Unc-51-like kinase (ULK) family

摘要：随着对生物类似单克隆抗体（mAbs）需求的不断增加，开发稳定高产的细胞系并缩短筛选时间变得至关重要 。本文综述了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系在单克隆抗体制备方面的研究进展，涵盖载体工程、宿主细胞工程、筛选与扩增策略、转染方法以及工艺优化等多个方面。这些进展旨在提高单克隆抗体的生产效率和质量，以满足医疗和制药行业的需求。通过综合运用这些技术，有望实现更高效、稳定的单克隆抗体制备，推动生物制药领域的发展。一、引言单克隆抗体在治疗癌症、自身免疫性疾病等多种严重和慢性疾病方面发挥着重要作用，自 1992 年首个治疗性单克隆抗体获批以来，已有众多单克隆抗体药物上市，应用范围不断扩大 。细胞系开发是生产重组治疗性蛋白质的关键步骤，其中 CHO 细胞系因其能够进行准确的糖基化修饰、可在悬浮培养中大规模生长且符合监管要求，成为生产生物类似药的 “黄金标准” 表达系统 。然而，现有生产平台存在生长特性不稳定、产量不一致和质量属性差异等问题，因此生物制药行业一直在探索新的、更高效的方法来提升治疗性蛋白质的生产能力（原文 Fig. 1，展示细胞系开发的工作流程示意图，帮助读者理解从基因构建到筛选高产细胞系的整个过程）。二、载体工程策略载体工程对细胞系的发展至关重要，它通过对载体元件的修饰来精确调控宿主细胞的基因表达 。启动子和增强子的优化：启动子和增强子在基因转录过程中起着关键作用 。多种启动子被广泛应用，如病毒来源的 CMV - IE、SV40，以及真核生物的 PGK、EF - 1 等 。其中，hCMVp 因能有效促进转基因表达而被频繁使用，但病毒启动子易受 DNA 甲基化影响而导致表达降低 。相比之下，内源性启动子如 CHEF - 1 可降低沉默和应激反应的风险，而合成启动子如 SCP1 则能大幅提高转录速率 。此外，像 Cumate 基因开关这样的诱导系统，在血清 - 无 CHO 细胞中能实现基于腺病毒或慢病毒载体的瞬时转基因表达，且具有可调节性，在需要快速生产少量蛋白质时具有优势 。染色质修饰元件的作用：基因表达还受到整合位点的影响，随机整合可能导致基因表达不稳定 。染色质修饰元件（CMEs）可分为两类：一类是使染色质处于转录开放状态的元件，如 UCOEs 和 LCRs；另一类是防止异染色质标记扩散的元件，如绝缘子、STAR 元件和 S/MARs 。UCOEs 能维持染色质开放，提高转基因表达水平并抵抗基因沉默；S/MARs 则通过与核基质或支架结合，保护转基因免受表观遗传沉默，但它的活性相对较弱且作用机制尚未完全明确 。（原文 Fig. 3，展示 UCOEs 保护基因免受表观遗传沉默的机制示意图，直观呈现 UCOEs 如何维持基因的开放状态以促进转录）密码子优化和信号序列的应用：密码子优化通过利用同义突变提高蛋白质表达，不同细胞中转运 RNA 的丰度差异会影响 mRNA 的稳定性和二级结构，进而影响蛋白质表达 。研究发现，基于密码子使用的优化可使 mAb 在 CHO 和人类细胞中的表达提高 1.5 - 4 倍 。此外，合适的信号肽对于蛋白质的转运和折叠至关重要，使用人类白蛋白产生的信号肽可使稳定产生 mAb 的 CHO 细胞的平均比生产率提高一倍以上 。三、宿主细胞工程为满足对治疗性蛋白质不断增长的需求，研究人员对 CHO 细胞进行了工程改造 。调控细胞死亡：细胞死亡会影响细胞培养和生物工艺的产量，通过调控细胞凋亡和自噬相关基因可以延长细胞培养的可持续性 。例如，过表达 BCL - 2 和 BCL - XL 等抗凋亡蛋白可以抑制细胞凋亡，提高细胞活力和 mAb 产量；利用 siRNA 沉默促凋亡蛋白或通过 CRISPR - Cas9 技术敲除相关基因，也能达到类似效果 。此外，敲除自噬起始关键基因 ULK1 可使蛋白质表达提高三倍，表明自噬与蛋白质表达之间存在复杂的相互作用（插入原文 Fig. 4，展示防止细胞凋亡工程的策略示意图，清晰呈现通过基因修饰抑制细胞凋亡的原理和方法）。优化宿主细胞代谢途径：宿主细胞的代谢活动会产生乳酸、氨等废物，影响细胞生长和产物产量 。通过控制培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的水平，或对相关代谢途径进行工程改造，可以减少这些有害代谢产物的积累 。例如，敲除 LDHA 基因可降低乳酸生成，同时提高重组蛋白产量；下调葡萄糖转运蛋白 GLUT5 可减少葡萄糖消耗，降低乳酸和氨的积累 。此外，探索替代代谢途径，如修饰半乳糖代谢途径，也有助于优化细胞代谢，提高产物合成（原文 Fig. 5，展示宿主细胞中乳酸代谢调控的示意图，帮助读者理解通过基因沉默减少乳酸生成的机制）。调节细胞周期：调节哺乳动物细胞的生长和分裂方式，有助于提高细胞密度和产量 。细胞周期抑制剂，如 p21CIP1 和 p27KIP1，以及干扰素调节因子 - 1（IRF - 1）等，可以用于平衡细胞生长和产物形成 。将细胞生长和生物治疗产物的生产阶段分离，是生物制药领域日益青睐的策略，通过控制细胞增殖和基因表达，优化细胞资源分配，提高生长特性和难表达蛋白的产量 。工程化糖基化：糖基化模式对单克隆抗体的行为和疗效至关重要，异常的糖基化可能导致免疫反应和抗体有效性降低 。研究人员通过多种策略来微调治疗性抗体的糖基化模式，包括操纵特定基因以诱导更接近人类的糖基化模式，控制 N - 糖基化途径，以及抑制特定糖基化途径等 。例如，利用 CRISPR - Cas 技术敲除 FUT8 基因，可以降低 IgG 的岩藻糖基化水平，增强抗体的疗效 。四、选择与扩增在转染合适的表达质粒后，需要对生产宿主细胞系施加选择压力，以获得稳定的细胞池，并实现基因的扩增 。基于 DHFR 的平台：使用 DHFR 表达载体结合 DHFR 缺陷的 CHO 细胞是常用的基因转移和扩增方法 。通过对 MTX 的抗性筛选，可以获得 DHFR 基因和目标基因共扩增的细胞，从而提高蛋白质表达水平 。然而，这种方法可能导致载体的多串联重复不稳定，影响产量 。近年来，一些改进策略如衰减 DHFR 选择标记的表达，结合位点特异性整合等，有助于提高蛋白质生产效率和产量 。基于 GS 的平台：谷氨酸合成酶（GS）选择方法也广泛应用于 CHO 细胞 。通过在培养基中添加 MSX，只有表达 GS 选择标记的细胞才能存活，从而实现细胞系的筛选和基因扩增 。敲除内源性 GS 基因可以提高细胞对 MSX 的敏感性，增加高产细胞的频率 。与 DHFR 平台相比，GS 平台所需的扩增时间更短 。此外，新的表达系统如\(OSCAR ^{TM}\)，通过利用部分失活的 minigene 载体和 HPRT 酶，实现了一步法的基因选择和扩增，具有成本低、效率高的优势，但仍需进一步研究其适用性 。高通量选择和筛选系统：转染后的细胞群体是异质的，需要进行单细胞克隆以获得遗传和表型一致的细胞系 。常用的单细胞分离方法包括有限稀释法、荧光激活细胞分选（FACS）和 ClonePix 系统等 。有限稀释法是经典的低通量方法，FACS 则可实现高通量单细胞分离，而 ClonePix 系统等基于图像技术的高通量系统，能够更高效地筛选和分析多个克隆，提高克隆的准确性和可重复性 。五、转染策略将表达载体导入宿主细胞的转染策略是产品细胞系开发的关键因素之一 。非病毒转染技术因其被监管机构认可用于生产供人类使用的蛋白质而受到青睐 。阳离子聚合物（如聚乙烯亚胺 PEI）是常用的经济且非细胞毒性的转染试剂，可实现近 100% 的转染效率，但与部分生长培养基成分不相容 。电穿孔技术通过短暂的电脉冲在细胞膜上形成小孔，实现高效转染，且适用于多种细胞类型，微流体电穿孔设备可实现大规模转染 。核转染技术是对传统电穿孔的改进，能够将 DNA 直接传递到细胞核，针对不同细胞类型有特定的缓冲液，以最大化转染效率并减少细胞死亡，在研究中应用广泛 。六、工艺优化利用哺乳动物细胞培养生产生物制品时，工艺优化对提高产量和质量至关重要（原文 Fig. 7，展示影响工艺优化的各种因素，包括培养基和补料优化、生物反应器设计和工艺参数优化、蛋白质纯化优化等，帮助读者全面理解工艺优化的范畴）。培养基和补料优化：培养基和补料的优化在提高生物制品产量方面起着重要作用 。先进的技术如动态补料方式、基于计算机生物模拟（“数字孪生”）以及代谢途径的基因组规模通量分析等，有助于确定最佳的培养基成分 。通过实验设计（DoE）等统计方法，可以减少培养基优化所需的时间和资源，提高整体工作效率 。生物反应器设计和工艺参数优化：生物反应器的类型多样，包括细胞培养袋、搅拌式生物反应器等，用于不同的生产目的 。近年来，一次性生物反应器因其便利性和符合 GMP 要求而成为生产生物制品的首选 。优化生物反应器的工艺参数，如温度、pH、溶解氧浓度和搅拌速率等，对确保生产高质量的治疗性蛋白质至关重要 。数字生物制造和人工智能、机器学习等技术的应用，可以实现对生物过程的实时监测和控制，提高生产效率和产品质量的稳定性 。蛋白质纯化优化：选择合适的蛋白质纯化方法（如色谱法、过滤法）并优化其工艺参数，能够提高产物的纯度和产量 。通过优化色谱条件等手段，可以有效去除杂质，提高单克隆抗体的质量 。过程监测和控制：实施适当的分析方法，如质谱、HPLC 和 ELISA 等，对生产过程进行实时监测和控制，能够及时调整工艺条件，确保生产过程的稳定性和产品质量的一致性 。数据分析和机器学习：利用先进的数据分析和机器学习算法，对过程数据进行分析，可以预测产品产量和质量，优化生物过程参数 。例如，通过对大量数据的分析，建立预测模型，实现对抗体糖基化的准确预测，为细胞系选择和代谢工程提供指导 。七、结论与展望近年来，CHO 细胞在单克隆抗体制备方面取得了显著进展，这得益于载体工程、宿主细胞工程、选择与扩增策略、转染策略、转录因子工程以及培养基优化等多方面的持续发展 。这些进展使得大规模生产高质量的单克隆抗体成为可能，推动了生物制药行业的发展 。未来，细胞系开发在单克隆抗体生产中的前景十分广阔 。机器学习、人工智能和自动化等新技术的融入，将在优化细胞系和加速生物制造过程中发挥更重要的作用 。例如，单细胞组学技术有望深入了解细胞异质性，为选择最佳性能的细胞和优化生物过程提供新方法；合成生物学方法则可能设计出具有特定功能和特性的细胞，生产出性能更优、成本更低的生物制品 。持续推进 CHO 细胞系开发对于满足日益增长的生物制药需求、改善患者治疗效果至关重要 。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

导读前几节我们介绍了RTKs（第一、二期）、MAPK通路（第三期），今天我们介绍另一个在RTKs下游、与MAPK平行的另一个重要通路—PI3K通路。01PI3K的组成与激活方式磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶活性的同时，也具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶活性。PI3K可分为3类，其中研究最广泛的为I类PI3K, 此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基p85（由PIK3R1基因编码）和一个催化亚基p110（由PIK3CA基因编码）组成。催化亚基共有α、β、δ、γ四种类型，其中，α、β、δ类对应p85α, p85β或p55调节亚基；而γ类对应p101和p84/87调节亚基。调节亚基具有SH2结构域，能够识别RTKs的胞内激酶结构域（TK），并引发催化亚基p110的激活。图 1. PI3K的激活方式PI3K的激活方式一共有4种。如上图所示，当胰岛素家族生长因子激活相应的RTKs时，p85可以通过IRS1等接头蛋白（Adapter Protein）间接被接活（a）；此外，其他家族生长因子及RTKs结合时，p85也可以直接识别TK结构域（b）；上一期中我们提到的RAS蛋白在RAS-GTP的形式下，也可以直接活化PI3K 的催化亚基p110（c）。Raf和PI3K均可被RAS调节是MAPK通路与PI3K通路存在交叉的主要原因；此外，γ型PI3K催化亚基还可以被某些G蛋白偶联受体激活（d）。02P13K催化功能图 2. PI3K催化的反应PI3K激活后能够催化PIP2的3位羟基磷酸化生成PIP3，从而进一步促进下游通路；恰恰相反，细胞中另一种酶PTEN则能催化这个反应的逆过程，并对PI3K下游的通路产生抑制作用。PIP3生成后，可以充当第二信使，同时招募PDK1和AKT蛋白到质膜上，使PDK1磷酸化AKT蛋白的308号位的苏氨酸（T308），导致AKT部分活化。被活化的AKT将进一步激活下游调控通路。03PI3k-AKT 通路图 3. PI3K-AKT及下游蛋白AKT 是一类 AGC 家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要包含3 个结构域：PH 结构域（对 PIP3 有亲和力，对与胞膜的结合至关重要）、催化结构域、调节结构域。AKT作为一种原癌基因，在多种细胞过程中发挥关键作用，如葡萄糖代谢，细胞凋亡，细胞增殖，转录和细胞迁移；PI3K/AKT 信号通路失调见于多种人类疾病，包括癌症、糖尿病、心血管疾病和神经疾病。 AKT下游作用的底物分类繁多，结合上图我们对主要的底物进行概述：1、TSC2TSC复合体（结节性硬化症复合体）包含三个亚基：TSC1，TSC2以及TBC1D7，能够负调控mTORC1复合体的活性，起到肿瘤抑制的作用。产生这种作用的主要原理是：TSC2包含的GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，简称GAP）结构域，将GTP形式的RHEB（RAS家族的一种小G蛋白）水解为GDP形式的RHEB，导致RHEB失活，不能激活mTORC1的激酶活性，从而抑制细胞生长。而AKT诱导TSC2蛋白(tuberin) 的939位Ser和 1462位Thr磷酸化后，活性抑制，导致mTOR通路反而被激活；2、BADBAD（Bcl2相关的细胞死亡激动剂）能够正向调节线粒体的凋亡，AKT磷酸化该蛋白后，BAD活性抑制；3、MDM2AKT能够通过磷酸化p53的泛素连接酶—MDM2而使其激活，从而抑制p53产生的细胞周期阻滞与凋亡。4、p21 和 p27    CDK抑制因子p21和p27是两个重要的细胞周期调节因子，在正常细胞 DNA受损伤时 , 被P53诱导产生，抑制DNA复制，增强DNA修复，起到抑癌作用。而AKT磷酸化抑制这些CDK抑制因子后能够抑制其活性。5、GSK3βGSK3β（糖原合成酶激酶3β）是一种在进化上非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与肝糖代谢，在Wnt 通路中扮演重要的角色。正常情况下GSK3β可以磷酸化β-catenin使其经蛋白酶体降解， AKT磷酸化GSK3β后，导致GSK3β失活，不能再磷酸化β-catenin，致使β-Catenin在胞浆内大量聚集，从而进入细胞核并激活与细胞分裂和生长调控相关的基因（如c-myc和Cyclin D1等）。6、IKK ( IκB kinase )IKK ( IκB kinase ) 被AKT磷酸化激活，IKK 进一步磷酸化抑制能够抑制NF-kβ途径的转录因子IκB（注意断句....），最终结果是：AKT正向调控了NF-kβ途径，从而对细胞生存、增殖、侵袭、血管生成和化疗耐药产生影响。 7、WEE1    CDK1抑制激酶—WEE1能够被磷酸化抑制，对有丝分裂产生影响。8、ASK1ASK1 （凋亡信号调节激酶1）是一种能够激活JNK信号通路（MAPK通路的一种，详情见第二期）的MAPKKK，与凋亡诱导，促凋亡和内皮网应激(ERS)有关，AKT磷酸化ASK1后，导致其活性抑制。9、FOXOFOXO是一种凋亡诱导转录因子，AKT磷酸化FOXO后导致其在细胞内重新定位并失去转录活性。综上所述，我们可以看出：AKT所产生的效应最终结果大多引起细胞增殖及避免凋亡。04PI3K-AKT-mTOR 通路及TORC复合物前面我们已经说过了，AKT能够通过抑制TSC2，间接导致RHEB激活mTOR增强。mTOR全称叫做哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin， mTOR）。mTOR是一类丝/苏氨酸激酶，C端与磷脂酰肌醇激酶（PI3K）催化域同源，但是却不具备酯酶激酶的活性，而具有Ser/Thr蛋白激酶活性。mTOR 能够形成两种复合物：TORC1和TORC2。图 4. PI3K-AKT-mTOR通路除了能被AKT激活外，mTOR还能根据细胞环境的能量与营养情况被激活或抑制。如上图所示，当能量不足（AMP/ATP 比例增高）、缺氧时， TSC2、TSC1形成复合体增强，抑制mTOR复合物形成。当溶酶体氨基酸过量时，H+-vATP酶能够激活带有鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs)的蛋白复合物Ragulator，从而促进TORC1的形成。图 5. TORC1与TORC2前面已经提到，mTOR有两种复合物：mTORC1 和mTORC2。mTORC1 由 mTOR、mTOR 调节相关蛋白 Raptor、MLST8 和非核心组分 PRAS40、DEPTOR 组成。mTORC2 由 mTOR、mTOR 帕霉素不敏感伴侣 RICTOR、MLST8 和 mSIN1 组成。这两种复合物的主要区别就在于：结合蛋白是Raptor还是Rictor以及相关蛋白是PRAS40还是mSIN1。其中，前者的区别主要决定TORC1对雷帕霉素敏感，而TORC2对雷帕霉素不敏感；而后者的区别则在于：PRAS40是AKT的底物，而mSIN1是MAPK的底物。从功能上来说，TORC2功能较为简单，它能够磷酸化AKT从而对mTOR产生正反馈，促进mTOR进一步活化（与前面PDK1的部分活化呼应）。TORC1则不同，能够继续磷酸化下游多种底物，调控细胞生存、增殖、蛋白质合成、脂质生成、血管生成和自噬等生物过程。05TORC1 下游底物与效应图 6. TORC1下游底物及效应TORC1 与蛋白质合成真核起始因子4E（eIF4E） 是一种帽结合蛋白，可以特异性地识别mRNA的5'端的帽子结构，在真核翻译的起始过程中发挥重要作用。其阻遏蛋白4EBP1磷酸化缺失时，eIF4E 不能被释放出来用于招募核糖体用于激活翻译过程。mTOR通过磷酸化4EBP1，解除其对EIF4E的抑制作用，从而促进翻译和蛋白质的合成。TORC1还可以先磷酸化激活下游AGC家族核糖体S6激酶（S6K1），S6K1可以磷酸化激活核糖体S6蛋白（RPS6）、PDK1（AKT上游激动蛋白）、MDM2（p53抑制因子）、转录调节因子EEF2、接头蛋白IRS等，磷酸化抑制促凋亡蛋白BAD。最终的效应就是：避免细胞凋亡、促进蛋白质合成。TORC1 与脂质合成TORC1除了促进蛋白质合成外，还可以磷酸化激活STAT3 (信号转导与转录激活因子3)促进细胞增殖；激活SREBPs(固醇调节元件结合蛋白)和PPARα和γ(过氧化物酶体增殖物激活受体) 促进脂质合成。TORC1 与血管生成TORC1能够通过激活HIF1α促进血管生成，而HIF1α也可以间接地激活TSC2，从而对TORC产生负调控作用。TORC1与自噬TORC1通过磷酸化抑制下游底物ULK1等自噬相关蛋白，抑制自噬过程。综上所述，TORC1通过磷酸化激活/抑制一系列底物，直接/间接提高了蛋白质和脂质的合成、促进细胞增殖，引起细胞和组织的生长。06PI3K-AKT-mTOR 与肿瘤从上文我们可知，PI3K 通路可以通过多种途径避免细胞凋亡，促进其存活及增殖。PI3K/AKT信号通路在肿瘤发生中广泛的激活，尤其是PIK3CA，PIK3R1，PTEN，AKT等基因存在高频突变（其中PIK3CA基因在大约36%的乳腺癌中存在突变），与肿瘤发生、发展以及耐药密切相关。目前该通路的主要涉及的突变有：1、PIK3CA突变PIK3CA是肿瘤中编码 PI3K 蛋白 P110 亚基的基因，具有较高的突变比例。在前列腺癌、乳腺癌等多种癌症中，超过 10%以上的病例存在PIK3CA 突变。其中，激活型突变占80%以上。激活点突变可以让 PI3K 蛋白不依赖上游信号，而持续保持激活状态。PIK3CA 突变被认为是 EGFR-TKI 治疗产生耐药的潜在原因之一。2、PTEN突变前文我们提到， 抑癌基因PTEN能够产生与PI3K相反的效应，因此其突变也导致癌症发展。在子宫内膜癌、脑癌、皮肤癌和前列腺癌中， 10%以上的病例存在 PTEN 基因突变。3、AKT突变AKT基因家族包括：AKT1，AKT2，AKT3。AKT 在肿瘤中最常见的突变形式，是激活点突变和基因拷贝数异常增加。在乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌中，有相当高比例的病例。图 7. 针对PI3K-AKT-mTOR通路设计的药物如上图所示，目前针对PI3K、AKT以及mTORC靶点的药物研发均有一些进展。参考文献：[1] Robert, Jacques. Textbook of Cell Signalling in Cancer [M]. Springer International Publishing, 2015.[2]  Wagener C , Stocking C , O. Müller. Cancer Signaling - From Molecular Biology to Targeted Therapy[M]. 2017.[3] Amanda H . Cancer cell signalling[M]. Wiley Blackwell, 2014.部分素材来源于网络，侵删。预告第五期：细胞因子通路；第六期：TGFβ通路；原创不易，欢迎发现“分享”和“点赞”

在日常生活中，塑料制品随处可见，从外卖餐盒到快递包装，从购物袋到一次性餐具。但你或许不知道，这些塑料制品在环境中逐渐分解，会产生微小的塑料颗粒——微塑料（MPs）。它们广泛存在于空气、水、土壤，甚至我们的食物中，对人类健康构成潜在威胁。Ecotoxicol Environ Saf上的一项研究Polystyrene microplastics induce nephrotoxicity through DDIT4-mediated autophagy and apoptosis就聚焦于微塑料对肾脏的影响，揭示了令人担忧的真相。微塑料是直径小于5毫米的塑料碎片，化学性质稳定，可通过食物链进入生物体内，甚至穿越生物屏障，在人体血液、胎盘和粪便中都能发现其踪迹。其中，聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）因在包装材料和一次性产品中广泛应用，备受关注。肾脏作为重要的排泄器官，血流量大、过滤功能强，是微塑料暴露的主要靶器官之一。以往研究虽表明PS-MPs会对肾脏造成损伤，但具体机制尚不明确，且传统研究模型无法完全模拟人类肾脏的复杂结构和功能。此次研究中，科研人员利用人类多能干细胞（hiPSCs）衍生的3D肾脏类器官模型和肾单位祖细胞（NPCs），探究1 μm聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）对肾脏发育和功能的毒性影响，重点研究相关分子通路。研究人员先对PS-MPs的形态和粒径分布进行表征，确认其为均匀球形、表面光滑，平均直径约1μm，适合后续实验。接着，将肾脏类器官暴露于不同浓度（1.25 – 10 μg/mL）的PS-MPs中24小时。图 1. 聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）的表征结果令人担忧。Imaris 3D建模显示，PS-MPs能进入肾脏类器官细胞内。而且，类器官大小随PS-MPs浓度增加而减小，肾单位特异性标记物受到干扰，近端小管（LTL）和远端小管（CDH1）信号减弱，足细胞（PODXL）表达升高。细胞活力检测发现，2.5 μg/mL PS-MPs处理24小时后，细胞存活率为80%，该浓度因此被选用于后续实验。RNA测序结果表明，PS-MPs处理后，共检测到761个差异表达基因，其中269个上调，492个下调。KEGG通路分析显示，与人类疾病、细胞过程和环境信息处理相关的通路显著富集，尤其是自噬和凋亡通路。GO分析发现，参与氧化应激、DNA损伤、缺氧等应激反应的基因也明显富集。这意味着PS-MPs可能通过激活这些通路引发肾毒性。图 2. 聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）在肾脏类器官中的内化及肾毒性进一步研究发现，PS-MPs确实诱导了肾脏自噬。TEM分析观察到PS-MP处理的肾脏类器官中存在自噬溶酶体，基因和蛋白质表达分析也证实，自噬相关基因（LC3、ULK1、ATG3）上调，p62下调，LC3-II/LC3-I比值升高。图 3. 聚苯乙烯微塑料（PS-MP）暴露后的RNA测序转录组分析研究还证实，DNA损伤诱导转录4（DDIT4）在PS-MP诱导的自噬中起关键作用。敲低DDIT4后，LC3-II水平降低，p62表达恢复，自噬体形成减少，mTOR活性恢复。这表明DDIT4通过抑制mTOR通路介导PS-MP诱导的自噬。除自噬外，PS-MPs还诱导了NPCs凋亡。TEM分析显示，PS-MP处理的细胞出现染色质浓缩等凋亡特征。RT-qPCR和Western blot分析表明，促凋亡标记物（BAX、CAS3、CAS9）上调，抗凋亡标记物BCL2下调。敲低DDIT4后，cleaved caspase-3和PARP水平显著降低，证实DDIT4是PS-MPs诱导NPCs凋亡的关键调节因子。图 4. 肾脏中DDIT4诱导自噬和凋亡的机制图这项研究揭示，聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）通过上调DDIT4，抑制mTOR通路，诱导肾单位祖细胞（NPCs）自噬和凋亡，进而损害人类肾脏发育。这一发现为微塑料诱导的肾毒性分子机制提供了新见解。虽然日常生活中我们难以完全避免接触微塑料，但了解其危害后，我们可以尽量减少一次性塑料制品的使用，做好垃圾分类，降低微塑料污染风险。未来，希望有更多研究关注微塑料对人体健康的影响，让我们能更好地保护自己和家人的健康。参考文献：Wang Y, Zhang A, Liang T, et al. Polystyrene microplastics induce nephrotoxicity through DDIT4-mediated autophagy and apoptosis. Ecotoxicol Environ Saf. Published online March 22, 2025. doi:10.1016/j.ecoenv.2025.118066本文仅用于学术分享，转载请注明出处。若有侵权，请联系微信：bioonSir 删除或修改！点击下方「阅读原文」，前往生物谷官网查询更多生物相关资讯~