USP9X

点击蓝字↑，关注我们 药研速览 2025.02.04 Online JMC Research Brief ·2025 近日，中科院上海药物所熊兵、刘同超、贺金雪等研究人员在药物化学国际顶级期刊《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一篇题为《发现和优化一系列新型含吗啉的USP1抑制剂》的研究论文。该研究基于KSQ-4279的结构，通过开环和环化策略设计了一系列新型含有吗啉骨架的USP1抑制剂，并成功优化出具有显著酶活性和细胞抑制活性的化合物38-P2。该化合物不仅表现出良好的药代动力学特性和安全性，还在BRCA1缺陷型癌症模型中显示出显著的抗肿瘤效果，且能够增强奥拉帕尼耐药细胞对奥拉帕尼的敏感性。此外，38-P2与穿心莲内酯在BRCA1正常的癌细胞中表现出协同抗肿瘤作用。这项研究为开发新型USP1抑制剂提供了重要的先导化合物，并为克服PARP抑制剂耐药性提供了新的治疗策略。 图片来源：ACS 01 Background 研究背景 USP1在DNA损伤修复中的作用 USP1通过与辅助因子UAF1结合形成复合物，参与调节Fanconi贫血（FA）和跨损伤合成（TLS）途径，这些途径与同源重组（HR）途径相互关联。USP1-UAF1复合物通过去泛素化作用负向调节FANCD2、FANCI和PCNA的活性，以确保基因组稳定性。在DNA损伤响应中，USP1的抑制可导致PCNA单泛素化水平升高，激活DDR通路。 USP1作为抗癌靶点的研究背景 USP1在多种癌症中异常激活或过表达，因此作为治疗靶点受到越来越多的关注。基于合成致死原理开发的PARP抑制剂已获批用于治疗BRCA1/2突变肿瘤，但耐药性问题日益突出。USP1抑制剂与PARP抑制剂的联合使用可能成为克服PARP抑制剂耐药的新策略。此外，USP1在逆转化疗耐药中也发挥重要作用，因此开发USP1抑制剂对于癌症治疗具有重要意义。 USP1抑制剂的研究进展 目前已有多个USP1抑制剂进入临床研究阶段，如KSQ-4279（RO7623066）和TNG-348等。KSQ-4279显示出良好的单药治疗潜力和与PARP抑制剂的联合治疗潜力，但其临床疗效有限。为了克服现有抑制剂的局限性，研究者们致力于探索新的化合物骨架，以开发更有效的USP1抑制剂。 图片来源：ACS 02 Drug Design 药物设计与评价 ①采用新型骨架设计USP1抑制剂 为了开发具有新骨架的高效USP1抑制剂，开展了基于结构的药物设计研究。Walden团队通过X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）技术对USP1-UAF1复合物的结构进行了深入研究，这些结构信息为针对USP1的基于结构的药物设计提供了宝贵的基础。最近，他们利用冷冻电镜技术解析了KSQ-4279与USP1结合的共晶结构（PDB代码：9FCI）。冷冻电镜分析显示，KSQ-4279占据了USP1的疏水通道，并破坏了蛋白质的结构。因此，KSQ-4279通过别构方式结合到USP1-UAF1的隐秘口袋中，从而抑制其活性。KSQ-4279的4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基团位于由Leu96、Tyr100、Leu152和Val156包围的疏水口袋中，可能与USP1蛋白形成疏水相互作用。咪唑基团的N原子通过一个关键的氢键与Gln160相互作用，而4-（三氟甲基）-1H-咪唑-2-基团则位于另一个疏水口袋中。显然，1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶核心的吡唑部分朝向溶剂区域，与USP1没有潜在的相互作用，而连接核心和苯基的亚甲基部分有足够的空间进行进一步的结构修饰。基于对共晶结构的这些分析，对1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶进行了环开环策略，并对亚甲基连接部分进行了进一步的环化策略，以设计具有新骨架的USP1抑制剂。 图片来源：ACS ②吗啉被鉴定为有望成为USP1抑制剂的骨架 为了寻找有效的USP1抑制剂骨架，作者首先合成了多种不同环状结构的化合物，并以KSQ-4279作为阳性对照进行活性测试。这些化合物由于环化反应均含有一个手性碳原子，但在初步筛选阶段未进行手性分离。测试结果显示，形成五元四氢吡咯环的化合物7对USP1/UAF1表现出较弱的抑制活性（10 μM时抑制率为63.4%）；而含有哌啶环的化合物8显示出中等活性，但对NCI-H1299细胞的抗增殖活性较弱。将哌啶环替换为哌嗪环后得到的化合物9活性显著下降，进一步引入甲基（化合物10）或异丙基（化合物11）修饰哌嗪环也未能改善活性。然而，当哌啶环被替换为吗啉环时，得到的化合物12展现出较好的酶活性和细胞活性，其IC50值分别为68.9 nM和241.5 nM，尽管其活性仍弱于KSQ-4279，但这一结果初步证实了这种环化模式在开发更有效的USP1抑制剂方面具有潜力。因此，作者在后续的优化工作中保留了吗啉环结构。 图片来源：ACS ③嘧啶部分取代基的构效关系 (SAR) 作者以化合物12为基础，系统地研究了吡啶环上取代基（R1和R2）对USP1抑制剂活性的影响。研究发现，取代基的类型和位置对抑制剂的活性有显著影响。例如，当R1位置的氟原子被甲基取代时（化合物16），抑制剂的活性显著增强，其对USP1/UAF1的IC50值为68.9 nM，对NCI-H1299细胞的IC50值低至0.8 nM，远低于KSQ-4279。然而，将甲基替换为乙基（化合物17）或引入其他取代基如三氟甲基、三氟乙基、羟基等均导致活性减弱。甲氧基取代（化合物21）的活性略低于化合物16，但对NCI-H1299细胞的抑制活性与化合物16相当。进一步调整取代基大小，如将甲氧基替换为乙氧基、2,2-二氟乙氧基、乙酰胺或N-甲基乙酰胺，均显著降低对USP1/UAF1的抑制活性，且细胞活性也依次下降。其他R1位置的取代基，如甲硫基、硝基、羧酰胺和甲酸甲酯，在10 μM浓度下对USP1/UAF1的抑制活性相当。对于R2位置的取代，单独的甲基或甲氧基取代均未表现出明显的抑制活性，而双取代的化合物则显示出弱至中等的抑制活性。这些结果表明，取代基的类型和位置对活性至关重要，特别是R1位置的甲基和甲氧基取代基对活性的贡献最为显著，为后续的结构优化提供了重要的指导。 图片来源：ACS ④末端部分的SAR研究 在确定了含有吗啉环和呋喃并[3,2-d]嘧啶核心的化合物38作为潜在的优化方向后，作者以化合物38为基准，系统地研究了终端基团对USP1/UAF1抑制活性的影响。研究发现，终端基团的结构和性质对抑制剂的活性有显著影响。例如，将化合物38中的异丙基替换为甲基（化合物44）会导致酶活性和细胞活性分别降低约7倍和10倍。将咪唑环替换为吡唑环（化合物45）也会显著降低活性。此外，将二取代的嘧啶环替换为其他结构，如2-环丙基苯基（化合物46）或2-异丙基苯基（化合物47），均显著降低了对USP1/UAF1的抑制活性。将嘧啶环替换为2-异丙基吡啶-3-基（化合物48）略微增强了对USP1/UAF1的抑制活性，但对细胞活性不利。而4-氯-1-异丙基-1H-吡唑-5-基（化合物49）虽然对USP1/UAF1表现出高活性，但细胞活性降低了约100倍。这些结果表明，终端基团的结构对抑制剂的活性至关重要，特别是二取代嘧啶系统的保留对于维持高活性非常关键。 图片来源：ACS ⑤化合物38的两种对映体的比较 为了深入理解化合物38的两个对映异构体（38-P1和38-P2）的活性差异，作者通过超临界流体色谱（SFC）分离得到了这两个纯对映异构体，并对它们进行了全面的生物学评估。实验结果显示，38-P2在抑制USP1-UAF1酶活性方面表现出显著优于38-P1的活性，其IC50值为3.8 nM，而38-P1的IC50值为110.0 nM，表明38-P2的酶抑制活性是38-P1的约28.9倍。在细胞水平上，38-P2对NCI-H1299细胞的抑制活性也远高于38-P1，其IC50值为0.5 nM，而38-P1的IC50值为141.5 nM，活性差异达到283倍。此外，38-P2对BRCA1缺陷的MDA-MB-436细胞表现出极高的抑制活性，IC50值低于0.03 nM，而38-P1的活性则显著较低。值得注意的是，这两个对映异构体在正常细胞系HL-7702和IM-9中的活性均较低，IC50值均大于10 μM，显示出良好的选择性。 分子对接研究进一步揭示了38-P2（R-对映体）与USP1蛋白结合的优越性。对接结果显示，R-对映体能够更好地适应USP1的结合口袋，尤其是在4-（三氟甲基）-1H-咪唑-2-基片段周围。因此，38-P2被确定为R-对映体，并被选为进一步研究的主要化合物。这些结果表明，38-P2不仅在酶活性和细胞活性方面显著优于38-P1，还具有良好的选择性和较低的毒性，使其成为一种极具潜力的USP1抑制剂候选化合物。 图片来源：ACS 03 In vitro 体外评价 ①38-P2显示出对USP1-UAF1的强效和选择性抑制 作者详细研究了化合物38-P2对USP1-UAF1的抑制活性、选择性、可逆性和抑制机制，并探讨了其在细胞水平上的生物学效应。研究发现，38-P2对USP1-UAF1表现出显著的抑制活性，其IC50值为3.8 nM，远低于KSQ-4279（21.3 nM），显示出更高的效力。同时，38-P2对USP1-UAF1的抑制作用具有高度的选择性，对其他USP家族成员（如USP4、USP7、USP8、USP9X、USP15和USP25）的抑制作用可以忽略不计。实验表明，38-P2主要通过可逆的方式抑制USP1-UAF1，且为非竞争性抑制机制。在细胞水平上，38-P2处理显著增加了单泛素化PCNA（Ub-PCNA）水平，激活了DNA损伤响应通路，并导致细胞周期在S期阻滞，同时显著增加了细胞凋亡的比例。此外，38-P2显著抑制了MDA-MB-436和NCI-H1299细胞的克隆形成能力，显示出对癌细胞生存能力的显著抑制作用。这些结果表明，38-P2作为一种新型的USP1-UAF1抑制剂，不仅具有高效的抑制活性和高度的选择性，还能通过激活DNA损伤响应通路和诱导细胞凋亡来抑制癌细胞的生存能力，使其成为一种极具潜力的抗癌药物候选化合物。 图片来源：ACS ②38-P2增强耐药细胞对奥拉帕尼的敏感性 化合物38-P2能够显著增强奥拉帕利耐药的MDA-MB-436/OP细胞对奥拉帕利的敏感性。实验中，38-P2单独处理耐药细胞时，能够显著增加单泛素化PCNA（Ub-PCNA）水平并激活DNA损伤响应通路，表现为γH2AX、磷酸化Chk1（p-Chk1）和磷酸化RPA32（p-RPA32）蛋白水平的升高。在克隆形成实验中，38-P2单独处理耐药细胞时，克隆形成能力显著降低（63%的抑制率），而奥拉帕利单独处理则没有显著的细胞毒性。然而，当38-P2与奥拉帕利联合使用时，耐药细胞的克隆形成能力进一步降低至79%。此外，38-P2单独处理耐药细胞24小时后，细胞周期在G2/M期发生阻滞，而与奥拉帕利联合处理时，细胞在S期和G2/M期的积累进一步增加。这些结果表明，38-P2不仅能够单独抑制耐药细胞的增殖，还能通过增强DNA损伤响应通路的激活，显著提高耐药细胞对奥拉帕利的敏感性，为克服PARP抑制剂耐药提供了潜在的治疗策略。 图片来源：ACS ③穿心莲内酯增加癌细胞对38-P2的敏感性 研究发现，穿心莲内酯能够显著增强38-P2对癌细胞的抑制作用。通过药物组合筛选，作者发现穿心莲内酯与38-P2在BRCA基因野生型的OVCAR-8和SKOV3卵巢癌细胞系中表现出显著的协同作用。Bliss协同分析显示，这种组合在不同浓度下均能显著抑制肿瘤细胞的增殖。此外，克隆形成实验也证实了穿心莲内酯与38-P2联合处理能够显著增强对肿瘤细胞的细胞毒性效应。这些结果表明，穿心莲内酯与38-P2的联合使用可能为BRCA基因野生型癌症的治疗提供一种新的策略，具有潜在的临床应用价值。 图片来源：ACS ④肝微粒体体外代谢稳定性、细胞色素 P450 (CYP450) 和hERG抑制 作者对化合物38-P2在不同物种肝微粒体中的代谢稳定性、对CYP450酶系的抑制作用以及对hERG通道的抑制作用进行了综合评估。结果显示，38-P2在小鼠、大鼠、狗、猴和人的肝微粒体中均展现出良好的代谢稳定性，其中在大鼠肝微粒体中的半衰期超过120分钟，表明其代谢过程较为缓慢。对于CYP450酶系的抑制作用，38-P2对大多数CYP450同工酶的抑制作用较弱，仅对CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19表现出一定的抑制活性，但抑制强度仍在可接受范围内。此外，38-P2对hERG通道的抑制作用较弱，其IC50值大于10 μM，这表明该化合物具有良好的心脏安全性。综合来看，38-P2在体外表现出的代谢稳定性和较低的药物相互作用风险，以及对hERG通道的低抑制活性，使其成为具有潜力的药物候选物，为后续的药物开发提供了有力支持。 图片来源：ACS 04 In Vivo 体内活性评价 ①ICR小鼠体内药代动力学评估 化合物38-P2在ICR小鼠体内的药代动力学特性表现出良好的口服吸收特性。具体而言，小鼠口服给药10 mg/kg后，38-P2的血浆浓度迅速上升，达到最大血药浓度（Cmax）为3510 ng/mL，显示出较高的药物暴露量。其药时曲线下面积（AUC0‑inf）为14200 h·ng/mL，表明药物在体内的吸收和分布较为广泛。此外，38-P2的半衰期（T1/2）为1.92小时，这一较短的半衰期意味着药物在体内的消除速度较快，但同时也提示可能需要较频繁的给药以维持有效的血药浓度。 图片来源：ACS ②38-P2的体内活性 化合物38-P2在MDA-MB-436（BRCA1缺陷型）乳腺癌细胞异种移植模型中表现出显著的剂量依赖性抗肿瘤效果。小鼠分别口服给予38-P2（75 mg/kg和150 mg/kg）或KSQ-4279（100 mg/kg）作为阳性对照，治疗持续21天。结果显示，38-P2在两个剂量下均显著抑制了肿瘤的生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为45%和66%。这一效果与KSQ-4279相当（TGI为50%）。在治疗期间，所有接受药物处理的小鼠体重未出现明显下降，且耐受性良好，表明38-P2具有良好的体内安全性和耐受性。此外，通过Western blot分析肿瘤组织中Ub-PCNA蛋白水平，发现38-P2处理的肿瘤组织中Ub-PCNA水平显著增加，这进一步证实了USP1抑制剂在体内通过增加PCNA单泛素化来发挥抗肿瘤作用的机制。这些结果表明，38-P2不仅在体外表现出良好的活性和药物特性，其体内抗肿瘤效果也得到了验证，显示出作为潜在抗癌药物的开发前景。 图片来源：ACS 总结 在本研究中，作者基于临床化合物KSQ-4279，通过环开环和环化策略设计并合成了一系列具有吗啉骨架的新型USP1抑制剂。经过详细的构效关系（SAR）研究，优化得到了化合物38-P2，其在酶活性和细胞活性方面均显示出比KSQ-4279更强的抑制能力。进一步的机制研究表明，化合物38-P2是一种选择性、可逆且非竞争性的USP1-UAF1抑制剂，能够激活DNA损伤反应通路，诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡，并显著抑制细胞存活。此外，38-P2还能增强对奥拉帕利耐药的MDA-MB-436/OP细胞对奥拉帕利的敏感性，并与穿心莲内酯在BRCA野生型癌细胞中表现出协同抗肿瘤效应。化合物38-P2在体外表现出良好的代谢稳定性，对大多数CYP450同工酶和hERG通道无明显抑制作用，显示出良好的药物安全性。在体内药代动力学研究中，38-P2显示出良好的口服吸收特性，具有较高的Cmax（3510 ng/mL）和较大的AUC（14200 h·ng/mL），半衰期为1.92小时。在MDA-MB-436乳腺癌异种移植模型中，38-P2以剂量依赖性方式显著抑制肿瘤生长，肿瘤生长抑制率（TGI）分别达到45%和66%。总体而言，38-P2作为一种新型的USP1抑制剂，具有良好的药物开发潜力，有望成为治疗HRD缺陷型癌症的候选药物。 参考来源： https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.4c02792 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

关注小药说药，一起成长！ 前言 基于T细胞的免疫疗法的出现显著改变了癌症患者的治疗模式。尽管取得了成功，但目前批准的免疫治疗方案仍然存在局限性。因此，需要对T细胞活化和抑制的分子机制有更深入的了解，以合理地扩大改善免疫治疗的靶点和可能性。 免疫信号通路下游的蛋白质泛素化对于几乎所有免疫反应，特别是T细胞激活的正调节和负调节至关重要。大量研究表明，泛素化通过控制蛋白质的功能、定位和稳定性发挥多种细胞和分子作用，对泛素依赖性通路的调节可以显著改变T细胞的活化并增强抗肿瘤反应。因此，人们正在积极开发有选择性地利用泛素相关酶用于癌症治疗的技术，靶向泛素化为推进T细胞免疫治疗提供了巨大的可能性。 蛋白质泛素化 泛素化是一种翻译后修饰，泛素是一种由76个氨基酸组成的小蛋白质，通常由一条泛素链与底物蛋白质内的赖氨酸残基共价连接。泛素化通过各种方式影响蛋白质功能，例如通过影响蛋白质稳定性、周转率、细胞定位，以及诱导影响与其他蛋白质相互作用的构象变化。 该过程由E1泛素激活酶启动，该酶使用ATP激活，然后将泛素单体转移到E2泛素结合酶。泛素最终在E3泛素连接酶的作用下从E2转移到底物。 泛素化是多方面的，底物蛋白可以仅用一个泛素（单泛素化）、多个单泛素（多个单泛素化）或多泛素链（多泛素化）标记。由于泛素本身有七个赖氨酸（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63）和一个N端甲硫氨酸残基（M1），可以进行泛素化，因此可以形成几种结构不同的同质/同型、混合/异型和分支多泛素链。 泛素化除了是通过蛋白质体降解蛋白质的主要调节器外，实际上是几乎所有细胞信号级联的多功能调节器。泛素化蛋白质的命运取决于添加的泛素数量和形成泛素连接的泛素氨基酸。通过这种方式，并且由于拓扑结构不同链的多种可能性，泛素构成了一种高度通用的信号。 单泛素化和多泛素化参与膜受体的内吞作用，以及蛋白质降解、定位和蛋白质-蛋白质相互作用，这些类型的链也与TGF-β信号传导有关。在同型多泛素链中， Lys48和Lys63连接的链是最丰富，它们分别驱动蛋白酶体降解和调节多种细胞信号事件。Lys11连接链调节细胞周期和线粒体自噬，M1连接链对炎症固有反应至关重要，特别是调节NF-κB信号。 由Lys6-、Lys27-、Lys29-、Lys33泛素连接链调节的细胞过程仍然不太清楚。Lys27连接链似乎对调节先天免疫、细胞周期和线粒体功能非常重要。Lys6链似乎参与DNA修复和线粒体自噬，而Lys29链与Wnt信号以及蛋白毒性应激和细胞周期相关。Lys33链在高尔基体后转运和T细胞受体（TCR）调节中起着关键作用。 此外，非常重要的是，泛素在底物上的组装可以通过去泛素化酶（DUB）的作用逆转，去泛素化酶水解并从底物上去除泛素，使泛素化成为一种瞬时修饰，DUB对于维持生理性泛素平衡是必不可少的。这种平衡的失调与人类疾病的发病机制有关，特别是癌症、感染、神经退行性变和免疫紊乱，因此，DUB已开始作为基于抑制剂的治疗成为有吸引力的药物靶点。 TCR/CD3激活中的泛素途径 E3连接酶 E3泛素连接酶Casitas B系淋巴瘤（Cbl-B）是最具特征的E3连接酶，是T细胞活化的主要参与者。在T细胞激活时，它在免疫突触处被招募到TCR中，在TCR下游发挥多种抑制机制。 Cbl-b通过其多个蛋白质相互作用结构域与关键TCR信号体分子（如LCK、SLP76、ZAP70、Vav1、PKCθ和PI3K）相互作用。Cbl-b与E3连接酶Itch协同作用，能够介导TCR-ζ的Lys33连接的多泛素化，其不针对TCR受体进行降解或内吞，而是阻止其磷酸化并进一步与下游ZAP70激酶结合。通过这些相互作用，以及一些信号体成分的泛素化，Cbl-b强烈抑制T细胞活化。Cbl-b敲除小鼠具有过度活跃的T细胞，其激活不需要CD28，此外，Cbl-b基因敲除小鼠中从未描述过自身免疫损伤。因此，Cbl-b具有多个检查点抑制作用和极小的自身免疫毒性，是未来靶向癌症免疫治疗的有力候选。 与淋巴细胞无能相关的基因（GRAIL）是一种跨膜E3连接酶，定位于内体，也对T细胞活化起负调节作用。TCR介导的T细胞活化促进GRAIL的表达，而GRAIL反过来又阻碍T细胞活化。机制上，GRAIL通过非降解泛素链稳定和激活Rho-鸟嘌呤解离抑制剂（RhoGDI），导致细胞骨架重排和IL-2分泌缺陷。 NRDP1是另一种损害TCR信号的E3连接酶。T细胞激活后，NRDP1将Lys33多聚泛素非降解链添加到ZAP70激酶。Lys33连接的泛素链有助于招募Sts1和Sts2磷酸酶，最终使ZAP70去磷酸化和失活。 除了作用于近端信号体外，E3连接酶还通过进一步作用于下游抑制T细胞活化，控制导致T细胞活化转录因子核易位的关键转导事件。例如，在TCR/CD28连接后，E3连接酶Pellino1（PELI1）通过用Lys48多泛素链标记c-Rel来阻止NF-κB通路，导致其蛋白酶体降解。 DUBs 去泛素化酶A20和CYLD，在调节天然免疫细胞中的NF-κB信号中具有重要作用，也能显著改变T细胞功能。外周T细胞中A20的条件性缺失导致CD8+T细胞具有增强的NF-κB信号，即使在低抗原剂量下也能更有效地被激活，以产生更高水平的IL-2和IFN-γ。 CYLD可以通过NF-κB损害T细胞活化，它是通过将CBM复合物下游TAK1激酶的Lys63泛素链进行去泛素化。CYLD缺陷小鼠出现结肠炎，T细胞频率和活化增加。 使用类似的作用机制，去泛素酶USP18对TAK1的去泛素化抑制TCR。USP18的基因缺失导致T细胞中NF-κB和NFAT的过度激活和IL-2的过度产生。相反，去泛素酶USP9X和USP12通过从BCL10中去除抑制性泛素链来积极调节NF-κB通路，从而阻断CBM信号复合物的组装。因此，缺乏USP9X或USP12的T细胞在TCR激活时表现出较低水平的NF-κB激活，以及增殖和细胞因子生成减少。 TCR内化 TCR信号幅度和持续时间由细胞膜受体的内化、再循环和降解的平衡决定。在抗原刺激下，TCR/CD3复合物是泛素化的，而泛素化对于表面受体的内化至关重要。据报道，Cbl-b可单独或与E3连接酶c-Cbl联合促进TCR的内化，Cbl-b还干扰激活和聚集，从而破坏免疫突触的稳定性，进一步减弱TCR信号。 类似地，E3连接酶GRAIL可以通过蛋白酶体多泛素化和降解CD3ζ分子来下调表面TCR/CD3复合物的表达。最近的研究表明，用于CAR-T治疗的CAR受体的表面表达也受到泛素介导的内吞和降解的影响。注入患者体内的CAR-T细胞持续性差是这种肿瘤免疫疗法的主要限制。最近的一项研究能够通过对细胞质结构域的所有赖氨酸残基进行突变来提高CAR的稳定性，这有效地绕过了CARs的泛素化依赖性溶酶体降解，因此，这些CAR-T细胞改善了CAR的持久性和来自内体的信号传导，同时增强了效应器功能，从而在小鼠模型中产生持久的抗肿瘤免疫反应。 共刺激受体下游的泛素途径 CD28 E3连接酶Cbl-b是CD28介导的信号传导的主要抑制剂，从机制上讲，E3连接酶Cbl-b通过结合和泛素化PI3K的p85β亚单位来抑制CD28依赖的PI3K途径。 E3连接酶不仅能阻碍CD28信号传导，而且能促进CD28信号传导。例如，TCR/CD28激活NFAT涉及E3连接酶TRAF6。TRAF6被招募到免疫突触与支架蛋白LAT相互作用，并通过Lys63泛素化增强LAT磷酸化和TCR信号。 为了充分激活T细胞，CD28共受体必须克服Cbl-b抑制。CD28信号通过触发Cbl-b的翻译后修饰来阻断Cbl-b抑制途径，最终导致其蛋白酶体降解。其中E3连接酶NEDD4发挥着重要作用，据报道NEDD4在CD28共刺激下结合并泛素化Cbl-b进行蛋白酶体降解。 其他共刺激受体 与CD28类似，肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员的共刺激受体4-1BB、CD40L、OX40和GITR与TCR协同促进T细胞活化，尤其是增殖和细胞因子的产生。作为TNFRs，它们缺乏内在的酶功能，依赖于几种E3连接酶，包括TRAF（TRAF1/2/3）、cIAP1/2和LUBAC，在导致NF-κB活化的信号转导级联中引导大量Lys63、Lys48和线性泛素化事件。去泛素酶A20、CYLD和OTULIN可以清除这些泛素化事件以阻止NF-κB的活化。 抑制性受体下游泛素途径 CTLA-4 到目前为止，没有任何E3直接泛素化CTLA-4的报道，也没有CTLA-4中泛素化位点的记录。然而，CTLA-4缺陷型T细胞的泛素修饰总体上显著减少，这有力地表明了泛素化事件在CTLA-4途径中的重要性。此外，实验证据表明，主要CTLA-4抑制功能由关键的T细胞抑制性E3连接酶介导，该连接酶也调节T细胞活化，即Cbl-b、ITCH和GRAIL。 此外，Cbl-b、ITCH和GRAIL是T细胞无能的基本驱动因素，而且这三种E3连接酶还通过调节Treg的发育和功能发挥重要的免疫抑制作用。Cbl-b和ITCH参与TGF-β介导的Foxp3调节，缺乏这两种E3连接酶都会损害TGF-β诱导的Foxp3+Tregs（iTreg）的发育，导致iTreg低表达，功能缺陷。 PD-1 与CTLA-4不同，一些报告强调了泛素化在PD-1/PD-L1系统中的关键作用。对于T细胞上的PD-1受体，Cbl-b也作为PD-1抑制途径的关键介质显著参与，缺乏Cbl-b的T细胞对PD-1抑制具有抵抗力。没有Cbl-b，PD-1在抑制IFN-γ产生或诱导T细胞活化后的细胞死亡方面效率低下。 另一种Cbl E3连接酶c-Cbl也影响PD-1，但与Cbl-b相反，它是一种负性调节因子。c-Cbl与PD-1的胞质尾部结合，并作为E3连接酶，泛素化PD-1进行蛋白酶体降解。因此，c-Cbl减少提高了CD8+T细胞和巨噬细胞中PD-1的表达。 同样，E3连接酶FBXO38通过介导PD-1降解来控制T细胞抗肿瘤反应。从机理上讲，FBXO38通过在Lys233处添加Lys48多聚泛素链来标记PD-1进行降解。缺乏FBXO38的黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型具有更高的肿瘤负荷，这与肿瘤浸润性T细胞中PD-1的高表达有关。 PD-L1 PD-L1的肿瘤水平是肿瘤免疫的重要决定因素。几项研究已确定癌细胞利用EGFR信号稳定PD-L1表达以逃避T细胞免疫。E3连接酶识别并泛素标记PD-L1进行蛋白水解，主要依赖于糖原合成酶激酶3（GSK3α/β）。GSK3β磷酸化PD-L1的C端结构域，以招募E3连接酶β-TrCP用于PD-L1泛素依赖性降解。而EGFR信号通过诱导GSK3β磷酸化位点附近的PD-L1大量糖基化来对抗GSK3β/β-TrCP/PD-L1降解途径。 另一项研究进一步表明GSK3α/ARIH1是另一种诱导PD-L1蛋白水解的激酶/E3连接酶对。E3连接酶ARIH1识别S279/S283处PD-L1的GSK3α依赖性磷酸化，随后PD-L1 Lys48泛素化和降解。最近，还发现EGFR通过额外干扰膜结合MARCH8 E3连接酶增加PD-L1水平，该连接酶也以PD-L1为降解靶点。最后，c-Cbl过表达，单独或与Cbl-b联合，也可以降低STAT3/AKT/ERK磷酸化，从而下调PD-L1表达并增加抗肿瘤反应。 Cullin3 SPOP和TRIM21E3连接酶通过泛素化依赖性降解进一步破坏PD-L1的稳定性，它们的作用再次依赖于激酶，特别是细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK5。然而，CDK4通过稳定Cullin3 SPOP协助PD-L1降解，而CDK5则消极干扰TRIM21对PD-L1的作用。 此外，PD-L1也因其他几种去泛素化酶而稳定，即OTUB1、USP9X、USP7。这些研究具有潜在的治疗意义，因为它们证明，抑制或清除这些DUB中的任何一种都可以重新激发小鼠的抗肿瘤反应，并使癌细胞对T细胞杀伤敏感。 泛素依赖途径肿瘤药物的开发 到目前为止，针对泛素依赖的途径主要是基于小分子抑制剂，这些小分子可以通过直接结合或变构作用阻断泛素相关酶的催化结构域，或阻止其与底物或其他调节蛋白结合。目前，已经开发了200多种化合物，其中许多化合物正在进行癌症治疗的临床前和临床试验。 大多数基于泛素的小分子化合物被设计成靶向癌细胞中必需的泛素途径。随着以T细胞为基础的肿瘤免疫治疗的出现，针对选择性E3和DUB的靶向抑制已有研究，其中关键的细胞内检查点T细胞抑制剂Cbl-b具有巨大的潜力。已有研究利用RNA干扰成功地下调了T细胞中的Cbl-b水平，这在不同的过继性T细胞转移肿瘤模型中产生了出色的体外和临床前结果，并且癌症患者对其耐受性良好，目前已进入临床试验（NCT02166255和NCT03087591）。此外，针对IAPs、MDM2和USP7的小分子已经进行了临床前试验，并证明单独使用或联合使用时，至少部分增强体内抗肿瘤免疫。 调节癌细胞中PD-L1降解的泛素化依赖途径也正在进行测试。例如，一种竞争性棕榈酰化抑制剂（CPP-S1），以防止PD-L1棕榈酰化，进而促进PD-L1泛素介导的降解。控制PD-L1泛素化和降解的EGFR信号通路也通过不同的方式在体内被有效阻断，包括EGFR小分子抑制剂、铜螯合剂和靶向CSN5的小分子，都显著增强T细胞抗肿瘤反应。 基于邻近性的治疗方法，包括PROTAC或分子胶技术，也正在迅速发展，以针对几种特定肿瘤蛋白质的蛋白酶体降解，目前有十几项临床试验正在验证这些基于泛素化技术的治疗潜力。 小结 数据表明，调节几种泛素依赖性途径，特别是所涉及的泛素依赖性酶，可以释放强烈、持久和靶向的抗肿瘤反应。目前，泛素领域也取得了巨大进展，开发出了多种新技术和新方法，可以专门针对几乎所有泛素依赖的酶，或者利用它们针对感兴趣的底物蛋白，包括肿瘤蛋白。展望未来，相信这些重要的泛素依赖途径的调节很快将成为改善靶向肿瘤免疫治疗的可行替代方案。 参考文献： 1.Ubiquitination in T-Cell Activation andCheckpoint Inhibition: New Avenues for Targeted Cancer Immunotherapy. Int J MolSci. 2021 Oct; 22(19): 10800. 公众号内回复“疫苗篇”或扫描下方图片中的二维码免费下载《小药说药疫苗篇》的PDF格式电子书！ 公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。

引言胶质母细胞瘤是最致命的恶性肿瘤之一，表现出明显的肿瘤内异质性，其中胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）对肿瘤发生和治疗抵抗起着重要作用。泛素连接酶和去泛素化酶的药物调节剂正在开发用于癌症和其他疾病。2024年3月19日，西湖大学谢琦，深圳湾实验室李磊和匹兹堡大学Jeremy N. Rich共同通讯在Cell Discovery 发表题为“RBBP6 maintains glioblastoma stem cells through CPSF3-dependent alternative polyadenylation”的研究论文。该研究进行了并行的体外和体内CRISPR/Cas9敲除筛选，针对人类泛素E3连接酶和去泛素化酶，揭示了E3连接酶RBBP6作为GSC维持的一个必需因子，靶向RBBP6抑制了GSC的增殖和肿瘤起始。在机制上，RBBP6介导CPSF3的K63-链接泛素化，稳定了CPSF3来调节选择性多腺苷酸化事件。RBBP6敲除导致MYC竞争性内源性RNA的3'UTR缩短，从而释放了miR-590-3p从缩短的UTRs中，从而降低了MYC的表达。用小分子抑制剂（JTE-607）靶向CPSF3可以减少GSC的存活率并抑制体内肿瘤生长。总的来说，RBBP6通过调节CPSF3依赖的选择性多腺苷酸化在GSC中维持高MYC表达，为胶质母细胞瘤提供了一个潜在的治疗范例。胶质母细胞瘤是最常见和致命的原发性脑肿瘤，中位生存时间不到两年。目前胶质母细胞瘤的标准治疗包括最大程度的手术切除，联合放疗和化疗，随后进行辅助化疗，只能提供姑息治疗。胶质母细胞瘤表现出肿瘤内异质性，其中自我更新的胶质母细胞处于层级顶端。胶质母细胞以其自我更新和肿瘤起始能力而功能特异化，此外还对肿瘤血管生成、放射抵抗力和化疗抵抗力有额外的贡献。胶质母细胞瘤是最早进行全面遗传分析的肿瘤之一，揭示了导致信号传导失调的频繁变异，包括涉及表观遗传学变化、转录调节因子和转录后调节的变异。然而，基于遗传突变的精准医学对胶质母细胞瘤患者的临床管理影响有限，表明替代的分子靶点可能提供治疗益处。泛素化是调节底物蛋白命运和/或功能的最常见的翻译后修饰之一。泛素-蛋白酶体通路维持大多数蛋白质的稳态。泛素分子通过涉及E1（泛素激活）、E2（泛素连接）和E3（泛素连接酶）酶的催化级联添加到靶标蛋白中，可以通过去泛素化酶（DUBs）逆转。先前的研究已将泛素途径与胶质母细胞瘤的生长总体和GSC的维持特异性联系起来。例如，胶质母细胞瘤可能过表达USP15，该酶结合SMAD7-SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶2（SMURF2）复合物去泛素化并稳定型I转化生长因子-β受体（TβR-I），增强TGF-β信号传导。在GSCs中，USP9x取消乙醛脱氢酶1A3（ALDH1A3）的多泛素化以稳定ALDH1A3并维持GSCs。用USP9x抑制剂WP1130处理GSCs可诱导ALDH1A3降解并抑制GSC的生长。此外，USP13和FBXL14相互调节GSCs中MYC的多泛素化。因此，去泛素化酶和泛素连接酶可能是胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。模式图（Credit: Cell Discovery）CRISPR/Cas9基因敲除（KO）高通量筛选已被证明是癌症治疗中目标基因发现的有效平台。先前的CRISPR筛选研究主要集中在体外培养的细胞模型上，这些模型无法充分代表肿瘤微环境的复杂效应，这种方法可能限制了药物开发的成功。在这里，作者改进了一种更具生理学相关性的体内CRISPR筛选方法，以识别对GSC维持和肿瘤形成至关重要的泛素连接酶和去泛素化酶。原文链接https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41421-024-00654-3责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述