TNF-α x FasL

摘要:免疫细胞治疗作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症护理。这是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的疗法。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）细胞疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法旨在利用身体的自然防御机制来定位和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤细胞（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，需要更高水平的操作，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制和细胞疗法产品设计的基本和临床研究以及技术创新方面取得了显著进展。随着技术的迅速整合和高创新格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足细胞疗法技术进步治疗癌症的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术创新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.引言 癌症是一种利用多种逃逸机制来躲避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变整个免疫系统的功能和组成。抗癌治疗的演变跨越了一百多年，其效果和特异性不断提高，旨在消除癌细胞的同时尽量减少对健康组织的损害。为了实现这一目标，免疫细胞治疗在现有方法中脱颖而出，成为了一种改变游戏规则的解决方案。2017年，食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharm的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和Novartis的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着抗癌治疗加速发展的一个重大里程碑。免疫细胞治疗的基本概念是通过外部供应具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以帮助患者对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应加入到抗肿瘤努力中。免疫细胞治疗的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞治疗的效果不佳。 根据癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润性免疫细胞），外部分化有效的细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞]，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）]。在本综述中，我们将讨论最新的免疫细胞治疗，总结应用于实现和优化这些治疗类别的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞治疗癌症 低风险免疫细胞治疗旨在使用患者自己的免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调的是细胞治疗领域内某些治疗相对更安全、副作用较少，属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞治疗包括四种关键技术：肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、DC疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，必须深入研究促进这些细胞治疗的基本机制和临床进展。 2.1.TIL细胞治疗 TILs是存在于实体肿瘤微环境（TME）中的天然单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润性淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润性淋巴细胞（sTILs）。与iTILs相比，sTILs主要是效应记忆T细胞，更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TILs“预训练”攻击癌细胞，同时留下健康的细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质细胞已经显示出治疗晚期癌症的潜力，第一个人类TIL治疗导致转移性黑色素瘤显著消退。实体瘤缺乏理想的肿瘤标志物，使得靶向肿瘤相关抗原（TAAs）具有挑战性。TILs作为具有多样化受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TILs在克服实体瘤的异质性方面表现出优越性，特别是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的趋化因子受体，并且与CAR-T细胞相比，它们的非靶向毒性较低，这归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TILs可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可供扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg，肿瘤相关巨噬细胞，髓系抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL治疗成功的至关重要步骤。TIL在体外的扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前阶段，TILs在高剂量白细胞介素（IL）-2下进行初级扩增。一些方法涉及选择肿瘤特异性TILs进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TILs以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备用于患者给药后进行淋巴细胞减少。 自1988年Rosenberg等人成功将TIL治疗应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL治疗首次被引入用于治疗非小细胞肺癌（NSCLCs），在涉及113名患者的临床研究中。结果显示，TIL与IL-2联合使用对NSCLCs是一种有效的治疗方法，与II期或IIIa期相比，对IIIb期NSCLCs有选择性益处。在初步成功后，TIL治疗的后续发展一直朝着提高治疗其他肿瘤类型的疗效方向发展，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成的肿瘤浸润性B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的临床结果改善。另一项关于胃癌TIL治疗的研究表明，TIL的组织学亚群与不同的存活时间相关。目前，TIL治疗的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发具有更有效分离和扩增方法的有希望的治疗性TILs，并可能与其他抗肿瘤疗法结合使用。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T和NK细胞样表型的异质免疫效应细胞。它们是通过将人的PBMC或脐带血单核细胞与干扰素γ（IFN-γ）、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外培养产生的。CIK细胞独特地表现出对肿瘤的主要组织相容性复合体（MHC）不受限制的靶向性，减少异体反应性，并能够攻击各种肿瘤类型。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子以激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效果。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活动并促进肿瘤细胞凋亡。它们主要通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/认知配体细胞间粘附分子-1（LFA-1/cam-1）与肿瘤细胞上的抗原结合的机制来实现肿瘤杀伤效果。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀伤肿瘤细胞。 激活的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效果和抑制肿瘤细胞，还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。主要由CIK细胞产生的IFN-γ增强了NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究指出，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞性白血病（CLL）细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris指出，某些肿瘤细胞（如黑色素瘤和卵巢癌）通过诱导表达FasL的淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或激活的T细胞被IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制选择性地消除。结合CIK细胞中高水平的抗凋亡基因表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应性的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有超过5,000名患有多种肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结肠癌等，参与了CIK细胞疗法。全球CIK细胞（或CIK细胞与DC联合）的临床试验已超过80项。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效果，正在发展中，是治疗癌症的一条令人鼓舞的途径。虽然临床前景看好，但一些公开讨论是必要的。与其他免疫细胞相比，CIK细胞输注后的毒性效应、最小化额外的支持性护理、确定与其他免疫疗法的优势、了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，以及在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs进行“疫苗接种”以对抗肿瘤组织是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs（如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒）处理体外培养的DCs。DCs将摄取抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，对影响免疫系统起着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 DC疫苗，通常采用体外成熟的自体单核细胞并用抗原冲击，已在多种肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间普遍较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每一步上。策略包括扩大DC来源、提高免疫原性、优化抗原选择、开发新的免疫佐剂以及探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效的成人恶性肿瘤治疗提供了希望，特别是对于去势抵抗性前列腺腺癌。通过培养患者的PBMCs与一种由TAA（前列腺酸性磷酸酶（PAP））和GM-CSF组成的重组蛋白（PAP-GM-CSF）来生产。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的一个重要进展，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DC主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂（ICI）以及化疗和放疗结合的免疫疗法中以改善结果。研究表明DC能够激活自然杀伤T（NKT）细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险的免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的综合协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中尤为明显，它们是可适应和协同的。这种协同作用旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效果而闻名，但由于缺乏特定的识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最近的研究表明CIK和DC之间的相互作用会在两个群体内部引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，与CIK细胞共同培养DCs发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展现出有希望的协同效应，即使在之前对CIKs有抵抗力且之前未与DCs共同培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DCs显著增加的IL-12分泌显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种合作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，并增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效果。同时，CIK细胞增强了DCs的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共同培养抑制了人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，并阻碍了肿瘤细胞的增殖。 基于上述机制，DC-CIK疗法以相互适应和协同为特点，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病（GvHD）的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的多个方面，从而形成了更全面的对抗疾病的方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤为有益，其中多种免疫功能障碍发挥作用。总的来说，低风险的免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的确切组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞治疗技术的进步 高风险免疫细胞治疗使用自体干细胞、异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些细胞都需要进一步的操作和评估。这些治疗的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重新激活已有的反应。在这里，我们描述了高风险免疫细胞治疗中的特征设计、转染方法、细胞来源，以及克服抑制性肿瘤微环境（TME）的方法，包括CAR-T、T细胞受体-T（TCR-T）、CAR-NK和CAR-巨噬细胞（CAR-M）。此外，我们提供了对未来趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程受体蛋白，为免疫细胞提供了识别癌细胞表面特定抗原的新能力，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的潜力。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也可能会显著影响治疗效果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。 细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括一个用于目标结合的单链可变片段（ScFv）和一个铰链区域，通常在CAR工程细胞中的免疫球蛋白（Ig）样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞能够识别癌症特异性靶标表位，不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。 CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或抗原丢失的复发，并且结合任一抗原都将触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将编码两个独立CAR分子的单个双顺反子向量转导到单个细胞中，或将编码双价CAR分子的向量转导到细胞中，或共同给药两种不同的CAR工程免疫细胞产品，或共同转导两个向量到单个免疫细胞中编码不同的CAR。这些方法对于B细胞淋巴性白血病特别有前景，尤其是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病（B-ALL），因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞具有显著的疗效，以及CD19/CD22双特异性CAR-T细胞。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，治疗28天后的总体反应率为82%，显示出治疗目的的安全性和有效性。此外，Wang等人表明，CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内表现出相当或更好的功能。 除了ScFv的优化，细胞外区域也得到了改进。与传统CAR直接作用于靶细胞不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR（modCAR）。这种CAR-T（图1D、E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），只要能针对至少一个所需的抗原并介导目标与效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图1. CAR的设计策略。针对肿瘤的CAR设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以生成双顺反子CAR工程细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，生成双价CAR。(C) 通过共同给予两种不同的CAR工程免疫细胞产品（上图）或共同转导两种编码不同CAR的载体到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计装甲CAR以共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以增加效果和持久性。(G) SynNotch CAR通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特设计对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。这也可以通过特设计的转录因子和转录机制（H）实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR细胞（图1F）旨在分泌细胞因子或其他分子，以帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，潜在地提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR细胞或TRUCKs（T细胞重定向用于抗原无限制的细胞因子启动的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合进行探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在早期阶段试验中。值得注意的是，IL-7和IL-15已被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19或CCL-21，能够趋化其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，从而提高了CAR-T细胞的有效性。 CAR设计中的最新发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G，H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过引入可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型的案例使用了布尔逻辑和逻辑门的原理，当所有条件满足时，通过构象变化激活的共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以执行AND、NOT和OR布尔逻辑门。在体外已经证明了针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还含有一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。 在T细胞中，第一代CAR已构建包含编码针对2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体的可变区域的重组基因片段，这些片段被拼接到α或β T细胞受体（α或β TCR）的C区之一。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并能够识别MHC非限制性的肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T利用T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子包括可诱导的共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中最广泛使用。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给予淋巴瘤患者CD19导向的第二代CAR-T细胞（带有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（带有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和优越的扩张。然而，目前评估仅第三代CAR-T的临床数据有限。在一个研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T治疗，在成人复发/难治性ALL患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解。此外，最近的研究表明，配备有4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与仅有一种共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建。已经开发了包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告称，含有细胞内域的CAR-NK，包含4-1BB和CD3ζ，克服了抑制信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞特别创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞对肿瘤细胞有显著增强的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明，与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同的信号域，如CD3ζ、DAP10和DAP12的CAR构建，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，与包含DAP10域的CAR相比，具有CD3ζ信号域的CAR表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但其细胞内信号域的功能不同，主要是为了增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和多个表皮生长因子样域蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的研究结果表明，添加一个串联的PI3K招募域可以增加对癌细胞的吞噬。CAR-M的第一个临床试验产品是第一代产品，包含CD3ζ作为其细胞内域，并且第一阶段的临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得了FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，非病毒转染技术因其在克服与病毒载体生产相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP合规性方面的经济利益而越来越受欢迎。例如，转座子或移动遗传元素被用来实现高效和持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔能够使免疫细胞如T细胞短暂表达基因组编辑核酸酶，例如CRISPR-Cas9的表达，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简单性、容量和吞吐量以及有利的安全概况方面提供了优势。 与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是主流模式，并被广泛认为是转染困难细胞类型（如免疫细胞）的一种高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组中。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus和Yescarta都是由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。一般来说，γ逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常可以获得30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。 与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具挑战性又效率低下，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，单轮转染效率范围为27%-52%，经过两轮转染后为47%-75.4%。虽然逆转录病毒已被广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏有效的基因转移方法仍是NK细胞在免疫疗法中使用的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入性突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染具有较低的遗传毒性和插入性突变风险。然而，原代NK细胞在LV转导中的效率很低，需要多轮转染。最近，Bari等人表明，用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体的转导效率比用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的高20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在约70%的不同供体的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。用BaEV-gp伪型的慢病毒带有肿瘤特异性CAR在NK92细胞中的转导率几乎达到100%，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的转染方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因表达在转染后约3-5天内下降。但当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，与其他系统相比，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒和转座酶DNA转染到iPSC中，成功地稳定创建了表达CAR分子的CAR-iPSC-NK细胞。 与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，例如较低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本，以及能够转移基因片段，其载荷能力接近9-10 kb。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的一个有力选择。然而，要充分利用转座子系统对原代NK细胞进行转染，需要进行优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞比其他造血系统中的细胞更难转染和抵抗遗传操作，因为它们有能力识别并响应外来核酸。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒系统，该系统通过感染时Vpx诱导的SAMHD1降解，已被证明可以有效传递转基因到骨髓细胞。Klichinsky团队使用复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35有效地传递CAR到巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了肿瘤杀伤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座子系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即使用的材料是患者自己的细胞。尽管这种方法已证明有效，但存在一些重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时制造的不良等待时间，由于患者T细胞功能障碍可能导致的生产失败，与健康淋巴细胞一起提取的恶性白血病细胞污染产品的风险，高生产成本，标准化的复杂性，以及再剂量机会的限制。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。特别是，CAR-NK是一种有前景的同种异体细胞治疗，对实体瘤和血液系统恶性肿瘤均无重大毒性副作用。它是一种更简单、可再注射、更实惠的通用治疗。 然而，当前的治疗尚未显示出强大的疗效和/或长期持久性，并且NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要在临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍显示出巨大潜力。 目前，CAR-M主要是自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现并正在进行进一步研究。 在开发同种异体方法时，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和GvHD（移植物抗宿主病）的发展。免疫排斥可能限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性的αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体引起，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，还进行额外的遗传修改。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调控，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定的和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在ALL小鼠模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。 此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，但其长期持久性较短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA类I分子的表达。这种方法防止了异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来物，但仍然容易受到宿主NK细胞的溶解。因此，一项研究使用突变的B2M融合蛋白来解决这个问题。为了在激活的异体CAR-T细胞生产过程中提高HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建众多同质HLA组合库的理想资源。通过从库中选择一个HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间CAR-T细胞的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人生成了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。 研究通过体内发挥效应功能证明了它们抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产满足临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过在培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来分化CAR转染的iPSCs为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都显示出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了一个骨髓/巨噬细胞分化协议，诱导CAR-iPS向骨髓细胞系分化，成功产生了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中测试时，CAR-iMacs的有效性有限。总的来说，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ并以HLA独立的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞显示出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效应，并且在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续性较差。此外，针对CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行第一阶段的临床试验。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。UCB衍生的CAR-T细胞在体内显示出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明了改善的治疗潜力。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），并且不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展为GvHD，也不太可能迁移到表现GvHD的器官。研究表明，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）与它们的分化对应物相比，具有优越的增殖和干细胞潜力，并且在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩张和持久性。 VSTs拥有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中显示出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，输注CAR-VST细胞取得了良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的第一阶段临床试验中显示出既安全又临床有效。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并促进CAR-T或TCR-T重定向到肿瘤的临床使用。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。PBMC衍生的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们显示出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向针对前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致大部分治疗小鼠的肿瘤被完全根除。一种短暂表达针对间皮素的mRNA CAR，MCY-M11的CAR-PBMC细胞产品已进入临床试验，它是一种混合产品，包含不同的CAR工程T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一类同时具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞群。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质以及糖脂的抗原呈递分子。I型NKT细胞或称为iNKT细胞不具有HLA限制性，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚未知晓。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并且具有增强的消除脑淋巴瘤的能力。另一种异体NKT细胞，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行临床试验，针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（NCT03774654）。 4.2.改善肿瘤微环境以增强治疗性免疫细胞的效果 免疫细胞治疗实体瘤的效果受限于低持久性和注入后的不充分增殖，这在很大程度上归因于免疫抑制微环境，它不是被动的旁观者，而是癌症进展的积极推动者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和驻留宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子-β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造支持性环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性细胞毒性T细胞。为了根除肿瘤，科学家们开发了几种策略来促进CAR工程或TCR工程治疗性免疫细胞向癌症焦点的迁移和渗透，包括利用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤退缩和增强的抗肿瘤效果。然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗癌的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制肿瘤微环境。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至会导致危及生命的毒性。在肿瘤微环境中阻断TGF-β信号是另一种提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的方法，因为它在肿瘤信号、重塑和代谢中起着至关重要的作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在肿瘤微环境中隔离TGF-β，耗尽调节性T细胞，并促进CTL共刺激。此外，通过转导优势负性TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了对TGFβ有抵抗力的肿瘤特异性T细胞，并已在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。另一种新策略是利用肿瘤微环境中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起被转导，与CAR或TC共表达，以产生工程化CTL。这些工程化CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。最近，这一策略已经进行了临床测试。这些工程化细胞被发现能有效克服免疫抑制肿瘤微环境，例如分泌更多的IFN-γ，积聚在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。细胞外基质为各种抗癌疗法创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和展示肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程巨噬细胞被证明能主动迁移到肿瘤部位，可以作为药物递送系统在抗原特异性环境中局部递送细胞因子和/或细胞毒性物质，显著改变免疫抑制肿瘤微环境，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。张等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现出抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准首个CAR-T细胞疗法产品以来，全球已有10个CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞疗法的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家角度看，高风险细胞疗法的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T疗法的主要临床治疗靶点是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的靶抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在病症方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T在头颈、肝脏和结肠癌症的临床研究正在迅速进展（图2C）。就CAR-NK病症而言，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤病症的进展速度更快（图2C）。 图2. CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法的临床试验。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞疗法临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组。(B) 按国家分组的细胞疗法临床研究数量，同样分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK几组，Y轴在50到450之间中断。(C) 针对不同适应症的细胞疗法药物的临床进展，细胞疗法药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和固体肿瘤两组。原始数据下载自https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 CAR-NK的临床治疗靶点主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。图2的数据可从补充表2获得。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中变得越来越重要。与替代免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂和细胞因子）相比，免疫细胞治疗表现出了优越的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液系统恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制肿瘤微环境、肿瘤异质性、靶标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略（如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗）结合起来被认为是有益的，可以通过不同的机制增强整体治疗效果。目前，全球已有10个CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一个获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TIL和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出了希望。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同的抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特征的异质细胞组成，在治疗相对高异质性的恶性肿瘤方面具有优势。另一方面，高风险免疫治疗如CAR-T和TCR-T通常是定向的和高度特异性的，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到了临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原和新抗原，使它们在外来抗原如病毒相关恶性肿瘤方面受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和降低GvHD风险和其他风险的方法为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略使得实现长期效果成为可能。同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低到中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或降低的产品活性。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，使用基因修饰细胞、自体干细胞或同种异体或异种细胞，这需要额外的评估。在临床上，这些疗法有时可能引发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征（CRS），这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风险管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不需要的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GVHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期遗传修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入性突变或遗传毒性以及恶性转化的可能性。然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。重要的是要理解风险在临床研究中无处不在，它被定义为在特定时间框架内发生不利结果的可能性。评估可接受的免疫细胞治疗风险水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，而是可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻微肿瘤或癌症适应症且存在适当治疗方法的患者相比，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。总的来说，免疫细胞治疗的技术障碍相对较高，创新动力强，技术发展多。近年来进展呈爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法如TIL面临由于无法完全消除Tregs而有限的效力。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以高效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉回输无法有效激活DC分化和成熟的影响。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为有希望的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将肿瘤靶向CAR-M转化为肿瘤支持表型方面的高适应性。然而，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来开发中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术创新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:免疫细胞疗法作为一种革命性的治疗方式，显著改变了癌症治疗。它是一种专业的免疫疗法，利用活的免疫细胞作为治疗癌症的生物制剂。与传统药物不同，细胞疗法被认为是“活药”，这些产品目前是定制的，需要先进的制造技术。尽管嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗血液恶性肿瘤方面受到了行业的极大关注，但其在治疗实体瘤方面的有效性常常受限，导致替代性免疫细胞疗法的出现。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法、细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗以及DC/CIK细胞疗法旨在利用人体的自然防御机制来靶向和消除癌细胞，通常具有较少的副作用或风险。另一方面，如嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞、T细胞受体（TCR）-T、嵌合抗原受体-自然杀伤（CAR-NK）或CAR-巨噬细胞（CAR-M）等细胞疗法通常使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，这需要更高水平的操纵，被认为是高风险的。这些高风险细胞疗法通常在肿瘤靶向和信号传导方面具有特殊特性，触发新的抗肿瘤免疫反应。最近，在抗肿瘤机制、细胞疗法产品设计和技术革新方面取得了显著进展。随着技术的快速整合和高度创新的格局，关键的未来发展方向已经出现。为了满足癌症治疗中细胞疗法技术进步的需求，我们在本研究中全面系统地调查了免疫细胞疗法的技术革新和临床进展。基于免疫细胞疗法的治疗机制和方法学特点，我们分析了这些疗法的主要技术优势和临床转化风险。我们还分析和预测了应用前景，为相关企业提供了必要的信息，以便他们做出关于研发方向选择的明智决策。 1.介绍 癌症是一种利用多种逃逸机制来逃避抗癌免疫的全身性疾病，并且显著改变了整个免疫系统的功能和组成。抗癌疗法的发展跨越了一百年，其在消除癌细胞的同时，对健康组织的损害最小化，效果和特异性不断提高。为了实现这一目标，免疫细胞疗法在现有方法中脱颖而出，成为改变游戏规则的解决方案。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了两种嵌合抗原受体-T（CAR-T）细胞疗法，即Kite Pharma公司的axicabtagene ciloleucel（Yescarta）和诺华公司的tisagenlecleucel（Kymriah），用于治疗淋巴瘤。这些批准标志着加速抗癌治疗发展的一个重大里程碑。 免疫细胞疗法的基本概念是通过向患者提供具有所需功能的细胞来增强免疫反应，以对抗癌症。它不仅重新激活了现有的免疫反应，还推动了新的免疫反应参与到抗癌努力中。免疫细胞疗法的反应通常涉及多种免疫细胞类型的激活和协作，包括抗原呈递细胞，如树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，T淋巴细胞（T细胞）以及自然杀伤（NK）细胞。一个肿瘤负担的免疫系统不仅在免疫细胞数量上失衡，而且在调节抗癌免疫反应的分子和信号通路上也表现出功能异常。因此，精确地施用适当的治疗策略是必要的，以防止免疫细胞疗法的次优效果。 根据不同的癌症类型及其机制，免疫过程的各个领域为治疗干预提供了途径。方法包括，例如，提取和扩增具有预先癌症识别能力的免疫细胞（例如，肿瘤浸润免疫细胞），外部分化有效细胞类型[例如，细胞因子诱导的杀手（CIK）细胞] ，以及基因修饰细胞以实现特定识别和肿瘤细胞消除[例如，T细胞受体（TCR）工程，嵌合抗原受体（CAR）] 。在这篇综述中，我们将讨论最新的免疫细胞疗法，总结应用于使各种类别的疗法得以实现和优化的策略，并提供未来的展望。 2.用低风险免疫细胞疗法治疗癌症 低风险免疫细胞疗法旨在利用患者的自身免疫细胞来消除癌细胞。需要注意的是，“低风险”强调了细胞疗法领域内某些疗法相对更安全、副作用更少，这些疗法属于再生医学或先进治疗药物产品（ATMPs）。低风险免疫细胞疗法包括四种关键技术：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法、CIK细胞疗法、树突状细胞（DC）疫苗和DC/CIK细胞疗法。为了更全面地理解这些方法，深入研究支持每种细胞疗法的基本机制和临床进展至关重要。 2.1.TIL细胞疗法 TIL是自然存在于实体肿瘤微环境（TME）中的单核细胞，包括肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞（iTILs）和基质肿瘤浸润淋巴细胞（sTILs）。sTILs主要是效应记忆T细胞，与iTILs相比更容易被检测到。作为一群已经接触过肿瘤组织的异质性淋巴细胞，TIL被“预训练”来攻击癌细胞，同时保留健康细胞。在小鼠肿瘤模型中，这些异质性细胞显示出治疗晚期癌症的潜力，第一种人类TIL疗法导致转移性黑色素瘤显著退化。实体瘤缺乏理想的肿瘤标记，使得针对肿瘤相关抗原（TAAs）的靶向变得具有挑战性。TIL作为具有多样受体的多克隆细胞，为实体瘤提供了独特的治疗选择。与基因修饰的免疫细胞相比，TIL在克服治疗实体瘤的异质性方面表现出优越性，尤其是像黑色素瘤这样高度异质性的肿瘤。此外，它们具有注射后迁移至TME的关键趋化因子受体，与CAR-T细胞相比，它们的低非靶向毒性归因于T细胞成熟过程中的负选择。 TIL可以从切除的肿瘤组织中分离出来。鉴于TIL在原始TME中的稀缺性，可用于扩增的TIL数量有限，以及阻碍TIL抗肿瘤细胞毒性的额外因素（例如，Treg、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞和各种免疫抑制分子）。TIL的生产和扩增是TIL疗法成功的关键步骤。TIL体外扩增涉及快速扩增协议（REP）。在REP前期，TIL用高剂量白细胞介素（IL）-2进行初步扩增。有些方法涉及选择肿瘤特异性TIL进行进一步扩增，而其他方法则扩增大量TIL以保持疗效。在REP阶段，同时给予高剂量IL-2和抗CD3，并使用辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）作为饲养细胞，直到获得足够数量的细胞。然后，经过质量控制的扩增细胞产品准备好后，就可以进行淋巴细胞耗竭后的患者给药。 自Rosenberg等人在1988年成功将TIL疗法应用于转移性黑色素瘤患者以来，一系列临床试验相继出现。1996年，TIL疗法首次在涉及113名患者的临床研究中用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。结果显示，TIL结合IL-2是NSCLC的有效治疗，与II期或IIIa期NSCLC相比，IIIb期NSCLC有选择性益处。在初步成功后，TIL疗法的后续发展旨在提高治疗其他肿瘤类型的疗效，包括皮肤、肾脏和胃癌。这些发展中的具体方法旨在阐明TIL细胞类型的组成及其与临床结果的相关性。例如，成功生成肿瘤浸润B淋巴细胞（TIBs）已被发现可以预测转移性肾细胞癌（mRCC）患者的改善临床结果。另一项关于TIL治疗胃癌的研究揭示了TIL的组织学亚群与不同的生存时间相关。目前，TIL疗法的临床转化仍处于初步阶段，缺乏长期临床观察。然而，初步成功表明有机会开发有前途的治疗性TIL，具有更高效的分离和扩增方法，以及与其他抗肿瘤疗法的潜在替代组合。 2.2.CIK细胞疗法 CIK细胞是具有混合T细胞和NK细胞样表型的异质性免疫效应细胞。它们是通过将人的外周血单核细胞(PBMC)或脐带血单核细胞与干扰素γ(IFN-γ)、抗CD3抗体、重组人IL-1和IL-2一起体外孵育生成的。CIK细胞独特地表现出不依赖主要组织相容性复合体(MHC)的肿瘤靶向，减少异体反应，并能够攻击各种类型的肿瘤[3]。在体外培养过程中，CIK细胞分泌各种细胞因子，激活巨噬细胞、NK细胞和CD8+ T细胞的细胞毒性活性，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并促进间接杀伤效应。CIK细胞诱导凋亡基因和抗肿瘤基因的表达，进行细胞毒性活性并促进肿瘤细胞凋亡。它们的肿瘤杀伤效应主要是通过通过粘附分子淋巴细胞功能相关抗原-1/同源配体细胞间粘附分子-1(LFA-1/cam-1)与肿瘤细胞上的抗原结合的机制。这促进了MHC-I或MHC-II分子的表达，导致增强的呈递、激活、识别和直接杀死肿瘤细胞。 活化的CIK细胞分泌各种细胞因子，包括IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和其他细胞因子，不仅直接增强细胞毒性效应和抑制肿瘤细胞，而且还通过调节免疫系统间接杀死肿瘤细胞。IFN-γ主要由CIK细胞产生，增强NK细胞、巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性。它还可以促进肿瘤细胞上MHC-I分子的表达，导致CTL杀伤增加。最近的研究表明，CIK细胞分泌的IFN-γ可以促进慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞上ICAM-1的表达，对细胞毒性效应细胞的凋亡诱导产生积极影响。肿瘤细胞的凋亡基因也可以被CIK细胞激活，因为这些细胞表达FasL，一种属于TNF超家族的Fas配体，它诱导肿瘤细胞凋亡。Verneris提出，某些肿瘤细胞(如黑色素瘤和卵巢癌)通过FasL诱导淋巴细胞凋亡来逃避免疫清除，但它们对CIK细胞敏感。这是因为，在CIK细胞的诱导过程中，Fas敏感或活化的T细胞通过IFN-γ等细胞因子的作用或激活诱导的细胞死亡机制被选择性地消除。结合CIK细胞中抗凋亡基因的高水平表达，这些因素使CIK细胞能够耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡。 尽管存在复发和无反应的担忧，CIK细胞的异质性使它们能够靶向并杀死各种肿瘤细胞。自1991年引入CIK细胞疗法以来，已有5000多名患有不同肿瘤类型的患者，包括肺癌、乳腺癌、脑癌和结直肠癌，参与了CIK细胞疗法。CIK细胞(或CIK细胞与DCs结合)的临床试验已超过80项，全球范围内。CIK细胞的治疗潜力超出了它们与NKG2D的相互作用，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)轴。与其他免疫疗法、常规化疗或放疗一起，CIK疗法表明了协同的抗肿瘤效应，不断发展并是治疗癌症的有希望的途径。虽然临床前景是有希望的，但一些公开讨论是必要的。比较CIK细胞与其他免疫细胞输注后的毒性效应，最小化额外的支持性护理，确定与其他免疫疗法相比的优势，了解与CIK细胞在癌症微环境中的串扰的关键决定因素，并在多个中心推广这种方法需要探索。 2.3.DC疫苗 操纵患者的自体DCs对肿瘤组织进行"疫苗接种"是一种有前景的方法。DC疫苗涉及用TAAs处理体外培养的DCs，如肽、蛋白质、DNA/RNA或病毒。DCs将吸收抗原，然后在仔细控制的培养过程中激活。DCs作为强大的抗原呈递细胞，在影响免疫系统方面发挥着至关重要的作用。虽然未成熟的DCs处理外来抗原，触发成熟和迁移到淋巴结，成熟的DCs可以在TME内促进肿瘤耐受，可能导致T辅助型2反应。 通常使用体外成熟并用抗原脉冲的自体单核细胞的DC疫苗，在不同的肿瘤患者中显示出良好的耐受性和最小的毒性。然而，抗原特异性免疫反应的幅度和持续时间通常较弱，限制了客观的临床反应。尽管在儿童肿瘤中的反应有限，正在进行的研究集中在增强疫苗生产的每个步骤。策略包括扩大DC来源，提高免疫原性，优化抗原选择，开发新的免疫佐剂，并探索同时进行的免疫调节或化疗。 Sipuleucel-T是唯一获得FDA批准的自体DC疫苗，为有效治疗成人恶性肿瘤，特别是去势抵抗性前列腺腺癌带来了希望。通过培养患者的PBMCs与一种重组蛋白(PAP-GM-CSF)，该蛋白由TAA[前列腺酸性磷酸酶(PAP)]和GM-CSF组成。这种开创性的疫苗代表了DC疫苗领域的重大进步，展示了在成人和儿童恶性肿瘤中改善结果的潜在途径。在临床试验中，DCs主要用于与CIK细胞、免疫检查点抑制剂(ICI)以及化疗和放疗的组合免疫疗法中，以改善结果。研究表明DCs能够激活自然杀伤T(NKT)细胞，或同时激活CD4+和CD8+ T细胞。 2.4.DC/CIK细胞疗法 当多种低风险免疫细胞疗法一起使用时，可以实现积极的协同效应，特别是在DC和CIK的共同应用中，这种协同作用尤为明显，旨在增强身体对疾病的免疫反应。CIK细胞以其广谱的肿瘤杀伤效应而闻名，但由于缺乏特异性识别能力而受到限制。DC目前被认为是最有效的抗原呈递细胞，最新研究表明，CIK和DC之间的相互作用会在两个群体中引起免疫刺激性表面分子表达的变化。实际上，将DC与CIK细胞共培养发挥了互补作用，相互促进成熟，共同增加抗肿瘤活性，并展示了有希望的协同效应，甚至在以前对CIK有抵抗力且之前没有与DC共培养的肿瘤细胞系上也是如此。DC分泌的细胞因子，如IL-2、IL-12和IFN-γ，增强了CIK细胞的成熟，导致CIK细胞中CD3+、CD8+和CD56+亚群的水平增加。值得注意的是，DC分泌的IL-12显著增加，显著增强了CIKs的细胞溶解功能。此外，这种协作环境还减少了IL-10的分泌和调节性T细胞（CD4+CD25+ Treg细胞）的数量，减弱了它们对肿瘤免疫的抑制作用，增强了CIK细胞的肿瘤杀伤效应。同时，CIK细胞增强了DC的抗原呈递特异性和共刺激分子的表达，有助于整体增加抗肿瘤活性。此外，DC和CIK细胞的共培养抑制了人类端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的表达，抑制了端粒酶活性，阻碍了肿瘤细胞的增殖。基于上述机制，以相互适应和协同作用为特征的DC-CIK疗法，已成为近年来肿瘤治疗领域的研究焦点。基础和临床研究迅速发展，并证明了在显著增强抗肿瘤免疫方面的有效性。尽管存在轻度移植物抗宿主病(GvHD)的担忧，试验经验表明结果是可控的。案例研究已经证明了安全性和提高的疗效。DC/CIK细胞疗法针对免疫系统的各个方面，实现了更全面的抗病方法。这在复杂情况或难治性恶性肿瘤中尤其有益，其中多种免疫功能障碍起作用。总的来说，低风险免疫细胞疗法可以帮助增强免疫系统识别和消除有害实体的能力，从而改善健康结果。这些疗法的协同效应有潜力显著提高基于免疫的治疗的有效性，并为患者提供更好的结果。然而，评估和定制这些疗法的精确组合和剂量以确保其对个体患者的安全性和有效性至关重要。 3.高风险免疫细胞疗法的技术进展 高风险免疫细胞疗法使用自体干细胞、同种异体或异种细胞，或基因修饰细胞，所有这些都需要进一步的操纵和评估。这些疗法的设计非常适合其预期目的。这些治疗刺激针对肿瘤的新免疫反应，通常有潜力重振现有的反应。在这里，我们描述了CAR-T、T细胞受体-T(TCR-T)、CAR-NK和CAR-巨噬细胞(CAR-M)等高风险免疫细胞疗法的特征设计、转染方法、细胞来源和克服抑制性TME的方法。此外，我们还提供了对即将到来的趋势的见解。 3.1.CAR的设计 CAR是工程化的受体蛋白，为免疫细胞提供了一种新的能力，可以识别癌细胞表面的特定抗原，从而可能触发免疫细胞消除癌细胞的专长。当前研究表明，即使是对CAR结构的微小修改也会显著影响治疗结果。它通常由三个模块化域组成：细胞外域、跨膜域和细胞内域。细胞外域：靶向的艺术。细胞外域包括用于目标结合的ScFv和铰链区域，通常是CAR工程细胞中的免疫球蛋白(Ig)样域铰链，并通过跨膜域锚定到细胞膜上。通过CAR的细胞外域引入了驱动免疫细胞激活的新功能，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。CAR工程免疫细胞可以识别癌症特异性目标表位，而不受MHC和共受体的限制，使它们在寻找和杀死癌细胞方面更有效。CAR工程免疫细胞已经从针对单一抗原发展到针对两种不同的抗原，以优化治疗阴性抗原癌细胞逃逸或失去抗原的复发，并且与任一抗原的结合都会触发CAR工程免疫细胞的激活。这可以通过几种方式实现（图1A-C），例如将一个双顺反子载体转导到一个细胞中，编码两个独立的CAR分子，或将一个编码双价CAR分子的载体转导到细胞中，或两种不同的CAR工程免疫细胞产品的共同给药，或将两个编码不同CAR的载体共转导到一个免疫细胞中。这些方法对于B细胞淋巴性白血病尤其有前景，特别是对于复发或难治性B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)，因为临床研究表明CD19/CD22共转导CAR-T细胞和CD19/CD22双特异性CAR-T细胞具有显著的疗效。同样，I期临床试验表明，双特异性CD20/CD19 CAR-T也可用于治疗复发和难治性B细胞恶性肿瘤患者，在治疗28天后的总有效率为82%，显示出治疗的安全性和有效性。此外，Wang等人证明CD19/CD22双顺反子CAR-T与单特异性CD19或CD20 CAR-T细胞相比，在体外和体内具有等效或更好的功能。除了ScFv的优化外，细胞外区域也得到了改进。与直接作用于目标细胞的传统CAR不同，研究人员提出了一个新概念：模块化CAR(modCAR)。这种CAR-T（图1D, E）通常与其适配器一起工作，适配器的一端结合到细胞上，另一端用于识别和结合肿瘤表面抗原。适配器分子可以是单克隆抗体、抗体片段（图1D）、小分子或任何结构（图1E），可以针对至少一个所需的抗原，并介导目标细胞和效应细胞之间的交联。它提供了一种高度灵活、可定制和通用的方法，以快速优化效应细胞活性，潜在地实现智能抗原靶向。 图 1. CARs的设计策略。展示针对肿瘤的CARs设计示意图。(A) 通过将编码两个独立CAR分子的双顺反子载体转导到单个细胞中，可以产生双顺反子CAR工程化细胞。(B) 通过将编码串联CAR分子的载体转导到细胞中，产生双价CAR。(C) 通过两种不同的CAR工程免疫细胞产品的联合给药（上图）或将编码不同CAR的两个载体共转导到免疫细胞中（下图），实现双特异性，但产品将复杂且昂贵。可以使用抗体（D）或其他适配器（E）生成modCAR。(F) 设计“装甲”CAR共表达分子，包括细胞因子和/或趋化因子，以提高效果和持久性。(G) 通过添加分泌蛋白和结合剂，并利用特殊设计的配对机制执行AND、NOT和OR布尔逻辑门，实现SynNotch CARs。这也可以通过使用特殊设计的转录因子和转录机制（H）来实现。CAR：嵌合抗原受体；modCAR：模块化CAR。 装甲CAR（图1F）被设计为分泌细胞因子或其他分子，帮助抵消肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性，可能提高CAR工程细胞的持久性和有效性。有时被称为第四代CAR或TRUCKs（T细胞重定向以启动抗原非限制性细胞因子引发的杀伤），它们为CAR靶向组织提供了一种多功能治疗，超越了传统CAR-T细胞的能力。TRUCK概念目前正在通过共表达分子如趋化因子配体或基于第二代或第三代CAR的细胞因子组合来探索。其中，IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-23以及这些分子的各种组合正在进行早期阶段的试验。值得注意的是，IL-7和IL-15被发现可以促进CAR-T细胞的增殖，而IL-12和IL-18增强了T细胞的效应能力。此外，表达特定分子的工程CAR-T细胞，如CCL-19（C-C基序趋化因子配体19）或CCL-217，化学吸引其他免疫细胞或CAR-T细胞向附近的癌细胞移动。这增强了免疫细胞的渗透和CAR-T细胞的存活，导致CAR-T细胞的有效性增加。 CAR设计的更近期发展是合成Notch（SynNotch）受体（图1G, H），它提供了一种精确的靶向策略，允许精确控制CAR工程细胞的激活，同时通过整合可诱导的开关来最小化非靶向效应。一个典型案例使用布尔逻辑和逻辑门的原则，共定位依赖的蛋白开关（Co-LOCKR）可以通过满足所有条件时的构象变化来激活AND、NOT和OR布尔逻辑门。体外已证明针对癌细胞的特异性，但在临床应用中仍面临各种挑战。 细胞内域：信号传导和细胞功能。细胞内域由一系列共刺激域组成，CAR的分类基于共刺激域的数量。第一代CAR仅由CD3ζ组成，而第二代CAR除了CD3ζ外还包含一个共刺激域，第三代CAR则涉及一个以上的共刺激域以及CD3ζ。在T细胞中，已构建了第一代CAR，包含编码抗2,4,6-三硝基苯酚（TNP）抗体可变区域的重排基因片段，与α或β T细胞受体（α或β TCR）链的C区之一相连。转导T细胞后，这种结构可以稳定地表达在T细胞表面，并且可以MHC非限制性地识别肿瘤细胞，但在临床试验中显示出较弱的抗肿瘤效果。第二代CAR-T借鉴了T细胞激活的经典信号，并增加了一个共刺激分子，如4-1BB（也称为CD137）或CD28，这显著提高了CAR-T细胞的激活水平和增殖能力。临床数据支持接受第二代CAR-T细胞治疗的患者对其肿瘤负担有延长和有效的控制。新发现的共刺激分子目前包括诱导性共刺激分子（ICOS）、OX40（也称为CD134）和CD40等。第二代CAR结构在临床实践中使用最广泛。第三代CAR-T细胞包含两个共刺激分子，导致增强的细胞毒性。在临床试验中，当共同给药淋巴瘤患者使用针对CD19的第二代CAR-T细胞（具有CD28共刺激域）和第三代CAR-T细胞（具有CD28和4-1BB）时，观察到更长的持久性和更好的扩张。然而，目前仍有有限的临床数据可用于单独评估第三代CAR-Ts。在一项研究者发起的试验中，HD-CAR-1，一种第三代CAR-T疗法，在复发/难治性ALL的成年患者中进行了评估。在90天的研究期结束时，80%的患者实现了完全缓解（CR）。此外，最近的研究表明，配备4-1BB和CD28共刺激域的CAR-T细胞增强了T细胞记忆表型，与只有一个共刺激分子的细胞相比，表现出更好的增殖和细胞因子释放水平。 迄今为止，大多数涉及CAR-NK细胞的研究都使用了最初用于T细胞的CAR构建体。已开发出包含CD28或4-1BB共刺激域的第二代CAR-NK。最近的研究报告了含有4-1BB和CD3ζ细胞内域的CAR-NK，克服了抑制性信号并诱导了NK细胞特异性，导致杀死CD19+ aALL细胞。然而，已经为NK细胞专门创建了新的CAR设计，这些不同的CAR构建体对NK细胞的细胞毒性和细胞因子产生有不同的影响。研究表明，包含NK特异性共刺激域2B4（也称为CD244）的CAR-NK细胞显著增强了对肿瘤细胞的细胞毒性活性，诱导快速增殖，增加细胞因子产生，并减少凋亡。这表明与NK细胞上的常规4-1BB CAR相比，NK细胞特异性激活信号在CAR性能中起着至关重要的作用。此外，利用不同信号域的CAR构建体，如CD3ζ、DAP10和DAP12，在原代NK细胞或NK92细胞系中表现出不同的抗肿瘤活性。具体来说，具有CD3ζ信号域的CAR与包含DAP10域的CAR相比表现出优越的性能，而使用DAP12域的CAR优于包含CD3ζ域的CAR。 CAR-M细胞与CAR-T细胞具有相同的结构和代级分类，但它们的细胞内信号域的功能不同，主要用于增强吞噬作用。CAR-M细胞能够直接利用CD3ζ细胞内域来传递吞噬信号。Fc受体（FcRγ）的γ亚基和具有多个表皮生长因子样域的蛋白10（Megf10）也可以作为细胞内信号域。最近的结果表明，添加串联的PI3K招募域增加了癌细胞的吞噬。CAR-M的首个临床试验是第一代产品，其细胞内域包含CD3ζ，并且I期临床试验结果显示了有希望的初步安全性和有效性结果，并获得FDA的快速通道指定。 4.提高基因转移方法的效率 在免疫疗法中引入核酸，包括基因表达和CRISPR基因编辑，是一个至关重要但具有挑战性的步骤。近年来，由于经济上的好处，非病毒转染技术越来越受欢迎，克服了与病毒载体制造相关的劳动密集和昂贵程序以及cGMP（现行良好生产规范）合规性的监管要求。例如，可以利用转座子或移动遗传元素实现高效且持久的转基因表达，在产生稳定的CAR-T细胞方面引起了极大的兴趣。此外，电穿孔或机械穿孔使免疫细胞（如用于CRISPR-Cas9表达）的基因组编辑核酸的短暂表达成为可能，并已在基于mRNA的人类T细胞修饰中进行了探索。这些非病毒转染技术在程序简便性、容量和吞吐量以及有利的安全性方面提供了优势。与非病毒转染相比，病毒转导方法在临床环境中是普遍的模式，并且被广泛认为是转染具有挑战性的细胞类型（如免疫细胞）的高效方法。常用的病毒载体，如腺相关病毒载体和腺病毒载体，不能整合到宿主基因组。然而，逆转录病毒载体和慢病毒载体可以整合，并且表现出高传递效率，使它们非常适合转导高度复制的细胞，如免疫细胞。Tecartus104和Yescarta3，均由Kite Pharma生产，依赖于γ逆转录病毒（GRV）载体将CAR构建体转导到T细胞中，而Kymriah则使用慢病毒（LV）载体进行转导。通常，γ-逆转录病毒和LV系统经常用于将基因转移到T细胞中，研究表明它们通常产生30%-80%的转导效率。然而，安全性、效率和便利性问题是必须考虑的问题。与T细胞相比，病毒基因传递到原代NK细胞已被证明既具有挑战性又效率较低，可能由于NK细胞的固有特性。研究表明，使用逆转录病毒载体成功转染原代扩增的NK细胞，实现了27%-52%的单轮转染效率，并且在两轮转染后达到47%-75.4%。虽然逆转病毒已广泛用于最近的临床前和临床研究中生产CAR-NK细胞，但缺乏针对原代NK细胞的高效基因转移方法仍然是使用NK细胞进行免疫疗法的主要障碍。此外，与逆转录病毒转染相关的插入突变和对原代NK细胞活性的有害影响是临床应用中的主要限制。与逆转录病毒载体相比，基于慢病毒的转染对基因毒性和插入突变的风险较低。然而，原代NK细胞在LV转导中表现出低效率，需要多轮转染。最近，Bari等人证明，使用狒狒包膜糖蛋白变体（BaEV-LV）伪型的LV载体显示出比使用泡状口炎病毒糖蛋白（VSV-G-LV）伪型的转导效率高出20倍以上，这是用于伪型LV载体的第一种且仍然最广泛使用的糖蛋白。他们通过这种转染方法成功地在来自不同供体的约70%的原代人类NK细胞中表达了CD19-CAR，这些CD19-CAR NK细胞有效地且特异性地根除了CD19阳性肿瘤细胞。BaEV-gp伪型慢病毒带有肿瘤特异性CAR，在NK92细胞中显示出近100%的转导率，在iPSC衍生的NK细胞或激活的原代NK细胞中为50%-80%。因此，它可能是NK细胞CAR基因转移的有希望的载体。此外，使用长臂猿白血病病毒（GaLV）包膜蛋白伪型的慢病毒可以有效转导原代NK细胞。电穿孔和脂质体介导的方法也用于在NK细胞中传递外源基因。与上述病毒转染相比，这些方法提供了更快的转基因表达、降低的凋亡水平、更小的个体间差异和更高的基因转移效率。然而，外源DNA通常不会整合到目标细胞的基因组中，导致转基因的短暂表达在转染后约3-5天内下降。但是，当与DNA整合技术结合时，这些方法可以产生稳定转染并表达转基因的细胞。DNA转座子是可以通过切割和粘贴机制在载体和染色体之间有效转座的移动DNA元素。PiggyBac（PB）和Sleeping Beauty（SB）是迄今为止最常用的两种转座子系统，并且在与其他系统相比时，在哺乳动物细胞中显示出最高的转座活性。通过将含有CAR的质粒转染到iPSC中，以及转座酶DNA，成功稳定地创建了CAR-iPSC-NK细胞，表达CAR分子。与病毒载体相比，转座子系统提供了许多好处，如更低的免疫原性、增加的生物安全性、降低的生产成本以及能够转移具有接近9-10 kb货物容量的基因片段的能力。这些优势使其成为将CAR整合到NK细胞基因组中以实现持久表达的有力选择。然而，完全利用转座子系统对原代NK细胞进行转染需要优化，例如通过电转染提高转导效率和细胞活性。 巨噬细胞由于其识别和响应外来核酸的能力，比造血系统中的其他细胞更难转染和对遗传操作具有抵抗力。Bobadilla及其同事创建了一种基于HIV-1的慢病毒（LV）系统，该系统已被证明在通过Vpx诱导的SAMHD1降解后，能够有效地将转基因传递给骨髓细胞。Klichinsky的团队利用了一种复制缺陷的嵌合腺病毒载体Ad5F35，有效地将CAR传递给巨噬细胞，并同时促进M1表型的表达，最终增强了其抗肿瘤活性。这些结果强调了基因工程巨噬细胞在癌症免疫疗法中的潜力。与生成CAR-NK细胞的方法类似，转座系统也被用来将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。 4.1.新型细胞来源方法推动现成的免疫细胞治疗产品 迄今为止，所有商业批准的癌症免疫细胞疗法都依赖于自体使用，即所使用的源材料是患者的自己的细胞。尽管这种方法已被证明有效，但仍存在重要的限制，例如在处理快速癌症进展的患者时，制造所需的等待时间不受欢迎，患者T细胞功能障碍可能导致制造失败，提取健康淋巴细胞时同时提取的恶性白血病细胞可能导致产品污染，高生产成本，标准化的复杂性，以及重新给药的机会受限。因此，当前的研究工作集中在开发同种异体疗法上，以克服自体疗法的限制。值得注意的是，CAR-NK是一种有前途的同种异体细胞疗法，对实体瘤和血液肿瘤都没有主要的毒性副作用。它是一种更简单、可重新注射且更经济的通用治疗。然而，目前的治疗还没有显示出强大的疗效和/或长期持久性，NK细胞更难进行工程改造。CAR-NK细胞的研究主要处于临床前和早期临床试验阶段，很少有临床试验报告。尽管如此，通用的同种异体CAR-NK细胞在癌症治疗中仍然显示出巨大的潜力。目前，CAR-M主要是一种自体疗法，但“现成的”同种异体CAR-M已经出现，并正在进行进一步研究。 为了开发同种异体方法，必须系统地解决最重大的风险：免疫排斥和移植物抗宿主病（GvHD）的发展。免疫排斥可以限制治疗的效力，因为接受者的免疫系统可能会排斥移植物。GvHD可能是致命的，由供体T细胞内源性αβ TCR复合体识别宿主肽-人类白细胞抗原（HLA）复合体，导致组织损伤。为了解决同种异体风险，可以采用两种主要策略。第一种是在供体αβ T细胞上除了引入CAR转基因外，进行额外的遗传改造。另一种是选择替代的细胞来源或亚群，如诱导多能干细胞（iPSCs）、脐带血（UCB）细胞、γδ T细胞、记忆T细胞亚群、病毒特异性T细胞（VST）等（VST）等。 为了消除内源性αβ TCR介导的GvHD，最直接的方法是破坏编码T细胞受体恒定（TRAC）α链的基因。Eyquem等人开发了一个案例，通过腺病毒转染和CRISPR-Cas9敲入技术将CAR构建体整合到TRAC位点，同时诱导CAR表达和TCR失活。与随机整合相比，CAR表达可以由内源性TCR启动子调节，并在暴露于抗原时模仿TCR转录，防止恒定和过度的T细胞激活，这可能导致T细胞分化和耗竭。此外，研究结果表明，这些TRAC-CD19 CAR-T细胞在小鼠ALL模型中显示出比用逆转录病毒编码的CAR的T细胞更大的抗肿瘤效力。此外，除了CRISPR-Cas9，基因编辑技术，如TALENs和锌指核酸酶（ZFNs），也被发现在消除TCR表达以创建“通用”供体T细胞方面有效。然而，尽管TCR缺失的CAR-T细胞降低了GvHD的风险，它们的长期持久性更短，可能是由于免疫排斥。因此，科学家们敲除了β2-微球蛋白（B2M）基因以限制HLA I分子的表达。这种方法防止了同种异体CAR-T细胞通过它们的TCR被识别为外来的，但仍然容易受到宿主NK细胞的裂解。因此，一项研究利用突变B2M融合蛋白来解决这个问题。为了提高在激活的同种异体CAR-T细胞生产过程中HLA-II消除的效率，一些学者提出抑制CIITA或HLA-DRA、HLA-DQA和HLA-DPA基因。 iPSCs具有无限的增殖和分化潜力，使它们成为创建大量同种异体HLA组合库的理想资源。通过从库中选择与HLA匹配的iPSC来源，可以最小化宿主和移植物之间的免疫排斥风险，但必须进行严格的质量控制以确保安全，因为未分化的、增殖的iPSCs可能引发不良结果。Wang等人产生了缺乏HLA-I/II、B2M和CD155的低免疫原性iPSC衍生的CAR-T细胞。研究表明它们通过在体内发挥效应功能来抑制肿瘤进展的有效性。此外，iPSCs也为生产符合临床需求的CAR-NK和CAR-M细胞铺平了道路。与分化的NK细胞或巨噬细胞相比，iPSCs可以更有效地被工程化以稳定表达CARs。Li等人通过向培养基中添加各种细胞因子和促分化蛋白来修改培养基，以将CAR转染的iPSCs分化为CAR-NK细胞。这些iPSC衍生的CAR-NK细胞在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤活性。Zhang等人建立了骨髓/巨噬细胞分化方案，诱导CAR-iPSCs分化为骨髓细胞系，成功生成了足够的CAR-iMac细胞（iPSC衍生的CAR-M细胞）。然而，当在小鼠模型中进行测试时，CAR-iMacs的效力受到限制。总体而言，iPSC衍生的工程免疫细胞的发展涉及复杂的生产程序，需要精确的细胞产品制造和质量保证，以支持更广泛的临床应用。 γδ T细胞表达TCRγδ，以HLA非依赖的方式识别恶性细胞。它不需要消除TCR表达或信号，并且GvHD的风险很低或不存在。研究表明，γδ CAR-T细胞表现出与传统的αβ CAR-T细胞相似或更大的细胞毒性效果，在体内没有观察到GvHD。然而，它们在体外的细胞毒性能力持续时间较短。此外，抗CD20的γδ CAR-T细胞在B细胞淋巴瘤的动物模型中取得了有希望的结果，目前正在进行I期临床试验。值得注意的是，已经鉴定出以HLA非依赖方式针对多种肿瘤的TCR，这些TCR来自αβ和γδ TCR库，允许工程化免疫细胞攻击患者之间常见的肿瘤特异性抗原。 脐带血（UCB）提供了一个容易获得的NK细胞和同种异体T细胞的来源。它们富含γδ T细胞和造血干细胞（HSCs），尽管总细胞数量有限。来自脐带血的CAR-T细胞在体内表现出增强的肿瘤抑制作用，减少了IL-10的分泌，并降低了调节性T细胞（Tregs）的比例，表明其治疗潜力有所提高。Van Caeneghem等人从脐带血中分离出CD34+ HSCs，然后生成CAR-T细胞。这些CAR-T细胞具有原始表型（CD45RA+ CD62L+），不表达TCRαβ复合体，显著降低了GvHD的风险，并有效地消除肿瘤细胞。 记忆T细胞的特征是CD45RA−CD45RO+表型，它们不太可能发展成GvHD，也不太可能迁移到表现出GvHD的器官。研究表明，与分化的对应物相比，T记忆干细胞（TSCM）和中央记忆T细胞（Tcm）具有优越的增殖和干性潜力，在T细胞转移后的临床研究中表现出高扩增和持久性。 VSTs具有能够识别病毒抗原的TCR，如巨细胞病毒（CMV）、Epstein-Barr病毒（EBV）等。经过CAR改造的VSTs在实体瘤中表现出有希望的结果，但与CARs相比，工程化针对肿瘤的转基因TCR VSTs更具挑战性。在肿瘤细胞中表达EBV相关抗原的霍奇金淋巴瘤患者中，CAR-VST细胞的输注显示出良好的耐受性和缓解率。针对HER2的CAR-VST细胞产品在CMV血清阳性和进行性胶质母细胞瘤患者的I期临床试验中显示出安全性和临床效果。值得注意的是，可以建立VST库，以覆盖大多数患者，并适当匹配的线，促进CAR-T或TCR-T向肿瘤的重定向用于临床。 PBMCs通常来自外周循环或脐带血等。它是临床目的的主要NK细胞来源。来自PBMC的NK（PB-NK）细胞可以从HLA匹配和不匹配的供体中分离出来，扩大了潜在供体池。通常，它们表现出成熟的表型，增殖能力降低，细胞毒性增加，没有GvHD的风险。Töpfer等人已经证明，表达CAR的NK细胞系YTS以及PB-NK细胞可以成功地重定向对抗前列腺干细胞抗原（PSCA）阳性肿瘤，导致治疗的小鼠中有相当一部分完全消除肿瘤。一种短暂表达间皮素靶向mRNA CAR的CAR-PBMC细胞产品，MCY-M11，已进入临床试验（NCT03608618），它是一种混合产品，包含多样化的CAR工程化T细胞亚群、单核细胞和B细胞群体，展现出理想的功能和免疫表型特征。 NKT细胞，也称为CD1d限制性T细胞，是一群具有T细胞和NK细胞特性的异质性T细胞。这些细胞主要识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。I型NKT或iNKT细胞缺乏HLA限制，可能作为通用供体细胞发挥作用，但其在体内的持久性尚不清楚。研究表明，CAR19-iNKT细胞表现出抗淋巴瘤活性，并增强了消除脑淋巴瘤的能力。另一种同种异体NKT，表达带有CD28和IL-15的抗CD19嵌合受体，目前正在进行针对复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者的临床试验（NCT03774654）。 4.2.修改肿瘤环境以治疗免疫细胞 低持续性和输注后不充分的增殖是实体瘤免疫细胞治疗有效性的重大挑战，这在很大程度上归因于免疫抑制性微环境，它作为癌症进展的积极推动者，而不是被动的旁观者。肿瘤细胞居住在这个由浸润和宿主细胞（如T细胞和巨噬细胞）、分泌因子（如IL-10和转化生长因子β（TGFβ））以及细胞外基质（ECM）组成的异质微环境中。这些组分可以相互作用，为恶性细胞的生长、迁移和转移创造一个支持性的环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性T细胞。 为了根除肿瘤，科学家们已经开发了几种策略，以促进CAR工程化或TCR工程化的治疗免疫细胞迁移和渗透到癌症焦点，包括使用趋化因子受体如CCR2、CXCR2、CCR4、CXCR4等。这些研究表明，CAR-T、TCR-T和NK细胞显示出增加的肿瘤渗透率，导致肿瘤缩小和增强的抗肿瘤效果。 然而，将基因工程免疫细胞渗透到肿瘤中只是抗击癌症的第一步。有时，可能需要直接转化方法来修改免疫抑制性微环境。使用免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1抗体和抗CTLA4抗体，可以改善免疫抑制性TME。然而，它可能导致药物抗性的出现、T细胞耗竭和复发，有时甚至可能导致危及生命的毒性。阻断TME中的TGF-β信号是提高检查点抑制剂效果和增强抗肿瘤反应的替代方法，由于其在肿瘤信号、重塑和代谢中的关键作用。临床证据也表明TGF-β信号与对检查点阻断剂无反应的患者之间存在相关性。为了解决这个问题，已经开发了双功能抗体-配体陷阱，使用针对CTLA-4或PD-L1的抗体与TGFβ受体II外域（TGFβRIIecd）融合。它可以在TME中隔离TGF-β，耗尽Tregs，并促进CTL共刺激。此外，通过转导显性负TGFβ受体-II（dnTGFβRII），开发了TGFβ抗性肿瘤特异性T细胞，并在动物模型和临床研究中显示出治疗益处。 另一种新策略是利用TME中高浓度的免疫抑制信号分子，通过引入一个嵌合开关受体（CSR），如PD-1:CD28、TIGIT:CD28、CTLA-4:CD28、TGF-βRII:4-1BB、Fas:4-1BB。CSR由PD-1、CTLA-4或TGF-βRII的细胞外域和CD28或4-1BB的细胞内域组成。T细胞与CSR一起转导CAR或TCR，以产生工程化的CTL。这些工程化的CTL仍然与肿瘤细胞上的免疫抑制分子相互作用，但通过细胞内域传递共刺激信号而不是抑制信号。 最近，这种策略已经进行了临床测试。发现这些工程化的细胞有效地克服了免疫抑制性TME，例如分泌更多的IFN-γ，积累在肿瘤中，并展现出优越的抗肿瘤功能。 ECM为各种抗癌治疗创造了物理屏障。然而，巨噬细胞在调节ECM和表现出肿瘤归巢行为方面发挥着关键作用。CAR工程化的巨噬细胞被证明能够主动迁移到肿瘤部位，作为药物输送系统时，能够在抗原特异性环境中局部输送细胞因子和/或细胞毒素，显著改变免疫抑制性TME，并通过吞噬作用消除肿瘤细胞。Zhang等人使用CAR修饰的巨噬细胞解决了ECM引起的免疫细胞渗透不足的问题。体外研究表明，CAR-147巨噬细胞能够重塑肿瘤的ECM，诱导CD3+ T细胞渗透，并提高肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ的水平，最终展现抗肿瘤效果。 4.3.临床研究进展 从临床进展的角度来看，自2017年FDA批准第一种CAR-T细胞治疗产品以来，全球已有10种CAR-T产品获得批准（补充表1）。自2013年以来，CAR-T、CAR-NK和TCR-T疗法的临床研究迅速增加，到2022年CAR-T细胞治疗的数量达到258例，值得注意的是，2023年的数据来自1月至10月（图2A）。从国家的角度来看，高风险细胞治疗的临床研究主要分布在美国和中国，占全球研究的80%以上（图2B）。CAR-T治疗的主要临床治疗目标是CD19、CD22、CD20和B细胞成熟抗原（BCMA）。在血液肿瘤中，增长最快的适应症是淋巴瘤和骨髓瘤。 图 2. 临床试验中的CAR-T、TCR-T和CAR-NK疗法。临床试验数据统计。(A) 2018年至2023年细胞治疗临床研究的数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK三个组。(B) 按国家分组的细胞治疗临床研究数量，分为CAR-T、TCR-T和CAR-NK三个组，Y轴在50到450之间中断。(C) 关于适应症的细胞治疗药物的临床进展，细胞治疗药物的分组与(A)相同，适应症分为液体和实体肿瘤。原始数据下载自 https://classic.clinicaltrials.gov/，更新至2023年10月30日。CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；CAR-NK：嵌合抗原受体自然杀伤细胞；CNS：中枢神经系统；HPV：人乳头瘤病毒；TCR-T：T细胞受体T细胞。 目前，TCR-T有一种治疗产品在市场上，用于转移性葡萄膜黑色素瘤。总的来说，TCR-T在实体瘤中的进展速度通常比血液肿瘤快（图2C）。TCR-T的目标抗原主要集中在MART-1、HPV16-E6、NYESO、HPV16-E7等。在条件方面，TCR-T的临床研究主要用于实体瘤的治疗。这些实体瘤大多与病毒感染有关，例如与人类乳头瘤病毒（HPV）感染相关的宫颈癌。此外，TCR-T对头颈、肝脏和结肠的癌症的临床研究进展迅速（图2C）。在CAR-NK条件方面，血液肿瘤仍然是进展最快的，其中淋巴瘤条件进展更快（图2C）。CAR-NK的临床治疗目标主要是血液肿瘤的CD19、CD22和BCMA，以及实体瘤的PSMA、HER2、ROBO1和MUC1。总的来说，TCR-T和CAR-NK仍然处于早期临床开发阶段。到目前为止，CAR-M的临床研究仍然处于起步阶段，只有一个I期临床试验（NCT04660929）。 5.结论与展望 免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的重要性日益增加。与传统的免疫治疗方式，如免疫检查点抑制剂和细胞因子相比，免疫细胞治疗表现出了更高的疗效、特异性，并倾向于引起可接受的副作用。当作为某些癌症的独立治疗手段时，特别是采用性T细胞转移疗法，在血液恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤中显示出了显著的成功。然而，由于免疫抑制性TME、肿瘤异质性、目标抗原表达低等因素，一些实体瘤对单独的免疫细胞治疗更具挑战性。在许多情况下，转向另一种免疫细胞治疗或将免疫细胞治疗与其他治疗策略结合使用，如化疗、放疗、其他免疫治疗或靶向治疗，通过不同的机制可能增强整体治疗效果。 目前，全球已有10种CAR-T产品获批，而DC疫苗和TCR-T各有一种获批产品。在低风险免疫细胞治疗方面，TILs和DC疫苗在治疗实体瘤方面显示出前景。此外，CIK治疗与其他免疫策略结合使用时显示出协同抗肿瘤效果。这些方法通常由具有不同功能特性的异质细胞组成，为治疗相对高异质性的恶性肿瘤提供了优势。另一方面，高风险免疫细胞治疗，如CAR-T和TCR-T，通常以目标为导向且高度特异性，使它们特别适合相对快速增殖的恶性肿瘤。在血液肿瘤中，CAR-T和TCR-T已经得到临床验证，它们在治疗实体瘤方面的应用正在稳步进展。而基于其生物学特性，CAR-NK和CAR-M在治疗实体瘤方面具有固有优势。TCR-T专注于特定的肿瘤相关抗原(TAA)和新抗原，使它们在外来抗原，如与病毒相关的恶性肿瘤中受益。研究人员目前正在努力突破包括CAR-T在内的细胞治疗技术的瓶颈。新的细胞来源和方法降低了GvHD和其他风险，为“现成的”或同种异体细胞治疗创造了机会，这些治疗可以事先准备好，并在需要时轻松地给多个患者使用，实现更快的诊断和癌症治疗。此外，针对CAR的新颖设计最小化了对健康组织的损害，并与传统治疗相比减少了副作用。某些设计甚至为治疗实体瘤提供了可能性。此外，修改肿瘤环境和诱导记忆T细胞的策略已使实现长期效果成为可能。 同时，由于这些疗法新颖、复杂和技术性，它们可能对公共卫生和个体患者构成以前未探索的风险。TIL细胞治疗、DC/CIK细胞治疗和DC疫苗被认为是低至中等风险。风险因素包括生产中使用的生物活性物质，如抗体、细胞因子、血清、生长因子和抗生素，以及在保存、冷冻、解冻和冷链运输过程中的产品稳定性和活性风险。此外，产品本身可能存在固有风险，如不完全去除肿瘤细胞或其他不需要的细胞，以及与归巢、植入、迁移和增殖相关的潜在并发症或产品活性降低。然而，高风险免疫疗法需要更多的操作，无论是使用基因修饰细胞、自体干细胞，还是同种异体或异种细胞，都需要额外评估。在临床上，这些疗法有时可能触发细胞因子风暴和细胞因子释放综合征(CRS)，这两种都是危及生命的全身性炎症综合征。因此，这些产品的风控管理考虑相应更具挑战性。必须仔细评估产品与患者之间相互作用产生的即时和延迟影响的潜在风险。这些风险包括不希望的免疫原性及其相关效应，包括CRS、GvHD、移植物排斥、过敏反应、超敏反应和免疫缺陷。此外，评估与患者细胞的预期和非预期基因修饰相关的潜在风险也很重要，包括细胞功能的改变、细胞凋亡、生长或分化的变化、插入突变或基因毒性，以及恶性转化的可能性。 然而，准确评估免疫细胞治疗的风险仍然具有挑战性。一些真正的风险超出了预期或在临床前研究中没有被揭示。了解风险在临床研究中无处不在，并且被定义为在特定时间内发生不良结果的可能性。评估免疫细胞治疗风险的可接受水平涉及权衡各种因素，而不仅仅是绝对风险，还要考虑可能随之而来的潜在治疗益处。与患有较轻肿瘤或癌症的患者相比，存在适当治疗方法的癌症指征，患有危及生命的晚期或严重恶性肿瘤的患者可接受的风险水平要高得多。 总体而言，免疫细胞治疗的技术壁垒相对较高，创新驱动力强，技术发展多样。近年来的进展显示了爆炸性增长。尽管CAR-T、TCR-T和DC疫苗已获批准，但其他免疫细胞治疗仍处于早期临床和临床前研究阶段。低风险疗法，如TIL，由于无法完全消除Tregs，面临有限的效果。CIK细胞治疗在获取和扩增方面遇到困难。DC肿瘤疫苗受到缺乏理想的肿瘤特异性抗原、TAA免疫原性弱、难以有效诱导免疫原性DC以及体外DC致敏方法的静脉再灌注无法有效激活DC分化和成熟的阻碍。高风险细胞治疗在克服肿瘤异质性的障碍方面仍有很长的路要走。CAR-T细胞仍面临效应T细胞耗竭、细胞因子风暴和免疫抑制微环境等挑战。TCR-T细胞治疗的挑战包括如何减少TCR不匹配和针对新抗原的最小选择。CAR-NK疗法正在经历遗传操作和细胞增殖困难。尽管CAR-M可能成为一种有前景的抗癌疗法，但它们尚未完全实现。临床研究需要确认肿瘤相关巨噬细胞在决定TME是否可以将针对肿瘤的CAR-M转化为支持肿瘤表型方面的高适应性。尽管如此，免疫细胞治疗在抗癌疗法的未来发展中仍具有至高无上的潜力。人们普遍认为，快速的技术革新将使这些疗法成为高效的癌症治疗手段，显著改善治疗效果，推进人类医疗保健。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言 细胞死亡在生物体的发育和稳态维持中起着关键作用。不同形式的细胞死亡，包括凋亡（Apoptosis）、坏死性凋亡（Necroptosis）、焦亡（Pyroptosis）和铁死亡（Ferroptosis），不仅在清除受损或过时的细胞中发挥作用，也在抑制病原体扩散中扮演重要角色。24年1月，Cell杂志刊文综述了各种细胞死亡路径的信号机制，探讨这些细胞死亡过程的异常激活或抑制如何导致疾病，并讨论了针对细胞死亡失衡状态的现有和潜在治疗方法。 细胞死亡可以是非溶解性的，且在免疫上相对沉默（凋亡），或者是溶解性的且促炎症的（坏死）。在多细胞生物中，基因程序化的细胞死亡被认为是维持稳态的重要支柱，但即使是单细胞生物也可以通过细胞死亡来抵御病原体或为适应营养匮乏而限制群落大小。非溶解性的细胞死亡程序最初是基于其形态学特征来定义的，这些特征包括细胞质空泡化、核浓缩和细胞膜起泡。其背后的分子机制在三个不同领域的多年研究之后才逐渐清晰。首先是认识到在遗传上易于操作的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中某些细胞可重复地经历凋亡。随后的遗传筛选识别出了细胞死亡的介导者（egl-1、ced-3和ced-4）和细胞死亡的抑制因子（ced-9），尽管当时它们还不能被赋予可识别的生化活性。关于ced-3功能的认识来自于对哺乳动物促炎症白细胞介素-1β（IL-1β）成熟的蛋白酶的鉴定。CED-3与这种现在被称为半胱天冬酶-1（caspase-1）的IL-1β转化酶之间的同源性促使人们认识到CED-3 是一种蛋白酶，并且秀丽隐杆线虫中的程序化细胞死亡是由蛋白水解驱动的。 ced-9基因在哺乳动物中有一个功能对应物，即B细胞淋巴瘤基因2（BCL-2），这是一种在人类滤泡性淋巴瘤中通过染色体易位激活的原癌基因。与许多其他原癌基因不同，BCL-2并不诱导增殖，而是抑制细胞死亡，并且能够在线虫中功能性地替代ced-9。在这些关键发现之后，进一步鉴定出了额外的哺乳动物半胱天冬酶(Caspase，半胱氨酸依赖的天冬氨酸定向蛋白酶）。此外，BCL-2被发现是控制Caspase激活的一个更大家族的成员，这个家族被称为内源性凋亡途径的裁决者。在外源性凋亡途径的形式中，出现了更多的复杂性，以及病原体对死亡途径成分的征用。对受感染细胞的研究显示，某些形式的坏死（即细胞破裂并释放促炎症内容物）也是基因程序化的。这些细胞死亡途径被称为焦亡（pyoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）。拥有多种死亡方式是对抗寻求保持其复制生态位的病原体的有效寄宿策略。 在成年人中估计每天有惊人的10^11个细胞经历程序化细胞死亡，这相当于我们一年内整个体重的细胞。通过细胞增殖，身体维持现状，同时排除老化、功能失调、受感染或突变的细胞。因此，扰乱细胞增殖与细胞死亡之间的稳态平衡将导致机体功能失调。过少的细胞死亡会导致过度增殖疾病，如癌症，而过多的细胞死亡则导致退行性疾病，如神经退行性疾病。在这里，本文主要基于当前对各种细胞死亡途径的主流观点，由于研究众多，有的令人困惑，甚至矛盾。为了避免遗漏某些进展，我们主要选择那些通过生物化学和遗传学相结合的方法经过考验的观点和证据，相对更能经受住时间的考验。内源性凋亡——从线虫到哺乳动物在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中，许多内源性凋亡信号传导在哺乳动物中也有保留，但哺乳动物的细胞死亡途径更为复杂（见图1）。相似之处包括使用支架蛋白来协调半胱天冬酶（caspase）的激活。在C. elegans中，CED-4担当此功能，用于激活半胱天冬酶CED-3，而在哺乳动物中，凋亡肽酶激活因子1（Apoptotic peptidase activating factor 1，APAF-1）介导caspase-9的聚合。这一过程在BCL-2同源区3（BH3）-仅蛋白（BH3-only proteins）（如C. elegans中的EGL-1；哺乳动物中的细胞凋亡相关BCL-2拮抗剂（BAD），BH3相互作用域死亡拮抗剂（BID），BCL-2相互作用杀手（BIK），BCL-2相互作用的细胞死亡介质（BIM），BCL-2修饰因子（BMF），harakiri（HRK），NOXA（也称为12-肉豆蔻酸-13-醋酸诱导蛋白1）、以及p53上调的凋亡调节剂（PUMA））与BCL-2蛋白家族的促存活成员（C. elegans中的CED-9；哺乳动物中的BCL-2、BCL-XL、髓细胞白血病基因1（MCL-1）、BCL-W以及胎儿肝中表达的BCL-2相关基因（BFL-1；在小鼠中称为A1））结合，从而抑制它们。这些BH3-仅蛋白（BH3-only proteins）的表达在发育信号或应激刺激（例如，营养剥夺、DNA损伤和内质网（ER）应激）的作用下增加，通过多种转录和翻译后机制实现。 图1 - 哺乳动物内源性凋亡信号传导途径与秀丽隐杆线虫和果蝇的凋亡信号传导对比（Credit: Cell） 在C. elegans中，CED-9通过阻止CED-4激活caspase CED-3来维持细胞存活。相比之下，哺乳动物中促存活的BCL-2家族蛋白通过限制它们的促凋亡成员，即BCL-2相关X蛋白（BAX）和BCL-2拮抗剂/杀手1（BAK），来防止caspase的激活。未受抑制的BAX和/或BAK聚合，并导致线粒体外膜渗透（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），从而释放促进凋亡的线粒体因子进入细胞质。线粒体释放的细胞色素c与adaptor APAF-1相互作用，促进凋亡体复合体的组装，有助于起始caspase，即caspase-9的二聚化和激活。线粒体释放的DIABLO（也称为线粒体衍生的第二凋亡激活因子[SMAC]）或HtrA丝氨酸蛋白酶2（HTRA2）阻止X连锁的凋亡蛋白抑制剂（XIAP）对caspase的抑制。虽然C. elegans没有类似BAK或BAX的蛋白，但其他线虫却有。因此，C. elegans可能是进化中的一个特例，因为它通过与CED-4的结合，以更直接的方式抑制caspase的激活，从而放弃了对凋亡的线粒体调控。或者，被BH3-only protein EGL-1结合的CED-9可能像BAX或BAK一样发挥功能。有证据表明CED-9与线粒体外膜相关，但EGL-1的亚细胞定位不太清楚。哺乳动物的caspase-9通过蛋白水解激活所谓的执行者caspase（caspase-3、-7和可能的-6），导致数百种细胞蛋白的切割。这些切割事件中的一些有助于拆解细胞，而其他则激活促进吞噬凋亡细胞及其膜包裹的碎片（称为凋亡体，apoptotic bodies）的过程。前者的一个例子是caspase-3或-7对caspase激活的脱氧核糖核酸酶抑制剂（ICAD，inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease）的切割，这释放了caspase激活的脱氧核糖核酸酶（CAD，caspase-activated deoxyribonuclease）以介导染色体DNA的核间切割。后者的一个例子是对XK相关蛋白8（XKR8，XK related 8）的蛋白水解激活，导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面显示为“吃我”的信号，以吸引吞噬细胞。吞噬作用对凋亡的非炎症性质很重要。如果凋亡细胞未被“吞噬”，它们最终可能发展出膜损伤。细胞内损伤相关分子模式（DAMPs, damage-associated molecular patterns）的释放向邻近细胞发出“警报”，触发促炎症反应。DAMPs包括DNA、ATP和蛋白质，如高迁移率族蛋白盒1（HMGB1, high mobility group box 1）和IL-1α。调节凋亡细胞的吞噬作用的过程在进化过程中得到了保留，凸显了它们对正常发育和成年组织稳态的重要性。果蝇（Drosophila melanogaster）是另一种用于研究程序性细胞死亡（programmed cell death）的模式生物。在果蝇中，Debcl、Buffy和Sayonara属于BCL-2蛋白家族（BCL-2 protein family），但它们在程序性细胞死亡中的作用比其哺乳动物和秀丽隐杆线虫（C. elegans）的对应物有限。果蝇的半胱天冬酶（caspases）主要受到细胞凋亡抑制蛋白（IAPs, inhibitor of apoptosis proteins）的控制（见图1）。果蝇中程序性细胞死亡的触发是由IAP抑制剂Reaper、Hid和Grim的诱导表达引起的。哺乳动物的IAPs在抑制细胞死亡中也扮演重要角色，但XIAP是唯一直接针对caspase的哺乳动物IAP，它抑制caspase-3、-7和-9。 BCL-2蛋白家族 BCL-2家族的成员可以分为三个亚组：促凋亡的BH3-only protein、促生存蛋白和促凋亡效应蛋白。哺乳动物的促生存蛋白具有四个BH区域（BH regions）、一个C末端跨膜域（TM domain, transmembrane domain）和一个疏水表面凹槽，用于介导与BCL-2家族两个促凋亡亚组的BH3域的相互作用。效应蛋白BAX、BAK和与BCL-2相关的卵巢杀手蛋白（BCL-2-related ovarian killer，BOK）的结构与促生存蛋白非常相似。它们也具有四个BH区域（由一个保守序列基序定义的BH4域）、一个TM域和一个BH3结合表面凹槽。相比之下，许多BH3-only protein在未与促生存家族成员结合时是未结构化的（unstructured）。 促凋亡效应蛋白BAX、BAK和BOK 大多数健康细胞都表达可检测量的BAX和BAK，尽管有些细胞表达其中之一的量要多得多。缺乏BAX的小鼠表现出雄性不育和轻微的脾肿大，而缺乏BAK的小鼠基本正常。然而，BAX和BAK的联合缺失通常产生严重的颅面异常，这在出生时是致命的。这种表型在缺乏BOK的小鼠中会加剧。与BAX和BAK不同的是，BOK似乎不受促生存BCL-2蛋白的抑制。BOK的丰度和活性反而受到位于内质网（ER）的泛素连接酶gp78的抑制，gp78将BOK定位为蛋白酶体降解。来自Bax−/− Bak−/−或Bax−/− Bak−/− Bok−/−小鼠的细胞对所有测试的内源性凋亡刺激都极度抵抗，这表明BAX和BAK在凋亡中具有很大的重叠功能，作为必需的凋亡效应蛋白，而BOK的作用是辅助的。尽管它们具有广泛的功能重叠，BAX和BAK之间还是有显著差异。尽管两者都与线粒体外膜上的促生存BCL-2蛋白相互作用，但健康细胞中的大多数BAX是细胞质的，其跨膜结构域嵌入其疏水凹槽内。BAX激活时跨膜域是如何被置换的目前还不太清楚。BAX和BAK的另一个区别是，BCL-2被认为主要抑制BAX，而MCL-1抑制BAK，但BCL-XL可以有效地抑制这两种蛋白。有趣的是，电压依赖性阴离子通道2（VDAC2, voltage-dependent anion channel 2）允许BAX定位到外线粒体膜上杀死细胞，但相反，它可以抑制BAK的激活。尽管经过多年的深入研究，BAX或BAK形成的介导线粒体外膜通透性改变（MOMP）的孔的结构仍然是个谜。BH3-only proteinsBIM、PUMA和被蛋白水解裂解的BID（称为截短的BID或tBID）与所有促生存BCL-2蛋白高亲和力结合，因此是强有力的凋亡启动因子。其他的BH3-only protein则以更选择性的方式结合。NOXA仅与MCL-1和A1/BFL-1结合，而BAD、BIK和HRK主要与BCL-XL结合，程度较小的与BCL-2和BCL-W结合。因此，这些BH3-only protein往往是较弱的杀手，因为它们只抑制保护细胞的部分促生存BCL-2蛋白。特定的BH3-only protein，尤其是BIM、PUMA和tBID，也可能通过与BAX和BAK直接相互作用来触发凋亡。然而，对缺乏所有BH3-only蛋白的细胞系的分析表明，这些相互作用对启动凋亡并非必需。当保护细胞的促生存BCL-2蛋白通过遗传手段移除或用小分子BH3模拟物抑制时，细胞仍然经历BAX或BAK介导的凋亡。这些发现总体上与一种模型一致，即BAX和BAK需要被促生存BCL-2蛋白抑制以维持细胞活性。当促生存BCL-2蛋白被BH3-only protein或蛋白酶体降解（下文描述）中和时，凋亡就会启动。启动凋亡的BH3-only protein取决于应激刺激和细胞类型。BIM在免疫耐受中起主要作用，通过清除自反应性B细胞和T细胞。它还通过移除免疫反应后不再需要的B细胞和T细胞，帮助免疫细胞的稳态。BIM和PUMA促进由生长因子剥夺、钙通量失调、糖皮质激素或内质网（ER）应激引发的凋亡。转录因子和肿瘤抑制因子p53（在小鼠中也称为转化相关蛋白53 [TRP53] (transformation related protein 53)，在人类中称为肿瘤蛋白p53 [TP53] (tumor protein p53)）通过诱导Puma和Noxa的表达促进凋亡。BID通过caspase-8在外源性凋亡途径（下文描述）或通过细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞释放的颗粒酶B (granzyme B)裂解而激活，后者通过穿孔素孔进入细胞。针对基因定位的小鼠的分析表明，BMF、BAD、BIK和HRK在启动凋亡中的作用不太突出。Pro-survival BCL-2 proteins所有促生存BCL-2蛋白（pro-survival BCL-2 proteins）都定位于线粒体外膜的外侧，但BCL-2也存在于内质网和核膜上。BCL-XL的相当部分是细胞质的。BCL-2、BCL-XL和BCL-W相对稳定，需要数小时才能转换，而MCL-1和A1/BFL-1是不稳定的蛋白，它们的半衰期以分钟而非小时计算，因为它们被泛素化并定向蛋白酶体降解。因此，当RNA或蛋白质合成停止时，MCL-1和A1/BFL-1的水平会急剧下降，依赖它们的细胞将死亡。许多病毒也产生促生存BCL-2同源物或结构类似物，强调内源性凋亡在消除病毒感染细胞中的重要作用。在小鼠中的遗传研究确定了不同促生存BCL-2蛋白的关键功能。A1的丧失只引起选择性造血细胞亚群的轻微缺陷。缺乏BCL-W的小鼠也基本正常，除了雄性不育。小鼠中缺乏BCL-2会导致过度的BIM驱动的凋亡，减少成熟B细胞和T淋巴细胞的数量，并导致过早白发以及致命的多囊肾病。BCL-XL缺乏在小鼠发育的胚胎第13天是致命的，因为这妨碍了血小板以及某些神经和红细胞群体的存活。MCL-1的缺失影响最为显著，对于早期植入胚胎和广泛的细胞类型的存活至关重要，包括造血细胞群、心肌细胞和肠上皮细胞。在某些细胞类型中，必须消除两种促生存BCL-2蛋白才能观察到严重缺陷。例如，BCL-XL或MCL-1可以维持肝细胞和某些神经细胞群的存活。促生存BCL-2蛋白和BH3-only protein的水平被精细平衡，因为基因剂量减半可能会产生戏剧性后果。例如，Mcl-1+/− Bcl-x+/−小鼠在出生后不久即死亡，表现出严重的颅面异常，但Mcl-1+/− Bcl-x+/− Bim+/−小鼠则健康。由缺陷的内源性凋亡引起的疾病 如上所述，强制表达BCL-2抑制内源性凋亡，可能导致人类滤泡性淋巴瘤。在小鼠中，淋巴细胞转基因过度表达BCL-2会引起类似于系统性红斑狼疮（SLE, systemic lupus erythematosus）的致命自身免疫疾病和低发病率的淋巴瘤。这些发现突显了内源性凋亡在维护免疫耐受以及肿瘤生成中的重要性。值得注意的是，当造血细胞还有MYC的非调节表达时，BCL-2是一个更强大的致癌基因，MYC是一个推动异常细胞分裂的转录因子。过量的BCL-2使恶性和非转化细胞对广泛的抗癌药物产生抵抗，无论这些药物是以p53依赖还是非p53依赖的方式杀死细胞。特别是BIM和PUMA这样的BH3-only protein未能中和过量的BCL-2，这阻止了内源性凋亡。因此，为癌症治疗开发了模仿BH3-only protein功能的小分子BH3类似物。特定于BCL-2的BH3类似物Venetoclax（也称为ABT-199）目前已被许多监管机构批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL, chronic lymphocytic leukemia）和急性髓性白血病（AML, acute myeloid leukemia），这些恶性病变主要依赖BCL-2而非其他促生存BCL-2蛋白来生存。针对MCL-1和BCL-XL的BH3类似物也已被开发，但它们在正常健康细胞中的靶向毒性构成了一个挑战。针对BCL-XL的治疗可能会导致血小板减少症，而心肌细胞、肠上皮细胞和血液细胞亚群是一些可能不耐受MCL-1抑制剂的细胞类型。将BH3类似物选择性地送达癌细胞的抗体偶联物的使用可能是限制正常健康细胞毒性的策略。在某些情况下，抑制内源性凋亡可以预防而非促进肿瘤发展。例如，在小鼠中，低剂量γ-射线诱导的胸腺淋巴瘤可被Puma缺陷所预防。解释是，成熟白细胞应激诱导的凋亡触发了大量的造血祖细胞的动员和增殖，从而产生了肿瘤原性病变（oncogenic lesion）。MCL-1缺陷导致的增强凋亡促进了小鼠肠道的肿瘤生成。因此，了解BH3类似物药物诱导的正常细胞凋亡是否可能为次发性治疗相关癌症埋下伏笔，就显得很重要了。过度的内源性凋亡与急性和慢性退行性疾病有关，包括缺血再灌注损伤和神经退行性疾病。至今为止，针对caspase的治疗策略并未取得成功，抑制剂在临床试验中展现出有限的疗效以及毒性。重要的是，抑制内源性凋亡途径中的caspase并不能阻止线粒体外膜通透性改变（MOMP）后的线粒体功能障碍和细胞死亡。目前正在努力寻找抑制BAX或BAK的抑制剂，但考虑到可能的靶向毒性，是否存在治疗窗口尚不清楚。外源性凋亡和坏死性凋亡外源性凋亡和坏死性凋亡途径主要由细胞表面的死亡受体结合的细胞外配体触发。通过caspase-8传递凋亡信号，而当caspase-8被抑制时，可能发生坏死性凋亡，这是一种溶解性的细胞死亡形式。坏死性凋亡可能作为一种抗病毒防御机制而进化，因为某些病毒，包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺病毒，编码caspase-8的抑制剂以防止凋亡。与此观点一致的是，缺乏坏死性凋亡的小鼠比野生型（WT）小鼠更易感染牛痘病毒或缺乏坏死性凋亡抑制剂病毒诱导的RIPK3降解（vIRD, viral inducer of RIPK3 degradation）的变异牛痘病毒。与内源性凋亡途径中的caspase-9一样，caspase-8通过裂解并因此激活caspase-3和-7来执行凋亡程序。配体和死亡受体(death receptor)配对包括FAS配体（FASL）与FAS、肿瘤坏死因子（TNF）或淋巴毒素-α与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、TNF样细胞因子1A（TL1A）与死亡受体3（DR3）以及与TRAILR1或TRAILR2（小鼠只有一个TRAILR）相关的诱导凋亡配体（TRAIL）。尽管它们的名字，死亡受体并不专门传递细胞死亡信号。许多细胞对TNFR1的激活不是通过死亡而是通过激活核因子κB（NF-κB）和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路，促进促炎症和促生存基因的表达。TNFR1信号机制的扰动可能会促使细胞死亡的诱导，并在下文中进行讨论。死亡受体之外，外源性凋亡或坏死程序（necroptosis）的机制也可以通过 Toll 样受体 3（Toll-like receptor 3, TLR3）、TLR4 或 Z-DNA 结合蛋白 1（Z-DNA binding protein 1, ZBP1）被激活。TLR3 通过内体（endosomal compartment）中的双链 RNA 被激活，而 TLR4 感应细菌的外细胞脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）并随后转移到内体。ZBP1 是内部的 Z-形核酸传感器，这种核酸具有左旋的双链螺旋结构，由一些病毒和内源性逆转录元件产生。TLR3 或 TLR4 信号的典型输出是促炎和促存活的基因表达，但如 TNFR1 信号传导所见，某些细胞缺陷可能会使信号传导倾向于细胞死亡。因此，当细胞暴露于某些死亡配体或病原体相关分子模式（PAMPs, pathogen-associated molecular patterns）时，如果立即受到威胁，反映在关键信号组件的损害上，它们可以将其反应从促炎和促存活基因表达升级为外源性凋亡或坏死程序。 TNFR1 TNFR1在许多细胞类型上表达，并在病原体防御中发挥重要作用，但持续激活该受体可能助长慢性炎症。事实上，TNF抑制剂，它们阻断TNF-TNFR1和 TNF-TNFR2信号，广泛用于治疗自发炎性疾病，如炎症性肠病、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。与所有死亡受体一样，TNFR1有一个细胞质同型蛋白互作基序(cytoplasmic homotypic protein interaction motif)，称为死亡结构域（death domain, DD）。在配体诱导的TNFR1寡聚化后，DD通过招募与死亡结构域相关的TNFRSF1A适配蛋白（TNFRSF1A associated via death domain, TRADD）和受体相互作用蛋白激酶1（receptor interacting protein kinase 1, RIPK1）启动所谓的复合体I的组装（图 2A）。TRADD 绑定到 TNF 受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2, TRAF2），这是 cIAP1 和 cIAP2 泛素连接酶的适配蛋白。cIAP1 和 cIAP2 通过向 RIPK1 和复合体 I 的其他组件添加K63连接的多聚泛素链，帮助对接线性泛素链装配复合体（linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC）和TGF-β激活的激酶1（TGF-beta activated kinase 1, TAK1）。LUBAC然后向TNFR1、TRADD 和 RIPK1添加M1连接的多聚泛素链，这增强了招募典型IκB激酶（IKK）复合体的能力。复合体I中TAK1和IKK 的激活，参与了NF-κB和MAPK 信号通路，驱动促炎基因（例如Ccl2, Ccl3, Ccl5, Csf2, Cxcl1, Cxcl2, Il1b, Il6, Nos2 和 Tnf）和促存活基因（例如Bclx和Cflar，编码细胞FLICE抑制蛋白[cFLIP]的基因）的表达。 图 2-外源性凋亡信号通路（Credit: Cell） 线性泛素链装配复合体（LUBAC，linear ubiquitin chain assembly complex）也是 TANK 结合激酶 1（TBK1）和 IKKε 进入复合体 I 的必要条件。这些激酶通过磷酸化 RIPK1，从而抑制其诱导死亡的激酶活性。TNFR1 信号激活的其他激酶，包括 IKK 和 MK2（也称为 MAPK 激活的蛋白激酶 2），通过在 RIPK1 的不同位点磷酸化促进细胞存活。RIPK1 的 K63 连接泛素化也似乎抑制了其激酶活性。阻断 RIPK1 上的这些翻译后修饰会使 TNFR1 信号向细胞死亡倾斜。TNFR1 下游 RIPK1 的激活如何促进细胞死亡仍在阐明中。RIPK1 的激酶活性对于 TNF 诱导的 NF-κB 或 MAPK 信号是非必需的，RIPK1 的主要底物似乎是其自身。RIPK1 在死亡结构域介导的激酶二聚化后的自磷酸化使 RIPK1 获得进入次级细胞质诱导死亡的复合体 II 的资格。RIPK1 从复合体 I 到复合体 II 的转变由圆柱状纤维瘤症（cylindromatosis, CYLD）增强，这是一种去泛素化酶，可以移除 M1 或 K63 连接的多聚泛素。CYLD 通过其适配蛋白: 精子生成相关蛋白 2（SPATA2）被招募到复合体 I，后者又与 LUBAC 结合。CYLD 是否能够接触其底物似乎还受到泛素结合蛋白 A20（也称为 TNF alpha 诱导的蛋白 3）和 A20 结合并抑制 NF-κB（ABIN-1）的进一步控制。这些蛋白都被招募进入复合体 I，并可能通过 CYLD 抑制多聚泛素链的切割。据此模型，缺乏 ABIN-1 和 A20 的小鼠肠上皮细胞比其 WT 对应物更易于 TNF 诱导的细胞死亡。使用环己酰胺抑制蛋白质翻译也可以增强 TNF 诱导的细胞死亡敏感性，但在这种情况下，RIPK1 的激酶活性是非必需的。TRADD 可以独立于 RIPK1 成核复合体 II。无论是 TRADD 还是 RIPK1 形成复合体 II 的骨架，两种蛋白都可以与通过死亡结构域相关的 FAS（FADD）结合，这是 caspase-8 的适配蛋白。FADD 中的死亡效应结构域（DED）然后与 caspase-8 酶原体中的两个 DED 之一相互作用。caspase-8 中的串联 DED 支持由 caspase-8 及其催化不活跃的同源物 cFLIP 组成的螺旋状 DED 丝状体的组装。caspase-8 的近邻诱导的同源二聚体，或者 caspase-8 与长型 cFLIP（cFLIPL）的异源二聚体，自我蛋白水解处理产生完全活跃的 caspase-8。caspase-8 的催化亚基之间的切割允许构象变化，稳定活性位点，但在 caspase-8/cFLIPL 异源二聚体中这一点不那么关键。异源二聚体介导的 caspase-8 同源二聚体的切割可能促进 caspase-8 的激活，至少在最初阶段如此。caspase-8 与 cFLIPL 的比例很重要，因为丰富的 cFLIPL 可以通过限制 DED 寡聚体中合并的 caspase-8 的总量来抑制 caspase-8 的激活。较短的 cFLIP 异构体（例如人类 cFLIPS 和病毒 FLIP 蛋白）通过扰乱定向 caspase-8 二聚体的螺旋状 DED 丝状体来抑制 caspase-8 的激活。环己酰胺似乎通过减少高度不稳定的 cFLIPL 量来促进 TNF 诱导的凋亡。cFLIPL 丰度的严格调控可能是为了促进快速杀死蛋白质翻译受损的病毒感染细胞而进化的。一些病毒获得了自己的 cFLIPS 版本，作为阻断外源性凋亡的手段。其他病原体，包括肠致病性大肠杆菌（EPEC），也获得了其他阻止死亡受体信号传导的手段。例如，EPEC 毒力因子 NleB1 是一种乙酰葡萄糖胺转移酶，可以修改并禁用 DD，包括 TNFR1、TRADD、RIPK1 和 FADD 中的那些。许多未感染的原代细胞对 TNF 的反应是低水平的 caspase-8 激活，不会触发凋亡。现有证据表明，在这种情况下，caspase-8 切割复合体 II 中的 RIPK1 支架，从而在有足够活跃的 caspase-8 有效切割和激活 caspase-3 和 -7 之前破坏复合体 II。与此模型一致的是，消除 RIPK1 中 caspase-8 切割位点的杂合突变增强了 TNF 诱导的 caspase-8 激活和凋亡。XIAP，作为 caspase-3、-7 和 -9 的抑制剂，可能增加了一层保护，防止凋亡的诱导。报道的其他限制复合体 II 的机制包括通过自噬相关蛋白 9A (ATG9A) 将复合体靶向溶酶体，以及通过聚 ADP 核糖聚合酶 tankyrase-1 的多聚 ADP 核糖化和随后的泛素化而导致的复合体的蛋白酶体降解。健康细胞中TNFR1对caspase-8的“挠痒”并非徒劳，因为它为当病原体抑制caspase-8时稳定化诱导死亡的复合体II（Complex II）奠定了基础。如果在复合体II中，活跃的RIPK1未被caspase-8切割，则它可以激活激酶RIPK3，释放caspase独立的混合谱系激酶结构域样（Mixed Lineage Kinase Domain-Like, MLKL）介导的坏死性死亡（necroptosis，如下所述）。因此，通过疱疹病毒B13R、牛痘病毒CrmA或小分子泛caspase抑制剂对caspase-8的抑制，会使某些细胞对TNF诱导的细胞死亡更加敏感。RIPK1和RIPK3通过它们的RIP同型互作基序（RIP Homotypic Interaction Motifs, RHIMs）相互作用。RHIM驱动的RIPK3寡聚化激活其激酶活性，导致伪激酶MLKL的磷酸化。MLKL随后形成寡聚体并转移到膜上，引发细胞裂解。坏死性死亡作为一种抗病毒防御机制的重要性，通过发现阻止RIPK3激活MLKL的病毒MLKL样假体（decoys）而凸显出来。已经鉴定出通过干扰RHIM依赖的RIPK3激活或针对RIPK3进行蛋白酶体降解来阻断坏死性死亡的病毒和细菌蛋白。虽然人类RIPK3的功能丧失突变与单纯疱疹脑炎（herpes simplex encephalitis）有关，但目前尚不清楚该疾病是否源于病毒感染细胞坏死性死亡受损，因为RIPK3还有坏死性死亡独立的功能。与RIPK3坏死性死亡独立作用一致，极少数MLKL缺陷病例未表现出对传染性病原体的增加敏感性。在小鼠中，肠上皮细胞或角质细胞中过量的TNFR1驱动细胞死亡是炎症的强劲驱动因素。例如，在LUBAC功能受损的Sharpincpdm突变小鼠中，慢性增生性皮肤炎可通过消除TNFR1、CYLD、FADD、caspase-8或RIPK1的激酶活性而被阻止。由于肠上皮细胞中IKK亚单位NEMO的丧失引起的结肠炎也可通过丢失TNFR1、FADD或RIPK1的激酶活性而被阻止。因此，即使在没有促炎症NF-κB信号的情况下，TNFR1诱导的细胞死亡也能驱动炎症。过度的凋亡可能会破坏皮肤或肠道这些屏障，并允许微生物的涌入，进而驱动炎症。在人类中，TNFR1诱导的细胞死亡被认为是由TBK1或OTULIN缺陷引起的自身炎症综合征的重要驱动因素。OTU去泛素化酶具有线性连接特异性（OTULIN, OTU deubiquitinase with linear linkage specificity）通过从泛素连接酶去除M1连结的多聚泛素来保持LUBAC活性。缺乏TBK1或OTULIN的患者细胞在培养中表现出对TNF诱导死亡的高度敏感性，值得注意的是，这些患者接受TNF抑制治疗可以缓解疾病。与人类不同，小鼠中Tbk1或Otulin失活突变会导致胚胎死亡。Tbk1缺陷导致胎儿肝脏中由TNFR1和RIPK1激酶活性驱动的细胞死亡，而Otulin失活（或丢失核心LUBAC基因Hoil1或Hoip）引起的胚胎致死部分依赖于TNFR1和活跃的RIPK1。缺乏NEMO的人类中的一些炎症病变对TNF阻断有反应，鉴于IKK缺陷增强了TNFR1刺激的细胞死亡，它们也可能反映了异常的TNF诱导细胞死亡。编码A20的TNFAIP3的半数不足可以引起自身炎症和自身免疫症，有些患者对TNF阻断有反应。虽然A20缺陷增加了对TNF诱导细胞死亡的敏感性，但完全缺乏A20的小鼠会发展出独立于TNF或TNFR1信号的严重早发炎症。后一观察表明，TNF诱导的细胞死亡只是A20负向调控的几个促炎过程之一。表达低活性A20且具有失活的锌指7（Zinc Finger 7, ZnF7）泛素结合结构域的小鼠会发展出TNF驱动的关节炎，而在A20中同时突变ZnF4和ZnF7会引发与A20缺陷相关的更严重表型。在完全缺乏A20或A20 ZnF4/ZnF7突变小鼠中消除依赖caspase-8的细胞死亡和依赖MLKL的坏死性死亡的影响尚未报道。因此，尚不清楚死亡受体或TRIF依赖的TLRs引发的异常细胞死亡是否是其致死性的主要驱动因素。TNFR1(肿瘤坏死因子受体1)刺激细胞死亡在没有通路负调控因子基因突变失活的情况下，其在人类炎症性疾病中的作用尚不明确。尽管如下所述，RIPK1 (受体相互作用蛋白激酶1)抑制剂的临床试验可能提供一些见解，但是抑制RIPK1的激酶活性也可能阻止FAS、TRAILR1、TRAILR2、TLR3和TLR4触发的某些形式的细胞死亡。接受RIPK1抑制剂GSK2982772治疗的类风湿关节炎和结肠炎患者在临床试验中未显示出益处（ClinicalTrials.gov 研究: NCT02858492和NCT02903966），但其他RIPK1抑制剂正在皮肤红斑狼疮（ClinicalTrials.gov 研究: NCT04781816）和肌萎缩侧索硬化症（ClinicalTrials.gov 研究: NCT05237284）的临床试验中。DR3DR3的表达范围不如TNFR1广泛，主要发现于淋巴细胞上，但它似乎与TNFR1以相似方式发出信号。TL1A (肿瘤坏死因子样配体1A) 与DR3的结合主要刺激促炎细胞因子和趋化因子的产生，但如cIAP缺乏这类扰动会促进细胞质中诱导信号复合体的组装。TL1A抑制剂已被证明对炎症性肠病患者有益，这表明TL1A像TNF一样，是慢性炎症的重要驱动因子。FAS和TRAIL受体FAS、TRAILR1和TRAILR2这些死亡受体也通过两个连续的复合体发出信号，但顺序与TNFR1和DR3相反。与受体相关的复合体触发细胞死亡，而第二个细胞质复合体称为FADDosome（FADD相关复合体），在未能死亡的细胞中可以刺激NF-κB和MAPK信号通路。FAS或TRAIL受体的DD（死亡结构域）直接与FADD结合以激活caspase-8。尽管caspase-8可以直接切割并激活caspase-3和-7，但FAS在“第二型”细胞（例如小鼠肝细胞）中诱导的凋亡需要caspase-8介导的促凋亡BH3仅限蛋白BID的蛋白水解激活，产生tBID。需要激活内在途径以克服XIAP介导的caspase-3和-7的抑制。FAS和TRAIL受体像TNFR1一样，在caspase-8被抑制时可以信号触发坏死性凋亡，这种细胞死亡依赖于RIPK1的激酶活性。RIPK1被FADD招募至受体复合体，随后与RIPK3结合促进坏死性凋亡。FADDosome的组装需要FADD和caspase-8，但不需要caspase-8的催化活性。FADDosome似乎包含了TNFR1复合体I的许多组分，包括TRADD、cIAP1/2、RIPK1、TRAF2、IKK、TAK1和A20。对于抵抗TRAIL诱导细胞死亡的肿瘤细胞，FADDosome调控的基因表达已被提出可调节抗肿瘤免疫细胞反应。FASL和TNF是细胞毒性T细胞用来杀死其靶细胞的武器，除了穿孔素和颗粒酶。过度的TNFR1驱动细胞死亡和过度的FAS或TRAILR触发的细胞死亡都可能导致组织损伤和炎症。FASL还通过杀死不再需要的淋巴细胞来维持淋巴稳态。FASL或FAS功能受损的小鼠和人类会发展成自身免疫性淋巴增生综合征（ALPS），一种通常稀有的、非传统B和T细胞异常累积的疾病。FADD或caspase-8酶活性的缺失（阻止所有外源性凋亡）对小鼠和人类的影响不同。无法激活caspase-8的小鼠会因未受控的TNFR1-、RIPK1-、RIPK3-和MLKL依赖的坏死性凋亡而在胚胎期死亡。相比之下，缺乏FADD或caspase-8的人类可能表现出ALPS、反复感染和早发性炎症性肠病。是否坏死性凋亡驱动了人类疾病尚不清楚。受损的caspase-8切割RIPK1必须促进炎症，因为杂合性RIPK1突变破坏了caspase-8切割位点，导致周期性发热综合征。NEDD4结合蛋白1（N4BP1）的切割和失活可能导致FADD或caspase-8缺陷患者的先天免疫受损。在人和小鼠的骨髓细胞中，N4BP1通过仅通过髓样分化基因88（MyD88）适配器信号的TLRs抑制细胞因子和趋化因子的产生。N4BP1是一种泛素结合内核糖核酸酶，但它如何精确地限制细胞因子和趋化因子反应还需进一步研究。TLR3、TLR4和ZBP1TLR3和TLR4都利用含RHIM（RIP同源相互作用基序）的适配蛋白Toll/IL-1受体域含有诱导干扰素-β的适配蛋白（TRIF）来与RIPK1和RIPK3结合（图3A）。反过来，RIPK1可能招募TRADD-TRAF2-cIAP1/2和FADD-caspase-8，最终导致NF-κB和MAPK激活以及caspase-8依赖的N4BP1切割。已显示阻断LUBAC或同时阻断cIAP1和cIAP2可使TLR3信号转向强烈的caspase-8激活和细胞死亡。如果caspase-8被抑制，那么TLR3和TLR4都可以刺激坏死性凋亡。抑制RIPK1可阻止巨噬细胞中TLR3或TLR4诱导的坏死性凋亡，这表明RIPK1的激酶活性通常是TRIF依赖性坏死性凋亡所必需的。然而，小鼠的遗传研究表明，即使在RIPK1缺失的情况下，TRIF或ZBP1也可以激活坏死性凋亡。实际上，小鼠RIPK1似乎利用其RHIM来抑制TRIF或ZBP1诱导的坏死性凋亡，因为RIPK1 RHIM突变小鼠中的炎症和围产期死亡可以通过失去MLKL或同时失去TRIF和ZBP1来预防。与RIPK1阻止TRIF从事细胞死亡机械相一致，缺乏RIPK1的原代人成纤维细胞对LPS或TLR3激动剂poly(I:C)诱导的细胞死亡更为敏感。总体而言，这些数据表明RIPK1的激活可能缓解其RHIM依赖性但又不甚明了的TRIF或ZBP1信号抑制。 图3-TLR3和ZBP1的细胞死亡信号（Credit: Cell） RIPK1支架也抑制caspase-8驱动的细胞死亡，因为Ripk1缺失的小鼠在围产期死亡，除非消除caspase-8和MLKL依赖的死亡程序。相比之下，RIPK1的激酶活性对小鼠的存活来说是可有可无的。RIPK1似乎至少部分限制凋亡，是通过阻止TRADD-FADD-caspase-8信号复合体的组装。考虑到RIPK1和TRADD似乎并行作用并且绑定相同的DD蛋白，RIPK1的缺失可能允许更多TRADD进入信号复合体，同时伴随着NF-κB和MAPK信号受损和cFLIPL表达减少。RIPK1缺失的原代人成纤维细胞也增强了TNF诱导的细胞死亡。尽管RIPK1的缺失在小鼠中是致命的，但缺乏RIPK1的人类主要表现为免疫细胞功能障碍，导致淋巴细胞减少、感染、关节炎和早发性炎症性肠病。小鼠与人类对RIPK1的更广泛需求可能反映了物种特异性差异，例如RIPK1的表达模式或其他通路组分的差异。ZBP1具有两个Zα结构域用于识别Z型核酸和一个RHIM与RIPK3结合。ZBP1-RIPK3相互作用可以通过MLKL触发坏死性凋亡或通过RIPK1、FADD和caspase-8触发凋亡（图3B）。RIPK1的激酶活性对这种细胞死亡来说是非必需的。制造Z-RNA的病毒包括巨细胞病毒、流感A病毒、单纯疱疹病毒1和牛痘病毒。巨细胞病毒通过产生caspase-8和RHIM-RHIM相互作用的抑制剂来逃避细胞死亡，而牛痘病毒则产生caspase抑制剂和一个Zα结构域蛋白，用以屏蔽病毒Z-RNA免受ZBP1的检测。内源性逆转录病毒元件产生的Z型核酸在过度的ZBP1依赖性细胞死亡导致皮肤或肠道炎症的小鼠模型中被暗示。有趣的是，ZBP1信号的输出不仅限于细胞死亡。ZBP1还可以独立于RIPK3、RIPK1 RHIM或细胞死亡，促进干扰素刺激基因（ISGs）的表达。解开这一信号通路将是重要的，因为ZBP1对由Adar1突变导致的ISG驱动病理有所贡献。人类ADAR1突变引起的重症特征是ISG表达增加，包括艾卡蒂-古蒂耶症候群（Aicardi-Goutieres syndrome）。特异性腺苷脱氨酶RNA（ADAR1）具有Zα结构域，似乎绑定并编辑会否则激活ZBP1的Z-RNAs。鉴于ZBP1诱导的坏死性凋亡和ISG表达的促炎性质，其他人提出利用ZBP1激动剂来增强癌症免疫疗法。焦亡(Pyroptosis) 焦亡是指由细胞质膜上的gasdermin孔洞引起的细胞死亡。焦亡作为一种独特的细胞死亡程序，起源于对感染沙门氏菌的巨噬细胞的研究。这种感染巨噬细胞的死亡依赖于caspase-1，这是一种蛋白酶，可以蛋白水解成熟IL-18和内源性发热原IL-1β。后续研究揭示，在人类中，caspase-1、-4和-5，以及在小鼠中，caspase-1和-11，都可以通过切割gasdermin D（GSDMD）引起焦亡。GSDMD的N端切割片段通过寡聚化并在膜上形成孔洞，促进细胞裂解。GSDMD在细胞膜上的孔洞会破坏离子梯度，并导致水分的大量涌入，最终引发依赖于ninjurin 1（NINJ1）的细胞质膜破裂（PMR）以及大量促炎DAMPs的释放。然而，包括IL-1β在内的小型DAMPs可以通过GSDMD孔洞离开细胞。在某些情况下，细胞膜修复机制可能限制GSDMD孔洞的形成。GSDMD孔洞是否能在不触发焦亡的情况下释放IL-1β仍未解决。炎症小体(Inflammasomes)Caspase-1在细胞质复合体中形成活性二聚体，这些复合体被称为炎症小体（图4）。炎症小体的组装由感应特定DAMPs或PAMPs的蛋白质触发，然后形成寡聚骨架。一些“感应器”蛋白质直接与DAMPs或PAMPs结合，而其他蛋白质则检测DAMPs或PAMPs在细胞内引起的扰动。前者包括absent in melanoma 2（AIM2），它与病毒或细菌的双链DNA结合，以及NLR家族凋亡抑制蛋白（NAIPs），它们与细菌的鞭毛、针和内杆蛋白结合。NLR家族含有pyrin结构域的1（NLRP1）和caspase激活和招募结构域8（CARD8）能够感知某些感染，因为它们各自具有一个抑制结构域，可以被细菌或病毒酶修饰并靶向蛋白酶体降解。这种抑制结构域的去除促进了炎症小体的组装。 图4-炎症小体诱导的GSDMD依赖性焦亡（Credit: Cell） 识别PAMPs或DAMPs的炎症小体感应器包括PYRIN和NLRP3。PYRIN能够感知修改和失活Rho GTP酶的细菌毒素，PYRIN的去磷酸化和微管聚合在炎症小体组装中发挥作用。NLRP3对多种刺激物作出反应，包括细菌毒素nigericin、胞外ATP和与痛风相关的尿酸晶体。细胞内钾离子流出被认为是驱动NEK7依赖性NLRP3寡聚化的统一事件，但这一过程的机制细节仍然不清楚。NLRP3在无菌炎症的背景下激活促使了小分子NLRP3抑制剂的开发。NLRP3抑制剂的临床试验集中在自身炎症性疾病上，包括骨关节炎、神经炎症以及COVID-19。PYRIN、NLRP1和NLRP3-NIMA相关激酶7（NEK7）炎症小体都包含了caspase-1适配蛋白含有CARD的凋亡相关斑点状蛋白（ASC），它有一个CARD与caspase-1中的CARD结合。NAIP和CARD8炎症小体不需要ASC，因为NAIP相互作用蛋白NLR家族含有CARD的4（NLRC4）中的CARD或CARD8本身可以与caspase-1结合。caspase-4或-5（啮齿动物caspase-11的人类对应物）中的CARD直接与细菌LPS的细胞质寡聚体结合。这种结合不需要表面表达的LPS受体TLR4。这些非典型炎症小体复合物产生活性的caspase二聚体，触发GSDMD依赖性焦亡。焦亡细胞还释放成熟的IL-1β，因为GSDMD切割引起的扰动激活NLRP3炎症小体和caspase-1。GSDMD依赖性焦亡在病原体防御和炎症性疾病中的作用小鼠的遗传研究表明，GSDMD依赖性焦亡是限制沙门氏菌等细胞内病原体生长的重要机制。其他细胞内细菌通过使用抑制焦亡的毒力因子来保护其复制生态位。志贺氏菌有两个效应器武器来阻止焦亡，caspase-4和-11的抑制剂OspC3和泛素连接酶IpaH7.8。后者通过将人类GSDMD和GSDMB（下文将描述）靶向蛋白酶体降解来抑制焦亡。焦亡的促炎性质有助于抗击病原体，因为包括中性粒细胞在内的免疫细胞被招募到感染部位。但是，由于通路失调导致的过度焦亡会引起疾病。人类NLRP1、NLRP3、NLRC4和MEFV（编码PYRIN）的生殖系激活突变破坏了正常的炎症小体调节，并引起一系列自身炎症性疾病。这些疾病的患者通常对IL-1β阻断反应良好，异常的IL-1β产生可能反映了焦亡的增强。与这一观点一致的是，Gsdmd的缺失阻止了表达疾病相关PYRIN或NLRP3突变体的基因敲入小鼠中炎症性病变和活性IL-1β水平的升高。值得注意的是，在体外培养细胞中，Gsdmd缺失延缓而不是阻止了经典炎症小体激活后的细胞死亡和IL-1β释放。细胞死亡仍然发生，因为caspase-1还可以通过蛋白水解激活caspase-3和-7来触发较慢的凋亡过程。因此，体内的细胞死亡类型很重要。可以推测，在Mefv或Nlrp3基因敲入突变小鼠中，Gsdmd缺陷细胞通过凋亡死亡可能有益，因为在继发膜损伤释放由caspase-1产生的促炎、成熟形式的IL-1β之前，它们被吞噬细胞清除。Gsdmd缺失还改善了小鼠败血症模型中的疾病。caspase-1、IL-1β和IL-18对小鼠LPS诱导的败血性休克是可有可无的，而caspase-11依赖性焦亡在内皮细胞中似乎驱动血管泄漏和低血压。通过内皮GSDMD孔洞的Ca2+流入可能促进微血管中致命的凝血和血块形成。总体来看，这些研究表明GSDMD抑制剂在暴发性炎症环境中可能提供治疗益处。有趣的是，最近的研究报告称，外源性添加的拮抗性GSDMD纳米体能够抑制体外细胞中的GSDMD依赖性焦亡。据称，GSDMD纳米体通过最初的GSDMD孔洞进入细胞，然后抑制进一步孔洞的形成。最初的GSDMD孔洞被认为是短暂的，并且通过膜修复机制从质膜中移除。这些发现表明GSDMD是可药用的，但这些纳米体是否能在体内抑制GSDMD尚不清楚。由于纳米体只能结合人类GSDMD，因此无法在临床前小鼠模型中评估其疗效。除了半caspase-1、-4、-5和-11，还有其他蛋白酶也能切割并激活GSDMD（Gasdermin D）。由caspase-8切割GSDMD引起的细胞焦亡在应对耶尔森菌感染的宿主反应中扮演了重要角色。中性粒细胞弹力酶也被证实能够切割并激活GSDMD。相比之下，据报道caspase-3通过在N端形成孔的域内切割来使GSDMD失活。更广泛的气道上皮细胞死亡蛋白家族人类有六种气道上皮细胞死亡蛋白家族成员（GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME, 和 GSDMF），而小鼠缺少Gsdmb，但有三种Gsdma基因（Gsdma1, Gsdma2, 和 Gsdma3），四种Gsdmc基因（Gsdmc1, Gsdmc2, Gsdmc3, 和 Gsdmc4），以及Gsdmd, Gsdme, 和 Gsdmf。除了GSDMF，每种气道上皮细胞死亡蛋白都有一个在N端的保守形成孔的域，被C端控制着。不同的蛋白酶切割不同的气道上皮细胞死亡蛋白以释放形成孔的域，这些域随后可以与细胞膜、细胞器膜或细菌的外膜结合。缺乏Gsdma1（或Gsdma1-3）、Gsdmc1-4、或Gsdme的小鼠比野生型对照组对某些细菌或蠕虫感染更易感，这表明许多气道上皮细胞死亡蛋白有助于宿主对病原体的防御。在培养细胞中，caspase-3对GSDME的蛋白水解激活被报告可以引起细胞焦亡或凋亡后的次级膜损伤。后者的生理意义不太确定，因为在体内吞噬细胞通常会迅速清除凋亡细胞。无论如何，GSDME已被证实在小鼠中介导化疗药物引起的组织损伤或感染肠道病毒71型。由细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme B可以切割并激活caspase-3来切割GSDME，但它也可以直接在靶向肿瘤细胞中切割GSDME。在各种肿瘤细胞中，GSDME的表观遗传沉默或突变失活暗示了GSDME在抑制肿瘤中的作用。因此，进行实验以查看Gsdme缺陷是否增强小鼠自发性肿瘤模型中的肿瘤发生将是有启发性的。已有报告称，嵌合抗原受体T细胞引起的GSDME驱动的肿瘤细胞裂解在小鼠中触发细胞因子释放综合征。GSDMA主要在上皮细胞中表达。它似乎直接作为病原体传感器，通过链球菌致热外毒素B（SpeB）的蛋白水解切割后诱导细胞焦亡。GSDMB可以被细胞毒性淋巴细胞释放的Granzyme A切割并激活，Granzyme A是另一种效应蛋白酶。值得注意的是，已在不同细胞类型中描述了多种GSDMB剪接变体，其中一些编码无功能的GSDMB蛋白，这些蛋白不能诱导细胞焦亡。哪些亚型最具生理相关性尚不清楚，这使得解释将GSDMB的单核苷酸多态性与哮喘、克罗恩病和溃疡性结肠炎相关联的全基因组关联研究变得复杂。较少研究的GSDMC可能通过从杯状细胞和潘氏细胞释放IL-33在小鼠中介导抗蠕虫防御。 NINJ1依赖的质膜修复（PMR） 由NINJ1介导的PMR负责焦亡细胞的破裂，NINJ1是一种表达在细胞表面的跨膜（TM）蛋白。消除NINJ1并不会阻止细胞死亡，但会阻碍大型细胞内分子（如乳酸脱氢酶（LDH），PMR的标准标记物，和HMGB1）的释放。在培养中诱导焦亡的Ninj1缺陷细胞因其持续膨胀的形态而显著。认为从死亡细胞中排出的大型DAMPs（损伤相关分子模式）可“警告”免疫细胞，因为缺乏Ninj1的小鼠比野生型对照组更易感染肠杆菌属鼠伤寒杆菌或伪结核耶尔森菌。在活细胞中，NINJ1似乎是单体或二聚体，但在焦亡细胞中则是寡聚体。纯化的NINJ1形成的纤维在一个表面上是疏水的，而另一个表面上是亲水的，这表明NINJ1通过封顶膜边缘245或形成类似纳米盘的环，从而撕裂膜的部分。目前尚不清楚什么触发了垂死细胞中NINJ1的寡聚化。一种可能性是NINJ1感知到随着细胞膨胀而发生的膜张力或脂质排列的变化。在培养中，NINJ1也介导凋亡细胞的次级PMR。凋亡细胞最终会膨胀，因为ATP水平下降和Na+/K+ ATPase泵功能失常。caspase-3对GSDME的切割和GSDME孔的形成可能会通过渗透压加速膨胀。有趣的是，NINJ1对经历坏死或铁死亡的细胞的PMR是可有可无的。NINJ1依赖的DAMP释放是否加剧炎症和疾病严重程度，是一个活跃的研究领域。细胞死亡的灵活途径有越来越多的证据表明哺乳动物细胞在编程性细胞死亡途径中的灵活使用。例如，巨噬细胞中的炎症小体可以激活caspase-1或-8，焦亡通常因为其更快的动力学而占优势。在小鼠中的遗传实验揭示了当通常占主导地位的死亡途径受阻时，细胞死亡的意外途径。例如，在小鼠中表达蛋白水解失活的caspase-8会激发致命的坏死，但如果消除MLKL以防止坏死，那么ASC和caspase-1信号传导则有助于致死性。在另一个例子中，FADD缺陷的小鼠肠上皮细胞的回肠炎是由坏死或GSDMD依赖的焦亡驱动的。最后，坏死可以触发细胞内NLRP3炎症小体的激活，导致caspase-1的激活和活化IL-1β的释放。假设NLRP3在垂死细胞内检测到某种形式的细胞扰动。尽管NLRP3和caspase-1不是这些细胞死亡所必需的，但它们仍然通过允许垂死细胞释放成熟的IL-1β，从而为死亡的炎症性质做出贡献。 铁死亡铁死亡指的是细胞积累致命水平的依赖铁的磷脂过氧化物，从而导致非凋亡性死亡。经历铁死亡的细胞会破裂，但磷脂过氧化物如何破坏质膜的完整性尚不清楚。合成易氧化膜脂的代谢酶（例如，长链酰基辅酶A合成酶家族成员4 [ASCL4] 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 [LPCAT3]）和氧化膜脂的铁依赖酶（例如，花生四烯酸脂氧酶）赋予细胞对铁死亡的易感性（图5）。常用的铁死亡诱导剂包括小分子erastin和RSL3，它们通过干扰限制膜脂过氧化物的机制发挥作用。RSL3抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），这是一种利用谷胱甘肽将脂质过氧化物还原为无毒的脂质醇的脂质过氧化物酶。Erastin通过抑制进口半胱氨酸和使半胱氨酸可用于谷胱甘肽合成的xc−系统来耗尽细胞内谷胱甘肽。抑制其他自由基清除代谢物的产生，包括辅酶Q10（CoQ10）和四氢生物蝶呤（BH4），也可以使细胞对铁死亡更加敏感。增加游离铁的丰度是使细胞准备好铁死亡的另一种方式。 图5-细胞组分决定对铁死亡的敏感性（Credit: Cell） 铁死亡已被暗示与许多疾病有关，但在基因层面上测试其在临床前疾病模型中的因果关系很困难，因为铁死亡的媒介物在正常细胞代谢中也扮演着关键角色。检测铁死亡是另一个挑战，因为没有一个独特的标记物能够区分这种细胞死亡形式。必须观察到脂质过氧化，并评估一系列标记物以排除其他形式的细胞应激。尽管如此，一个活跃的研究领域是探索是否可以通过诱导铁死亡选择性地消除癌细胞。例如，一些肿瘤细胞可能比正常细胞更依赖半胱氨酸的摄入。结论和未来方向细胞死亡对于多细胞生物的存活和适应性是必需的，但必须严格调节以防止疾病。对细胞死亡信号机制的全面理解揭示了在疾病中抵制异常细胞死亡的机会。就内在凋亡途径而言，成功的故事是BCL-2抑制剂Venetoclax的开发，用于治疗某些血液系统恶性疾病。基于在临床前炎症性疾病模型中遗传消除这些途径的益处，抑制促炎细胞死亡程序的抑制剂的识别是一项较新的努力。焦亡的效应器，如NLRP3和GSDMD，以及作为外源性凋亡和坏死途径的介质的RIPK1，是感兴趣的靶点。这些努力的关键是知道不同细胞死亡途径在人类疾病中何时何地被激活。各种形式的细胞死亡的分子标记已被定义，例如，坏死途径的磷酸化RIPK3或磷酸化MLKL，以及炎症小体诱导的焦亡的切割GSDMD，但它们在组织中的存在可能是短暂的，因为噬菌细胞会迅速清除死亡细胞。因此，即使在遗传学告诉我们途径处于活跃状态的临床前模型中，检测途径激活标记也可能具有挑战性。 真正重要的是，阻断一个死亡途径是否会在临床上带来好处。如果焦亡是驱动败血症中失控炎症的引擎，那么针对GSDMD等焦亡的特异性抑制剂应该是有效的。这样的治疗的前景值得进一步调查。类似地，BCL-2抑制剂在临床上的巨大成功激励了开发针对常在固态恶性肿瘤中过度表达的MCL-1和BCL-XL的抑制剂。将这些抑制剂靶向癌细胞将至关重要，以避免对正常健康细胞的靶向毒性，但正在取得进展。例如，与针对肿瘤抗原CD276的特异性抗体结合的BCL-XL抑制剂似乎在保留抗肿瘤活性的同时引起的血小板减少症较少。希望过去50年在细胞死亡研究中取得的进展将继续转化为有意义的救命疗法。 感谢您能耐心读完 原文链接 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.cell.2023.11.044 责编|探索君 排版|探索君 End 往期精选 围观 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