FZD7

已批准药物的靶标的三分之一是G 蛋白偶联受体 (GPCR，)；然而，这些药物仅针对人类 GPCR 库的大约八分之一。GPCR 调节多种关键生理过程，包括器官发育、心血管功能、情绪、认知、多细胞性、细胞运动、免疫反应以及光感、味觉和气味。然而，许多GPCR表达较低，并且很大一部分具有未知的配体和不清楚的信号通路。由于小分子发现面临诸如成药性、选择性和分布等挑战，GPCR 可能更适合单克隆抗体 (mAb) 的靶向。单克隆抗体在这些方面具有更好的类似药物的特性。在此，回顾了之前发现的针对临床和/或开发中的 GPCR 的单克隆抗体，同时回顾了生物物理学方面的考虑因素，这些因素使得 GPCR 的使用极具挑战性，但也为生物成药性提供了机会。 1、背景介绍 人类基因组包含超过 800 个 GPCR，其中近 400 个是嗅觉受体。虽然嗅觉受体的表达主要限于嗅觉上皮，但一些嗅觉受体在其他组织中表达，针对它们可能具有治疗益处。GPCR 根据其序列同源性和进化的系统发育分析进行分类。A 类或视紫红质样家族包含所有嗅觉受体和许多临床靶向受体，包括趋化因子、胺和肽受体。B1 类受体共享一个大的细胞外 N 末端（ 图1 ) 和 B2 类属于粘附 GPCR 家族。粘附 GPCR 因其独特的延伸胞外结构域而成为特别令人感兴趣的抗体靶点。C 类 GPCR 被认为以二聚体的形式发挥作用，T 类味觉受体也是如此。最后，F 类受体包含 Frizzled 和 Smoothened两个调节生物体发育的 GPCR。 图 1. G 蛋白偶联受体胞外拓扑和配体结合模式。 生物制剂具有许多小分子药物无法实现的独特特性。许多生物制剂利用抗体的特性，特别是可以对 Fc（可结晶片段）区域进行改造，以延长药物半衰期并诱导抗体依赖性细胞毒性（或完全避免细胞毒性）。通常，抗体通过血液、组织间隙和淋巴系统扩散，并被排除在中枢神经系统之外。与小分子不同，抗体不会被肾脏清除，而是通过 Fc 受体介导的内吞作用降解。正如我们将在本次综述中详细介绍的那样，生物制剂的另一个优点是抗体可以融合在一起以创建针对两种不同受体的双特异性分子，或针对同一受体上的两个表位的双互补位分子。最后，由于其生物学性质，可以应用合成生物学方法（例如定向进化）来设计具有所需药物样特性的抗体、抗体片段和肽。 尽管 GPCR 具有新型治疗方式的潜力，但对于生物制剂药物的开发仍然难以捉摸。部分原因在于质膜中 GPCR 的结构。GPCR 的细胞外表面遵循常见的拓扑结构（ 图1A)：一个胞外 N 端结构域和三个胞外环。GPCR 的胞外环往往非常短，但大小变化很大，从 5 个氨基酸到超过 170 个氨基酸不等。正位结合口袋是配体结合的地方，位于跨膜结构域内。大多数细胞外环参与配体结合，尽管对于小分子来说，这些相互作用对配体结合的贡献微弱。视紫质是一种对激活状态进行了高度详细研究的 GPCR，其正位结合袋完全被细胞外环封闭，并且配体（视网膜）通过质膜横向扩散。 通常，GPCR 具有较短的 N 端结构域，但许多 GPCR 也具有具有多种功能的扩展 N 端结构域（ 图1B），包括形成双位和变构配体的第二个结合位点。GPCR 的 N 末端通常很容易生产为可溶性肽，并且这些肽经常被用作抗体发现活动的抗原。然而，此类抗体无法结合细胞外环。基于抗体的 GPCR 生物制剂面临的最大挑战之一是生成能够真正与埋藏在跨膜结构域深处的正位结合袋结合的抗体。 表 1. G 蛋白偶联受体靶向的生物类药物。包括激活剂（激动剂和正变构调节剂）、阻断剂（拮抗剂、反向激动剂和负变构调节剂）以及靶向 GPCR 的下一代分子。只有三种分子获得批准（dulaglutide、erenumab 和 mogamulizumab），只有一个分子在 3 期临床阶段（talquetamab）。 2. 针对G蛋白偶联受体的生物制剂的功能活性2.1. 激活 G 蛋白偶联受体的生物制剂 B1 类GPCR 的促胰液素家族已成为治疗糖尿病和肥胖症的激动剂抗体的靶标。临床批准的胰高血糖素样肽 1 受体 (GLP-1 R) 激动剂度拉鲁肽 (Trulicity) 由礼来公司设计，作为 GLP-1 肽与 IgG4 Fc（片段可结晶区）的融合体。已知 IgG4 与 FcRn 受体结合，通过回收延长抗体半衰期，事实上，度拉鲁肽在人体中的血清半衰期超过 12 小时，而艾塞那肽和其他 GLP-1 肽模拟物 的血清半衰期不到 2-5 小时。重要的是，IgG4 不会激活补体级联，从而导致抗体依赖性补体依赖性细胞毒性 (ADCC)。此外，F234A 和 L235A 突变被引入度拉鲁肽的 IgG4 Fc 区，以减少 ADCC 的可能性。总之，度拉鲁肽是一种独特的肽激动剂，与惰性 Fc 区融合以激活 GLP-1 R。此外，Gmax Biopharm 还开发了 glutazumab，一种 GLP-1 肽与抗 GLP-1R 抗体 轻链的融合物。Glutazumab 目前正在进行治疗糖尿病的临床试验。另一种与 GLP-1 肽融合以产生激动作用的抗 GLP-1 R 抗体 Everestmab 已被描述。Everestmab 是一种介于白蛋白结合域和突变 GLP-1 肽之间的双特异性纳米抗体。 同样，最近描述了 GLP-1 肽与GLP-1 R 抗体轻链的融合，称为 TB-059-002。安进 (Amgen) 最近报道了与葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体 (GIPR) 抗体 AMG-133融合的 GLP-1 肽的阳性数据，该抗体可作为双重 GLP-1 R 激动剂/GIPR 拮抗剂。将 GLP-1 肽与抗 GIPR 抗体连接具有延长 GLP-1 肽半衰期的优点，并且被证明可以增强该分子在胰腺中的定位。AMG-133 作为 GLP-1 R 激动剂/GIPR 拮抗剂，最近有报道显示在肥胖方面显示出有效的 1 期临床数据。 与 GLP-1 R、GIPR 和 PTHR1 一样，许多 GPCR 可以具有大的、扩展的细胞外结构域，通常位于其 N 末端（图1）。一种称为促甲状腺素受体或促甲状腺激素受体 (TSHR)的GPCR，具有大量富含亮氨酸的重复细胞外 N 末端结构域，并且已发现自身抗体可通过与该细胞外结构域结合来激活 TSHR，从而导致格雷夫斯病(又名毒性弥漫性甲状腺肿，是一种自身免疫性疾病)。与 TSHR 一样，C 类代谢型谷氨酸受体 (mGluR) 具有较大的 N 末端结构域，远端具有捕蝇草结构，并且已开发出骆驼单域抗体（纳米抗体）DN10 和 DN13 来激活 mGluR。mGluR 受体家族需要胞外域二聚化，DN10 和 DN13 均识别桥接两个二聚化胞外域的独特表位。有趣的是，DN10 识别 mGluR2 同二聚体，而 DN13 与 mGluR2 同二聚体和 mGluR2/mGluR4 异二聚体发生交叉反应。这种独特的药理学被证明可以有效增强 mGluR2 激动剂对神经元和 DN13 小鼠恐惧调节受损的抑制作用。最近，DN10 和 DN13 还被用于使用标记纳米抗体的时间分辨 FRET 传感器在体内检测 mGluR2 同二聚体和 mGluR2/mGluR4 异二聚体。 虽然这些是通过大的 N 末端胞外结构域激活受体的变构调节抗体的例子，但许多 GPCR 的胞外表面积有限，尤其是 A 类视紫红质样 GPCR 家族(图1A）。一些抗体已被证明可以通过直接结合短胞外环并且有时进入正位配体结合袋来激活 GPCR。安进 (Amgen) 最近报道了一种新型 apelin 受体 (APJR，apelin receptor ) 激动剂纳米抗体的设计。抗体 JN241 被发现可以阻断 APJR 激活，并且 CDR3 延伸到正构结合袋中。作者利用结构分析和构效关系信息设计成激动型抗体，通过在 CDR3 区域引入突变，将 JN241 转化为激动剂。此外，β1-肾上腺素能受体 (β1AR) 抗体被证明是偏向激动剂，可激活 G 蛋白，但不激活作为变构调节剂的 β-arrestin 信号传导。 2.2. 阻断 G 蛋白偶联受体的生物制剂 许多抗体已被描述为 G 蛋白偶联受体拮抗剂。促胰液素家族(B1 亚类)受体具有一个大的 N 末端结构域，可与形成 α 螺旋杆的激动剂结合（图1B）。 最近描述了一种针对 GLP-1 R 的竞争性拮抗抗体TB-001-003，GLP-1 R 是 B1 类或促胰液素家族 GPCR。TB-001-003 能够以与肽拮抗剂 avexitide (exendin-(9-39)) 类似的方式从 GLP-1R 中取代 GLP-1。相比之下，GLP-1 R 拮抗剂抗体 Fab 3F52 是针对 GLP-1R 大 N 末端产生的，X 射线晶体学显示可通过变构抑制机制抑制 GLP-1 结合。与 TB-001-003 类似，一种名为 Gipg013 的 GIPR 拮抗剂抗体被证明可以取代 GIPR N 末端结构域的 α 螺旋 GIP 肽。Regeneron 将 crotedumab （另一种称为胰高血糖素受体 (GCGR) 的促胰液素家族 GPCR 拮抗剂抗体）推进到了针对心脏代谢疾病的 1 期临床试验，但进一步的开发已停止。Crotedumab 是使用 GCGR 的人源化小鼠免疫产生的。 REMD Biotherapeutics 已将另一种 GCGR 拮抗剂抗体 volagidemab 推进到治疗糖尿病的 2 期试验。最后，还开发了针对 GCGR 的纳米抗体拮抗剂。一款称为erenumab，用于治疗偏头痛。Erenumab 与降钙素基因相关肽 1 型受体 (CALRL) 结合，并与受体活性修饰蛋白 1 (RAMP1) 接合。CALRL 和 RAMP1 的复合物称为降钙素基因相关肽受体 (CGRPR)，erenumab 是针对 RAMP1 和 CALRL 胞外结构域的不对称 Fc 融合而产生的。 其他具有大 N 末端结构域的受体已成为抗体拮抗剂的靶标。OncoMed报道 vantictumab可阻断 Frizzled 受体家族 (FZD)，该受体具有 FZD1、FZD2、FZD5、FZD7 和 FZD8 的交叉反应拮抗剂活性，并阻断 Wnt 信号传导以发挥抗肿瘤活性。FZD 受体拥有一个大的 N 末端，其远端含有富含半胱氨酸的结构域。富含亮氨酸的重复 GPCR (LGR) 家族通过 FZD 增强 Wnt 信号传导，具有较大的 N 末端，LGR5 是 Kyowa Kirin 开发的名为 KM4056的拮抗剂抗体的目标。 已经描述了许多针对 A 类视紫红质 GPCR 家族的拮抗剂抗体。FDA 批准了 getagozumab的 IND 许可，getagozumab 是一种内皮素受体 A (ETA) 拮抗剂抗体，另一种名为 AG8的 ETA 拮抗剂抗体最近也得到了表征。MedImmune 描述了 Fpro0165的发现和优化，Fpro0165 是一种甲酰基肽受体 1 (FPR1) 拮抗剂抗体，通过将抗体与受体的结构对接，该抗体被证明可以与受体的细胞外环 2 结合。此外，一系列合成纳米抗体，包括称为 AT118i4 的优化抗体，已被描述为血管紧张素 II 1 型受体 (AT1R) 的拮抗剂。使用胆囊收缩素 B 受体 (CCK-BR) 胞外结构域片段免疫的小鼠文库中的核糖体展示来发现一种有效的拮抗抗体，称为 scFv 77-2。scFv 77-2 在神经性疼痛的临床前模型中有效。 GPCR 拮抗剂抗体已针对趋化因子受体（称为 CCR 和 CXCR）大量开发，以便在不同疾病状态下调节免疫系统。趋化因子受体属于 A 类视紫红质受体家族，具有有限的细胞外表面积。Mogamulizumab 是一种临床批准用于治疗白血病的 CCR4 抗体，但其作用机制是诱导抗原依赖性细胞毒性 (ADCC) 杀死肿瘤细胞，而不是直接拮抗 CCR4。另一种 CCR4 拮抗剂抗体已被描述为阻断 CCR4 功能，随后通过腺相关病毒介导的抗体表达递送至肿瘤。针对 CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 的抗体拮抗剂已被大力开发用于治疗癌症，其中包括 LY2624587，一种有效的拮抗剂。此外，ulocuplumab 已被开发并被证明是 CXCR4 内源配体 CXCL12 的竞争性拮抗剂。其他 CXCR4 抗体已在正构结合袋和细胞外环 中靶向并显示可竞争 CXCL12。CXCL12 与 CXCR4 以及 CXCR7 结合，已描述了针对 CXCR4 和 CXCR7 的抑制性纳米抗体。CXCR2 是另一种重要的趋化因子受体，在癌症中失调。一种新型双互补位抗体被描述为将两种效力较弱的纳米抗体结合在一起，从而产生一种强反向激动剂分子。此外，已经使用噬菌体展示合成抗体库描述了针对 CXCR2 的单克隆抗体。CCR5 是一种经过充分验证的 HIV-1 侵入共受体，并且已经开发出大量抗体来阻断 CCR5 信号传导和 HIV-1 结合。最后，已经描述了 CCR2、CCR7 和 CCR9的抗体拮抗剂。病毒性 GPCR 也已成为人们感兴趣的治疗靶点，例如由巨细胞病毒编码的病毒趋化因子受体 US28。US28 的过度表达与胶质母细胞瘤有关，并且已经描述了 US28 的拮抗剂抗体可用于胶质母细胞瘤的潜在治疗。 2.3. 靶向 G 蛋白偶联受体的下一代生物制剂 Mogamulizumab 是一种临床批准的治疗白血病的 CCR4 抗体。Kyowa Kirin 首先开发了 mogamulizumab，其作用机制是诱导 ADCC，从而消耗 CCR4 表达细胞。Mogamulizumab 被设计为减少岩藻糖基化，从而增强 ADCC。与 CCR4 类似，CCR8 是 ADCC 耗竭的目标，因为 CCR8 特异性表达于肿瘤微环境中的免疫抑制调节性 T 细胞 (Treg)。一种名为 Nb-Fc1b 的新型四价纳米抗体靶向表达 CCR8 的 Tregs 并抑制肿瘤生长。吉利德已将 GS-1811 推进到实体瘤的 1 期试验，以在表达 CCR8 的 Tregs 中触发 ADCC。同样，百时美施贵宝 (Bristol-Myers Squibb) 有一种名为 BMS-986340 的抗 CCR8 抗体，处于实体瘤的 1 期试验中。然而，正如 CCR8 敲除小鼠中所证明的那样，CCR8 的靶向需要 ADCC 来消除 Tregs，因为阻断 CCR8 信号传导对 Treg 介导的免疫抑制没有影响。 许多分子利用双特异性结合，其中抗体的每个臂结合不同的抗原。最近通过筛选源自患者的类器官中的双特异性抗体库，发现了一种名为 MCLA-158 的 LGR5 和 EGFR 双特异性抗体。BsNb PX4 是一种双特异性抗体，由两种纳米抗体组成，一种靶向 CXCR4，另一种靶向 PD-L1。在对 PD-L1 抑制具有抗性的肿瘤类型中，BsNb PX4 比单独使用每个纳米抗体治疗小鼠模型更有效。Talquetamab 是一种双特异性抗体，处于多发性骨髓瘤 3 期临床试验中，靶向 CD3 和 GPRC5D，该靶点在多发性骨髓瘤细胞上高度表达。此外，还描述了 CXCR5 和 CD3 双特异性抗体。 抗体药物偶联物 (ADC) 已针对许多 GPCR 靶标开发。对于 CXCR4，使用非天然氨基酸掺入将表面残基引入抗 CXCR4 抗体中，从而可以与 auristatin（一种用于治疗癌症的抗有丝分裂剂）结合。后来，针对称为 ADC 713 的抗体，通过增加药物与抗体比率 (DAR) 改进了该策略，从而降低了毒性。此外，一种名为达沙替尼的 Lck 抑制剂与 CXCR4 抗体偶联，以抑制自身免疫性疾病中的 T 细胞功能（因为 Lck 表达仅限于 T 细胞）。最后，描述了一种名为 4M5.3X4 的分子，它是一种针对 HIV 蛋白的小干扰 RNA，与 CXCR4 纳米抗体缀合，可抑制 CXCR4 阳性 T 淋巴细胞中的 HIV 复制。 CAR T 细胞疗法是细胞重编程的一种高级形式，可将免疫细胞靶向肿瘤以治疗癌症。孤儿 GPRC5D 已被证明在骨髓瘤癌细胞中过度表达，并已成为称为 MCARH109 的嵌合抗原 T (CAR-T) 细胞疗法的靶标。溶瘤疱疹病毒 (oHSV) 被设计为通过将病毒与称为 oHSV/Nb-gD 的 CXCR4 纳米抗体融合来靶向 CXCR4+ 胶质母细胞瘤细胞。oHSV/Nb-gD 还可以诱导 TRAIL 的表达，TRAIL 是一种 TNF 家族配体，可诱导 CXCR4 阳性胶质母细胞瘤细胞凋亡，从而减少肿瘤生长。 3. G蛋白偶联受体生物制剂发现的机遇与挑战3.1. 许多 G 蛋白偶联受体都是孤儿 约 400 个非嗅觉 GPCR 中大约有 30% 是孤儿，没有已知的配体，信号转导特性知之甚少。如上所述，许多针对 GPCR 的抗体起到变构或正构激活剂的作用。因此，抗体配体可用于去孤儿化 GPCR 信号通路，使用诸如 TRUPATH、APEX或 PRESTO-TANGO等技术。例如，许多分子针对 CAR T 细胞的 GPRC5D，因为 GPRC5D 在骨髓瘤癌细胞中高表达。然而，目前对 GPRC5D 的配体或信号转导机制知之甚少。因此，GPRC5D 抗体可用于通过 APEX 标记来分析信号传导，从而为内源配体的去孤儿化提供筛选平台。3.2. 如何实现 G 蛋白偶联受体偏向性的激动 GPCR 能够通过各种 G 蛋白家族成员和 β-arrestins 传递多效性信号，在这种情况下，有可能使用所谓的偏向激动剂来靶向有益途径。正如 APJR 抗体 JN241-9 所证明的那样，可以通过进行点突变来改变抗体配体的功能特征（在这种情况下拮抗剂转变为激动剂）。因此，诱变可以用作生物制剂基于结构的药物发现的平台。此外，通过对每个 GPCR 信号通路进行并行测试，有可能捕获通过治疗有益的通路发出信号的偏向抗体配体，并避免副作用。DNA 的快速且可扩展的合成使得强大且多样化的抗体库的开发成为可能，这使得能够发现能够与 GPCR 中的神秘位点结合的抗体，例如正构配体结合口袋（ 图2A）。DNA 合成还允许对正配体结合抗体进行大规模诱变，这将是设计针对 GPCR 的偏向激动剂抗体的策略。此外，与受体胞内侧结合的纳米抗体可用于稳定不同的受体构象，从而加速药物发现策略。 图 2. G 蛋白偶联受体生物制剂发现的机遇和挑战。A. 抗体可以靶向配体结合（正构）位点或 GPCR 的其他变构区域。 B. 抗体可以稳定 GPCR 构象，从而实现复杂的药理学（正负调节剂、反向激动剂等） C. 抗体可以激活 GPCR 下游的多种信号，并被设计为选择性激活某些途径。 D. 抗体可以破坏同一细胞（反式）或顺式（不同细胞中）的蛋白质相互作用，包括阻止更高级 GPCR 寡聚物的形成。 这里详细介绍了一些抗体影响 GPCR 信号传导的分子机制，并将它们分为两大类：正构或变构结合剂（图2A）。此外，这些抗体能够稳定 GPCR 构象（图2B），这是驱动受体下游功能选择性的一种方法（图2C)。3.3. G 蛋白偶联受体的细胞类型特异性表达 作为药物，抗体具有细胞类型特异性靶向的独特特性。抗体不是全身作用并立即代谢，而是倾向于在具有高浓度抗原的组织中积累。GPCR 通常在特定组织类型中以非常低的水平表达。大规模数据集，例如人类蛋白质图谱 和人类细胞图谱正在阐明受体特异性表达谱。最近一个特别令人兴奋的例子是趋化因子受体 CCR8，它在肿瘤微环境中的 Tregs 中表达受限。因此，利用高亲和力抗体，可以特异性地消除肿瘤微环境中的免疫抑制性 CCR8 阳性 Tregs。这是将 GPCR 独特的表达谱与抗体疗法的特性相结合的一个例子。3.4. 细胞外 G 蛋白偶联受体相互作用 最后，由于其高亲和力、通过亲合力结合和大尺寸，抗体疗法特别适合破坏蛋白质/蛋白质相互作用。最近，人类基因组中的一些细胞外蛋白质的细胞外蛋白质/蛋白质相互作用图谱（相互作用组学）受到关注。检查点抑制剂疗法会破坏细胞外蛋白质/蛋白质相互作用，而 GPCR 的细胞外相互作用才刚刚开始被绘制出来。调节细胞外与抗体的相互作用将为进一步了解 GPCR 的生物学及其广泛的 N 末端结构域和其他蛋白质之间涉及的各种相互作用提供信息。 10.1080/17460441.2023.2193389 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCR)，也被称为七次跨膜受体，是真核生物中最大的细胞表面受体家族[1]。GPCR是最成功的治疗靶点之一，占已批准药物的近35%。  01  GPCR是ADC新晋靶点集中在临床前阶段人体中约有800个GPCR，根据氨基酸序列相似性将它们分为六大类：A类-视紫红质样受体，B类-分泌素受体家族，C类-代谢型谷氨酸受体，D类-真菌交配信息素受体，E类-环腺苷酸受体，F类-卷曲受体[2]。在人体中只发现其中四类-A、B、C和F类。靶向GPCR的药物主要包括小分子、天然产物、多肽、抗体等，其中小分子类药物占比大于90%，抗体类药物占比不足2%[4]。因为针对GPCR的抗体筛选困难。除了GPCR本身蛋白体外表达困难、GPCR蛋白胞外区较小之外，其核心功能区域在物种间非常保守，常规的免疫方式难以获得针对功能区域的抗体应答。但随着晶体学、抗体筛选等方面取得的重大进展，包括抗体类药物在内的生物制剂数量正在逐年攀升[5]。目前，有3种FDA批准的靶向GPCR或其相关配体的单克隆抗体用于非肿瘤适应证：抗CCR4单抗（mogamulizumab）、抗降钙素基因相关肽（CGRP）1型受体单克隆抗体（erenumab）和抗CGRP单抗（eptinezumab）。截至2019年的数据，估计至少有146个GPCR靶向的mAb处于发现阶段，另有45个处于临床试验阶段，目前估计更多。随着基于GPCR抗体的疗法不断扩大并进入市场，获批药物的形式可能会超越mAb，包括bsAb、纳米抗体、ADC等。毫无疑问，GPCR也开始成为ADC的新晋靶点，开始扩展ADC的应用前景。表1：目前有7款在临床和临床前阶段的GPCR ADC表2：靶向GPCR的ADC安全性研究   02  CXCR4CXCR4属于A类GPCR，其在细胞迁移、增殖、造血和组织再生方面发挥重要功能。由于其在许多血液癌和实体瘤类型中高表达，因此CXCR4成为有吸引力的肿瘤治疗靶点[6]。第一个靶向CXCR4的ADC由美国斯克利普斯研究所（Scripps Research Institute）Peter G. Schultz教授组开发，研究其对CXCR4+转移性肿瘤的治疗效果[7]。使用不可裂解的亲水性Linker-Payload (MMAF-PEG4-ONH2)与非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸(p-acetylphenylalanine, pAcF)进行位点特异性偶联成肟生成高亲和力的抗CXCR4 ADC (IgGX-MMAF)，DAR=2 (图2A)。MMAF含有末端羧基，细胞渗透性极小，几乎无旁观者效应，可降低对非复制造血干细胞的脱靶细胞毒性。利用高表达CXCR4的人骨肉瘤细胞系(SJSA-1-met)评估体外疗效，经IgGX-MMAF处理后，SJSA-1-met细胞活力显著降低(IC50=0.08 nM)，而CXCR4 mAb处理没有明显抑制效果(图2B)；同时，IgGX-MMAF对CXCR4阴性细胞无抑制效果。体内功效研究表明，使用CXCR4 mAb或IgGX-MMAF进行肺部肿瘤治疗，IgGX-MMAF在第8天时几乎无法检测到肿瘤，而CXCR4 mAb治疗的肿瘤与对照组相当(图2C)。目前，尚未报告该ADC的后续疗效或安全性研究。 图2. IgGX-MMAF ADC的构建及其体内外活性评价除上述研究外，该课题组还开发了另一款靶向CXCR4的ADC的药物[8]。利用自身前期研究成果牛抗体(BLV1H12)[9]中超长的重链CDR3移植到Trastuzumab中，替换Trastuzumab CDR3H中的原始Trp99-Met107环肽，得到人源化抗体HLCX (图3A)[9]。经流式检测发现HLCX对CXCR4的选择性和亲和力并未受到太大影响；同时，HLCX也具有较高内化效率。利用随机偶联的方式经两步反应引入含有不同Linker (可切割/不可切割)的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)抑制剂-Dasatinib (图3B)，DAR≈3，由此产生的ADC可抑制T细胞受体(TCR)介导的T细胞活化和细胞因子表达，EC50较低，且对细胞活力的影响极小(图3C)。该ADC的成功构建可能会带来一类新型的选择性免疫抑制药物，其安全性得到提高，并将ADC策略扩展到肿瘤学以外的适应症，用于激酶抑制剂的靶向递送。 图3. 含Dasatinib ADC的构建及其对细胞因子分泌的影响辉瑞(Pfizer)科研人员为改善治疗指数降低靶向CXCR4 ADC的脱靶毒性，筛选了含有不同Linker、Payload、DAR、mAb亲和力和Fc形式的ADC[10]。经实验评价，Payload选择Aur0131，其对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，但对外周血单核细胞(PBMC)没有毒性。候选ADC在NHL、ALL、MM和AML等癌细胞异种移植模型中进行活性测试，数据表明活性较优的ADC由较低亲和力的mAb组成，其Fc介导的效应功能也相应降低。ADC 713通过mAbs上的赖氨酸残基与不可裂解的Linker-Payload进行随机偶联而构建(AmPEG6C2-Aur0131; DAR=4，图4A)。针对CXCR4 mAb耐药的MOLP-8 MM细胞异种移植模型，ADC 713 (0.15 mg/kg)可导致肿瘤消退并显著延长生存期(图4B)。此外，该ADC也可提高化疗药吉西他滨在CXCR4+患者来源的非小细胞肺癌异种移植模型中的疗效(图4C)。目前，该款ADC仍处在临床前研究。 图4. ADC 713偶联位点、Linker-Payload及其活性评价  03  CXCR5CXCR5是趋化因子CXCL13的受体，在大多数B细胞恶性肿瘤中表达，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)[11]。对复发性DLBCL患者肿瘤活检的评估表明，CXCR5染色仍然很高，这表明它可能是探索非霍奇金淋巴瘤(NHL)治疗的相关靶点。BAY-924是由拜耳(Bayer)研发的一款新型首创ADC，由纺锤体驱动蛋白抑制剂(Kinesin Spindle Protein inhibitor, KSPi)与人源化抗CXCR5 IgG1抗体组成[12]。值得注意的是，研究人员对ADC的结构进行针对性优化，使其代谢模式与KSPi作用模式相匹配，并能够最大程度地提高肿瘤细胞内的有效载荷。SPR显示该抗体与CXCR5具有高亲和力(2.5 nM)，通过流式细胞术测量不同CXCR5+淋巴瘤细胞系中ADC的亲和力为0.8-10 nM。在体外实验中，BAY 924在不同CXCR5表达水平的肿瘤细胞系中具有高选择性和抗增殖活性(<0.03-2 nM; IC50)。在包括CXCR5+ MCL REC-1细胞在内的多种细胞系中观察到Ab的有效内化和溶酶体共定位。在体内实验中，BAY-924在多种CXCR5+淋巴瘤模型中具有高度活性；与肝脏、脾脏和肾脏等器官相比，肿瘤中的Payload有特定的积累，血浆中几乎检测不到。在大尺寸肿瘤(～500 mm3) REC-1模型中，以10 mg/kg、Q7D静脉注射2次BAY-924后可观察到持久的肿瘤消退。在恶性ABC DLBCL模型OCI-LY1中，单次注射10 mg/kg BAY-924可诱导10/10小鼠完全缓解(直至治疗后第95天)。在此模型中，头对头比较显示，BAY-924与利妥昔单抗、苯达莫司汀、来那度胺相比具有更优异的活性。鉴于其独特的结构，使得BAY-924具有高稳定性；同时HSPi可被困在肿瘤细胞内而不会发生细胞渗透性游离，预计BAY-924将显示出良好的安全性。总体而言，这些结果支持BAY-924作为治疗CXCR5+非霍奇金淋巴瘤的创新方法的进一步开发。  04  LGR5LGR5属于A类GPCR，活化经典Wnt/β-catenin信号传导[13]并介导细胞间粘附[14]。LGR5在许多胃肠道(GI)癌症中高表达，正常组织低表达，并标记肿瘤起始癌症干细胞(CSC)，使其成为有利的治疗靶点。UTHealth分子医学研究所的研究人员开发了靶向LGR5的ADC，该ADC由大鼠-人嵌合LGR5 mAb与MMAE偶联组成[15]。利用两种不同Linker (MC-VC-PAB vs MP)进行ADC构建，二者均与链间半胱氨酸残基偶联(DAR=4，图5A)，并显示能够以高亲和力特异性结合LGR5、内化并转运至溶酶体，与母体mAb相当。在LGR5高表达的LoVo (结直肠)和AGS (胃癌)癌细胞中，具有可裂解Linker的ADC比具有不可裂解Linker的ADC表现出11倍的效力(IC50分别为2–4.5 nM与47–51nM)，因此含可裂解Linker的ADC被选为体内研究的先导药物(图5B)，且该ADC对LGR5阴性癌细胞系没有影响，证明其靶标特异性。 在LoVo CRC异种移植模型中，含可裂解Linker的ADC治疗可导致肿瘤消除，并且没有观察到脱靶毒性(图5C)。 图5. 靶向LGR5 ADC的构建及其活性测试尽管尚未报道该ADC的进一步开发情况，但该组研究人员于2021年开发了靶向LGR5及其相关受体LGR4和LGR6的肽体药物偶联物(peptibody drug conjugate, PDC)[16]。该肽体包含RSPO4的弗林蛋白酶结构域，结合LGR4-6，但不增强Wnt信号传导，与抗体Fc区融合。利用微生物转谷氨酰胺酶进行位点特异性的偶联，引入含有可裂解(VC) Linker的MMAE或Duocarmycin SA (DMSA) (图6A)。在LGR4/5高LoVo细胞中，两种PDC的效力比抗LGR5-MMAE ADC强约3倍(图6B)，LoVo异种移植模型中的PDC治疗导致肿瘤显著消退并延长生存期(图6C)。该类PDC进一步的体内功效和耐受性研究尚未有报道。 图6. 肽体药物偶联物的构建示意图及其活性评价Genentech报道了两款抗LGR5 ADC，一款是通过链间半胱氨酸将蛋白酶可切割的MC-VC-PAB-MMAE与人源化LGR5 mAb偶联所得，DAR=3.5；另一款是通过重链上工程化的半胱氨酸将可酸水解的NMS818与人源化LGR5 mAb偶联所得，DAR=2[17] (图7A)。NMS818中含有PNU159682，其是一种插入DNA的蒽环类药物，可抑制拓扑异构酶II。MMAE在分裂细胞中表现出高效力，而PNU15982在亚纳摩尔浓度下表现出更高的效力，并在非分裂细胞中表现出细胞杀伤作用。这表明抗LGR5-NMS818可能具有更广泛的细胞杀伤范围，但也可能会增加正常组织毒性。该两款ADC在LGR5高表达D5124原代人胰腺癌异种移植模型中表现出相似的效力，导致肿瘤停滞或消退；裸抗和同种型对照抗体对肿瘤生长均没有显著影响，对照组ADC可导致肿瘤有一定程度的消退，但与靶向LGR5的ADC相比效果要差得多(图7B)。抗LGR5-NMS818显示出严重的肠道和肝脏毒性，而抗LGR5-MMAE治疗的小鼠则没有这种毒性，表明Linker-Payload的选择对于ADC耐受性至关重要。在APCmin/+; KRASLSL-G12D/+; Villin-Cre基因工程小鼠肠道肿瘤发生模型中进一步评估抗LGR5-MMAE的活性，长期治疗可显著提高生存率并缩小肿瘤体积(图7C)；然而，与对照组相比，肿瘤总数没有变化。这与MMAE已被证明对胃肠道肿瘤相对无效有关。因此研究其他Linker-Payload组合将会更有意义。与其他小组的研究相结合，这些发现展现出靶向LGR5治疗不同类型癌症的潜力。 图7.不同载荷ADC的活性评价  05  FZD7FZD7是一种Frizzled家族GPCR (F类)，可介导经典的β-catenin和非经典c-Jun激酶依赖性Wnt信号通路[18]。FZD7在卵巢癌中高表达，表达量与患者的中位生存期密切相关[19]，这表明它可能是ADC开发的一个极有吸引力的靶点。加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的研究人员开发了一款抗FZD7的ADC-Septuximab vedotin，由嵌合人-小鼠FZD7 mAb通过可裂解MC-VC-PABC-MMAE偶联，DAR=4 (图8A)。与FZD7敲除(KO)的(OVCAR3和MA-148 FZD7-KO; IC50=25–60 nM)卵巢癌细胞系相比，Septuximab vedotin在FZD7+ (MA-148和PA-1; IC50=5 nM)中的效力增强。使用表达荧光素酶的MA-148、PA-1和MA-148 FZD7-KO异种移植模型测试其体内活性，MA-148和PA-1肿瘤能够得到明显消退，而在MA-148 FZD7-KO中未观察到显著的肿瘤生长抑制(图8B)。由于Septuximab vedotin特异性结合人FZD7，因此使用CRISPR-Cas9对小鼠进行工程改造，将Fzd7上的mAb表位从小鼠序列转换为人序列(Fzd7hF7/hF7)，未观察到对小肠隐窝/绒毛结构的明显毒性或损伤。此外，该ADC避免了全局Wnt抑制相关的脱靶效应。这些初步结果使该ADC在PDX和免疫活性模型中的进一步测试合理化，以评估其临床潜力。 图8. Septuximab vedotin模式图及其体外活性测试  06  CTR降钙素受体(CTR)属于B类GPCR，广泛表达于成人组织中，尤其是骨骼中。CTR在恶性神经胶质瘤和神经胶质瘤干细胞的致死性脑肿瘤胶质母细胞瘤的活检中广泛表达。墨尔本大学和莫纳什大学的研究人员开发了一款靶向CTR的ADC，该ADC由mAb2C4抗体通过赖氨酸末端ε-氨基与可裂解Linker-Payload (OSu-Glu-VC-PAB-MMAE)偶联组成，DAR=7[20]。此外，还利用SPDP linker构建了含有Dianthin-30[His6]或Gelonin的抗体偶联物。使用高度CTR阳性神经胶质瘤SB2b和JK2细胞以及U87MG GBM细胞评估抗CTR-MMAE活性，在SO1861 (一种促进溶酶体逃逸的三萜糖苷)存在情况下，抗CTR-MMAE的效力增加10倍(EC50=25.1 vs. 2.5 nM，表1)。关于此款ADC的体内研究和未来开发均未有报道。表1. 免疫毒素与ADC在SB2b、U87MG和JK2细胞系中的活性比较  07  GPR56GPR56是粘附类GPCR家族的成员，在大脑发育、免疫调节、HSC生成和肿瘤发生中具有重要功能。GPR56在多种肿瘤类型中高表达，包括结直肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[21]。GRP56的缺失可以抑制结直肠肿瘤的生长并使癌细胞对标准化疗敏感。GPR56在肿瘤发生中的潜在作用以及在各种肿瘤类型中的高表达为靶向GPR56 ADC的开发提供了理论依据。UTHealth分子医学研究所的科研人员基于已有10C7 mAb开发靶向GPR56的ADC[22]。10C7以高亲和力与GPR56的胞外结构域结合，并增强下游Src-Fak信号传导，被用于治疗CRC，特别是微卫星稳定亚型(MSS)[23]。为了确定最佳的ADC有效负载，研究人员筛选了一系列细胞毒素，探究其在CRC细胞中的效力。根据实验结果，选择含有可裂解Linker (VC)的DNA烷化剂DMSA与10C7通过链间半胱氨酸残基偶联，DAR=3.54 (图9A)。在具有不同GPR56表达水平的CRC细胞系中测试发现，在GPR56高表达CRC细胞系(SW620、SW403和HT-29；IC50=3.7–29.4 nM)中观察到有效的细胞毒性，而对GPR56阴性CRC细胞系没有影响；对照ADC没有诱导显著的抑制活性，表明该杀伤机制是GPR56依赖性(图9B)。同时，10C7 ADC在转移性直肠癌的GPR56+患者来源的肿瘤类器官(PDO)模型中进行活性研究，结果表明与对照ADC的抑制活性相比，10C7 ADC几乎可以完全杀死肿瘤细胞(图9C)。此外，10C7 ADC在MSS CRC细胞异种移植模型中显示出显著的抗肿瘤功效(图9D)。在免疫功能正常的小鼠中进行的初步安全性研究并未显示任何明显的毒性迹象，但由于小鼠和人之间10C7结合表位的序列差异，靶标介导的毒性可能被低估。 图9.GPR56 (10C7) ADC的构建及其体内外活性评价  08  CCR2CCR2在肿瘤浸润性骨髓细胞(包括肿瘤相关巨噬细胞)表达，并通过限制 CD8+ T细胞浸润来促进免疫逃逸。TAK-500[24]是一款免疫刺激抗体偶联物(Immune-stimulating antibody conjugate, ISAC)，由三部分组成：基于TAK-676的STING激动剂作为Payload (目前正在进行Ⅰ期临床评估[NCT04420884、NCT04879849])、IgG1抗CCR2抗体和一个自降解的含有马来酰亚胺的蛋白酶可切割的多肽Linker。TAK-500具有三种可能的作用机制：激活IFN反应、将抑制性肿瘤内CCR2+细胞重编程为炎症表型，以及阻断抑制性肿瘤相关巨噬细胞募集。因此，TAK-500有潜力克服CPI耐药性，用于难治性和免疫排除或荒芜的肿瘤(Immunologically excluded or deserted tumors)治疗。目前，TAK-500已进入Ⅰ期临床试验(NCT05070247, Recruiting)[25]，联合或不联合Pembrolizumab用于患有特定局部晚期或转移性实体瘤的成人患者的治疗。  09  CCR7CCR7属于A类GPCR，在肿瘤细胞迁移、转移和免疫细胞招募中发挥重要作用。CCR7在许多癌症类型中高表达，并与较差的预后相关，使其成为癌症治疗中极具吸引力的靶点。诺华(Novartis)开发了一款靶向CCR7的ADC-JBH492，用于治疗CLL和NHL[26]。JBH492由IgG1抗体组成，通过可裂解Linker与Ravtansine (DM4)偶联(细节暂未批露)。体外研究表明，与正常免疫细胞相比，JBH492优先结合CCR7高表达的肿瘤细胞，并通过DM4介导的细胞毒性和抑制配体诱导的CCR7信号传导发挥作用。在弥漫性大B细胞淋巴瘤PDX模型中JBH492实现部分或完全逆转，在非人类灵长类动物中没有明显的毒性或循环免疫细胞群的变化。JBH492单药疗法目前正在进行I期临床试验(NCT04240704, Recruiting)，用于治疗复发/难治性CLL和NHL患者，同时评估其安全性。  10 GPR20GPR20是一种在胃肠道间质瘤(GIST)中过表达的A类GPCR孤儿受体，大多数成人GIST是由原癌基因受体酪氨酸激酶(KIT)或血小板衍生生长因子受体α (PDGFRA)的激活突变驱动的。目前，唯一批准的GIST疗法是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，但肿瘤经常在KIT中产生继发性耐药突变，亟需更有效的治疗方案来克服这种耐药性。第一三共(Daiichi Sankyo)开发了DS-6157a，将GPR20 mAb通过高度稳定的组织蛋白酶可裂解的Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG)四肽Linker与Deruxtecan (DXd)偶联，DAR=8 (图10A)[27]。在过表达重组GPR20 (GIST-T1/GPR20)的GIST-T1细胞和GPR20-NCI-N87胃癌细胞中DS-6157a仅在GIST-T1/GPR20细胞中表现出活性(IC50=156 ng/mL)，证明其对GPR20的特异性(图10B)。在GIST-T1异种移植模型中，使用DS-6157a治疗的两种模型中均观察到显著的TGI；值得注意的是，在GIST-T1异种移植模型中，DS-6157a导致肿瘤消退在治疗终止后持续8周；GPR20 mAb和对照ADC均不影响肿瘤生长，表明TGI依赖于GPR20和DXd (图10C)。重要的是，无论KIT突变状态如何，DS-6157a都能阻止PDX肿瘤生长，而TKI治疗的疗效因获得性或内在耐药性而变化(图10D)。 图10. DS-6157a的构建、活性测试及其克服耐药性的试验安全性研究显示DS-6157a对猴子的毒性极小或轻微，最高非严重毒性剂量为30 mg/kg (人体等效剂量=9.6 mg/kg)，以上数据支持DS-6157a进入临床试验(起始剂量=1.6 mg/kg)。评估DS-6157a单药疗法的安全性、有效性和药代动力学的I期临床试验于2020年5月开始(NCT04276415)。不幸的是，几乎所有患者都经历了轻度至重度治疗引起的和相关的不良事件，其中出现一例治疗相关性死亡(肝功能衰竭)，因此该临床试验被第一三共终止。  11  GPRC5DGPRC5D属于是GPCR孤儿受体，在原代多发性骨髓瘤细胞表面高表达，在正常组织的表达仅限于免疫赦免性的毛囊区域。GPRC5D的过表达与多发性骨髓瘤患者的不良预后和肿瘤负荷有关，这种关联使其成为治疗多发性骨髓瘤的潜在候选靶点。国内礼新医药利用其自有专利技术平台-LX-ADC™-开发了一种新型抗GPRC5D ADC：LM-305[28]，由抗GPRC5D单克隆抗体、蛋白酶可降解Linker和MMAE组成。体外研究表明，LM-305以高亲和力与GPRC5D过表达细胞系和GPRC5D内源表达的MM细胞结合，并呈剂量依赖性。它可以被GPRC5D表达细胞有效内化，并进一步在溶酶体中裂解。当与MM肿瘤细胞(NCI-H929和MM.1R)共培养时，LM-305显示出有效的细胞毒性，IC50值范围为0.1-0.3 nM。体内肿瘤异种移植模型表明，LM-305治疗可对荷瘤小鼠的肿瘤生长产生剂量依赖性抑制；同时，LM-305在GPRC5D高表达MM CDX模型中以3mg/kg 的剂量表现出完全缓解(CR)。此外，LM-305 在动物研究中表现出良好的安全性。基于以上可喜的数据，2023年5月12日，礼新医药已与阿斯利康就临床前阶段的LM-305项目达成全球独家授权协议。根据协议条款，阿斯利康将获得LM-305的研究、开发和商业化的独家全球许可[29]。礼新医药将有资格获得包括首付款在内共计5500万美元的近期付款，以及最高达5.45亿美元的潜在开发和商业里程碑付款，外加全球净销售额的分级特许权使用费。此次授权(Licence-Out)，又是我国本土创新药企昂首挺胸进入全球化“深海”的典范。目前，LM-305已经入Ⅰ/Ⅱ临床试验(NCT05647512; Not yet recruiting)，用于复发性或难治性多发性骨髓瘤(RRMM)和其他浆细胞疾病的治疗，期待能够有好的临床试验结果。  12  US28US28 (四种人巨细胞病毒编码的病毒GPCR之一)已在多种肿瘤中检测到，包括神经胶质瘤、结直肠癌和前列腺癌等；US28可激活致癌信号通路，并在胶质母细胞瘤等肿瘤的进展中发挥肿瘤调节作用[30]。Vrije Universiteit Amsterdam和Utrecht University的科研人员开发了一种靶向US28的纳米抗体偶联物(VUN100-PS)，利用已有的US28-Nb[31]通过其C端未配对的半胱氨酸与水溶性光敏剂Mal-IRDye700DX偶联获得，不影响Nb的结合亲和力(图11)[32]。该偶联物可选择性杀死2D培养物以及3D球体中表达US28的胶质母细胞瘤细胞。这些数据表明靶向GPCR纳米抗体在光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)领域的潜力。 图11. 纳米抗体光动力疗法选择性杀死表达病毒GPCR的胶质母细胞瘤细胞  13  多款靶向GPCR的ADC被暂停除上述处于临床前/临床试验的ADC外，还有多款靶向GPCR的ADC终止研究或出于无进展状态(表2)[33, 34]。表2. 临床试验终止或无进展的ADC药物ADC是增长最快的癌症治疗药物之一，已证明其具有良好的抗肿瘤功效，并已获得FDA批准用于治疗多种实体瘤和血液恶性肿瘤。目前生物制药行业和学术界正在为改善癌症治疗做出广泛努力，有理由推断，针对GPCR的ADC数量在未来几年将继续增加，GPCR超家族将会成为ADC开发的热门靶点。免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表个人立场，亦不代表个人支持或反对文中观点。本文并非治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。刍荛之作，若有纰漏/不足，欢迎各位批评指正(dyc21@mails.tsinghua.edu.cn)，谢谢！ 主要参考文献 1. Hauser, A.S., et al., Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(12): p. 829-842.2. Congreve, M., et al., Impact of GPCR Structures on Drug Discovery. Cell, 2020. 181(1): p. 81-91.3. Hutchings, C.J., et al., Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov, 2017. 16(9): p. 787-810.4. https://gpcrdb.org.5. Yang, D., et al., G protein-coupled receptors: structure-and function-based drug discovery. Signal transduction and targeted therapy, 2021. 6(1): p. 7.6. Buck, A.K., et al., CXCR4-targeted theranostics in oncology. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2022. 49(12): p. 4133-4144.7. Kularatne, S.A., et al., A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angew Chem Int Ed Engl, 2014. 53(44): p. 11863-7.8. Wang, R.E., et al., An immunosuppressive antibody-drug conjugate. J Am Chem Soc, 2015. 137(9): p. 3229-32.9. Liu, T., et al., Rational design of CXCR4 specific antibodies with elongated CDRs. J Am Chem Soc, 2014. 136(30): p. 10557-60.10. Costa, M.J., et al., Optimal design, anti-tumour efficacy and tolerability of anti-CXCR4 antibody drug conjugates. Scientific Reports, 2019. 9(1).11. Wang, B., et al., CXCL13-CXCR5 axis: Regulation in inflammatory diseases and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2022. 1877(5): p. 188799.12. Johannes, S., et al., Preclinical characterization of BAY-924, a first in class ADC targeting CXCR5-positive B-cell malignancies, with a KSP inhibitor as novel payload. Cancer Research, 2019. 79(13_Supplement): p. 4825-4825.13. Park, S., et al., Unlike LGR4, LGR5 potentiates Wnt–β-catenin signaling without sequestering E3 ligases. Science signaling, 2020. 13(660): p. eaaz4051.14. Carmon, K.S., et al., LGR5 receptor promotes cell–cell adhesion in stem cells and colon cancer cells via the IQGAP1–Rac1 pathway. Journal of Biological Chemistry, 2017. 292(36): p. 14989-15001.15. Gong, X., et al., LGR5-Targeted Antibody-Drug Conjugate Eradicates Gastrointestinal Tumors and Prevents Recurrence. Mol Cancer Ther, 2016. 15(7): p. 1580-90.16. Cui, J., et al., Drug Conjugates of Antagonistic R-Spondin 4 Mutant for Simultaneous Targeting of Leucine-Rich Repeat-Containing G Protein-Coupled Receptors 4/5/6 for Cancer Treatment. J Med Chem, 2021. 64(17): p. 12572-12581.17. Junttila, M.R., et al., Targeting LGR5+ cells with an antibody-drug conjugate for the treatment of colon cancer. Sci Transl Med, 2015. 7(314): p. 314ra186.18. Zeng, C.M., Z. 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Morphogens are the secreted molecules that pattern embryonic tissues. These molecules are important not only for the embryo during development, but also for the adult during tissue repair. However, the way these morphogens are distributed to ensure patterning occurs is still not fully understood. Using a combination of experiments and mathematical modeling, researchers learned more about the role morphogens play in tissue patterning. Their results are relevant to medical applications, such as drug design. Morphogens are molecules that travel from biological cell to cell to pattern tissues in the embryo. These molecules are important not only for the embryo during development, but also for the adult during tissue repair. However, the way these morphogens are distributed to ensure patterning occurs is still not fully understood. Using a combination of experiments and mathematical modeling, a research team from the University of Tokyo and their international collaborators has learned more about the role morphogens play in tissue patterning. The results are relevant to medical applications, such as drug design. The team's findings are published in the journal eLife. The Wnt morphogen has emerged as a key regulator of heart development in vertebrates. These Wnt proteins are molecules that play an important role in cell development. However, it is still generally unclear to scientists exactly how Wnt regulates heart development. There are differences among the vertebrate classes, as well as redundancy in some species. However, scientists can study how Wnt regulates heart development in the Xenopus, an aquatic frog that is native to sub-Saharan Africa. The Xenopus, with its lungs and three-chamber heart, is cost-effective and useful to scientists in their study of human diseases. In Xenopus heart development, scientists have already established that the Wnt6 morphogen is sent out by the epidermis, those outer layers of cells that make up the skin, to pattern the cardiogenic mesoderm, which is the group of cells in the embryo that will form the heart. From this patterning, a relatively thin pericardium (the membrane around the heart) and a broad myocardium (the heart's muscular tissue) develop. Scientists are still working to better understand how the Wnt6 morphogen distribution is regulated to ensure reproducible positioning of the pericardium and myocardium in the cardiogenic mesoderm. "It is still unclear how reproducible patterning can be achieved with diffusing molecules, especially when that patterning concerns differentiation of thin tissues." said Takayoshi Yamamoto, an assistant professor at the University of Tokyo and the first author and corresponding on the paper. Scientists do know that in early embryo development, the range of Wnt8 morphogen signaling is precisely regulated heparan sulfate and secreted Wnt binding proteins, including Frzb (which is also known as sFRP3). Heparan sulfate is a carbohydrate that is important is embryo development. Wnt signaling is one of the main processes by which tissue takes shape during the development of the embryo. The research team wondered whether mechanisms similar to those that operate in early embryos also regulate distribution of Wnt6 morphogen in the cardiogenic mesoderm. The Wnt receptor, Frizzled7, is essential for heart development. The expression of Frizzled7 is increased by Wnt signaling in the development of the nervous system in the Xenopus and in the development of human embryonic carcinoma cells, but there are no such reports in heart development. So the research team focused their study to analyze the way Wnt signaling occurs in the development of the heart, focusing on the extracellular components -- the Frizzled7 cell-surface receptor, sFRP1 (an inhibitor of Wnt6 that can also travel from cell to cell) and heparan sulfate. "With a combination of experiments and mathematical modeling, this receptor-feedback appears essential to shape a steep gradient of Wnt signaling. In addition, computer simulation revealed that this feedback imparts robustness against variations of Wnt ligand production and allows the system to reach a steady state quickly," said Yamamoto. Wnt6 and sFRP1 molecules not only regulate normal heart development in the embryo, but also regulate repair and regeneration after heart muscle injury, such as in the case of a myocardial infarction, or heart attack. "Our findings will be relevant to medical applications, for example, for drug design, since cell-surface molecules such as Frizzled or a specific modification of heparan sulfate or even the secreted molecule sFRP1, generally provide better drug targets than molecules inside cells. To reveal the precise regulation of morphogens and to consider medical applications, regulatory mechanisms of these components must be investigated further," said Yamamoto. The research was conducted in collaboration with researchers at the University of Aberdeen in the U.K.