NUPR1

摘要：尽管在类器官生成方面取得了巨大进步，但对研究人员而言，稳健且稳定的类器官协议仍然是一个主要挑战。评估类器官结构及其在体外或体内的功能的研究常常受到精确策略的限制。人们对评估类器官的兴趣日益增加，旨在标准化获取类器官的过程，以准确模拟人类衍生的组织。类器官复杂的微环境、复杂的细胞间交流、器官特异性的架构，以及进一步的功能复杂性迫切需要高通过率的方案。通过利用多组学分析和单细胞分析，可以破译细胞间交互机制，并通过组织学分析详细查看它们的结构。在这篇综述中，我们将总结研究类器官分子机制和细胞异质性的新方法，并讨论类器官与人体在组织学和形态学上的相似性。未来的功能分析展望将得到发展，类器官将成为成熟的模型。 1.引言 ‘类器官’一词被用来定义复杂的三维（3D）结构，这些结构展现出与体内器官相似的架构和功能。现在，一个更狭窄的定义包括从原代组织或干细胞生成的类器官，作为体外平台来模拟其器官对应物的多个方面，不仅仅是它们的结构和功能。干细胞培养的进步和对细胞外基质（ECM）生物学的理解促进了类器官的培养，捕捉到了真实器官的关键多细胞和功能特征。在类器官技术之前，由于免疫原性风险和功能整合挑战，诱导干细胞在3D中模拟真实器官是有限的。然而，3D类器官技术开创了一个新的时代，使研究人员能够研究疾病的分子机制并开发新的治疗方法。类器官在生物医学应用中具有巨大的潜力，包括提供生物发育和各种病理的再现模型，并以个性化的方式预测药物反应。因此，对人体受试者进行困难的干预研究有了机会。例如，一项研究创建了原发性和转移性乳腺癌（BC）类器官系，为BC研究和药物发现提供了宝贵的体外平台。不用说，类器官提供了包括癌症、罕见遗传病和多因素疾病的治疗在内的患者特异性化身，尽管类器官的应用才刚刚开始被探索。最近的研究在类器官构建方面取得了显著进展，用于模拟疾病和人体组织，使其成为一个新兴领域。然而，为了发挥类器官技术的全力，最紧迫的是，需要持续改进对类器官的更好表征和验证。尽管类器官模型中的局部模式显示了在产生相对定位区域方面的前景，但宏观布局仍然与真实器官不同。的确，在生成区域身份时出现了非常大的“批次效应”，尽管同时制作的类器官非常相似，但最终导致质量不稳定。这将需要对类器官模型进行多方面的评估，以建立细胞组成和组织学、形态学以及对刺激的功能反应的一致性的质量标准。类器官的结构通常是异质的且不可复制的，例如，缺少细胞类型或异常基因调控，限制了它们在临床上的使用。多组学分析在全面评估类器官模型中起着关键作用，揭示了它们在基因组、转录组和蛋白质组水平上的分子机制。此外，单细胞分析和空间分析提供了前所未有的全面分子图谱的定量、高维评估，为以疾病为中心的研究提供了参考图谱。病理学和形态学分析恢复了宏观尺度上的完整架构图景，以评估与体内器官和体外疾病/药物模型的相似性。这些方法被广泛使用，并适当地从细胞水平到结构水平评估了类器官。然后，功能属性分析将完成拼图的最后部分，即类器官协议是否能够实现与真实器官对应物具有复杂功能的模拟。事实上，对于侵袭性恶性肿瘤来说，筛选适合患者遗传概况的药物尤其相关。因此，一个未来经过良好评估的类器官目录将更加关注量化在体内呈现原始组织时的生物学变异，并进一步解决体外类器官模型的环境扰动。对类器官模型的评估显著推进了我们的理解，从机制研究到功能属性。这里，我们回顾了最近使用各种分析方法研究药物反应和疾病发病机制的类器官应用。我们进一步讨论了类器官的功能属性，以评估它们作为患者和动物研究模型之间的转化桥梁的可靠性，促进了体外发现向临床应用的转化。类器官在个性化和再生医学中具有潜力，因为它们可以为安全移植到患者体内产生功能性生物结构。 1.1.多组学分析 下一代测序的方法学进步增强了转录组和表观基因组测序的灵敏度（图1）。多组学分析可以评估转录组和表观基因组表达，以监测类器官系和类器官衍生物的稳定遗传，通过蛋白质组学和代谢组学测序进行评估。 图 1 多组学分析在评估类器官中的应用。全基因组测序在DNA和表观遗传层面被广泛用于分析类器官的基因图谱，比较它们的相似性。ATAC-seq经常被用来发现精确的表观遗传调控网络。RNA-seq是评估分子机制的常用方法。此外，蛋白质组学和代谢组学分析类器官的代谢物和共培养，如肠道类器官。 1.2.基因组学 基因组学通常从整体角度研究生物体的基因组表达，这允许测试类器官是否被引导发展。基因组研究有助于重新评估复杂的类器官培养条件的适宜性。最初开发了一个用于评估原发性乳腺癌类器官长期培养中细胞组成的整体基因组漂移的检测方法，通过全基因组测序进行。结果表明，最好将最具代表性的组织起源限制在原代培养中。基因组分析优化了内部类器官的方向性分化条件，允许在α1抗胰蛋白酶缺乏症携带者中稳定模拟肝细胞特异性基因表达谱。同样，在大脑类器官培养模型中，小胶质细胞发挥保守作用，调节关键的转录程序，并诱导神经干细胞对局部培养环境的变化。 基因组分析揭示了来自不同来源的类器官的解剖起源，并且转录组轮廓在同一供体中高度可比。例如，从胆囊衍生的胆管细胞类器官（BCOs）展现出与体内胆管细胞的相似性。然而，即使在来自不同胆汁来源的BCOs中也观察到区域特异性基因差异，表明培养条件主要影响总体转录组轮廓而不是类器官的起源。基因组轮廓的相似性为评估类器官在疾病建模方面开辟了新的途径，而无需侵入性收集的活检。 表观遗传技术是评估疾病与加速衰老标志相关程度的适当技术。表观遗传时钟特别适用于那些具有强烈炎症成分的疾病。类器官在细胞分化过程中保持了节段性DNA甲基化模式和年龄阶段，使它们成为研究体外干细胞固有衰老的可靠工具。 1.3.转录组学 传统的转录组学也适用于类器官研究。与基因组学相比，它更关注类器官在成熟后是否具有特定功能。 高通量类器官药物筛选应确保类器官模型与其相应的患者肿瘤之间的一致性。使用去势抵抗性神经内分泌前列腺癌表型类器官，这些类器官在基因组和表观基因组上与母体患者肿瘤一致，发现了一个表观遗传修饰增强子，zeste 2（EZH2）。它参与了雄激素非依赖机制的发病机制。这提名了一种在罕见癌症类器官模型的临床试验中筛选靶向药物的组合策略，通过操纵神经内分泌表型中的癌基因表达。此外，当在类器官构建中改变基因修饰时，也可以系统地测试基因组和表型稳定性。LuCaP患者衍生的异种移植（PDX）/类器官模型作为依赖基因型的模型来测试药物敏感性。它们保持了对雄激素受体信号通路的依赖，并且基因组异质性也得到了保留，这提供了一个遗传特征化的平台来研究疾病发病机制以及治疗反应。Ormel等人使用RNA测序和流式细胞分析验证了类器官培养的小胶质细胞的微胶质细胞身份，其典型的分子表型、形态和功能与成人小胶质细胞在整体转录组水平上相似（图2B）。因此，整个基因网络越精确，对类器官模型的分子机制的评估就越好，以揭示疾病的发病机制。 1.4 代谢组学 原代类器官培养中的巨大变异性导致实验系统中的噪声增加，因为这些培养包含多种细胞类型，产生无法解释的结果。然而，捐赠者、分化介质、通道和细胞培养复制仍然可以控制。 在肠道生物学中，彻底评估人类类器官培养需要仔细量化肠道中各种来源的变异，特别是代谢活性。一项研究发现，当通过目标分析中央碳代谢物和激素生产模型评估时，成人人类肠道干细胞类器官培养中的捐赠者-捐赠者变异性保持在可控水平，从而使得研究代谢过程的实验设计稳健且可解释（图2C）。 图 2 多组学分析在分子水平上评估类器官。(A) 使用DNA甲基化、chromHMM和ChIP-seq追踪视网膜类器官中H3K9me3、H3K27Ac和H3K27me3的重编程基因表达水平。版权所有 2018，Elsevier。(B) 微胶质细胞（oMG）和成年微胶质细胞之间特征性细胞表面标志物的表达相似。版权所有 2018，Springer Nature。(C) 来自回肠和结肠的ASC类器官的分化相似，并可用作后续分析中基因表达的基线。版权所有 2021，Elsevier。(D) 来自蛋白质组学（左）和转录组学（右）数据集中差异表达蛋白的相关性热图在CRC类器官中。 1.5 蛋白质组学 创建个性化的人类类器官蛋白质组档案需要更敏感和快速的蛋白质组评估。扩大研究范围，包括更多的患者和类器官蛋白质组档案，将增强疾病分类并为优化个性化治疗提供技术工具。与健康的类器官蛋白质组相比，肿瘤类器官中几种蛋白质的表达水平显著且一致地发生变化，这些蛋白质先前被报告为癌症生物标志物蛋白质。基于定量质谱的患者衍生肿瘤类器官的蛋白质组档案重现了患者间的多样性，甚至类似于原始肿瘤。（图2D） 由于表型差异与蛋白质组的变化密切相关，因此应该更好地评估个性化的蛋白质组。蛋白质组学分析揭示了iPSC衍生的上皮和间充质（EM）类器官中多样化的表皮细胞增殖和分化蛋白质。这些在皮肤组织中存在的蛋白质有助于各种信号通路，支持表皮发育。另一方面，EM类器官中不同的细胞外基质（ECM）蛋白质可能促进一些细胞因子，并调节未来组织修复的因素。个体组织的差异也可以反映在特定的蛋白质组中。当暴露于缺氧和再氧化（HR）的类器官时，由于缺血再灌注（IR）引起的肠病变在隐窝状（CL）和绒毛状（VL）人类肠道类器官中表现不同。为了破译蛋白质动态和HR的病理学，Kip等人使用基于质谱（MS）的系统蛋白质组学方法和功能富集分析。显著改变的蛋白质表明，蛋白质代谢的变化在CL类器官中更为明显，而细胞应激和细胞死亡在VL类器官中更为明显。 总的来说，对个性化的患者特定类器官蛋白质组档案的更深入理解有助于诊断患者，从而促进个性化疗法的发展。 1.6 细胞异质性 模型生物拥有生理上完整的系统，但它们没有人类遗传背景。类器官更适合疾病表现和高通量筛选。然而，在复杂和多样化的异质细胞系统中，类器官特别适合使用新兴的高维技术，如单细胞技术和空间分析。这些方法提供了可重复的评估技术，作为评估类器官模型的预定义标准，能够在研究实验室环境中全面破译基础的单细胞和单类器官异质性（图3）。此外，单细胞技术和类器官技术的融合，这两个快速发展的领域，并不遥远。 图 3 单细胞技术破译类器官的细胞异质性。随着单细胞技术的高通量技术进步，单细胞RNA测序被广泛用于解码类器官及其对应器官的转录本，以发现突变的关键调控因子或改进构建协议。空间转录组技术适用于3D多细胞结构，以注释空间信息。 1.7 单细胞RNA测序 类器官模型的多样性在疾病建模中仍然是一个关注点：研究人员如何检测与疾病表型相关的类器官基因型？彻底分析对于理解控制类器官形成及其与体内发育的相关性的机制至关重要。 1.7.1 肿瘤类器官 肿瘤类器官内部细胞水平行为的异质性在临床上具有重要意义，特别是在开发新疗法方面。单细胞分析首先在此领域中用于评估肿瘤类器官的药物反应。肝胆肿瘤的分子异质性对于讨论包括肿瘤间和肿瘤内差异的耐药性很重要。赵等人使用单细胞RNA测序探索肝胆肿瘤类器官对药物耐药性的异质性和演变。他们提出肿瘤内异质亚群的合作使恶性肿瘤表型。（图4A） 图 4 单细胞技术在不同类器官模型中的应用。(A) 单细胞RNA测序(scRNA-seq)揭示了肝胆肿瘤类器官中的肿瘤内异质性和药物抗性机制。版权所有 2021，Wiley-VCH GmbH。(B) 通过单细胞转录组学、表观遗传学和空间信息评估的人类皮层类器官发育的单细胞图谱。版权所有 2022，Elsevier。(C) 基于细菌液滴的单细胞RNA测序(bacterial droplet-based scRNA-seq)揭示了异质的细胞状态。版权所有 2023，Elsevier。(D) 将单细胞方法与空间分析相结合，发现通过类器官模型测试的人类肺部发育的多组学细胞图谱。 单细胞技术还揭示了同一培养物中单个类器官内细胞的基线代谢异质性，与生长异质性无关。使用来自PDCOs的患者特定数据自动化评估方法可以规范化基线培养特征，并使测量更加稳健，测试临床相关的药物剂量和时间表，以潜在成功的疗法。接近正常细胞类型的多样性链接，存在多种结构类型的结构异质性在人类类器官培养中值得注意。单细胞分析与质谱细胞测量（飞行时间[CyTOF]）广泛评估了类器官培养是否保留了通过长期传播的复杂祖细胞或分化细胞类型的能力。已经证明，类器官中多种乳腺上皮谱系忠实地保留了原始组织中乳腺特异性蛋白质表达模式的单一培养。 1.7.2 大脑类器官 为了模拟大脑的复杂性，大脑通常由多种亚群的细胞组成。单细胞测序技术已成为评估大脑类器官的不可或缺的评估工具，用于检测大脑的遗传图谱。根据scRNA-seq数据，人类皮层发育的特有特征，如祖细胞成熟轨迹和新生神经元的区域特异性，并未在类器官中完全重现。细胞应激通路的异常激活损害了细胞类型规范，scRNA-seq数据集为评估皮层类器官作为体外人类大脑发育模型的准确性提供了初步框架。然而，在研究具有特定细胞类型的疾病表型时，应仔细考虑类器官中缺乏特异性的问题。PITRM1基因敲除iPSCs自发发展的大脑类器官显示了阿尔茨海默病（AD）的病理特征。这检查了PITRM1缺乏的细胞类型特异性病理发病机制，支持线粒体功能与神经退行性蛋白疾病之间的机械关联。Uzquiano等人提出了人类皮层类器官发育的全面和精确的细胞图谱，从单细胞转录组学、表观遗传学和空间信息，这将人类皮层在体外的发育从神经祖细胞的产生到分化的神经元和胶质亚型的产生（图4B）。 1.7.3 视网膜类器官 与真正的人类视网膜不同，目前使用的视网膜类器官无法将光响应通过突触传递到内层视网膜。此外，对视网膜遗传疾病的建模缺乏基因表达的定量比较。视网膜类器官迫切需要高通量测序技术来检测它们的遗传特征。来自五个不同分化时间点的人类胚胎干细胞（hESCs）衍生的视网膜类器官的单细胞RNA测序显示了转录组的丰富谱系信息。王等人还确定了胰岛素受体，这是一个特别表达的受体，对光感受器的生成有强大的影响。通过scATAC-seq扩展转录组分析可以帮助评估视网膜中潜在的基因调控网络。然而，hESC衍生的视网膜类器官中的可接近染色质与人类胎儿发育不同，缺乏像黄斑这样的专业化，并揭示了Notch信号失调的差异。为了更接近人类视网膜，精确调节相关信号通路可能会改善视网膜类器官的相对细胞组成。顺式调节元件（CREs）涉及视网膜中几种遗传性疾病。snATAC-seq和snRNA-seq的结合在识别人类视网膜和iPSC衍生的视网膜类器官中的发育动态和细胞类别特异性CREs方面已经证明是有效的。这表明类器官作为研究CRE相关疾病的宝贵模型具有重要的潜力。为了进一步评估视网膜类器官的保真度，产生视网膜类器官的细胞系资源应考虑它们的时间和发展效率。使用单细胞RNA测序展示了恒河猴iPSC（rhiPSC）建立视网膜分化类器官的协议。RhiPSC衍生的视网膜类器官在特征上与人类iPSC衍生的视网膜类器官无法区分，遵循一个短暂但相似的、更快的发展。 1.7.4 肠道类器官 肠道类器官的起始细胞状态本质上是复杂的，规模不足，将其应用于研究疾病的复杂分子机制将受到限制。利用大规模并行单细胞RNA测序，一个普遍适用的框架比较了体内细胞类型和状态与类器官，提高了模型的保真度。肠道类器官通常用于研究Paneth细胞（PC）的脱颗粒动力学，但缺乏对定义细胞类型和状态的全局比较。这些由具有自我组织能力的单个肠道干细胞形成的类器官，模仿了多种细胞类型和组织结构，创建了复杂的多细胞非对称结构。在非对称结构符合过程中至关重要的是第一次对称性破坏事件，一部分干细胞分化为PC。他们使用单细胞RNA测序发现PCs内未被认识的异质性，并展示了细胞状态如何适应性地响应不同的感染。单细胞RNA测序描绘了单细胞在暴露于统一的生长促进环境中时的内在自我组织行为。通过利用促进PCs存活的压力响应因子Nupr1，肠道类器官的生理保真度得到提高。这种增强以转录组、细胞测量学、形态学和蛋白质组学的变化为特征，带来了超越体内组织映射的先进机制见解和生物工程能力。最近，开发了一种高度可扩展的技术，BacDrop，用于细菌单细胞RNA测序，以解锁细菌对肠道类器官反应的新微生物学见解（图4C）。 1.7.5 肾脏类器官 由于变异性、肾单位不成熟、通量低和规模有限，肾脏类器官需要更好的方法来实现快速和高通量的可复制细胞活性生成。一项研究应用基于挤出的3D细胞生物打印构建肾脏类器官，并通过单细胞RNA测序的基因/蛋白质表达分析识别细胞簇，显示出所有类器官构型中的相似性。此外，在生物打印系中形成了更多的肾单位，并精确地操作了生物物理属性。因此，自动化基于挤出的生物打印方法提高了肾脏类器官生产的质量控制和规模，单细胞RNA测序提供了一个有用的技术来评估构建方法的适用性。单细胞技术在推进类器官分化协议和区分不同协议的差异中发挥着关键作用。诱导SIX2+肾单位前体细胞对于生成肾脏类器官的功能肾单位至关重要。吴等人使用单细胞RNA测序和单核RNA测序比较了两种定向分化方法，分析了65个胎儿和成人肾细胞的转录组。通过减少90%的神经元，他们实现了不同的肾细胞类型，而不会影响类器官的分化。他们还提到，两种不同的协议，即生成SIX2+（无眼盒2）肾单位前体或诱导PAX2+（配对盒2）前中胚层细胞，将大大影响肾脏类器官的复杂性和成熟度。最近的一项研究强调了形成更成熟的肾单位的后肾特异性的重要性，并增强了具有优越近曲小管的肾脏类器官，这与显示后肾不同祖细胞群体的发育研究一致，功能性肾脏。对于疾病研究，单核RNA测序也被用来阐明肾脏类器官中内在的细胞修复机制。 1.7.6 骨类器官 2022年，国际上首次报道了骨类器官相关研究，并开始探索其潜在应用。骨类器官是指使用类骨基质生物活性材料，通过体外3D培养结合定向诱导技术，培养和组装各种干细胞（如骨髓干细胞等）或功能细胞（成骨细胞、破骨细胞等）形成类骨组织。骨类器官具有某些骨骼特有的功能，可用于骨骼生物学机制研究，药物筛选和骨骼组织再生与修复。从分化调控的角度来看，骨形成具有长期特性，不同时间剖面中的细胞并不完全相同。 与其他类型的类器官不同，骨类器官需要基质和精确的空间排列，要求使用高通量技术监测分化。一个研究小组观察到在裸鼠中注射“骨痂”类器官4周后发生了骨化和血管化，表明它们的成熟度和吸引血管侵袭的能力。与体内组织相比的单细胞RNA测序数据显示，“骨痂”类器官中的细胞处于软骨内成骨的晚期阶段，表明它们促进骨再生的潜力。 1.8 空间转录组测序 理想的类器官模型应该能够利用细胞局部环境中的空间信息及其在生理学中的作用来完整描述。空间分析技术，如空间转录组技术，评估组织的原位组织和3D结构。这项技术通过多重测量增强了类器官的质量控制，包括识别缺失的细胞类型和异常基因调控。空间转录组方法揭示了同一组织不同区域中发生的多种生物过程的机制。 将开发更方便的计算机程序来评估类器官的空间图谱。空间光活化彩色编码细胞地址标签可以在注释、跟踪和分离细胞的同时保持细胞活性。这种方法提供了一个计算框架，将数据集与大量先前的研究数据匹配，以确定空间偏差的转录组模式和丰富的细胞表型。 将单细胞方法与空间分析相结合，细胞图谱可以生成细胞信号网络和转录因子层次结构。这种方法已在长期类器官模型中进行了彻底测试，并允许进行复杂的细胞测试，如上皮、中胚层和内皮细胞在怀孕5-22周内的发育。（图4D） 总的来说，单细胞技术提供了前所未有的细节，揭示了分子和细胞水平的生物过程。特别是，单细胞RNA测序检测类器官中的异质性、细胞类型和细胞状态，而单细胞ATAC测序识别并建立这些细胞类型的可调节序列。空间转录组方法剖析了来自转录和蛋白质丰度的空间组织图谱，提供与参考图谱的比较，以优化类器官协议。先进的微技术，如微流控，可以为高通量功能分析工程化类器官。对细胞内在属性的全面评估增强了我们对类器官作为研究器官形态和功能的体外模型的理解。 1.9 组织学分析 类器官通过应用某些染色试剂模拟组织结构的相似性，这些试剂可以与组织/细胞的化学成分特异性结合。化学成分的变化通过病理分析显示，从而加深了对结构变化和代谢变化的理解，特别是对于某些代谢性疾病的诊断。（图5）随着生理相关的肿瘤模型在最近的研究中被广泛使用，临床前类器官模型忠实地重现了组织学特征和药物反应。它们在筛选候选药物（特别是化疗药物）以及在临床进展中的应用的重要性逐渐显现（表1）。当使用组织学技术评估患者来源的类器官（PDO）的生长时，发现PDO具有开放腔室的球形结构。通过免疫荧光技术确认PDO可以表达胆管癌表型的细胞角蛋白，并可以测试其对药物NTRC 0652-0的敏感性。 图 5 组织学分析检测类器官中的结构变化。基于抗原-抗体结合反应，组织学分析通过病理染色技术检测结构变化。通过与类器官中特定细胞类型结合的特定免疫荧光技术，可以清晰地看到类器官的结构。 原始人类类器官可以显示肿瘤样细胞的形态、组织结构和极性，而细胞球体只能形成均匀的非空心球体。患者来源的胃癌（GC）类器官中的组织学亚型规格反映了克隆差异或分化层次。通过组织病理学分析和基因表达分析的原位杂交，建立了人类弥漫性胃癌，准确模拟了组织学亚型。这表明组织学亚型规格是由肿瘤微环境而非细胞内在差异调节的。 人类类器官还重现了目标器官的多样性和功能，这可以通过组织学分析进行评估，用于基础和转化研究。单细胞RNA测序和组织化学揭示了视网膜类器官与人类视网膜细胞类型和体内发育的相似性。它们包含色素上皮的斑块，其光感受器显示出特征性的亚细胞区室，与成人视网膜的三层核层和两层突触层相匹配的形成。生物反应器可以根据这些特征扩大视网膜细胞的制造。 形态学或组织化学分析可以在长时间连续培养时检测细胞层次，观察分化方向。组织学和超微结构分析对于评估人类肝脏类器官（HLO）药物筛选模型的微观解剖结构非常有价值。免疫组织化学分析揭示了HLO中的管状结构包含人类肝细胞，反映了体内肝脏组织的独特微观解剖结构。为了推进研究，基于HLO的药物诱导肝损伤检测可以转变为一个高速实时成像平台，具有384个孔，能够进行多通道读取以测量生存能力。这种方法成功预测了基因组对肝脏毒理学研究的易感性，并促进了化合物优化。 类器官的组织学评估有其固有的局限性，特别是当评估脑类器官中特定途径的神经元网络活动时。需要采用替代方法，如钙成像和体外记录，以克服这些局限性，更深入地了解大脑网络功能。组织完整性差影响肌腱类器官的评估，需要研究恢复策略。 1.10 形态学分析 显微镜技术的进步使得筛选和成像日益复杂的生物模型成为可能。为此，类器官被期望用于高内涵成像，因为它们需要充分表征以重现其母体组织。同时，基于显微镜的图像选择提供了高信息量，并允许进行表型分析。尽管如此，获取高分辨率图像和分析复杂的类器官结构带来了技术和分析挑战（图6）。 图 6 最近用于类器官成像的形态学分析。为了解码类器官的3D结构，不仅在表征中应用了传统技术，还使用了高内涵成像系统来全面展示综合的空间信息。 为了可视化类器官的空间关系，可以使用荧光活体显微镜结合扫描电子显微镜进行评估。在评估类器官的3D形态和细胞密度时，光学相干断层扫描（OCT）是一种有用的方法，可以在不标记的情况下检测Matrigel对通过液体覆盖技术生成的类器官的影响。此外，OCT不仅提供了结构活性的信息，而且还通过区分圆盘状聚集体和肿瘤类器官中存活或死亡的细胞，为纵向药物功效研究提供了概念验证（表2）。 除了可视化类器官生长外，共焦拉曼显微镜最近被用于评估凝胶基质中的类器官形成。这种无需标记且无创的技术提供了有关材料-细胞相互作用的有价值的信息，有助于选择合适的水凝胶配方作为动物源培养基质替代品。此外，相差显微镜、荧光寿命成像显微镜（FLIM）和高光谱成像（HSpec）为活体类器官的微观结构和代谢功能提供了实时和无创分析的机会。由于深度依赖的光衰减限制了穿透深度，类器官难以表征亲密的细胞-ECM相互作用。因此，通过丙烯磺化物交换扩张显微镜（PhASE-ExM）发展了光转移技术，以克服这些挑战，甚至在亚微米尺度上可视化类器官及其ECM。传统成像方法不可避免地影响了体积获取的时间分辨率，导致无法捕获快速的细胞和组织动态变化。混合点扩散函数（hPSF-FLFM）和傅里叶光场显微镜可以用来更快地扫描更大的体积和高分辨率，并探索类器官研究中的复杂时空机制。FLIM也用于在芯片上的类器官受到流动时可视化活体机械应力。 各种成像方法已经改变了类器官评估。共焦显微镜有助于药物渗透和实时荧光定量，用于视网膜母细胞瘤玻璃体种子的药物反应分析。活体成像染料，活体功能分析工具，可以揭示肾脏类器官中跨上皮运输的纵向成熟。Gessner等人介绍了一种3D功能性超声成像技术，为了解类器官中的血管网络结构和营养获取提供了见解，对于人类肝脏发育特别有价值。该方法提供了统计流速分布可视化，显示血管回路的矩阵，并且有潜力用于使用保留胶原蛋白和生长因子的“生物基质支架”进行血液透析研究。 慢性成像不容易与通过分离细胞进行分子表型筛选的方法兼容。Denoth-Lippuner等人发明了一种可诱导的细胞分裂计数器（iCOUNT），用于使用延迟成像和重组蛋白诱导的标签交换，通过细胞周期依赖的内源性蛋白标记，分析体外神经干/祖细胞的细胞分裂历史。高速扫描离子导电显微镜用于长期成像，可以同时揭示类器官的形态。它可以动态揭示细胞类型依赖于细胞基底表面和局部弹性模量（E）的形态相关因素。长期延时成像可以并行监测多个类器官的活性和均质性。由于它们的异质性和抽象形态，分析类器官的结构发展具有挑战性。Abdul等人引入了D-CryptO，这是一种基于深度学习的图像分析工具，可以自动分类类器官形态，特别是评估结肠类器官的隐窝形成和颜色不透明度，有效解决了这一限制。大脑类器官（或脑类器官）为活体分析提供了宝贵的平台，包括荧光成像。Giandomenico等人设计了一种简单但有效的方法，结合基本工具和免疫染色，标记神经元并研究它们的形态。这个方案突出了类器官的结构细节，与未图案化的脑类器官相比，实现了改进的形态和可重复性。由于其高信噪比，这种方法非常适合高对比度分割研究。脑类器官中缺乏血管系统会导致坏死核心的形成，限制了它们作为药物筛选和空间模式实验模型的有用性。为了解决这个问题，使用聚己内酯支架的工程方法创建了具有改善扩散条件的平面类器官，防止坏死。这种方法允许定制大小，并促进自我生成的回旋，以更好地模拟大脑。另一项研究使用具有连续介质流动的微流体系统，通过改善氧合和代谢成熟，减少“死亡核心”并提高细胞活力和分化效率。 这些先进的成像技术为类器官提供了洞见。通过弥合细胞动态与宏观行为之间的差距，这些成像工具为基于类器官的研究、药物筛选和组织工程的进步铺平了道路。然而，形态学分析在动态数据、潜在的假象和主观性方面存在限制。还需要开发更先进的图像处理和解释方法。 1.11 功能属性分析 考虑到人类真实组织和器官的多种功能，类器官应该具有相似的功能（图7）。尽管完全模拟功能属性仍然具有挑战性，但特定的分析可以评估它们之间的相似性。来自53位患者的活体膀胱癌类器官生物库通过免疫组化和基因表达分析揭示了不同的亚型，表明了开发新的膀胱癌治疗方法的潜力。这突出了类器官发展的未来方向，旨在创建具有不同功能属性的多种体外模型，类似于生物银行。这些类器官技术的进步为个性化医疗、药物发现和疾病建模打开了大门。 图 7 功能属性分析评估类器官的模拟性。不同种类的类器官是从干细胞生成的，它们在体外和体内都具有基本的功能属性。越来越多的技术结合传统设备被开发出来，用以评估生理学和结构功能属性，例如体外的电生理学和生物力学。重要的是，未来的研究中，类器官应该被开发来模拟体内微观生物过程和宏观系统过程。 1.11.1 体外 为了更好地适应人体的真正器官，模拟体外相应的物理属性是构建成熟类器官的进一步要求。 生理功能属性 基于CMOS的微电极阵列（MEA）设备能够大规模映射皮层突触投影和神经网络之间的功能连接。高密度3D电子探针克服了技术限制，记录了三维神经活动。先进的CMOS-MEA技术从类器官切片生成详细的电活动图，相当于形成大脑横截面区域。Sharf等人通过电极冗余和由神经元位置确定的波形形状，精确地分配个体单元活动，展示了药理干扰对生理参数的影响。在神经活动记录方面的创新为类器官功能提供了宝贵的见解，增强了我们对神经网络和药物效果的理解。 根据最近的研究，可以看到心脏类器官已经逐渐发展出了腔室和心脏细胞组织的基本形态，并具有模拟血管化和电生理信号的功能（图8A-B）。与使用微尖端分析单细胞动作电位的贴片钳技术相比，使用钙成像和MEA测量的类器官受到的损伤较小。因此，未来可能会广泛使用提供高通量和多模态表征的新技术。 结构功能属性 光学成像对于心脏组织或类器官的机械评估是有限的。集成基于纳米分裂铂膜的软电子传感器提供了一种柔软且超灵敏的方法，可以直接测量天然细胞培养中的心脏类器官收缩。这项技术允许与各种大小和形状的类器官可靠接触，为它们的机械属性和功能提供了宝贵的见解（图8C-F）。 可以通过基于图像的方法评估骨骼肌组织的收缩性，以表征软结构的运动。为了准确测量与光学刺激相关的空间和时间收缩机械属性，赵等人创建了一种微型3D框架。作为3D骨骼肌组织的机械接口，3D光遗传活性肌肉环可以在不同条件下检测骨骼肌组织的机械属性。 从iPSCs生成的运动神经元球体与骨骼肌纤维共培养，在微流控设备中诱导肌肉收缩，以确定肌萎缩侧索硬化症的发病机制（图8G-H）。 其他多种类器官的机械属性正在等待进一步的功能评估方法来表征。 图 8 高级技术评估类器官的多重功能属性。(A) 在跳动室形成中的心肌细胞（CMs）成熟度的验证 - 人类心脏（CF-hHOs）。版权所有 2022，Elsevier。(B) 内在光学传感（IOS）在类似心房区域（红色）和类似心室区域（蓝色）的局部波形。比例尺：200 微米。版权所有 2022，Elsevier。(C) 基于铂的弹性纳米裂纹力感应膜组装在基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的类器官培养室中。版权所有 2022，Springer Nature。(D) 类器官和软力感应膜界面的光学图像。版权所有 2022，Springer Nature。(E 和 F) 工程化的血管化人类心脏类器官，用心脏肌钙蛋白T（绿色，心肌细胞）、CD31（红色，内皮细胞）和DAPI（蓝色，核）染色。(E) 和 (F) 中的比例尺分别为 500 和 100 微米。版权所有 2022，Springer Nature。(G) 肌萎缩侧索硬化症（ALS）的微生理3D模型和光遗传运动神经元。运动神经元（MN）球体和肌肉纤维束嵌入在微流控芯片的胶原蛋白凝胶中，时间点为第0天（D0）。版权所有 2018，美国科学促进会。(H) 制造的骨骼肌纤维束大约长1500 微米，在第7天和第21天附着在柱子上。比例尺，200 微米。版权所有 2018，美国科学促进会。(I) 人类脊髓微生理系统，由人类脊髓类器官和3D打印的类器官支架装置组成，用于模拟阿片类药物诱导的耐受性和痛觉过敏。 1.11.2 体内 类器官模拟体内生化过程的能力尚不健全，需要额外的技术来评估和检测。 微观生物过程 大脑类器官是患者匹配脑修复的有希望的方法。为了研究大脑神经回路的解剖性能，光遗传学被用来研究类器官神经。Yoon等人对表达ChR2的人类皮层球体(hCS)应用光遗传刺激来触发潜在的效应。结果表明，hCS在功能上已经成熟，并且可以模拟神经系统疾病的发病机制。在模拟人类疼痛方面的最新进展是有希望的；然而，脊髓类器官的可重复神经电测量仍然难以实现。新的人类脊髓微物理系统，结合即插即用神经活动传感器，已经实现了阿片类药物诱导的耐受性和过敏疼痛的生物过程建模。独特的平面类器官设计不仅克服了类器官和MEA电极之间的电极接触问题，而且还支持神经成熟/活动，这将在转化疼痛研究中得到广泛应用（图8I）。此外，Wu等人开发了一种味觉芯片上的类器官系统(TOS)，使用生物电子类器官来模拟味觉系统。TOS通过从刺激浓度中提取信号特征并使用主成分分析，准确识别味觉感觉。这些创新为推进疼痛和味觉研究提供了潜力。 宏观系统过程 当前的肠类器官仍然缺乏对人类肠道生物学和体内免疫成分的完整表示。一种新的带有免疫细胞的人类肠道类器官在微生物暴露后显示出免疫反应的激活和IgA抗体的分泌，为研究感染或过敏驱动的肠道疾病提供了模型。将肝脏类器官与液相色谱-质谱(LC-MS)直接集成，允许选择性自动跟踪药物代谢。肝脏类器官配备有液相色谱柱外壳，可以通过将“柱中的器官”单元与LC-MS在线耦合来监测和分析药物的第一阶段代谢。同时，作为概念验证，“柱中的器官”单元可以检测海洛因酶代谢产物的产生。 类器官的成熟是一个主要挑战。尽管类器官能够分化为许多不同细胞类型，但考虑到可能不精确的规格和成熟状态，其展现生理相关功能的能力仍然未知。然而，随着更多先进技术的出现，类器官将成为理想的模型，模拟体外和体内的功能属性。 2.结论 几十年来，类器官技术已经从构建类器官的技术限制转变为进一步评估生理保真度以证明其效用。研究人员通过优化培养格式和条件的改进，如应用于高通量药物筛选的器官芯片，做出了巨大努力以提高类器官的保真度。然而，由于不同的协议似乎产生了具有不一致特征的类器官，因此迫切需要提出黄金标准来定义“真正的”类器官是什么。本文讨论的技术提供了高信息量，以探索类器官的多细胞结构内的细胞机制，使我们可以评估它们与体内人类组织的成分和功能属性的比较。传统的低维技术阐明了类器官的基因组学、蛋白质组学和表观基因组学，而先进的单细胞方法允许评估微妙的细胞状态和空间信息。病理学和形态学分析提供了宏观见解，对于理解类器官的生理相关性至关重要。表征细胞组成、组织结构、形态结构和功能特征确保了一个可重复和全面的类器官模型。然而，考虑到组织异质性，类器官是否甚至在功能属性上完全替代传统的动物模型？未来的评估必须提高分子机制和独特物理特性的保真度。另一方面，我们必须牢记，一个强大的类器官模型对于获得可重复的结果而不是3D细胞混合系统对于基础和转化研究至关重要。一个强大的类器官模型应该反映体内人类器官的细胞组织、组织结构、基因表达模式和发展轨迹。 总之，随着多重模态技术的不断扩展应用范围，类器官正逐渐成为一个准确和通用的仿生模型。随着智能算法和机制研究在类器官中的广泛整合，高维技术将得到发展，以提高类器官的仿生准确性。也许在不久的将来，类器官共培养也将被用于更大规模的细胞-细胞通信和系统生物过程建模，以产生生物学见解（图9）。 图 9 综合评估类器官的技术方案。未来经过良好评估的类器官目录将专注于量化生物学变异，并解决环境扰动，以更好地代表体内原始组织。为了全面评估复杂的类器官模型，多组学分析在揭示类器官内的分子机制、分析基因组、转录组和蛋白质组方面发挥关键作用。单细胞分析和空间分析提供了与相应人类组织相比类器官内分子图谱前所未有的高维评估。病理学和形态学分析恢复了宏观尺度上的完整架构图景，以评估相似性。功能属性分析将确定类器官协议是否实现了类似于真实器官的复杂功能。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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导读 我们通常认为癌症是一种与衰老挂钩的疾病，随着年龄的增加，患癌的风险也会有所增长。 但事实上或许并没有这么简单，最新研究表明，老年人患肺癌的风险急剧下降，70岁至75岁后的老人，尤其是耄耋老人，癌症的发病率神秘下降。 这是为什么？ 01 耄耋之年意想不到的“福利” 癌症是一种可怕的疾病，人们对其谈之色变，患癌除了无尽的生理、精神痛苦外，还会将整个家庭的经济拖入到无尽深渊。 在传统认知中，癌症常被视为衰老的副产品，一般认为癌症随着年龄的增加而风险加大，许多癌症的确诊高峰往往出现在人们的六七十岁。然而，令人费解的是，一旦跨过这个年龄段，许多癌症的发病率却神秘地下降。 最近，佛罗里达州坦帕市H. Lee Moffitt癌症中心与研究所研究衰老与癌症的专家Ana Gomes指出，“这个现象我们观察了几十年，但一直未能找到合理的解释。” 然而，近来科学家的最新研究或许能揭示其背后的原因。 据两项针对小鼠的研究，步入耄耋之年的老年人或许能享受到一个意想不到的“福利”——患肺癌的风险显著降低。 这些研究成果以预印本的形式发布在bioRxiv上，虽然尚未经过同行评审，但它们已经揭示了与癌症风险下降密切相关的特定基因，并意外地发现了这些基因与铁代谢之间的紧密联系。 同时，新研究也揭示了衰老过程中组织结构的改变同样在影响着癌症的发生。 以肺部为例，随着年龄的增长，肺部组织会逐渐积累疤痕，细胞再生能力减弱，对无序生长的抵抗力也随之下降。Gomes解释，“从结构和功能上来看，老年时期的身体环境与年轻时截然不同。这种变化可能不利于肿瘤的生长。” 此外，新发现的与铁代谢相关的基因也可能在癌症风险的变化中扮演了重要角色。铁作为生命活动中不可或缺的元素，其代谢过程的异常往往与多种疾病相关联。 02 关键蛋白助力老年群体远离肺癌 这一研究由斯坦福大学癌症生物学家Emily Shuldiner及其团队领衔，他们通过精心设计的实验，揭示了年龄与肺癌生长之间的微妙关系。 为了深入了解衰老对肿瘤生长的影响， Shuldiner团队利用了一种特殊的实验小鼠模型，这些小鼠体内携带了一种可由基因开关控制的致癌突变。研究团队分别在年轻和年老小鼠的肺部激活了这些突变基因，结果令人惊讶：年轻小鼠的肿瘤不仅数量更多，而且体积也更大。这一发现挑战了我们对年龄与癌症风险之间关系的传统认知外，还提示我们衰老过程中可能存在某种机制在抑制肿瘤的生长。 为了进一步探索这一机制，研究团队采用了CRISPR/Cas9基因编辑技术，在小鼠肿瘤中逐一评估了超过二十个具有抑制肿瘤生长功能的基因。他们发现，虽然关闭这些基因中的大多数都会加速各年龄段小鼠的肿瘤生长，但年轻小鼠的肿瘤数量更多、体积更大。这一结果暗示，在年老小鼠中可能存在一种不同的过程来抑制癌症的发展。 与此同时，另一项由纽约市纪念斯隆-凯特琳癌症中心癌症生物学家Xueqian Zhuang领导的研究团队，则发现了衰老与铁代谢之间的紧密联系。他们发现，随着衰老，小鼠和人类肺细胞中会增加一种名为NUPR1的蛋白质的生产。这种蛋白质能够影响铁代谢，使得细胞表现出铁缺乏的状态，从而限制了其快速生长的能力——而这正是癌症的一个显著特征。 为了进一步验证这一发现，Zhuang团队利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在年老小鼠中失活了Nupr1基因。结果，这些小鼠肺部的铁水平上升，而它们患肿瘤的风险也随之增加，变得与年轻小鼠相似。这一实验结果不仅证实了NUPR1在抑制肿瘤生长中的重要作用，还为我们提供了干预这一过程的潜在靶点。 更为引人注目的是，研究人员还在人类身上发现了类似的现象。他们发现，80岁以上人群肺组织中的NUPR1含量显著高于55岁以下人群，这表明小鼠实验中发现的机制在人类身上同样存在。这一发现不仅为我们理解肺癌的发病机制提供了新的视角，也为开发新型肺癌药物提供了重要线索。    03 肺癌或许是个例外 不过，研究人员认为人类与小鼠在肿瘤生成机制上可能存在重大差异。在人类身上，致癌突变往往是一个长期积累的过程，癌症的种子可能在数十年前就已悄然埋下，直至肿瘤被检测出来。 而在小鼠模型中，肿瘤的生成则显得更为直接和迅速——通过在小鼠老年时突然激活致癌基因来实现。这种差异提醒我们，在将小鼠实验结果应用于人类癌症治疗时，必须保持谨慎和批判性思维。 斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的肿瘤学家兼癌症流行病学家Cecilia Radkiewicz指出，肺癌的研究成果并不能简单地推广到其他类型的癌症上，“不同部位的癌症之间存在显著的生物学差异，它们由不同的生物驱动因素所主导。” 事实上，每一种癌症都有其独特的病理机制和生物学特性，随着年龄增长而出现的发病率下降可能只是一种假象。肺癌或许仅仅是个例外。    参考资料 Why cancer risk declines sharply in old age https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/d41586-024-02107-z 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

*仅供医学专业人士阅读参考 本质上来说，癌症是由DNA突变积累所导致的，因此癌症与年龄密切相关。理论上来说，随着年龄增长，积累的基因突变更多，癌症发生的风险就更高。 与这个观点相印证的是，大多数癌症的确发生在60岁以上的老年人当中；但与之不符的是，当年龄进一步增加，高龄者的癌症发病率反而会下降。有研究认为，大多数实体瘤的发病率在75-85岁后会降低。 这是为啥？长寿还有这效果？ 近期，《自然》杂志发表评论文章，讨论了两篇发表在预印本杂志bioRxiv上的论文。一篇论文发现，在衰老小鼠中，抑癌基因失活带来的影响会减弱，如PI3K/AKT通路的负调节因子PTEN。另外一项研究则发现，衰老会增加小鼠和人类肺部NUPR1蛋白，这种蛋白会影响细胞铁代谢，导致癌细胞陷入缺铁状态、失去干性，无法快速生长。 看来，衰老给组织带来的负面影响，对癌细胞也是生效的，可以说是祸福相生了。 论文题图 确实，随着年龄的增长，组织环境也在变化。比如说，衰老的肺部可能具有更多的疤痕组织、再生能力也较差，这对于癌细胞的生长来说还真谈不上理想的环境。 为了了解衰老对癌症发展的影响，斯坦福团队开展了实验。研究者们利用Cre系统，在4-6月龄年轻小鼠和20-21月龄年老小鼠中激活KRAS突变。 神奇的是，15周后，研究者观察到，年轻小鼠中肿瘤生长速度远远超过年老小鼠，肿瘤负荷高达三倍。 年轻小鼠比年老小鼠肿瘤生长更快 为了找出背后的原因，研究者利用CRISPR系统对小鼠中25个已知或推测的抑癌基因以此敲除并观察变化。 抑癌基因敲除后，显然，小鼠的肿瘤生长会更加快速，但在年轻小鼠中肿瘤生长速度更快。例如，抑制PTEN使年轻小鼠和年老小鼠都发展出肺癌，但年轻小鼠中的肿瘤负荷约为年老小鼠的2.5倍。 单细胞RNA测序结果显示，癌细胞中也存在诸多衰老相关的基因表达改变，说明年龄同样会成为癌细胞转化的干扰项。 另一篇来自MSKCC的研究，则更具体地寻找到了一个衰老限制肿瘤发生的中介，NUPR1。NUPR1是一种核蛋白转录调控因子，参与铁稳态调控和DNA修复、内质网应激、氧化应激等其他细胞过程。 研究者发现，在衰老的荷瘤小鼠中，能观察到铁稳态相关基因的一致性改变，其中表达变化最大的就是NUPR1。此外，在多种其他癌症中也观察到了NUPR1表达的升高，NUPR1还可以有作为抗癌靶点的潜力。 实验中，研究者发现，NUPR1表达的增加导致了衰老细胞中的功能性铁缺乏，并造成了细胞干性的丢失，抑制了肿瘤的生长。使NUPR1基因失活，则会令衰老小鼠的肿瘤易感性升高到年轻小鼠的水平。 对人类组织的分析显示，70以上人群相较50岁以下人群，肺组织含有更高水平的NUPR1，意味着这条通路可能是保守的。 高龄人群中NUPR1水平更高 在《自然》的评论文章中，有研究者指出，高龄老人癌症发病率下降可能是一种统计学上的偏倚。根据一份尸检统计数据，虽然癌症登记数据显示，65-84岁癌症高峰期后发病率有所下降，但从尸检结果看，在高龄老人中癌症发病仍然是持续增加的，意味着高龄者缺乏相关的诊断可能才是真正的原因。 不过研究者也补充道，肺癌的确有其特殊性，将尸检数据考虑在内它仍表现出高峰期后的发病率下滑。或许本研究的结论无法普遍推广到其他癌种。 参考资料： [1]Shuldiner, E. G. et al. Preprint at bioRxiv https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1101/2024.05.28.596319 (2024). [2]Zhuang, X. et al. Preprint at bioRxiv https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1101/2024.06.23.600305 (2024). [3]https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/d41586-024-02107-z 本文作者丨代丝雨