过程激活了 pSTAT3/PI3K-AKT 信号通路。研究还表明，降低 AGD1 表达可增强多西他赛在 CRPC 中的治疗效果。 总之，本研究表明AGD1 通过 USP10/METTL13 介导的 CD44 mRNA 降解增强肿瘤生长和转移，从而介导前列腺癌干细胞的干性和凋亡，并促进去势抵抗性前列腺癌对多西他赛治疗的耐药性。 https://jeccr-biomedcentral-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/10.1186/s13046-025-03272-3#Sec29 https://jeccr-biomedcentral-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/10.1186/s13046-025-03272-3#Sec29 背景信息 背景信息 01 01 根据最新的全球统计数据，前列腺癌（PCa）已成为泌尿系统中老年男性发病率和死亡率的首要原因。前列腺癌迅速进展至去势抵抗性前列腺癌（CRPC）这一关键阶段，会显著缩短总体生存期（OS）。根据最新指南，多西他赛等化疗药物是这一阶段的一线治疗选择。然而，大多数患者不可避免地会产生治疗耐药性，恢复多西他赛的化疗敏感性将有利于前列腺癌患者。肿瘤内的癌症干细胞（CSCs）是一小部分异质性细胞，具有多能性。与 CSCs 类似，前列腺癌干细胞（PCSCs）可通过 CD44、CD133、CD49f、整合素α2/β1、ALDH1、KLF4、SOX2、NANOG 和 P63 等标志物加以区分。利用这些标志物，可通过流式细胞术（FACS）或磁激活细胞分选术（MACS）从细胞系和手术组织中分离出 PCSCs。此外，类器官是一种支持前列腺癌长期扩增的三维培养系统，有助于研究干细胞与癌细胞之间的相互作用，使其成为筛选新型治疗药物的有价值的临床前工具。在本研究中，研究人员探讨了 AGD1 通过影响前列腺癌细胞的干性在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛耐药治疗中的作用。 根据最新的全球统计数据，前列腺癌（PCa）已成为泌尿系统中老年男性发病率和死亡率的首要原因。前列腺癌迅速进展至去势抵抗性前列腺癌（CRPC）这一关键阶段，会显著缩短总体生存期（OS）。根据最新指南，多西他赛等化疗药物是这一阶段的一线治疗选择。然而，大多数患者不可避免地会产生治疗耐药性，恢复多西他赛的化疗敏感性将有利于前列腺癌患者。肿瘤内的癌症干细胞（CSCs）是一小部分异质性细胞，具有多能性。与 CSCs 类似，前列腺癌干细胞（PCSCs）可通过 CD44、CD133、CD49f、整合素α2/β1、ALDH1、KLF4、SOX2、NANOG 和 P63 等标志物加以区分。利用这些标志物，可通过流式细胞术（FACS）或磁激活细胞分选术（MACS）从细胞系和手术组织中分离出 PCSCs。此外，类器官是一种支持前列腺癌长期扩增的三维培养系统，有助于研究干细胞与癌细胞之间的相互作用，使其成为筛选新型治疗药物的有价值的临床前工具。在本研究中，研究人员探讨了 AGD1 通过影响前列腺癌细胞的干性在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛耐药治疗中的作用。 研究进展 研究进展 02 02 为了探究 METTL13 在多西他赛耐药性中的作用，研究人员利用 METTL13 shRNA 或过表达质粒建立了 PC3 和 DU145 细胞系。实时 PCR 和蛋白质印迹分析表明，METTL13 shRNA-1 的敲低效率高于 shRNA-2。细胞增殖实验和 EdU 掺入实验表明，多西他赛处理的 CRPC 细胞在 METTL13 过表达后增殖显著增加，而 METTL13 敲低后增殖减少，这些效应可通过 AGD1 逆转。蛋白质印迹分析证实，METTL13 过表达时 KLF4 和 CD44 在 PC3 和 DU145 细胞中上调，而 METTL13 敲低时则下调。在体内实验中，皮下肿瘤体积在 METTL13 过表达时增大，而在 shMETTL13 处理和每周两次腹腔注射 10 毫克/千克多西他赛时减小。综上所述，这些发现表明 METTL13 降低了 CRPC 细胞对多西他赛化疗的敏感性，且这种效应可通过 AGD1 逆转。 为了探究 METTL13 在多西他赛耐药性中的作用，研究人员利用 METTL13 shRNA 或过表达质粒建立了 PC3 和 DU145 细胞系。实时 PCR 和蛋白质印迹分析表明，METTL13 shRNA-1 的敲低效率高于 shRNA-2。细胞增殖实验和 EdU 掺入实验表明，多西他赛处理的 CRPC 细胞在 METTL13 过表达后增殖显著增加，而 METTL13 敲低后增殖减少，这些效应可通过 AGD1 逆转。蛋白质印迹分析证实，METTL13 过表达时 KLF4 和 CD44 在 PC3 和 DU145 细胞中上调，而 METTL13 敲低时则下调。在体内实验中，皮下肿瘤体积在 METTL13 过表达时增大，而在 shMETTL13 处理和每周两次腹腔注射 10 毫克/千克多西他赛时减小。综上所述，这些发现表明 METTL13 降低了 CRPC 细胞对多西他赛化疗的敏感性，且这种效应可通过 AGD1 逆转。 研究人员采用肺转移模型来研究 AGD1 敲低后对多西他赛的化疗敏感性。研究显示，在 PC3 和 DU145 细胞中敲低 AGD1 后，多西他赛的治疗效果显著增强，转移病灶明显减少。此外，研究人员还采用类器官模型进一步研究多西他赛的治疗效果。实时 PCR 确认 shRNA 显著沉默了 AGD1 的表达。细胞增殖实验表明，在第五天，用 shAGD1 处理的类器官在多西他赛作用下细胞活力降低。此外，AGD1 敲低后类器官的直径显著减小。另外，研究人员还研究了 PC3 和 DU145 细胞中 AGD1 敲低或过表达后信号通路的变化。蛋白质印迹分析显示，AGD1 敲低或过表达后 pSTAT3/PI3K-AKT 通路发生显著变化，而 NFκB 和 ERK1/2 通路基本未变。这些结果综合表明，AGD1 敲低通过 pSTAT3/PI3K-AKT 信号通路增强了多西他赛在去势抵抗性前列腺癌中的治疗效果。 研究人员采用肺转移模型来研究 AGD1 敲低后对多西他赛的化疗敏感性。研究显示，在 PC3 和 DU145 细胞中敲低 AGD1 后，多西他赛的治疗效果显著增强，转移病灶明显减少。此外，研究人员还采用类器官模型进一步研究多西他赛的治疗效果。实时 PCR 确认 shRNA 显著沉默了 AGD1 的表达。细胞增殖实验表明，在第五天，用 shAGD1 处理的类器官在多西他赛作用下细胞活力降低。此外，AGD1 敲低后类器官的直径显著减小。另外，研究人员还研究了 PC3 和 DU145 细胞中 AGD1 敲低或过表达后信号通路的变化。蛋白质印迹分析显示，AGD1 敲低或过表达后 pSTAT3/PI3K-AKT 通路发生显著变化，而 NFκB 和 ERK1/2 通路基本未变。这些结果综合表明，AGD1 敲低通过 pSTAT3/PI3K-AKT 信号通路增强了多西他赛在去势抵抗性前列腺癌中的治疗效果。 透射电子显微镜（TEM）显示，纳米-siAGD1 复合物近乎球形，平均直径约为 143 ± 3.6 纳米。研究人员通过 TEM 确认纳米-siAGD1 成功内化到 PC3 细胞中，这与之前的研究报告一致。研究人员通过皮下注射 PC3/DU145 细胞评估纳米-siAGD1 的安全性，苏木精-伊红（H&E）染色表明主要器官未受损害。研究显示，来自 PC3/DU145-nano-siAGD1 细胞的皮下异种移植瘤体积显著减小，且每周两次给予多西他赛治疗。来自 PC3-nano-siAGD1 的皮下异种移植瘤的免疫组织化学（IHC）显示，AGD1 沉默后 METTL13 和 CD44 表达显著下调，而 USP10 表达无显著变化。这些发现表明 AGD1 是治疗去势抵抗性前列腺癌的一个很有前景的靶点。 透射电子显微镜（TEM）显示，纳米-siAGD1 复合物近乎球形，平均直径约为 143 ± 3.6 纳米。研究人员通过 TEM 确认纳米-siAGD1 成功内化到 PC3 细胞中，这与之前的研究报告一致。研究人员通过皮下注射 PC3/DU145 细胞评估纳米-siAGD1 的安全性，苏木精-伊红（H&E）染色表明主要器官未受损害。研究显示，来自 PC3/DU145-nano-siAGD1 细胞的皮下异种移植瘤体积显著减小，且每周两次给予多西他赛治疗。来自 PC3-nano-siAGD1 的皮下异种移植瘤的免疫组织化学（IHC）显示，AGD1 沉默后 METTL13 和 CD44 表达显著下调，而 USP10 表达无显著变化。这些发现表明 AGD1 是治疗去势抵抗性前列腺癌的一个很有前景的靶点。 结论 结论 03 03 总之，本研究首次探讨了 AGD1 在调节去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛敏感性中的作用。AGD1 通过增强肿瘤生长和转移，在体外和体内介导前列腺癌干细胞（PCSCs）的干性和凋亡，并促进多西他赛治疗耐药性。本研究为通过 AGD1/USP10/METTL13-CD44-pSTAT3/PI3K-AKT 级联反应介导的多西他赛化疗的分子机制提供了新的见解，为 CRPC 的基因治疗提供了新的靶点。（转化医学网360zhyx.com） 总之，本研究首次探讨了 AGD1 在调节去势抵抗性前列腺癌（CRPC）对多西他赛敏感性中的作用。AGD1 通过增强肿瘤生长和转移，在体外和体内介导前列腺癌干细胞（PCSCs）的干性和凋亡，并促进多西他赛治疗耐药性。本研究为通过 AGD1/USP10/METTL13-CD44-pSTAT3/PI3K-AKT 级联反应介导的多西他赛化疗的分子机制提供了新的见解，为 CRPC 的基因治疗提供了新的靶点。（转化医学网360zhyx.com） 【参考资料】 【参考资料】 https://jeccr-biomedcentral-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/10.1186/s13046-025-03272-3#Sec29 https://jeccr-biomedcentral-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/10.1186/s13046-025-03272-3#Sec29 【关于投稿】 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。

在大规模生产诱导多能干细胞（iPSC）的过程中，确保其质量和多能性以满足临床需求面临着诸多挑战。iPSC的多能状态极为敏感，且对培养基质有较强的依赖性。为了实现可放大的干细胞生物工艺，必须采用能够实时监测细胞分化、生长状态及活性的标记物。此外，开发适合的细胞培养模式，以支持高质量的悬浮干细胞生长，是实现工业化规模生产的关键。本文将综述在iPSC的诱导、扩增和生产过程中，如何通过优化培养基、悬浮培养模式和监测技术来维持其质量和多能性。 干细胞生产的最新进展以及挑战 干细胞疗法，包括组织移植和药物发现等应用，已被广泛用于治疗多种临床适应症，特别是在肿瘤、心脏病、免疫疾病和神经疾病等领域。因此，干细胞研究的核心目标之一是在保持细胞分化精确控制的同时，优化细胞生长策略。传统上，胚胎干细胞（ESC）因其固有的多能性而被视为细胞治疗的理想选择，这种多能性使得细胞能够分化为任何特定的细胞类型。ESC的发现为再生医学以及多种病理疾病的治疗提供了巨大的潜力。无论干细胞的来源如何，ESC在增殖过程中必须进行自我更新以维持其多能性，同时抑制向特定细胞类型的分化。 在2007年，Yamanaka及其团队实现了干细胞研究领域的一项重大突破，成功地将人类体细胞转化为具有与人类胚胎干细胞（hESC）相似的基因表达谱和多能性的细胞。这些细胞被命名为人类诱导多能干细胞（hiPSC）。iPSC的产生避免了从胚胎中提取干细胞所带来的伦理问题，使其成为研究和临床应用的一个更为有利的平台。由于其固有的自我更新能力、多能性以及相对较低的免疫原性，iPSC成为一种极具前景的、来源于患者的无限细胞资源，可用于人类遗传疾病的建模和毒理学研究，从而降低了药物开发和临床试验的总体成本和相关风险。凭借其多方面的能力，iPSC技术仍然是个性化细胞治疗和再生医学领域的一个有前途的科学工具。 目前，临床细胞治疗和人类组织再生需要大量（10^8至10^10）符合现行良好生产规范（cGMP）的临床级干细胞。然而，由于多能干细胞对支持基质的依赖以及其多能状态的敏感性，将细胞培养放大到所需规模仍面临重大挑战。在收获过程中，iPSC的最终质量取决于其代谢状态；具体而言，维持多能状态和自我更新对于生产临床级iPSC至关重要。因此，监测细胞分化状态、生长状态和活性的内在标记方法对于大规模生产具有重要意义。此外，现有平台正在不断优化，以满足cGMP标准，从而有效地将生物工艺放大到临床生产环境。本文将重点介绍iPSC细胞培养方法的最新进展，包括培养基、悬浮模式和监测技术，这些方法在一定程度上保持了iPSC的质量和多能性，以满足临床生产的需求。此外，我们还将探讨未来可能提高iPSC生物工艺效率和产量的技术。 从异质细胞群中分离iPSC 许多信号能够激活干细胞分化，因此，细胞培养条件的微小变化或对细胞的应激可能导致细胞群体的异质性分化。这构成了一个严重的安全问题，因为分化细胞的污染可能在细胞移植受体中引发潜在的肿瘤或畸胎瘤形成。然而，干细胞分化也可能自发发生，例如在细胞外基质中长期培养时观察到的间充质干细胞（MSC）的情况。为了调节这种类型的反应并保存用于未来应用的多能干细胞（PSC），已经应用了分离多能细胞和分化细胞的细胞分选方法。荧光活化细胞分选（FACS）和微孔粘附是流行的高通量方法，用于基于定义的多能性特征分离细胞，通过细胞培养条件增强多能性标记阳性干细胞的选择性。对于iPSC，当添加四种抑制剂的小分子混合物（SMC4培养基）时，分选后观察到SSEA4/TRA-1-81阳性iPSC克隆比在传统重编程培养基中分选的细胞衍生克隆增加了55倍。尽管FACS是高度自动化和标准化的，但分选单个细胞以产生稳定的多能细胞克隆仍然是一项劳动密集型且耗时的工作。因此，能够产生多能细胞群体作为池培养的方法是首选的，因为池可以保持多能标记物的长期稳定表达。为此，使用细胞表面标记抗体的磁激活细胞分选（MACS）方法已被用于生成iPSCs池。在这种情况下，用TRA-1-60和SSEA4抗体进行一轮异质性细胞池分选后，TRA-1-60和SSEA4阳性细胞的数量分别增加了28%和11%。另外几轮的MACS进一步富集了表达多能性标记的细胞群体。一般来说，MACS是比FACS更好的方法，因为它可以轻松快速地同时在多个样品上进行，同时仅对细胞施加较小的剪切应力。 尽管细胞分选技术在基于形态学和表面标志物表征干细胞群体方面表现出有效性，但其在分离动物或临床研究级别的多能干细胞方面的广泛应用仍受到限制。这主要是由于GMP级抗体的高昂成本以及临床级FACS设备和专业技能的有限可用性。因此，在未来的细胞治疗临床试验中，迫切需要开发可放大的平台，以生成可靠、均一且安全的临床级多能干细胞群体。 最佳iPSC培养基及培养基的开发 在iPSC扩增过程中，确保其质量的关键步骤之一是使用经过良好表征的材料，其中细胞培养基和基质发挥着至关重要的作用。细胞培养基通过提供营养、矿物质和pH值的良好平衡，对维持健康且增殖的细胞至关重要。细胞培养基质则作为细胞粘附和增殖的支撑结构，通常被饲养层细胞或生长支持因子包裹，以进一步促进细胞的粘附和生长。使用完全表征的细胞培养系统对于控制良好的生物工艺过程至关重要，尤其是对于生产临床级别的生物样品。在过去十年中，iPSC培养基配方和基质已经得到了显著的发展，这主要得益于对维持iPSC细胞系多能性和整体工艺可放大性的信号通路的深入考虑。 在为iPSC设计培养基时，一种有效的策略是识别多能性依赖的信号转导途径中涉及的内源性生长因子。调控干细胞多能性基因表达的途径多种多样，包括转化生长因子（TGF）-β超家族激活级联、受体酪氨酸激酶信号通路（如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的下游信号）、以及涉及胰岛素样生长因子（IGF）的途径等。值得注意的是，维持小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性的蛋白质和生长因子（如骨形态发生蛋白（BMP）和白血病抑制因子（LIF））与人类胚胎干细胞（hESC）不同。多能干细胞在维持多能性和自我更新方面可能需要不同的生长因子。例如，bFGF已被确定为维持体外hESC自我更新的关键添加物，在无饲养层培养物中其浓度通常在40 ng/ml到100 ng/ml之间。此外，Wnt/β-catenin信号通路与hPSC的自我更新相关，尽管单独添加Wnt3a不足以在没有饲养层细胞的情况下维持未分化的hESC。由于这些代谢研究主要在hESC上进行，而非iPSC，因此需要对iPSC进行更深入的表征，以便设计培养基，并考虑每种新细胞系在临床应用中开发的独特要求。 通过提供特定的干性支持因子以及创造富含细胞外基质（ECM）的环境，基于饲养层细胞的基质可以防止干细胞自发分化，并改善ESC和/或iPSC的附着。最常用的饲养层细胞是增殖失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），因为它们能够产生多种对维持多能性至关重要的蛋白质，如TGF-β1、激活素A、BMP-4和多营养因子（肝素结合生长因子）等。然而，由于饲养层细胞的增殖能力有限，经过多次传代后，其支持iPSC多能性的效率会降低，且在分离iPSC过程中存在较高的污染风险，这在大规模生产iPSC时会引发相关技术挑战。此外，动物源性饲养基质可能增加病原体和未知病毒向宿主细胞转移的风险，从而导致免疫系统的排斥反应。因此，iPSC的培养方法主要转向使用ECM蛋白、条件培养基或合成生物材料，以实现无动物成分和无细胞（称为“无饲养”）的培养系统。 在过去十年中，随着培养基技术的进步，iPSC细胞培养基质逐步达到了cGMP标准。最近的研究表明，长期使用动物源性血清和含异源分子的培养基可能会影响细胞形态、扩增潜力、基因表达和细胞因子谱。这促使了无异源成分培养基（XFM）配方的开发，随后是无动物源性成分（ACF）培养基，以支持iPSC的扩增。在已开发的ACF培养基中，Essential 8™（Thermo Fisher Scientific）培养基是iPSC培养中使用最广泛的基础培养基之一，因为它包含了8种对干细胞增殖至关重要的成分：DMEM/F12、L-抗坏血酸、磷酸镁、硒钠、FGF-2、胰岛素、NaHCO3以及转铁蛋白、TGF-β1或Nodal。 无饲养iPSC扩增技术的发展为未来的自动化生产提供了可能性。事实上，利用CompacT SelecT™细胞培养系统，在无饲养条件下，大规模自动化生产未分化的iPSC是可行的。在这种情况下，使用含有Activin A和FGF-2的化学限定培养基（CDM）进行自动传代的聚体hiPSC能够保持其特征形态和多能性标记物的表达。生物材料也被探索作为无饲养iPSC培养系统的增强基质。例如，一项研究发现，具有最佳弹性（25 kPa）的水凝胶基质能够使细胞保持多能性。进一步的研究表明，接枝到水凝胶（储存模量为25 kPa）上的双链体外连接素衍生的寡肽支持hESC和iPSC的长期生长，可持续超过10代。细胞外基质（ECM），如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和玻璃体连接蛋白，或来自ECM的寡肽，具有特定的细胞结合结构域，使其成为支持iPSC在无饲养基质系统中生长的重要成分。3D生物打印和细胞/组织打印技术也为未来的工艺放大和自动化提供了新的可能性。最近的研究表明，当iPSC在涂有纤维连接蛋白的无饲养壳聚糖或聚氨酯膜上驯化和扩增时，细胞打印技术的有效性得到了验证。在这项研究中，嵌入热敏聚氨酯（PU）水凝胶基质的iPSC显示出更高的活性。然而，需要进一步优化基于聚合物的无饲养基质，因为PU水凝胶培养的多能性标记（如OCT4和NANOG）与对照MEF饲养层培养存在差异。 细胞培养动力学不仅决定了iPSC的最终行为，还影响了整个生物工艺的成本。尽管在具有监测和反馈控制pH值和溶解氧（DO）能力的一次性多层培养器皿中，已经证明了在2D静态培养中大规模生长hPSC的可行性，但在2D或3D静态基质上大规模生产hPSC仍是一种成本高、劳动密集且空间需求大的方法。已知静态培养条件会导致培养基成分、代谢废物、旁分泌因子和气体的不利梯度。目前的共识是，动态悬浮培养是实现临床应用所需的多能干细胞密度的最佳方法，目前正积极开发高效且可放大的悬浮多能干细胞扩增的新策略。例如，可以利用成功的基质研究来设计最佳的悬浮培养模式。 iPSC悬浮方式的关键考虑因素 (聚集体、微载体和微胶囊) 无基质的iPSC悬浮培养系统克服了静态基质在放大生产方面的局限性，同时支持iPSC的生长和多能性维持。由于iPSC的贴壁特性，在悬浮体系中接种和扩增时，会自发形成3D聚集体（或球体）。这些iPSC聚集体与胚状体（EB）相似，因此可以作为扩增后直接进行谱系分化的有效途径。iPSC聚集体的生长和多能性主要受微环境、聚集体大小分布和细胞培养罐大小的影响。已有研究对培养条件进行了优化，使得hiPSC在转瓶中于E8™无饲养条件下，以未分化的悬浮细胞聚集体形式扩增超过10代。此后，搅拌悬浮培养已扩展至3000 ml的一次性生物反应器（1000 ml工作体积），以生产大量的hiPSC聚集体（多达2x10^9个细胞），同时保持多能性标记物的表达，包括TRA-1-81、SSEA-4、OCT4和SOX2。 然而，动态悬浮培养中iPSC聚集体的扩增存在一些限制。与静态悬浮培养相比，其扩增效率较低，且聚集体大小分布不均匀。若不加以控制，细胞团块（>800 μm）的形成可能导致细胞活性下降、自发分化增加、营养和氧气扩散梯度加剧，以及整体扩增过程变慢。通过优化搅拌桨类型和搅拌速度，可以有效控制iPSC培养中的聚集体尺寸。垂直轮生物反应器（VWBR）是一种新型的生物反应器系统，能够在扩增iPSC的同时降低聚集体的大小。该系统通过垂直叶轮搅拌实现容器内的高效均质化。使用该系统，在保持多能性的同时，成功产生了平均直径为350 μm的聚集体（最高密度可达2.3x10^6 cells/ml）。 培养基添加剂对聚集体的形成有显著影响。例如，在hiPSC聚集体的扩增过程中，短期应用维甲酸（RA）可以进一步维持其多能性。类维生素A通过提高多能依赖性转录因子（如Nanog和Oct4）的表达以及激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路来支持iPSC的自我更新。此外，在化学限定培养基中添加Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y27632可以促进多种悬浮罐类型中从单细胞接种开始的iPSC聚集体的形成。ROCK抑制剂通过减少解离诱导的细胞凋亡和提高克隆效率来支持干细胞聚集体的存活。然而，最近的研究表明，长期暴露于ROCK抑制剂会改变iPSC的代谢特性。因此，培养基添加剂、接种策略和生物反应器设置是优化生物工艺产量的关键参数。通过进一步优化，可以实现足够用于临床应用的iPSC聚集体的大规模生产。在这种模式下，需要改进营养物质的运输机制和聚集体的大小分布，以在高密度条件下保持细胞聚集体的多能性和活力。 微载体 在生物反应器系统中加强干细胞培养扩增的工作已经在微载体的应用方面取得了显著进展。微载体的优势在于它们提供了一个表面积以支持多能干细胞（PSC）的生长和附着，同时保留了动态悬浮培养系统的特点。微载体可用于细胞种子制备，如果是可生物降解的，还可以在治疗过程中用于将细胞运送到受损组织。各种生物可降解材料通常用于制造针对细胞系扩增的微载体，包括葡聚糖、胶原蛋白、明胶、聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚L-乳酸（PLLA）、聚苯乙烯（PS）和羟基磷灰石（HA）。与较大的静态基质类似，微载体通过其表面电荷的适当调控，以及当被细胞外基质（ECM）蛋白（如玻璃体连接蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白）包裹时，为PSC的生长提供了进一步增强的支持。搅拌微载体培养系统已被证明可以促进贴壁依赖性干细胞的扩增和规模放大，同时为监测和控制干细胞健康和分化提供了必要的工具。通过增强氧气供应和代谢物的质量传输以及降低微环境毒性，PSC的产量得以提高。 然而，在使用微载体扩增hiPSC时，存在一些需要考虑的问题。微载体的限制主要取决于其直径（100-400 μm）、密度（通常为1 g/ml）和化学成分，这些因素会影响细胞的附着，从而影响扩增能力。由于微球的表面积有限，hiPSC的峰值密度似乎受到微球与细胞比例的限制。附着在微载体微球上的细胞需要经过酶解和过滤处理，这可能会损害细胞的活力和多能性，具体取决于所采用的方法。为了解决这一问题，生物可降解微载体正在开发中。与传统的聚苯乙烯（PS）微载体相比，无异源可溶性微载体的开发取得了显著进展，使得转瓶中的细胞回收率大幅提高。 搅拌式生物反应器会对微载体微球施加流体动力剪切应力，这可能会影响hiPSC的整体健康和多能性。通过优化生物反应器的工艺参数（如搅拌速率），可以减轻剪切应力对iPSC的不利影响。例如，Gupta及其同事的研究表明，在转瓶中，iPSC在微载体上的长期附着、多能性和扩增依赖于维持25 RPM的最佳搅拌速度。这种参数优化方法需要应用于更大规模的iPSC扩增（如生物反应器）。 微载体微球的制造成本是另一个需要考虑的问题，因为根据所使用的材料和添加剂，该工艺可能会变得异常昂贵。因此，微载体材料应具有成本效益，如果可能的话，应可回收，并且在每次生产运行后可消毒。目前，基于微载体的iPSC培养方法正在开发中，旨在通过控制良好的生物工艺系统实现人类iPSC在细胞治疗和组织工程中的持续扩增和回收。 利用微载体制备人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的生物工艺研究进展，典型工艺包括静态培养、放大工艺、下游工艺和制剂，微载体通常在放大过程中引入，在下游工艺过程中去除。 微胶囊化 微胶囊与将细胞附着在微球表面的微载体不同，微胶囊化涉及将细胞捕获在球形胶囊内，细胞生长所需的营养物质、氧气和其它生长因子可以通过球形胶囊扩散。球形胶囊由半透性材料或膜组成，在悬浮培养系统中可以保护细胞免受聚团和剪切力的影响。用于生成微胶囊的生物材料包括海藻酸盐、琼脂糖、尼龙、胶体、聚苯乙烯、丙烯酸酯、聚赖氨酸-海藻酸盐水凝胶、醋酸纤维素-乙基纤维素和聚酯膜。通常通过乳化或挤压方法捕获细胞，形成保护管，使细胞增殖。总的来说，聚合物微胶囊与凝胶微胶囊相比具有一定的优势，包括生物相容性和GMP相容性。每单位体积的胶囊材料可以容纳更多的细胞，并且由于在胶囊内空间存在液体细胞悬浮液，聚合物胶囊中的颗粒间扩散限制不那么严重。 在微胶囊系统中培养的干细胞既可以维持多能性，也可以被诱导分化，这取决于其胶囊的组成和微环境中存在的生长因子。微胶囊化技术在大规模生产中所面临的缺点与微载体类似，即制造成本和有限的表面积。此外，一些干细胞类型，如hMSC，在没有添加肽或蛋白质（如纤连蛋白）的情况下被包裹时 (例如，在海藻酸盐中) 增殖困难，前者可改善细胞附着。相比之下，如果细胞附着增强，在收获过程中回收被包裹的细胞可能会带来更困难的挑战。 iPSC监测技术、计算机建模和质量设计 hiPSC敏感的多能性受到细胞微环境、代谢和信号通路变化的影响，因此对需调节干细胞分化的细胞治疗和组织工程方法的发展构成了重大挑战。细胞聚集体悬浮培养和微载体系统的最新进展为有朝一日实现大规模生产用于各种临床应用的hiPSC提供了希望。然而，未来大规模生物反应器 (>5L) 的利用需要开发新的生物反应器监测技术，以便在控制干细胞分化的同时优化iPSC生产过程。 目前有几种离线分析方法可用于生物反应器监测，其中许多方法确定重要的过程变量，如细胞计数、细胞活力和培养基中特定成分的浓度。通常使用染料排除法 (即台盼蓝排除显微镜) 和流式细胞术来测量细胞浓度和活力，而一些流式细胞术也可以量化PSC群体。最近为提高iPSC表征工作的通量所做的努力表明，将荧光细胞条形码 (FCB) 结合到流式细胞术中可以识别多能性和细胞异质性。尽管条形码方法对连续平台不实用，但它们是有用的离线质量控制 (QC) 测试方式。质谱 (MS) 和高效液相色谱 (HPLC) 已被联合用于代谢组学和蛋白质组学研究，确定指示或影响多能性的代谢标记物和途径。这些发现揭示了在代谢物水平上预测和监测iPSC分化的计算机建模的必要性。有趣的是，糖酵解和蛋氨酸代谢被发现调节造血干细胞的分化，因此，模拟这些途径中涉及的关键代谢物的行为可能是一个合适的起点。与此同时，高效液相色谱和质谱系统也得到了改进，以促进在线和近线测量，例如采样自动化，但这些技术仍然受到维护成本和处理样品所需时间的限制。Western blots、qPCR或RT-PCR和免疫组织化学 (ELISA) 是常用的检测方法，通过检测相对于天然ESC的ESC标记基因的表达水平，来确定hiPSC在特定时间点的代谢功能和分化状态。总的来说，在整个制造过程中，有几种有效的离线分析方法可以确定iPSC的多能性和质量。然而，非自动化离线分析测试的样品收集和准备，以及仪器和试剂盒的成本和维护，限制了过程的可放大性，增加了生产成本，牺牲了样品，并存在培养污染的风险。此外，样品采集和数据输出之间的时间延迟大大限制了它们作为过程控制技术的实用性。 为了提高工艺可放大性，生物制药行业最近开始采用质量源于设计 (QbD) 战略，其中工艺和产品管理基于科学知识和风险评估。通过这种方式，可以利用传感器或其它实时检测变化的分析技术开发更灵活的生产工艺，允许通过数据驱动的过程控制进行快速响应，从而在潜在的运行故障发生之前减轻故障。QbD框架通过将可测量的细胞群体的分子和细胞特征与最终产品质量联系起来来运作。就iPSC而言，有效的QbD策略需要实时测量影响干细胞多能性和自我更新的关键参数。 在线传感器在生物反应器过程实时监测方面很有应用前景，包括目前最先进的DO和pH探针。先前的研究表明，缺氧和生物反应器流体动力学可以共同诱导hiPSC向心肌细胞分化，因此，DO水平是生产过程中维持iPSC质量的关键工艺参数。光谱方法，如拉曼和近红外，也可以作为有用的在线探针来监测代谢物 (葡萄糖、乳酸等)，因此，在开发化学计量模型和机器学习算法时，可以提供有用的信息，实时预测和调节iPSC多能性。除了标准的工艺特征外，可重复和稳定形成的hiPSC聚集体对工艺可放大性至关重要。在这方面，某些光学技术显示出作为实时监测细胞健康和分化状态的工具的潜力。例如，双光子激发 (TPE) 荧光显微镜光学测量NAD(P)H和FAD的自身荧光已被证明是监测三维组织构建中细胞分化的有效技术。结合荧光寿命成像显微镜( FLIM)， TPE可以通过NAD(P)H和FAD的光学氧化还原比和荧光寿命来确定MSC的分化状态。通过对NAD+/(NADH + NAD+)的LC-MS/MS测量证实，在分化的MSC培养物中观察到光学氧化还原比值的下降，这是为生物反应器设计的TPE-FLIM探针的潜在能力的一个例子。利用TPE-FLIM作为iPSC监测工具，必须开发一种稳健而灵活的TPEM探针，可以接近生物反应器内的细胞并收集在线数据；然而，目前还没有这样的产品存在。最近，一种原位显微成像装置被开发出来，用于实时可视化和监测连续搅拌罐生物反应器中hiPSC聚集。虽然聚集体大小的控制对维持多能性很重要，但分化进展的直接指示只能通过安装荧光显微镜模块来实现。毫无疑问，仍然需要新的创新工具，结合显微镜成像和荧光检测来评估hiPSC在动态培养中的多能状态。 质量控制措施和考虑因素 为了充分发挥iPSC衍生疗法的潜力，iPSC需要在临床级GMP标准下生产。这是一个复杂的过程，其中iPSC细胞系、传代和关键质量属性 (CQA) 可比性的表征和论证是必不可少的，并且有充分的记录。CQA被定义为生物、化学或物理性质，这些性质应保持在适当的限度内，以维持或控制最终产品的质量。随着自动化、封闭细胞培养系统和经过验证的测试方案的发展，iPSC生产线工业化的目标比以往任何时候都更接近。国际干细胞库倡议 (ISCBI) 最近为临床级hiPSC注册提供了推荐指南，包括：（i）多能性测试; （ii）体外和体内分化测试；（iii）核型分析显示遗传稳定性；（iv）细胞身份鉴定；（v）通过干细胞阵列分析基因表达特性；（vi）微生物试验。 目前用于iPSC扩增的GMP级培养系统需要多次更换培养基和传代，这导致了显著的可放大性、可重复性和成本挑战。由于这些原因，目前个性化iPSC生产的财务成本对大多数患者来说是负担不起的，因此，iPSC库的构建将是有益的。全球iPSC治疗联盟 (GAiT) 的成立旨在支持针对临床应用的iPSC库的创建和全球协调。Alvarez-Palomo及其同事总结了创建临床级iPSC库的关键考虑因素和标准操作程序。 iPSC领域的一个主要QC问题是遗传组稳定性。由于可获得的长期临床数据有限，需要制定严格的遗传稳定性检测指南。先前涉及iPSC的临床试验因在细胞重编程过程中观察到单核苷酸变异(snv)和拷贝数变异(cnv)而暂停。因此，全基因组测序(WGS)，包括snp和比较基因组杂交(CGH)阵列，被推荐作为iPSC产品进入临床前的QC测试。用于生成hiPSC的基因转染平台也对基因组整合带来了巨大的安全问题。由多肽生成的非转基因PSC效率较低，mRNA/miRNA转染需要多个步骤，这就产生了批次间的可变性。毋庸置疑，在整个细胞治疗生物工艺中，遗传标记验证对于开发安全有效的治疗方法至关重要。 结束语和未来展望 在过去的十年中，hiPSC生物工艺技术有了显著的进步，但在临床应用和新产品推出方面的进展仍然缓慢。主要挑战来自基础生物科学和当前大规模生产平台的局限性。现有的hiPSC工艺开发和生产方法是劳动密集型的，这在很大程度上限制了工艺的可放大性，并导致不可预测的批次间可变性。业界一致认为，生产iPSC的最佳方法是悬浮培养，从而提高细胞的生长能力。当选择悬浮方式进行放大时，应考虑将多能性iPSC的生长特征与其随后的分化细胞类型结合起来的工艺，因为一些研究已经发现了多种有益的基质来生长特定类型的高质量iPSC。与重复批次工艺相比，完全自动化的灌流操作与培养环境的反馈控制将允许营养物质的持续置换，并获得显著更高的细胞产量。由于诱导多能干细胞的应激敏感性，目前的灌流系统仅成功用于小鼠诱导多能干细胞。然而，使用现有的ACF培养基和微载体悬浮微球成功扩展hiPSC，表明该行业未来有能力实现可放大的高质量PSC密度。此外，存在进一步推进iPSC工艺发展领域的额外机会。 随着新技术和新模式的出现，需要工艺友好的表征方法和监测工具来控制iPSC在生产过程中的质量。由于基因组和代谢组稳定性对hiPSC的重要性，基因组维度的模型可用于确定影响多能性的关键工艺参数，并指导生产过程中生长表型的优化。此外，结合图像和荧光显微镜的更灵敏的细胞质量检测工具将进一步增强实时监测干细胞分化的PAT。随着这些分析工具的发展，进一步的培养基优化和QbD策略的扩大，临床级iPSC的大规模生产的目标将在未来十年实现。 参考资料：A.Polanco, B.Kuang, S.Yoon, Bioprocess Technologies that Preserve the Quality of iPSCs. Trends in Biotechnology, 2020. 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:肿瘤细胞与正常细胞的主要区别在于它们无限制的增殖能力和通过侵袭和转移扩散到不同器官的能力。胚胎干细胞（ESCs）和癌细胞之间已经发现了多种相似之处。因此，基于干细胞的疫苗可以通过向免疫系统呈现各种肿瘤抗原来帮助发展对癌细胞的强大预防性免疫。特别是诱导多能干细胞（iPSCs）和ESCs可能在摆脱各种生长限制方面类似于肿瘤细胞。免疫疗法目前被认为是一种范式转变的治疗策略。癌症疫苗（CVs）属于免疫疗法的范畴，特别关注基于干细胞的疫苗，这些疫苗针对各种实体瘤，是一种有希望的方法。这些疫苗通过在肿瘤微环境（TME）中诱导抗肿瘤免疫来工作，当与其他靶向疗法结合使用时，它们可能具有临床价值，以实现更好的临床结果。尽管在开发合理的癌症方案方面做出了重大努力，但由于癌症干细胞（CSCs）导致的耐药性问题仍然是一个挑战。基于干细胞的CVs有潜力引发显著的抗肿瘤反应，可能抑制原发肿瘤的转移，并诱导针对CSCs的体液和细胞毒性免疫反应。这些基于干细胞的疫苗在癌症管理中具有重要的治疗和预防潜力，解决了药物耐药性问题。尽管它们在临床前研究中显示出了有希望的结果，但需要进一步探索它们在人类中的应用。因此，一种针对癌症的新型基于干细胞的疫苗方法可能有助于克服这一障碍。 1.引言 癌症是一种非传染性疾病，起源于希腊词“Karkinos”，意指恶性细胞团或螃蟹。当正常细胞绕过身体的调节过程时，会导致异常的细胞生长，导致这些细胞恶性或无控制的生长。它被认为是一种严重且危及生命的状况，构成了重大的公共卫生问题。大约70%的癌症死亡发生在低或中等收入国家，主要是由于医疗服务不足导致诊断延迟和预后较差。随着预期寿命的增加和现代不健康生活方式的流行，多年来癌症病例的流行病学一直在上升。在印度，大约80%的癌症患者在疾病的晚期被诊断出来，导致临床结果恶化。 目前，癌症的管理策略包括手术、化疗、放疗以及其他靶向疗法，这些疗法专注于免疫系统或激素系统。免疫靶向疗法围绕免疫监视的概念，允许宿主免疫细胞识别异常的肿瘤细胞，对正常分裂的细胞影响最小。抗体（Abs）作用于各种靶点，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、程序性死亡配体1（PD-L1），以及针对致癌病毒（病毒相关癌症）的疫苗，如乙型肝炎病毒（HBV）和人乳头瘤病毒（HPV），都包括在免疫靶向疗法中。癌症疫苗（CVs）属于主动免疫调节疗法的子类别，因为它们协助身体的天然免疫细胞识别和摧毁肿瘤。这些疫苗被认为是免疫疗法的一种有希望的方法，因为它们可以通过影响抗原特异性T细胞免疫反应来产生长期的抗癌效果。它们通常通过非特异性免疫调节来刺激或修改免疫反应。CVs可以是预防性的或治疗性的。预防性疫苗旨在提供针对在癌症发展中具有显著风险因素的病毒的预防。美国食品药品监督管理局（USFDA）已经批准了针对两种病毒的疫苗，即HPV和HBV，它们分别是宫颈癌和肝癌的主要原因，在低收入国家分别负责近25%的病例。另一种疫苗，称为治疗性或治愈性疫苗，可用于通过直接刺激免疫介导的攻击来治疗非传染性原因的癌症。已有FDA批准的治疗性疫苗可用于宫颈癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤。传统疗法往往无法针对某些肿瘤细胞，这些细胞具有在人体内部各种环境中通过快速增殖和自我更新来生存的能力。 除了疫苗接种，其他免疫疗法策略尽管显示出显著效果，但面临各种问题，如高成本和其他免疫相关的副作用。因此，癌症疫苗的概念最终被开发出来。近年来，已经开发了各种癌症疫苗策略，分为四大基本类别：基于细胞的、基于蛋白质的、基于病毒/细菌的和基于基因的疫苗。 基于细胞的疫苗包括从免疫细胞如树突状细胞（DCs）或自然杀伤细胞（NK细胞）衍生的疫苗。尽管这些疫苗具有高免疫原性和控制抗原呈递的优势，但这些疫苗成本非常高，制备困难，并且存在高风险的白细胞分离术相关并发症，如血管损伤和电解质失衡。 另一方面，基于蛋白质或肽的疫苗更容易制备，毒性最小且免疫原性低，主要是由于对特定类型的人类白细胞抗原（HLA）亚型的认识受限。然而，基于病毒或细菌的疫苗由于其高免疫原性，携带更高的毒性风险和增加的机会性感染几率。基于基因的疫苗，包括脱氧核糖核酸/核糖核酸（DNA/RNA）基疫苗，诱导HLA非特异性的细胞和体液免疫。然而，它们需要非常特定且具有挑战性的储存条件，并且在人类中显示出较差的免疫原性。 基于DNA质粒的疫苗已被证明通过广泛和特定的免疫激活提供显著的安全性和有效性。然而，肿瘤发展出的免疫抑制反弹导致这种类型的疫苗治疗效果减弱。DNA疫苗的缺点的主要原因包括肿瘤在发展过程中获得的抗性。有几个重要因素促成了抗性的发展，包括：（i）被假定为宿主免疫细胞识别的表位的变化；（ii）T细胞的耗竭；（iii）调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等免疫抑制细胞的过度表达；以及（iv）各种细胞因子的释放，包括转化生长因子β（TGF-β）和白介素-10（IL-10）。除了这些理论上的缺点外，当前疫苗的临床前和临床试验也没有显示出作为单独疗法对疾病结果有显著的希望影响。不同CVs的优缺点在表8.1中总结。因此，需要一种新的方法来开发一种克服这些限制并提供更好结果的CV，重点关注CSCs，这是一种主要的细胞类型，负责癌症复发和对化疗-放疗产生抗性的发展。CSCs通过表达不同的致癌表面标志物分化成各种细胞，促进肿瘤形成。CSCs与TME之间的相互作用导致肿瘤环境的各种变化，如上皮间充质转化（EMT），这已被充分记录并与癌细胞表型强烈相关。癌胚抗原，包括癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和人绒毛膜抗原（HCG），通常在胎儿阶段合成但在癌症中表达。这些基于癌胚抗原的疫苗具有潜在的治疗应用，但它们与局限性相关，如伦理问题和过敏性。因此，各种干细胞，如胚胎干细胞（ESCs），已经开发出来，与CSCs共享相似性和共同因素。这些ESCs可以作为多种癌症的目标，因为它们能够递送多种抗原并诱导对肿瘤细胞的免疫反应。诱导多能干细胞（iPSCs），是一种类似于ESCs的干细胞亚型，可以从患者的干细胞中重新编程，并作为有价值的目标。这种重新编程通过肿瘤抗原触发对CSCs的免疫反应。初步研究已经研究了iPSC衍生疫苗的有效性；然而，这些疫苗不能作为单独的治疗方法。因此，它们将与常规疗法结合使用，以改善患者的预后并克服抗癌药物抗性问题。 基于这一假设或概念，可以研究各种目标，如癌胚肽疫苗、基于ESCs的疫苗、基于成人干细胞（ASCs）的疫苗、基于iPSCs的疫苗等。本章总结了iPSCs、ESCs和ASCs的免疫原性，以及当前关于不同类型癌症中基于干细胞疫苗的研究。本章还提供了已经进行和正在进行的各种临床前和临床试验的总结。这些信息可以帮助我们的科学界就是否在抗癌药物方案中包含基于干细胞的疫苗做出决定。 2.干细胞的免疫原性 干细胞可以根据其潜力进行分类，包括以下类别：（i）全能干细胞，它们能够分化成所有可能类型的干细胞，如胚胎的桑葚期；（ii）多能干细胞，可以分化成大多数细胞类型，包括囊胚细胞团；（iii）多能干细胞，转化为密切相关的造血干细胞（HSCs）；（iv）寡能干细胞，产生急性淋巴细胞和髓细胞；以及（v）单能干细胞，可以自我更新为肌肉干细胞。干细胞也根据其来源进行分类，如神经干细胞（NSCs）、HSCs、间充质干细胞（MSCs）和ESCs（见图8.1）。癌症干细胞（CSCs）是其活动可以在发育的初始阶段被阻断的细胞。CSCs主要被分类为肿瘤启动癌症（TIC）细胞和肿瘤迁移癌症（TMC）细胞。TICs起源于上皮细胞，能够独立生长，而TMCs起源于间充质细胞，具有迁移和侵入其他组织的能力。启动CSCs，也称为副胚胎干细胞（P-ESCs），负责肿瘤启动，这需要通过间充质-上皮转化（MET）进行体细胞重编程。CSCs根据它们与胚胎细胞或胚胎细胞的相似性被分为三个亚组，包括初级、次级和三级CSCs。初级CSCs与人类胚胎的外胚层细胞在结构上相似。由于NANOG、八聚体结合转录因子4（OCT4）、DNA结合抑制因子-1（ID-1）和SRY-Box转录因子2（SOX2）基因表达等几种转录因子的过度活跃，初级CSCs被困在多能阶段，表现出自我更新的特征，类似于外胚层细胞。此外，次级CSCs类似于人类胚胎的低胚层细胞，通过促进由各种突变、过表达和自分泌/旁分泌信号传导引起的血管生成、侵袭和组织增殖，组织肿瘤生长和进展。当TME因低氧和其他自分泌/旁分泌信号传导压力因素而限制癌症的进一步生长和增殖时，一种新的表型细胞，即三级CSCs出现。这些细胞负责癌症迁移和侵入其他部位，导致微转移和巨转移。 图 8.1 干细胞的分类。注释：干细胞可以根据它们分化成特定细胞类型的能力进行分类。顾名思义，胚胎干细胞和iPSCs被称为多能干细胞。另一方面，成体干细胞被称为多能干细胞。癌症干细胞根据肿瘤的类型、起源和性质，可以表现出多能或多能的特性。 各种癌胚蛋白，包括CEA、甲胎蛋白（AFP）、HCG、胶质蛋白3、癌睾丸抗原、未成熟层粘连蛋白受体、胎盘碱性磷酸酶和IGF-2 mRNA结合蛋白（IMP）家族，通常存在于CSCs中。针对这些抗原可能导致基于癌胚蛋白的抗CVs的发展。这些抗原在最初的肿瘤发展中发挥作用，并使肿瘤细胞变成对化疗-放疗有抵抗力的细胞，使它们成为抗肿瘤免疫疗法的理想目标。 2.1.胚胎干细胞（ESCs） 胚胎干细胞（ESCs）本质上来源于胚胎内部细胞团（ICM），具有在人体内部广泛生长、增殖和适应不同环境的显著能力。人类胚胎发育与癌症之间可以画上一条平行线。 胚胎干细胞和癌症干细胞（CSCs）共享多个特征和共同因子，例如增加的端粒酶活性，通过维持端粒长度赋予CSCs不朽性。虽然人类ESCs源自上皮细胞，但它们经历了从上皮到间充质细胞的转变，也称为上皮-间充质转化（EMT）。ESCs和CSCs之间的主要区别在于基因组稳态，前者观察到而后者没有（图8.2）。 图 8.2 癌症干细胞（CSCs）的基因组不稳定性。注释：在正常的无病状态下，干细胞分化形成各种细胞，这些细胞经历正常的生长和增殖。这种正常生长在分化过程中由基因组稳态维持。然而，在疾病或易导致癌症的风险因素存在的情况下，基因组稳态会被破坏。因此，在分化过程中干细胞会经历基因组不稳定性，导致无控制的增殖和肿瘤形成。这就是为什么干细胞被称为癌症起始细胞，并且是癌症治疗的一个有希望的靶点。 ESCs还经历了去分化和再分化，伴随着各种致癌突变的发生，导致恶性。当移植时，ESCs在宿主细胞中引发异体免疫反应，主要是由于主要组织相容性复合体（MHC）和次要组织相容性（miH）抗原的存在。尽管两个亚类，I类和II类MHC的表达非常低，可以忽略不计。基于ESCs的疫苗比肿瘤胎儿肽特异性疫苗更受青睐，因为它们能够递送多种抗原。2012年Kavitha等人使用小鼠源ESCs作为疫苗在小鼠中进行的一项研究表明，产生的免疫反应不是由于异体反应，而是由于分化簇（CD）8+效应T细胞。肿瘤保护效应需要一定水平的CD8+ T细胞。这些细胞的消耗导致肿瘤保护活性的完全丧失。 2.2.诱导多能干细胞（iPSCs） iPSCs最初于2006年被发现，为医学领域干细胞的应用带来了新的视角。最初，人们主要关注iPSCs的再生潜力，对其免疫原性有所担忧。然而，这一特性可以被探索用于其抗肿瘤活性作为免疫疗法。iPSCs可以分为自体和异体iPSCs。在这些中，自体iPSCs显示出更广泛的肿瘤抗原，并且可以更好地作为癌症疫苗（CVs）进行探索。它们是通过将人类体细胞暴露于四个Yamanaka致癌转录因子，即Sox2、Oct3/4、c-Myc和Kruppel样因子（KLF4），以改变它们的转录状态以类似于肿瘤细胞。这四个因子中至少有一个在几乎所有癌症类型中都已知过表达。这些转录因子对CSCs的详细信息如下： 1.SOX4：SOX，也称为Y染色体性别决定区（SRY）相关的高迁移率族盒，负责癌症发展和增殖。它被归类为8个不同的亚类，从SOX A到SOX H。SOX4在为CSCs提供干细胞特性方面发挥着关键作用。它通过与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）-1相关的转录促进，并增强CSCs的干细胞特性，通过结合到其启动子位点。 2.OCT4：也称为八聚体结合转录因子，普遍表达于大多数CSCs，并作为多能性的标志。OCT4的调节涉及表观遗传修饰，如DNA甲基化、乙酰化和磷酸化，这有助于增加CSCs的干细胞特性。此外，由微小RNA（miRNAs）、非编码RNA（ncRNAs）和小干扰RNA（siRNAs）组成的复杂框架为CSCs提供了多个靶点。 3.c-Myc：它是一个调控基因，控制着在正常情况下负责细胞增殖、血管生成和细胞周期进展的基本转录因子。其转录中的任何不规则都会导致肿瘤细胞的基因组不稳定性、无控制的生长、增殖和细胞周期进展。C-Myc还通过增加染色体异常、基因组不稳定性并激活各种下游信号基因来促进化疗抗性。在各种研究中，一些较小的致癌基因被c-Myc原癌基因所取代。 4.KLF4：也称为Krupple样因子4，是一种涉及增殖、分化和迁移的锌指转录因子。KLF4是负责CSCs干细胞特性的四个因子之一。KLF4表达的降低导致肺和结肠恶性，解释了其假定的作用。相反，在头颈癌中，其上调促进了肿瘤的生存和进展。KLF4在CSCs中的作用仍有待探索，需要进一步分类。iPSCs可以通过外部诱导重新编程为多能干细胞。iPSCs与多能肿瘤细胞在表观遗传和转录组方面具有相似性。使用iPSCs而不是ESCs的一个主要优势是能够绕过MHC不匹配和异体免疫。虽然ESCs和iPSCs在许多方面类似于肿瘤细胞，但iPSCs表现出更大的多能性，使它们成为更好的选择。此外，iPSCs与细胞因子释放综合征相关的毒性发生率较低，这是免疫疗法如嵌合抗原受体-T细胞（CAR-T细胞）疗法和PD-L1抑制剂中的常见问题。 2018年，Kooreman及其同事的一项研究显示iPSCs、ESCs和癌症组织之间存在显著的遗传重叠。由iPSCs产生的疫苗能够通过刺激合成各种炎症介质和抑制其他具有促进肿瘤活性的免疫细胞来调节宿主对恶性细胞的免疫反应。iPSCs通过诱导产生干扰素（INF）-γ和IL-4的脾细胞来展现抗肿瘤活性。多项研究表明，在用胎儿组织免疫肿瘤细胞后，观察到显著的抗肿瘤效果。干细胞特性是衡量细胞分化能力的量化指标。计算出的干细胞特性指数在转移或从原发部位进一步侵入的肿瘤细胞中最高，而在原发肿瘤部位显著较低。进行的一项研究计算了干细胞特性指数，揭示了肿瘤转录组特征（与干细胞特性相关）和iPSCs之间存在显著的正相关。除了开发其他针对免疫疗法的方法外，iPSCs还有助于生成针对各种癌症的人类造血细胞。未分化的iPSCs通过颗粒酶B、干扰素-γ（IFN-γ）和穿孔素来发挥其免疫反应。另一方面，自体iPSCs以不同的方式诱导其免疫原性效应。2014年Almeida等人使用小鼠模型进行的研究表明，iPSC衍生的内皮细胞的免疫反应是通过耐受性反应介导的，其特征是IL-10的显著表达。这种自体iPSCs的免疫反应机制与上述未分化iPSCs的免疫反应显著不同。这种区别可以归因于iPSCs的致瘤性和免疫原性，这与它们作为基于干细胞的癌症疫苗的潜力有关。因此，除了作为基于干细胞的疫苗的应用外，iPSCs还可以有助于阐明和理解肿瘤启动和进展背后的分子机制。不是单独使用iPSC衍生的疫苗，而是将它们与 toll样受体（TLR）-9激动剂，CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）结合使用，这有助于通过加速抗原呈递细胞（APCs）的成熟来增强疫苗的抗肿瘤活性。这种iPSC加CpG疫苗导致小鼠肿瘤组织的排斥，表明了T细胞介导的肿瘤特异性免疫刺激。2007年，Gąbka-Buszek等人报告称，将源自全细胞的黑色素瘤疫苗与干细胞结合使用的混合疫苗暴露于高IL-6（HIL6）黑色素瘤细胞。这通过抑制Treg激活、促进树突激活和抗原呈递增强了抗肿瘤活性。HIL6修饰的肿瘤细胞在无病生存（DFS）和长期总生存（OS）方面显示出显著改善。多项研究得出结论，作为直接使用iPSCs的替代方法，从iPSCs再生其他免疫细胞如DCs、T细胞或自然杀伤细胞（NK细胞）也能展现出显著的肿瘤细胞毒性。2018年，Kooreman等人使用辐照iPSCs作为预防性疫苗在各种基于小鼠的癌症模型中进行了研究。这通过降低Th-17细胞水平和增加Gr1+CD11b+髓细胞水平，减少了复发和转移。如上所述，iPSCs源自体细胞，如从全血中提取的皮肤成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMCs）。这些细胞使用四个Yamanaka因子重新编程为iPSCs。辐照后，它们与CpG ODN和其他分子结合，如包括单磷脂A（MPL）在内的免疫刺激剂，MPL是一种细菌衍生的非毒性分子，负责激活巨噬细胞。此外，各种皂苷和细胞因子可以用作免疫刺激佐剂，以修改和重定向免疫反应。当这些iPSCs作为疫苗注入生物体内时，它们主要通过两条途径导致肿瘤大小和体积的减少：iPSC介导的直接呈递和iPSC介导的交叉呈递。使用iPSCs作为基于整个细胞的疫苗导致naïve或记忆CD4+细胞的直接激活，不涉及APCs。这种激活是通过肿瘤抗原介导的CD4+细胞上的T细胞受体（TCRs）激活来实现的，它们直接负责肿瘤回归。另一方面，在交叉呈递中，CD8+以及CD4+naïve和记忆细胞的激活是由APC呈递的肿瘤抗原介导的，随后导致它们的激活和免疫反应在肿瘤回归中的激活。因此，iPSCs进入肿瘤后，导致APC呈递上调，并通过激活肿瘤特异性抗体以及细胞毒性T细胞（图8.3）来展示它们的抗肿瘤作用。 图 8.3 从人类成纤维细胞或外周血单个核细胞衍生诱导多能干细胞（iPSCs）及其在肿瘤大小减少中的作用机制。注释：(1) 人类皮肤成纤维细胞或外周血单个核细胞（PBMCs）被照射并用四种山中因子处理，即OCT4、KLF4、Sox-2和c-Myc。(2) 形成免疫原性的自体iPSCs。(3) 这些iPSCs随后与CpG寡核苷酸以及其他营养物质、代谢药物和免疫刺激分子结合。(4) 这种混合物被制成一种称为基于iPSC的全细胞疫苗的疫苗。(5) 当注射到宿主体内时，这种iPSC疫苗通过直接呈递给激活的或记忆性CD4+细胞，或通过抗原呈递细胞介导的交叉呈递给激活的或记忆性CD8+或CD4+细胞，发挥其抗癌活性。(6) 这导致通过肿瘤特异性抗体释放介导的肿瘤体积减少。[PBMC：外周血单个核细胞；iPSC：诱导多能干细胞；OCT4：八聚体结合转录因子；KLF4：Kruppel样因子；Sox-2：性别决定区Y盒2；MHC：主要组织相容性复合体；APC：抗原呈递细胞；CD：分化群]。 除了自体诱导多能干细胞（iPSCs）之外，异体iPSCs作为癌症免疫疗法的使用仍在研究中。自体iPSCs的缺点是制造过程漫长且复杂，这可以通过使用异体iPSCs来绕过。一些研究表明，异体iPSCs在疫苗策略中显示出有希望的结果，表明其潜在用途。2016年，Kindy等人进行了一项研究，使用半异体iPSCs照射肿瘤细胞作为抗胶质母细胞瘤的免疫疗法（antiCV）在小鼠模型中。结果表明，接种疫苗的小鼠的总生存期（OS）有所提高，肿瘤体积减少了5到10倍。尽管理论上给人留下深刻印象，但基于iPSCs的疫苗单独在患者中并不表现出强烈的抗肿瘤效果。然而，它们可以与其他抗癌策略协同作用，或作为其他治疗的辅助手段。基于上述研究，可以得出结论，iPSCs在探索疫苗策略和抗肿瘤疗法中的免疫疗法中扮演着重要角色。总之，从自体iPSCs衍生的全细胞疫苗被发现可以作为预防性疫苗，以及作为癌症治疗策略的辅助手段。 2.3.成体干细胞（ASCs） ASCs属于能够为特定组织或器官群体生成新细胞的干细胞类别。它们在癌症疫苗中的用途在下文中详细提及。 2.3.1.间充质干细胞（MSCs） MSCs是ASCs的一个亚型，具有多能性，起源于中胚层，并对宿主免疫系统具有特定的刺激作用。MSCs主要因其抗炎活性而受到认可。然而，过去的某些证据表明MSCs参与刺激适应性免疫。这使它们成为预防性和治疗性疫苗的有希望的治疗选择，用于病毒或非病毒起源的癌症，这被认为是当前时代最重要的治疗发现之一。它们有潜力激活肿瘤特异性免疫。 为了增强MSCs的抗癌效果，进行了某些修改，例如与质粒转染，随后导致蛋白质的长期稳定表达。修改后的MSCs表达病毒抗原，如TLR配体，随后刺激产生抗原特异性抗体。MSCs主要促进IFN-α或IFN-γ的表达，导致肿瘤细胞凋亡。在2011年Wei等人进行的一项研究中，研究了基于表达E6/E7蛋白的MSCs的疫苗在小鼠模型中的效果。小鼠被注射了转移性纤维肉瘤细胞。结果表明，接受E7蛋白修饰的MSCs疫苗的小鼠与仅接受MSCs疫苗的小鼠相比，肿瘤进展减少。此外，MSCs作为外来抗原作用于免疫炎症细胞，帮助促进IFN-γ的表达。这反过来导致通过上调MHC-I和MHC-II来保护肿瘤或癌细胞，分别被细胞毒性CD8+和CD4+ T细胞识别。因此，这调节了效应细胞。 在另一项研究中，使用来自原始脂肪组织干细胞和适应性E7抗原的疫苗，在小鼠中对肺和结肠恶性肿瘤显示出显著的保护作用。这些疫苗通过减少血管内皮生长因子（VEGF）和CD31的表达，从而抑制血管生成并诱导恶性细胞凋亡。 2.3.2.造血干细胞（HSCs） HSCs是来自脐带和胎盘的多能原始ASCs，可以转化为所有类型的成熟血细胞。这类干细胞作为不同癌症的疫苗并没有被广泛探索。然而，异体HSCs对适应性免疫有相当大的影响。作为化疗后输注的自体外周血干细胞并没有显示出有希望的结果，因为复发率很高。一项研究表明，接受IL-2孵化的HSCs的患者群体，展示了抗原特异性的基于细胞的免疫反应。自体和异体HSCs也被用来提高多种癌症的存活率，如多发性骨髓瘤、各种淋巴瘤、白血病、神经母细胞瘤、卵巢癌等更多亚型。 2.3.3.神经干细胞（NSCs） NSCs是神经系统的ASCs亚型，发展成再生神经元和胶质细胞。有报道称，树突状细胞（DC）裂解物和胶质瘤干细胞疫苗的组合在恶性胶质瘤的小鼠模型中诱导了细胞毒性T细胞的形成和随后的抗肿瘤免疫的发展。在另一项研究中，发现NSCs可以调节转移到大脑的HER2阳性乳腺癌细胞。NSCs的颅内注射促进了抗HER2抗体的生产，这些抗体专门结合到过度表达HER2的肿瘤细胞，导致抑制磷脂酰肌醇3激酶/Akt（PI3K-Akt）信号传导，并提高小鼠模型的总生存期。 3.基于干细胞的疫苗在特定癌症中的临床前和临床数据 3.1.肺癌（LC） 肺癌被认为是全球癌症发病率和死亡率的首要原因。尽管手术切除肿瘤是治疗的黄金标准，但与局部和远处复发及较差的反应相关。目前正在进行各种临床和临床前试验，以开发新的免疫疗法策略，如基于干细胞的癌症疫苗，以成功治疗肺癌。在诱导肺腺癌的小鼠体内研究中，当使用人类iPSCs与CpG预免疫时，显示出更显著的肿瘤抑制作用，导致更强大的抗原呈递和细胞毒性T细胞反应。因此，得出结论，与未接种疫苗的小鼠相比，iPSCs具有肿瘤保护特性。另一项研究揭示了肺癌中肿瘤启动细胞（TICs）的抗肿瘤易感性，表明这些细胞通过修改它们的MHC-I表达来绕过免疫监视。因此，提高恶性细胞上的MHC-I表达可以增强肿瘤对T细胞毒性的敏感性。在小鼠模型中，ACSC-DC疫苗作为手术后切除肿瘤的辅助治疗，与抗PD-L1抑制剂联合使用。结果令人鼓舞，显示肿瘤转移减少和生存率提高。异体小鼠源ESCs被用作预防性疫苗，用于预防小鼠模型中的肺肿瘤，结合免疫刺激疗法。疫苗的肿瘤保护效应部分由适应性和体液免疫反应介导，特别是显示CD8介导的细胞毒性反应。对40名鼻咽癌患者进行了I期和II期临床试验（NCT02115958），以评估CSC负载的DC疫苗用于临床的安全性和有效性。该研究的主要目标是确定在人体中施用基于干细胞的疫苗的安全性，次要目标是测量对疫苗的免疫反应。还进行了类似的临床试验（NCT02084823）针对肺肿瘤，以评估基于干细胞的疫苗在临床实践中的适用性。结果显示只有I级局部和系统性不良事件（AEs），其中注射部位反应最为常见，所有这些都得到了症状缓解。为了评估免疫反应，测量了对照组和比较组的淋巴细胞计数，发现接受疫苗的患者的淋巴细胞计数显著增加，以及Th-1型细胞因子水平升高。除了免疫标记外，接种疫苗的患者血浆中CSC的结合也显著高于未接种疫苗的组。 3.2.卵巢癌 卵巢癌是最具有侵略性的妇科癌症之一，在过去三十年中，总生存率（OS）为43.6%。这是因为使用生物标记物对其他妇科癌症的筛查取得了进展。已经做出了重大努力，利用各种生物标记物，如黏蛋白16（MUC16）的表位或癌症抗原125（CA125），为卵巢癌开发有效的筛查方法和模型。卵巢癌的肿瘤被发现包含一个干细胞生态位，与肿瘤微环境（TME）和免疫系统以动态方式相互作用，在肿瘤生长、增殖和转移中发挥关键作用。抑制肿瘤细胞生长最有效的方法之一是通过针对肿瘤相关抗原（TAAs）的疫苗接种。基于DC的疫苗已被用于针对CSCs。虽然这种疫苗在小鼠模型的鳞状细胞癌中显示出益处，但其在卵巢癌中的有效性尚未得到证明。溶瘤病毒疗法（OVT）通过阻断趋化因子（CXC基序）配体2（Cxcl2）靶向癌症启动干细胞。针对卵巢癌的干细胞生态位的试验很少。一项研究表明，二甲双胍在预防卵巢癌中由干细胞诱导的化疗抗性方面是有效的，可能通过DNA甲基化。另一项研究产生了针对干细胞生态位的抗体，导致卵巢癌中的抗肿瘤活性。2012年，Zhang等人进行的一项研究评估了ESCs作为CV产生抗肿瘤效应的潜力。他们通过西方印迹分析展示了卵巢肿瘤细胞和ESCs之间的交叉反应，并发现ESCs呈现了大量负责肿瘤生长的标记、抗原和基因。然而，细胞因子水平没有差异。总的来说，ESCs显示出了为卵巢癌开发基于ESCs的疫苗的巨大治疗潜力。携带特定肽段的DCs，如NANOG肽段，而不是整个肿瘤裂解物，能够引发细胞毒性T细胞反应，这可以作为免疫记忆储存。将来，这种方法可以提供对抗通过可塑性产生的CSCs的行动。 由宁等人在2012年进行的一项I/II期研究（NCT02178670）旨在证明基于树突状细胞（DC）的癌症干细胞（CSCs）疫苗的抗肿瘤活性。研究发现该疫苗能够诱导对CSCs的免疫原性以及使用CSCs含量的DC疫苗刺激的B细胞进行特异性裂解。 3.3.胰腺癌 胰腺癌是一种致命且极具治疗挑战性的疾病，其特征是在胰腺组织中形成恶性（癌症）细胞。它是不同癌症亚型中导致死亡的主要原因，预后非常差，五年总生存（OS）率不到5%。由于这种肿瘤天生对吉西他滨有抵抗力，因此正在开发包括基于干细胞的疫苗作为免疫疗法在内的各种新方法。胰腺癌以其高度异质性而闻名，CSCs作为肿瘤启动细胞（TICs），表达高水平的CD9，这有助于肿瘤生长。以下，我们提供了进行的各种基于干细胞疫苗的临床前和临床试验的总结。 如前所述，人类诱导多能干细胞（iPSCs）和TIC干细胞之间存在显著的分子相似性。在小鼠胰腺导管腺癌模型中进行的一项研究中，引入了一种由自体iPSCs和CpG组成的联合疫苗。结果表明，这种疫苗主要通过诱导记忆T细胞和B细胞反应，以及通过CD4+ T细胞抑制调节性T细胞（Treg）介导的免疫抑制反应，显著保护小鼠免受肿瘤生长的影响。据报道，iPSCs和CpG的联合作用通过iPSCs释放肿瘤相关抗原（TAAs）和通过CpG激活抗原呈递细胞（APCs）来协同工作。 大约75%的小鼠显示出对肿瘤形成的显著保护。此外，通过将病毒感染的、重编程的体细胞衍生的肿瘤细胞引入小鼠体内，开发了基因工程iPSCs作为疫苗。这种方法在小鼠注射胰腺癌细胞时导致肿瘤发展延迟，为开发针对高风险因素个体的预防性基于iPSCs的胰腺CVs提供了基础。 为了研究基于干细胞疫苗在人类中的安全性，进行了一项临床试验（NCT02074046）。这项I/II期试验共招募了40名胰腺癌患者，他们接受了由装载DCs的CSCs衍生的疫苗。研究的主要目标是评估疫苗在人类中的安全性。也测量了疫苗诱导的免疫反应等次要结果。 另一项正在进行的II期临床试验（NCT01088789）涉及总共72名患者，使用一种与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）转染的同种异体胰腺肿瘤细胞疫苗。这项试验显示出有希望的结果，并旨在评估疫苗对人类胰腺癌的安全性和可行性。最终结果将根据无病OS以及与疫苗接种相关的任何特定不良事件（AEs）来确定。 3.4.肝细胞癌 肝细胞癌（HCC）是世界上第六大常见癌症，也是最难治疗的癌症之一。包括经动脉化疗栓塞在内的传统管理策略并未取得令人满意的结果。此外，更新的免疫疗法模式仅对10%-20%的患者显示出有效性。FDA已经批准了一种针对HBV的预防性抗癌疫苗用于肝癌。 肿瘤排斥的主要机制涉及由胚胎产物产生的免疫反应，这表明干细胞作为不同癌症疫苗的潜在用途。一种使用iPSCs的全细胞基础疫苗已经获得专利，用于包括HCC在内的各种癌症。一项使用辐照HCC细胞作为全细胞疫苗的研究，结合淋巴细胞诱导的人工Th9细胞，在小鼠模型中显示出对HCC的保护作用。这种有益效果主要归因于增加分化和转录因子水平，从而减少肿瘤大小和生长。另一项研究调查了基于CSCs疫苗对肝转移的预防效果，在大约50%的接种疫苗的小鼠中显示出对肿瘤发展的抵抗。接种疫苗的小鼠显示出原发肿瘤大小的减少和转移的预防。一项I/II期临床试验（NCT02089919）已经进行，招募了40名HCC患者。这些患者接受了不同剂量的CSCs装载DC疫苗，旨在评估基于干细胞疫苗在人类中的可行性。主要目标是评估这些疫苗的安全性，而次要目标是测量疫苗的免疫原性。 3.5.结直肠癌（CRC） 结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，2020年全球死亡人数达0.9百万。CRC的总生存（OS）率约为65%，而在远处转移性癌症病例中降至15%。在CRC中，干细胞壁龛由Paneth细胞和血管内皮细胞组成。这些细胞提供重要的生长因子，并调节如Wnt、Notch和Hh等通路，这些通路负责生长、增殖和转移。临床试验在CRC干细胞基础疫苗的开发中显示出进展，证明了其安全性和减缓肿瘤发展。 一些研究使用减毒的结直肠CSCs进行，但没有产生有希望的结果。然而，p53和p21基因的调节作用已被强调，同时靶向它们可能会进一步提高疫苗的效力。与DC相关的疫苗显示出通过先天和适应性免疫诱导抗原反应的潜力。CSCs基质涉及生长、增殖和肿瘤发生，靶向结直肠CSCs的TME可能是CV开发的重要方法。针对CD24、CD26和CD29等多种生物标志物的CV可能在CV开发中发挥决定性作用。另一项研究检查了由体外翻译RNA转染诱导的iPSCs衍生疫苗的效果，该疫苗成功地在体外肿瘤球状体模型中针对CRC诱导了针对新抗原的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应。由结肠CSCs CD44+制成的疫苗已被制成含有缺陷核糖体产物的自噬体丰富的小泡（DRibbles）疫苗。有趣的是，当在CRC动物模型中测试时，这种疫苗上调了脾淋巴细胞中的CD8+并激活了MHC-I和-II复合体，从而产生强烈的细胞毒性效应。一项研究将与结肠肿瘤相关的细胞表面抗原MUC1与结肠CSCs结合，并将其整合到治疗性地给予感染结肠癌细胞（CC）的小鼠的疫苗中。研究得出结论，MUC1可能在表达结肠CSCs的抗肿瘤免疫原性中发挥关键作用。 一项I/II期临床试验（NCT02176746）已经进行，以证明与DC相关的CSCs疫苗在诱导针对CSCs和来自PBMCs的B细胞相关结合和裂解的免疫反应方面的效力。试验的主要结果衡量是人类使用干细胞疫苗的安全性。在不同的队列中给予不同剂量的疫苗以确定安全剂量。次要结果是基于疫苗对癌症的免疫反应进行衡量的。 3.6.乳腺癌 乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，导致女性癌症相关发病率和死亡率。尽管早期诊断和靶向治疗显著改善了预后，但许多突变肿瘤对这些传统治疗有抵抗力。针对乳腺癌的疫苗可以是细胞基础的、肽基础的或基因靶向的疫苗。这些疫苗通过靶向干细胞作为TICs来工作。 一项研究展示了在正位乳腺癌的小鼠模型中，使用基于iPSCs的疫苗结合非基因工程CpG作为预防措施的有效性。这种方法产生了有效的免疫原性反应，IgG结合最高，并在Th1和细胞毒性细胞中上调抗原呈递。iPSCs已被证明作为预防性疫苗具有肿瘤保护效果。三阴性乳腺癌（TNBC）因缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的过表达而具有干细胞样特性。一项研究在小鼠模型中进行了基于HIF-1α的疫苗以针对体内乳腺CSCs，这表明通过肿瘤细胞的主动免疫下调肿瘤生长的特性。另一项研究从乳腺祖细胞中提取疫苗，并将其作为治疗性疫苗用于乳腺癌模型。这些疫苗通常被调节性T（Treg）细胞下调。然而，当预先用淋巴结T细胞致敏时，它们显示出对Treg抑制作用的显著耐受性。因此，用T细胞致敏的疫苗显示出具有更大意义的免疫原性肿瘤破坏效果。进行了一项临床试验（NCT02063893），招募了40名乳腺癌患者，以评估基于CSCs疫苗的不同剂量的安全性、免疫原性和可行性。 3.7.多发性骨髓瘤 多发性骨髓瘤，也称为浆细胞骨髓瘤，是一种罕见的浆细胞癌症，浆细胞是一种通常产生抗体的白细胞。它占所有液体癌症的约10%。尽管治疗方面最近取得了进展，但复发率非常高，生存率为8-9个月。基于CAR-T细胞的治疗最近在多发性骨髓瘤的管理中引起了关注。这种疗法涉及从患者的血液中提取T细胞，并将它们工程化以针对特定的免疫系统标记物，如CD-19、-38和-138，这些标记物在液体肿瘤表面普遍存在。然后，这些工程化的T细胞被重新给患者，导致肿瘤生长减少。CAR-T细胞疗法已被批准用于各种基于B细胞的肿瘤。 一项研究展示了由造血干细胞(HSC)衍生的树突状细胞(DC)疫苗的有效性，该疫苗显示出多种益处，例如通过抗原呈递细胞(APCs)增强抗原摄取，以及通过细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)阻断T细胞介导的T细胞刺激和迁移增加。因此，可以建议将CTLA-4阻断剂与这种基于HSC的疫苗结合使用，可能在多发性骨髓瘤中具有协同效应。另一项研究强调了间充质干细胞(MSCs)在多发性骨髓瘤中的重要性。从非疾病宿主处施用基于MSCs的疫苗可能在改善疾病结果方面极为有益。 在一项II期临床试验(NCT00019097)中，向多发性骨髓瘤患者施用了自体干细胞（捐赠者和接受者为同一人）。共有60名患者接受了自体肿瘤细胞疫苗与沙格拉莫司汀的联合治疗，沙格拉莫司汀是一种众所周知的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。 3.8.胶质瘤 胶质瘤，也称为胶质细胞的癌症或恶性病变，是最常见的脑肿瘤类型。低级别胶质瘤，被分类为I级和II级，较为不具侵略性，通常发现于年轻患者中。另一方面，高级别胶质瘤，III级和IV级，在老年人中更为常见。胶质母细胞瘤，作为一种侵略性的胶质瘤形式，被归类为IV级胶质瘤。它在所有原发性脑肿瘤中存活率最低，平均只有1.5年。 为了解决传统基于细胞的胶质瘤疫苗的局限性，一项研究开发了一种名为STDENVANT的疫苗。这种疫苗结合了胶质瘤干细胞、CpG寡核苷酸和DCs。在胶质瘤的小鼠模型中，这种治疗性疫苗显示出显著的效力。它上调了PD-1/PD-L1，导致中枢神经系统和淋巴结中的Treg细胞增加。因此，它改善了肿瘤治疗的结果。用TLR-4预处理的MSCs已被证明比常规MSCs具有更大的稳定性。此外，这些MSCs可以被制成微囊泡以增强对胶质瘤肿瘤细胞的免疫原性反应。另一项研究报告了在胶质瘤模型中，基于DC的疫苗转染CSCs RNA的有效性。接种这种改良疫苗的大鼠与接种传统基于DC的疫苗的大鼠相比，OS（总生存期）提高了10-15天。因此，使用结合DCs和CSCs的改良疫苗的免疫疗法可能在胶质瘤治疗中更有效。Sox2被认为是维持正常神经干细胞(NSCs)的重要因素。因此，用Sox2条件性缺失突变后的CSCs接种小鼠，导致肿瘤发展延迟和存活率提高。使用胶质瘤干细胞的细胞裂解物制成的DC疫苗，针对胶质瘤-CSCs，通过CD8、CD11和MHC-II复合物的表面激活介导了显著的抗肿瘤免疫。胶质瘤干细胞脉冲DC疫苗也在体外被证明可以诱导IFN-γ水平。一项I/II期临床试验(NCT00846456)测试了一种基于DC的疫苗，该疫苗转染了CSCs-mRNA，并在20名招募的患者接受六周放化疗术后皮下注射。传统研究的主要目标是建立基于CSCs的疫苗在人类中的安全性。招募的患者没有显示出与疫苗相关的任何自身免疫或其他特定不良反应。同时，研究的次要目标是确定疫苗的有效性，主要基于疾病进展和存活率。最后，他们证明了接种疫苗的患者无进展生存期(PFS)是匹配对照组的2.9倍。 4.使用基于干细胞的疫苗进行的各种癌症临床试验的总结 迄今为止，还没有干细胞衍生的疫苗被批准用于癌症的管理。然而，由于体外结果充满希望，全球正在开展众多的临床前和临床研究，以探索基于干细胞的疫苗在各种癌症管理中的使用。这些疫苗目前处于临床前/临床开发的不同阶段，正在进行的临床试验的详细信息列在表8.2中。 5.基于干细胞的癌症疫苗的不足 与基于干细胞的治疗相关的风险因素多种多样，取决于施用地点、使用的细胞类型和施用方法。基于干细胞的CVs应该根据理论和潜在风险进行评估。需要严格评估AEs和临床结果。正如在小节中所述，干细胞治疗可能存在各种副作用。 5.1.肿瘤形成 用于开发完整或整个基于细胞的CVs的iPSCs和ESCs，与CSCs具有显著的相似性。在胚胎阶段，这些ESCs被周围细胞包围，这些细胞充当检查点，从而防止它们的无控制生长和增殖。然而，当作为CVs使用并在没有这些周围细胞的外部环境中培养时，ESCs可能会经历无控制的增殖，导致诸如畸胎瘤和畸胎癌等恶性肿瘤的发展。 5.2.移植物抗宿主病 在某些情况下，异体干细胞基础疫苗也可能通过B细胞衍生的抗体和针对外来抗原的T细胞介导因子引发移植物抗宿主病。它还可能导致异常的免疫反应，这些反应可能对内脏器官造成损害、继发癌症和感染。异体移植排斥可能导致疫苗效力的丧失，并引发不良反应。然而，胚胎干细胞(ESCs)和间充质干细胞(MSCs)由于其极低的免疫原性潜力，被认为是免疫特权的。尽管如此，当它们被施用到不寻常的部位并分化时，它们的免疫原性可能会增加。 5.3.自身免疫 基于整个细胞的疫苗包含癌症特异性和正常细胞抗原。因此，它们可能引发针对身体正常组织的免疫反应。然而，Nigel等人在2018年对诱导多能干细胞(iPSCs)进行的一项研究没有显示出对正常细胞的任何自身免疫反应。未来应进行进一步的研究，以探索基于整个细胞的疫苗的安全性。 5.4.病毒整合和转基因复活 异种或异体基础的iPSCs是使用逆转录病毒和慢病毒生产的。因此，这引发了与用于X连锁免疫缺陷障碍的基因疗法类似的伦理问题。这些病毒及其载体可能与原癌基因整合，并可能导致新肿瘤（新肿瘤形成）的形成。从本质上讲，这可以重新激活转基因或其因子，如c-Myc，这可能促成恶性肿瘤的发展。此外，iPSCs可以在染色质中诱导表观遗传变化，进一步增加细胞的肿瘤形成潜力，并重新激活像c-Myc这样的肿瘤介质。然而，需要更多的研究来完全理解它们在恶性肿瘤形成中的作用。为了解决这个限制，已经开发了新的方法，如使用小分子生成iPSCs和利用非病毒载体进行整合。尽管如此，这种方法根据突变位点携带恶性肿瘤发展的风险。 6.前进的方向 根据当前可获得的文献，癌症的主要病理过程可以通过CSCs（也称为TIC细胞）来解释。CSCs不仅负责肿瘤细胞的启动和增殖，它们也是发展对粗放化疗和其他靶向疗法的抗性的主要原因。CSCs的抗性机制主要由各种途径介导，包括Hh信号、TGF-β、Notch途径和Wnt/β-catenin。这些途径的激活是通过CSCs上的抗原表面标记物介导的，如CD133。Hh途径信号的激活主要是通过CSCs过度表达Hh信号基因来实现的，导致化疗抗性。通过得出肿瘤无控制生长的主要原因是CSCs的存在，它们可以作为治疗靶点，通过产生针对CSCs的抗体。首先，需要识别和理解特定的蛋白质或基因组标记，这些标记将非干细胞癌细胞、正常干细胞和CSCs区分开来。此外，如果通过疫苗诱导的抗体反应针对CSCs的表面抗原，可能不会导致肿瘤体积的即时减少，但随后CSCs的缺失将阻止进一步的肿瘤增殖。这些CSCs上的表面抗原包括CD133，它在各种肿瘤的CSCs中作为抗原标记。除了表面标记物外，各种蛋白质分子如醛脱氢酶1 (ALDH-1)在不同肿瘤的CSCs中表达。一群侧群(SP)细胞分泌一种非表面标记染料分子，这有助于将其与正常干细胞区分开来。作为疫苗，iPSCs能够克服许多基于肿瘤胎儿或ESC疫苗的障碍。这些基于干细胞的疫苗单独使用时不能引发抗肿瘤反应，并显示出临床上显著的效果。因此，它们可以作为其他免疫刺激剂的佐剂，以实现最佳反应。此外，它们也可以与传统化疗联合使用，以实现肿瘤大小的减少。这种组合不受肿瘤复发问题的限制，因为在没有CSCs的情况下，肿瘤将被根除。目前，iPSCs或任何其他干细胞衍生的疫苗都是从患者自己的组织中提取的，重新设计，并作为疫苗施用回去。另一种方法是开发一种能够诱导对广泛类别肿瘤产生免疫反应的通用疫苗。如上文所述，目前正在进行研究，通过动物和人类试验探索将干细胞重新用作CVs的潜力。目标是展示在临床实践中使用这些疫苗的可行性。然而，在将它们纳入治疗方案之前，仍有许多未探索的机制和安全问题需要解决。 7.结论 癌症是一个复杂的疾病，影响着全球相当一部分人口。癌症病例的增加和实现积极临床结果的挑战并没有伴随着新的管理策略的发展或现有疗法效果的提高。当前疗法存在各种限制，如难以忍受的副作用和抗药性的发展。因此，需要一种新的方法来实现最佳的临床结果。正在发现几种疗法，包括基因疗法、激素疗法、靶向疗法和疫苗接种。在这些疗法中，文中详细讨论的基于干细胞的疫苗接种尤为重要，因为它针对所有肿瘤共有的一种病理学。肿瘤起始干细胞（CSCs）在肿瘤中占一小部分但具有影响力。鉴于胎儿干细胞和肿瘤起始细胞（TICs）之间的分子和基因组相似性，它们可以被视为开发抗癌疫苗的理想靶标。这可以通过使用不同类型的干细胞来实现，包括胚胎干细胞（ESCs）、诱导多能干细胞（iPSCs）和成体干细胞（ASCs）。总之，直接针对肿瘤起始干细胞可能是癌症治疗的一个重要进展。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。