YAP1

在这项研究中，研究人员发现，一种名为YAP的蛋白质在胆汁酸代谢中扮演着关键角色，YAP是Hippo信号通路的核心组成部分，这一通路在调控细胞生长和癌症发展中起着至关重要的作用。 作为机体最大的内脏器官，肝脏不仅负责解毒、代谢，还承担着一个鲜为人知却至关重要的任务，即生产胆汁。胆汁是由机体肝脏分泌的的一种特殊液体，其不仅能帮助机体消化脂肪，还在调节代谢过程中发挥着类似激素的作用。然而，当胆汁酸（胆汁的主要成分）的平衡被打破时，可能会引发一系列严重的肝脏疾病，甚至包括肝细胞癌（HCC）等疾病，肝细胞癌是一种最常见的肝癌类型。 随着现代生活方式的改变，肝脏疾病的发生率逐年上升，尤其是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和肝细胞癌（HCC）。近年来科学家们逐渐认识到，胆汁酸代谢的紊乱可能是这些疾病的关键因素之一；胆汁酸不仅能帮助消化脂肪，还在调节肝脏代谢、免疫反应和细胞增殖中发挥重要作用；然而当其平衡被打破时就会引发肝脏损伤、炎症，甚至癌变。 近日，一篇发表在国际杂志Nature Communications上题为“Disrupting bile acid metabolism by suppressing Fxr causes hepatocellular carcinoma induced by YAP activation”的研究报告中，来自哈佛大学等机构的科学家们发表了一项开创性的研究，揭示了胆汁酸代谢失衡与肝癌之间的直接关联。 在这项研究中，研究人员发现，一种名为YAP的蛋白质在胆汁酸代谢中扮演着关键角色，YAP是Hippo信号通路的核心组成部分，这一通路在调控细胞生长和癌症发展中起着至关重要的作用。YAP的激活会抑制一种名为FXR（法尼酯X受体）的核受体，而FXR是维持胆汁酸平衡的关键调节器，当YAP被激活时就会干扰FXR的功能，从而导致胆汁酸的过度产生和积累，进而引发肝脏纤维化、炎症，最终可能导致肝癌。研究人员通过一系列实验模型验证了这一发现，他们指出，通过激活FXR并抑制YAP的抑制功能（比如通过抑制HDAC1），或者增加胆汁酸外排蛋白BSEP的表达就能有效减少肝脏损伤和癌症进展，这些发现不仅揭示了YAP在胆汁酸代谢中的意外作用，还为开发新的肝癌治疗方法提供了潜在的靶点。 肝细胞中YAP的激活可引起严重的胆汁淤积 本文研究揭示了YAP与FXR之间的复杂相互作用，以及这种相互作用如何影响胆汁酸代谢和肝癌的发生。研究人员发现，YAP的激活不仅能直接抑制FXR的转录活性，还会通过招募组蛋白去乙酰化酶HDAC1来进一步增强这种抑制作用，这种抑制作用就会导致胆汁酸的过度积累进而激活YAP从而形成一个恶性循环，并加速肝癌的发展。此外，研究者还发现，通过药物激活FXR或抑制HDAC1就能打破这一恶性循环并减少胆汁酸的积累，从而减轻肝脏损伤和癌症进展，这些发现不仅为肝癌的治疗提供了新的思路，也为其它与胆汁酸代谢紊乱相关的疾病（如非酒精性脂肪性肝病）提供了潜在的治疗策略。 YAP与FXR之间的相互作用为肝癌的治疗带来了新的希望，通过激活FXR或抑制YAP的抑制功能，科学家们有望开发出新型药物来打破胆汁酸的恶性循环，从而减轻肝脏损伤和癌症进展。 研究者Yang教授表示，这一发现不仅为肝癌治疗提供了新的靶点，也为研究YAP在代谢调控中的作用提供了新的视角。随着对胆汁酸代谢和YAP功能的进一步研究，科学家们有望开发出更有效的治疗方法从而改善肝癌患者的预后。这项研究不仅揭示了肝脏疾病的复杂机制，也为未来的医学研究和临床应用提供了新的方向。正如Yang教授所说：“这一发现让我们看到了通过激活FXR来治疗肝癌的希望，这非常令人兴奋。”（生物谷Bioon.com） 参考文献： Liu, Y., Zhu, J., Jin, Y. et al. Disrupting bile acid metabolism by suppressing Fxr causes hepatocellular carcinoma induced by YAP activation. Nat Commun 16, 3583 (2025). doi：10.1038/s41467-025-58809-z

OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。在《Nature》期刊上发表的这篇文章中，日本的科研团队探讨了通过激活Wnt和STAT3信号通路来实现人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。这项研究解决了肝细胞在体外培养中扩增能力与功能保持之间的权衡问题。研究发现，YAP的激活促进了肝细胞的增殖，但会导致其向胆管导管谱系的分化。相反，OSM诱导的STAT3激活不仅促进了肝细胞的增殖，还抑制了导管化生，维持了肝细胞的特性。移植到小鼠体内的肝细胞类器官能够重新构建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在去除培养基中的特定因子后形成具有胆管网络的绳索状结构，表现出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。该研究为开发针对人类肝脏疾病的治疗策略提供了新的途径。01研究背景首先，肝脏是人体内一个关键的代谢器官，负责多种重要的生物化学过程，如葡萄糖生成、糖原合成、尿素循环、脂质生成、胆汁酸合成、蛋白质生产和药物代谢。这些功能的严重损害会导致肝功能衰竭，通常需要进行肝移植。近年来，随着抗病毒治疗的进步，肝功能衰竭的病因从病毒性肝炎转向与现代生活方式相关的代谢性肝病，特别是代谢功能障碍相关的脂肪性肝病。这种疾病如果不加以治疗，会进展为脂肪性肝炎、肝硬化和肝功能衰竭。然而，由于缺乏能够真实再现肝脏代谢功能的人类肝细胞模型，预防代谢性肝病的成功率有限。其次，体外分离的肝细胞在增殖能力上迅速下降，与其在体内的强大再生能力形成对比。现有的培养方法只能暂时维持初级人类肝细胞的功能性，但会影响其扩增能力。虽然一些研究尝试通过不同的策略来克服这一限制，如使用小分子抑制剂促进肝细胞的扩增，但这些方法往往导致胆管化生，即功能性细胞被重新编程为增殖能力较强的细胞。这种现象被称为“paligenosis”，使得在再生医学、药物发现和毒理学领域中使用人类肝细胞面临重大挑战。因此，开发一种能够长期扩增且保持功能性的人类肝细胞培养系统至关重要。02研究发现人类成年肝细胞类器官的长期扩增和功能保持：研究团队通过激活Wnt和STAT3信号通路，实现了人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。YAP信号的激活促进了肝细胞的增殖，但会导致其向胆管细胞谱系分化。相反，Oncostatin M通过激活STAT3信号，促进了肝细胞的增殖，同时抑制了胆管化生，保持了肝细胞的特性。研究表明，这种类器官在移植到小鼠体内后，能够重建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在去除特定培养因子后，形成具有胆小管网络的肝索样结构，表现出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。类器官在基因编辑和疾病建模中的应用潜力：研究表明，这些肝细胞类器官可以进行基因编辑，从而为代谢性肝病的功能建模提供了可能性。新开发的培养系统为人类肝病的治疗策略开发提供了一个有前景的途径。通过优化的培养条件，研究团队成功地在体外模拟了肝细胞的代谢功能，这标志着功能性类器官医学的新时代。03临床意义肝移植的替代方案：HHOs可能成为肝移植的替代方案，特别是在供体短缺或无法进行肝移植的情况下。  药物筛选和毒性测试：HHOs展示的药物代谢能力与体内肝细胞相似，使其成为药物筛选和毒性测试的理想模型。这可以加速新药的开发和安全性评估。  代谢性肝病的研究和治疗开发：HHOs提供了一个真实反映人类肝脏代谢功能的平台，有助于深入研究代谢性肝病的病理机制，并开发针对这些疾病的治疗策略。  再生医学的应用：由于HHOs能够进行基因编辑，它们可用于研究遗传性肝病并探索基因治疗的可行性。  总之，该研究不仅为肝细胞的体外长时间培养提供了新的策略，还为肝脏相关疾病的基础研究和临床应用开辟了新的方向。04实验策略1. 信号通路激活与抑制：  通过激活Wnt和STAT3信号通路，实现人类成年肝细胞类器官的长期自我更新。 YAP激活促进肝细胞增殖，但同时导致其向胆管导向分化。 通过抑制TGFβ信号和使用Oncostatin M激活STAT3，促进肝细胞增殖并抑制导管化生，从而保持肝细胞特性。2. 类器官培养体系的优化：  在培养基中添加EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ抑制剂（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA激活剂（Forskolin），支持小囊状类器官的形成。 通过去除某些培养因子（如Noggin和forskolin），并补充激素（如生长激素、催乳素和皮质醇），促进肝细胞类器官的线索状结构形成及胆小管网络的建立。3. 体内移植实验：  将类器官移植到经过药物处理以去除肝细胞的小鼠体内，评估其在小鼠肝脏中的再生能力和代谢分区结构的重建。4. 基因编辑与功能建模：  类器官易于进行基因编辑，从而用于代谢性肝病的功能建模。05数据解读图1：人类成人肝细胞类器官在特定因子下的扩增Figure 1 展示了人类成人肝细胞类器官（HHOs）在特定培养条件下的扩增情况，包括使用不同因子如IL-6和OSM对类器官的影响。  A. 为了观察PHH来源的类器官在扩增培养基（加IL-6）中的表达情况，作者进行了免疫荧光染色。结果显示，HHOs表达白蛋白，而ICOs则显示CK19和EpCAM的表达。此结果在三个供体中获得一致性。  B. 为了研究HHOs在扩增培养基中添加OSM或IL-6后的扩增情况，作者通过传代比率和基于ATP的细胞计数估算了细胞数量。每个点代表一次传代事件，三个类器官系在初始3个月内大约每2周传代一次，传代比率为3-12倍，‘x’表示传代失败。供体分别为39岁、53岁和61岁。  C. 为了观察OSM对单个PHH来源类器官生长的影响，作者拍摄了时间推移图像。相同的类器官在相同放大倍率下显示。此结果在两个供体中获得一致性。  D. 为了研究OSM对HHOs基底极性的影响，作者进行了代表性明场和整体免疫染色，标记了CDH1（蓝色）、ZO-1（红色）、整合素β4（绿色）和细胞核（白色）。此结果在四个供体中获得一致性。  E. 为了分析胆管细胞相关转录因子、YAP靶基因和TGFβ信号相关基因的转录组，作者对PHHs、ICOs和HHOs在有无OSM和LATSi（TRULI，5 μM）条件下进行了分析。供体分别为11个月和16个月。  F. 为了观察HHOs在±OSM和±LATSi（5 μM）培养14天后的情况，作者进行了Alb和CK19的免疫染色（左）。细胞核用Hoechst 33342标记。结果显示，CK19+类器官仅在无OSM和有LATSi的条件下观察到（右）。  结论：人类成人肝细胞类器官在特定因子如IL-6和OSM的影响下能够有效扩增，并且不同因子组合对类器官的极性和表型有显著影响。图2：小鼠肝脏用人类肝类器官（HHO）再生Figure 2 展示了通过异种移植方法，将人类肝类器官（HHO）移植到小鼠肝脏中，观察其在小鼠肝脏中的再生情况。  a. 为了研究HHO在小鼠肝脏中的再生能力，作者设计了异种移植实验流程。TK-NOG小鼠在接受ValGCV处理以消融肝细胞后，被移植了HHO或人类原代肝细胞（PHH）。每周采集血液样本，并在8周后收集肝脏样本。  b. 通过苏木精-伊红染色（H&E）和STEM121染色，展示了HHO移植物的代表性图像。结果显示，移植的小鼠和人类肝细胞之间有明显的界限。类似结果在21个PHH移植物（来自五个供体）和104个HHO移植物（来自八个供体）中获得。  c–h. 研究了PHH或HHO（来自两个供体）在小鼠肝脏中的再生情况。通过测量血清中人类白蛋白（hALB）的浓度随时间的变化来评估再生效果。不同的HHO传代次数用不同颜色表示；‘x’表示小鼠死亡。STEM121染色显示了PY53和PY30 HHO移植物。再生效率通过人类肝细胞面积相对于总肝脏面积的比例计算。每个点代表一只小鼠。统计分析显示，与对照组PHH相比，HHO组的再生效率显著提高。  i. 对HHO移植物进行了hALB（红色）、闭合蛋白（绿色）和人类MRP2（蓝色）的染色。结果显示，来自PHH（一个供体）和eHHO（三个供体）的数据具有相似的结果。  j. 在HHO移植物中对分区标记物进行染色，HAL（红色；顶部）位于门静脉附近，CYP2E1（红色；底部）位于中央静脉附近。细胞核用Hoechst 33342（白色）染色；移植细胞为STEM121+（绿色）。门静脉和中央静脉的腔用虚线标出（*表示门静脉）。来自PHH（两个供体）和eHHO（HAL为六个供体，CYP2E1为八个供体）的代表性数据显示了相似的结果。  k,l. 分别显示了在STEM121+区域内HAL+（k）或CYP2E1+（l）面积的比例。每个点代表一只小鼠的一个切片；每种条件下来自两到三只小鼠的平均比例。使用Welch双侧t检验进行统计分析。  结论：HHO能够在小鼠肝脏中有效再生，并表现出与人类肝细胞相似的功能特性。图3：建立具有代谢功能的dHHOs（分化后的人体肝细胞类器官）Figure 3 展示了文章中的一项关键实验，即分化后的人体肝细胞类器官（dHHO）建立及其代谢功能的评估。  形态变化： dHHOs从上皮样结构转变为肝细胞样结构，显示出成熟的形态特征。 胆汁酸代谢： 实验证明dHHOs可以合成胆汁酸，并在胆汁小管中运输荧光标记的胆汁酸衍生物，表明其具有生理功能。 胆汁酸的合成和分泌： LC–MS/MS分析显示，与体外培养的人体肝细胞相比，dHHOs产生更高浓度的胆汁酸。 甘油三酯生产： dHHOs能够合成甘油三酯，并在存在微粒体甘油三酯传输蛋白抑制剂时被阻断，验证了其代谢活性。 结论： 这些成功的分化实验及其结果表明，通过优化培养条件，dHHOs不仅展示了典型的胆汁酸代谢功能，还具备了潜在的药物发现和毒理学研究的应用能力。这为将来利用类器官模型进行更深层次的人类肝脏代谢研究奠定了基础。图4：建立门静脉肝细胞类器官Figure 4 展示了对分化后的人体肝细胞类器官（dHHOs）的功能评估，特别是在再现肝脏门静脉区域特定功能方面的能力。  葡萄糖合成与糖异生： dHHOs在饥饿后展示了较高的葡萄糖生成能力，并成功追踪到13C标记的葡萄糖合成路径，证实了其有效的糖异生能力。 尿素合成： 使用15N标记氯化铵进行追踪，发现dHHOs能够转变氨为尿素，验证了其尿素循环的完整性。 线粒体功能活性： dHHOs显示出高于eHHOs的最大呼吸能力，提示其具有更活跃的氧化磷酸化水平。 白蛋白和凝血因子生产： dHHOs能够合成接近人体生理水平的白蛋白，并在维生素K存在下增加凝血因子的活性。 结论： 通过一系列功能性实验，Figure 4展示了dHHOs在多种重要肝脏代谢功能方面的恢复能力，特别是与门静脉区域相关的功能。这包括葡萄糖生成、尿素合成及相应代谢途径的活跃性，表明dHHOs可以作为体外研究人类肝脏功能和代谢疾病的有效模型。图5：生成基因敲除的肝细胞类器官Figure 5 展示了通过基因编辑技术生成基因敲除的人体肝细胞类器官（HHOs）的过程和结果。  基因敲除成功： 成功通过sgRNA实现了对G6PC和OTC基因的敲除，Sanger测序和免疫检测确认了对应蛋白的缺失。 形态和功能保持： 尽管基因敲除，G6PC和OTC缺失的HHOs仍然保持了正常的类器官形态，并能够合成一定水平的白蛋白。 功能影响： G6PC敲除使得糖异生功能降低，而OTC敲除导致瓜氨酸生成的缺失，验证了各基因在其代谢途径中的关键角色。 培养条件优化： 通过使用LATSi和人血小板裂解物，促进了基因编辑HHOs的扩增，而没有引起生长停滞或管道分化。 结论： Figure 5描述了一种有效的流程来对成人肝细胞类器官进行基因敲除，从而提供一种稳定的模型来研究肝脏代谢疾病。这一进展为通过基因编辑技术探索肝脏功能、发现疾病机理和开发治疗策略提供了可能性。06主要结论这项研究展示了一种新的培养系统，该系统能够在体外长期扩增人类成体肝细胞类器官（HHOs），并保持其代谢功能。通过激活Wnt和STAT3信号通路，研究人员成功实现了HHOs的自我更新，并避免了导管化生的发生。HHOs能够重新构建受体小鼠肝脏的代谢分区结构，并在体外展示出与体内肝细胞相当的主要肝脏代谢功能。这种文化系统为肝脏疾病的治疗策略开发提供了新的途径。07讨论总结研究强调了HHOs技术在解决人类成体肝细胞体外扩增与功能性之间权衡的潜力。通过基因组学分析，关键的培养因子如EHF、Wnt/R-spondin、Noggin、TGFβ抑制剂、OSM和福司可林被确定为促进肝细胞扩增的必要因素。特别地，OSM-STAT3激活不仅促进了肝细胞的增殖，还保留了肝脏谱系的完整性，防止了导管化生和上皮-间质转化。  研究指出，HHOs技术代表了一种新的类器官培养系统，兼具肝细胞的扩增性和功能性。其优点包括提供了一个稳定、可重复且成本效益高的平台，用于探索人类肝脏代谢，超越了传统的人类肝细胞模型的局限性。此外，HHOs在再生医学中的潜在应用为解决肝衰竭问题打开了新的视野。END免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。OTC2025论坛深度聚焦类器官与疾病建模、新药发现/研发、3D细胞培养、类器官培养及质控。展位咨询请联系：王晨 180 1628 8769。戳“阅读原文”立即领取OTC2025免费参会名额!

-01-引言Treg细胞是CD4+T细胞的一个亚群，通过预防自身免疫、控制过度炎症和维持免疫耐受，对免疫稳态至关重要。Treg细胞的免疫调节特性在癌症中会促进肿瘤的进展。对TIL亚群的分析表明，免疫细胞浸润的组成与患者预后之间存在明确的关联。过表达细胞毒性T细胞的TIL通常与良好的预后相关，而TIL中Treg细胞的频率增加与不良预后相关。Treg细胞的分化和功能依赖于谱系特异性转录因子Foxp3的表达。FOXP3基因功能丧失改变的人类患有免疫失调、多内分泌疾病、肠病、X连锁（IPEX）综合征，表现为广泛的自身免疫和炎症损伤。Treg细胞在胸腺中由一组前体细胞发育而来，这是一个需要T细胞受体（TCR）和IL-2激活的两步过程。Treg细胞可以通过各种不同的机制抑制免疫反应。CD25是IL-2受体的一种高亲和力亚单位，在Treg细胞上组成性高表达，但在效应T细胞上也上调。Treg细胞上高水平表达的CD25竞争性地结合IL-2，从而剥夺效应T细胞的这种专性生长因子。Treg细胞还表达一系列抑制分子，如CTLA-4，与Treg介导的抑制有关。此外，Treg细胞还可以分泌抑制性细胞因子，如IL-10和TGF-β。基于这些有效的免疫抑制机制，Treg细胞通常被认为是最有效的抗肿瘤免疫抑制剂。因此，以Treg细胞为靶点的癌症治疗策略也是目前的研究热点。-02-一、Treg的分类和功能Tregs可分为两类：天然调节性T细胞（nTregs）和诱导调节性T细胞（iTregs）。两种类型的Tregs都普遍表达 Foxp3。nTregs在胸腺中自然发育，其抑制作用是通过细胞间接触实现的，它们的主要功能是维持正常的免疫耐受和控制炎症反应。iTregs来源于肿瘤微环境信号诱导的外周原始T细胞，包括肿瘤抗原、细胞因子（如TGF-β）和其他可溶性分子。iTregs通过多种促进肿瘤进展的机制抑制效应T细胞（Teff）、NK细 胞和DC的抗肿瘤免疫作用。Tregs主要有以下五种功能机制：①Tregs分泌抑制性细胞因子，包括 IL-10、TGF-β 和 IL-35。② Tregs 通过颗粒酶和穿孔素杀死效应细胞。③ Tregs 影响效应细胞的功能：Treg 与效应T细胞竞争消耗 IL-2，从而抑制效应T细胞的生长；Tregs通过产生胞外酶CD39和CD73 促进TME中腺苷的产生，诱效应细胞导的抑制和抗增殖作用；Tregs通过缝隙连接将大量 cAMP 转移到效应T细胞，干扰其代谢。④Tregs通过刺激性和抑制性受体（CTLA-4 或 LAG3）诱导DC耐受，后者通过IDO进一步抑制T细胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 产生的因子形成正反馈环，促进增殖，增强抑制环境。         此外，一项研究使用一种新的策略来定义Tregs， Th1样Tregs（T- 234bet+IFNγ+Foxp3+），Th2 样Tregs（Gata3+IRF4+IL4+Foxp3+）和Th17样Tregs（IL-17+RORγt+Foxp3+），这为靶向 Tregs 治疗提供了新思路。 -03- 二、Treg抑制抗肿瘤免疫反应的机制Treg通过多种机制阻碍抗肿瘤免疫反应。在Tregs中，共抑制受体细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）通过与APCs中的CD80/B7-1和CD86/B7-2结合干扰共刺激信号，从而抑制效应T细胞中的共刺激受体CD28。                 IL-2是Treg和效应T细胞生存所必需的细胞因子。与效应T细胞相比，Treg主要通过由α（CD25）、β（CD122）和γ（CD132）亚单位组成的更高亲和力受体结合IL-2。此外，Tregs比效应T细胞具有更高的CD25表达，而CD25是IL-2的一种高亲和力受体。这使得Treg在利用TME中有限的IL-2方面具有竞争优势。因此，在TME中，Treg的累积量大于效应T细胞。同时，Treg还分泌免疫抑制分子（包括免疫抑制细胞因子）抑制抗肿瘤免疫。Treg产生TGF-β、IL-10和IL-35导致免疫抑制。表达在Tregs细胞表面的CD39和CD73作为外核苷酸酶，分别将ATP或ADP水解为AMP和AMP水解为腺苷。CD39和CD73产生的腺苷会抑制效应T细胞。当Treg在TME中发生凋亡时，凋亡的Treg通过外核苷酸酶释放大量腺苷，从而产生更强的抗肿瘤免疫抑制。-04-三、TME中Treg浸润的机制趋化因子和细胞因子依赖性浸润Treg具有多种趋化因子受体。趋化因子梯度，如CCR4-CCL17/22，CCR5-CCL5, CCR8-CCL1,和CCR10-CCL28，可参与将Treg招募到TME中。           在炎症肿瘤中，炎症细胞产生Treg招募趋化因子，如CCL22。CCR8+Treg被CCR8配体（如CCL1和CCL18）招募到TME等炎症部位，CCL1不仅将CCR8+Treg招募到肿瘤中，还诱导对Treg抑制至关重要的FOXP3、CD39和IL-10的STAT3依赖性上调，从而增强Treg的免疫抑制活性。在一系列细胞因子和趋化因子受体中，与正常组织驻留的Tregs相比，CCR8仅在人类乳腺癌的肿瘤浸润性Tregs中显著上调，表明CCR8是TME中Tregs的一个有希望的治疗靶点，而不会引起系统性自身免疫。基于TME代谢适应的生存优势效应T细胞和Treg在正常和炎症条件下使用不同的代谢系统，Treg表现出更强的生存优势。TCR刺激通过磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-雷帕霉素（mTOR）信号途径激发特定的代谢程序，导致氨基酸和葡萄糖的吸收增加，从而增强有氧糖酵解。活化的效应T细胞将其代谢程序从氧化磷酸化（OXPHOS）转变为有氧糖酵解，这是其生存和功能所必需的，从而导致效应T细胞和TME中的肿瘤细胞之间的葡萄糖竞争。肿瘤细胞中的代谢重编程将TME转变为营养受限，富含乳酸和低氧环境，不利于效应T细胞的存活和功能。然而，在TME中，Treg可以在如此恶劣的条件下存活并保持其免疫抑制功能。FOXP3通过抑制糖酵解和促进氧磷和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化，因此，Treg可以利用乳酸作为能量来源。当肿瘤浸润性非Treg将丙酮酸转化为乳酸以产生NAD+以维持糖酵解时，TME中的Treg将丙酮酸转化为线粒体中的乙酰辅酶a以触发三羧酸循环，这为Treg提供了比其他T细胞更大的存活益处。此外，即使在低葡萄糖条件下，Treg还可以利用脂肪酸实现其增殖和免疫抑制功能。研究发现，胃癌中RHOA Y42突变通过上调脂肪酸合成酶（FASN）产生大量脂肪酸，导致TME中更多的Treg和更少的肿瘤浸润性CD8+T细胞。非炎症肿瘤的浸润机制虽然炎症肿瘤通常含有Treg，但有时在非炎症肿瘤中也检测到大量Treg，这表明炎症相关浸润以外的机制参与了Treg向TME的募集。研究发现，某些基因改变可以通过调节下游信号通路来修饰肿瘤细胞产生趋化因子。在肺腺癌中发现的EGFR突变通常与非炎症性肿瘤相关，在这些肿瘤中检测到大量的Treg，而不存在炎症细胞。EGFR突变通过抑制IFN调节因子1（IRF1）减少CXCL10的产生，这对CXCR3依赖的CD8+T细胞向TME的募集产生负面影响。此外，CCL22的产生通过EGFR下游信号中的JUN诱导而增加，导致CCR4依赖性Treg浸润到TME。在具有RHOA Y42突变的胃癌中也观察到类似的表型，RHOA Y42突变是一种功能缺失突变，通过抑制IRF1降低CXCL10/11水平。此外，粘着斑激酶的过度激活通过调节趋化因子的产生与Treg浸润和CD8+T细胞排斥相关。治疗相关的Treg积累放射治疗和CTLA-4阻断抗体等治疗可能促进肿瘤中Treg的积累，这被认为是一种适应性免疫抵抗机制。由于对辐射的敏感性低于其他淋巴细胞，因此即使在放射治疗后，Treg仍在TME中持续存在，可能导致某些类型癌症发生免疫抑制性TME。在临床前模型中，去除Treg可提高肿瘤对辐射的敏感性并抑制转移。在小鼠模型中，抗CTLA-4抗体通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）有效地去除Treg，而在患者中的作用机制仍存在争议。免疫组化分析显示，根据治疗前和治疗后活检样本的比较，抗CTLA-4抗体治疗后，Treg数量增加。因此，某些治疗干预可能会增强Treg浸润，从而影响后续治疗的疗效。-05-四、Treg作用的新机制新的代谢机制Tregs活化的核心是支持其生存和功能的脂质代谢的变化，这可由脂肪酸结合蛋白（FABPs）促进。此外，糖酵解和氧化代谢都有助于Tregs的扩增，因为肿瘤内Tregs在葡萄糖摄取方面的相对优势可能促进FA合成。Tregs表现出另外一种独特的代谢特征是线粒体代谢的增加。线粒体转录因子A（Tfam）和线粒体复合体III是维持Tregs免疫抑制功能调节基因表达所必需的。此外，Foxp3缺乏会导致mTORC2信号转导的失调，并增强有氧糖酵解和氧化磷酸化。值得注意的是，CD36在肿瘤内的Tregs中被选择性上调，作为一种中枢代谢调节剂。CD36通过PPARβ信号精细调节线粒体适应性，重编程Tregs以适应富含乳酸的TME。在抗PD-1治疗过程中，CD36靶向诱导了额外的抗肿瘤反应。肝激酶B1（LKB1）调节Tregs的代谢和功能适应度，并作为DCs免疫原性的关键抑制剂发挥作用。在Tregs中，LKB1的特异性缺失可导致一种以Th2型显性反应过多为特征的致命性炎症性疾病，不仅破坏Tregs的生存、线粒体适应度和代谢，还可诱导免疫调节分子的异常表达，包括PD-1和TNF受体超家族蛋白的GITR和OX40。新的遗传机制Helios可以增强人类胎儿CD4+幼稚T细胞向Tregs的优先分化，作为在炎症反应期间稳定Tregs的关键转录因子。肿瘤中Helios缺陷的Tregs获得效应T细胞功能，并通过上调对自身抗原具有高度亲和力的效应细胞因子来促进对癌症的免疫反应，如GITR/PD-1表达增加和对自身抗原的反应性增强。Foxp1是一种forkhead转录因子，Foxp1的缺失会导致Tregs的功能受损，TSDR、CNS2、CNS3均为Foxp3相关的作用元件，调控着Foxp3的表达和功能。YAP是Hippo通路的辅活化因子，在Tregs中高度表达，并促进Foxp3的表达和功能。TAZ是一种诱导Hippo信号转导的TEAD转录因子的辅激活因子，它通过减少组蛋白乙酰转移酶Tip60介导的Foxp3的乙酰化而减弱Tregs的发育。核受体Nr4a是维持Treg基因程序的关键转录因子，参与Treg介导的TME抗肿瘤免疫抑制。促自噬蛋白AMBRA1也是T细胞的一个关键调节因子。此外，SUMO特异性蛋白酶3（SENP3）介导的BACH2去SUMO化阻止BACH2的核输出，从而抑制与CD4+T效应细胞分化相关的基因，并稳定Treg特异性基因特征。新的分子机制在Tregs的分子机制方面也取得了一些新的进展。Tregs具有丰富的IL-2受体（IL-2R）表达，依赖于活化T细胞产生的IL-2，提示Tregs对IL-2的消耗与其抑制功能有关。并且IL-2R依赖的转录因子STAT5的激活在Tregs的抑制功能中起着重要作用。丝氨酸-苏氨酸激酶Mst1被鉴定为Tregs中IL-2-STAT5活性的信号依赖性放大器，Tregs中Mst1和Mst2的高活性对于防止肿瘤抵抗和自身免疫是至关重要的。在T细胞活化过程中，Tregs中Foxp3的磷酸化可以通过TAK1 Nemo样激酶（NLK）信号通路进行调节。另外，Tregs激酶TAK1的特异性缺失可以减少外周淋巴器官中Tregs的数量，而E3泛素化连接酶TRAF6缺乏的Tregs在体内功能紊乱。ST2被认为是IL-33的唯一受体，表达ST2的Tregs对IL-33有反应，并且在IL-33刺激下Tregs的百分比增加，特别是Foxp3+GATA3+Tregs。在结直肠癌（CRC）的小鼠模型中，肿瘤浸润的Tregs优先上调ST2，IL-33/ST2信号与肿瘤负荷呈正相关。激活的Tregs表面表达糖蛋白-A为主的重复序列（GARP），它结合并激活潜伏的TGF-β。此外，整合素α4β1的激活也可增加Tregs的抑制能力。Tregs稳态通过Tregs内在和外在机制与黏膜相关淋巴组织1（Malt1）功能密切相关。相比之下，CARD11-BCL10-MALT1（CBM）信号对于以Malt1蛋白酶依赖的方式介导Tregs的抑制功能至关重要。-06-五、Treg靶向治疗策略抗CTLA-4单克隆抗体，如ipilimumab，通过Treg靶向改善TME的免疫特征。然而，在临床研究中的详细作用机制仍然存在争议。在小鼠模型中，抗CTLA-4单克隆抗体诱导的抗肿瘤免疫反应完全依赖于通过Fc介导的ADCC对Treg的消耗。而在人类中，Treg的消耗与伊普利单抗抗肿瘤的主要疗效无关。此外，靶向肿瘤内Tregs高表达分子的双特异性抗体，如CTLA-4和OX-40或CTLA-4和GITR，它们可能通过有效地消耗体内的Treg来提高抗肿瘤疗效。由于肿瘤内Treg比其他效应T细胞表达更高水平的CD25，CD25可能是Treg耗竭的关键靶点。一些针对CD25的治疗策略已经被FDA批准。例如，IL-2与白喉毒素的融合蛋白denileukin diftitox用于皮肤T细胞淋巴瘤。denileukin diftitox可与表达CD25的细胞结合，并通过白喉毒素的细胞毒性作用杀死它们。新的抗CD25抗体RG6292被开发用于选择性地清除Tregs，而不会干扰效应T细胞中的IL-2信号，目前正在进行临床评估（NCT04158583）。靶向CD25的近红外光免疫治疗（NIR）也可能是肿瘤局部Treg去除的一种有希望的方法。此外，还开发了ADCT-301，一种抗CD25的抗体偶联药物，用于靶向表达CD25的淋巴瘤。它业可作为另一种在肿瘤中去除Tregs的选择，目前正在进行临床试验（NCT03621982）。     通过Tregs表达的外核苷酸酶CD39和CD73靶向腺苷途径也可能是增强抗肿瘤免疫的一个有希望的靶点。阻断外核苷酸酶活性的抗CD39和抗CD73抗体，如TTX-30、MEDI9447和BMS-986179，目前正在进行临床试验（NCT03884556、NCT03742102和NCT02754141）。除了抑制腺苷的产生外，腺苷受体A2AR的小分子抑制剂也可防止腺苷依赖性T细胞抑制。这些抑制剂的临床试验正在进行中（NCT02655822、NCT04089553和NCT02403193）。此外，靶向VEGFA-VEGFR2轴可能通过减少TME中的Treg增殖和浸润来激活抗肿瘤反应。已经证明，抗VEGFR2抗体ramucirumab可以减少胃癌患者eTreg的增殖。以FOXP3为靶点的疗法也有开发。AZD8701是FOXP3的反义寡核苷酸，在体外实验和人源化小鼠模型中部分降低了FOXP3及其下游转录分子的表达。AZD8701的临床试验正在进行中（NCT04504669）。抗CCR4抗体mogamulizumab可减少实体瘤患者中CCR4+Treg的数量。在一项临床试验中，mogamulizumab联合抗PD-1抗体（nivolumab）治疗的患者中证实了Treg的缺失，这表明该组合是癌症免疫治疗组合中一个有希望的选择。由Treg高度表达的免疫检查点分子，如OX40、GITR和ICOS，也可能成为治疗靶点。一些研究表明，这些受体的刺激降低了Treg的免疫抑制功能，导致效应T细胞的激活。作为OX40激动剂的抗体，如MEDI6469134（NCT02274155），GITR，如MK-4166135（NCT02132754），以及ICOS，如KY1044136（NCT03829501），目前正在开展临床研究。-07-结语在炎症和非炎症肿瘤中，TME中Treg浸润、激活和存活的多种机制都已被揭示，影响TME中Treg浸润、激活和存活的机制可能因患者而异。肿瘤细胞中的基因改变不仅决定免疫原性和炎症状态，而且也有助于调节TME中的免疫细胞浸润和生存，例如基于趋化因子的Treg浸润和基于代谢变化的Treg激活，这些都可以被特异性激酶抑制剂靶向。因此，TME中主要导致Treg浸润的机制需要通过基于基因改变的免疫学和代谢谱来表征，并以精准免疫治疗为目标。基于机制的Treg靶向治疗有望改善目前的免疫治疗。参考资料：1.Development of Bispecific Antibody for CancerImmunotherapy: Focus on T Cell Engaging Antibody. Immune Netw. 2022 Feb; 22(1): e4.2. A pivotal decade for bispecific antibodies?. MAbs. 2024 Jan-Dec;16(1):2321635.公众号内回复“ADC”或扫描下方图片中的二维码免费下载《抗体偶联药物：从基础到临床》的PDF格式电子书！公众号已建立“小药说药专业交流群”微信行业交流群以及读者交流群，扫描下方小编二维码加入，入行业群请主动告知姓名、工作单位和职务。