CK1α x IKZF2

研究背景来那度胺是一种沙利度胺衍生物，可作为E3泛素连接酶底物接头cereblon（CRBN）和诱导蛋白底物之间的分子胶，作用示意图如图1图1 来那度胺作用机理锌指Ikaros（IKZF1）、Aiolos（IKZF3）、酪蛋白激酶1α（CK1α）等都是来那度胺的作用靶点。来那度胺及其衍生物的临床成功，也推动了开发更有效的CRBN配体以对抗IKZF1和IKZF3以及其他靶标如Helios（IKZF2）的研究。来那度胺靶向连接底物蛋白是通过识别暴露的β发夹残基，并对β发夹残基的结构高度敏感。如IKZF1与IKZF2在结构上只有单个氨基酸的差距。研究内容为了在不影响 IKZF1 和 IKZF3 的情况下选择性地促进IKZF2的降解，哈佛大学Dr Woo课题组制备了一系列来那度胺的衍生物（图2），并研究了这七种衍生物在AML细胞系MOLM-13细胞中对IKZF1和IKZF2水平的影响其结果如图3所示。可见萘基类似物3和二苯并呋喃类似物7能够诱导IKZF2降解。虽然这组化合物同样降解了IKZF1，但提供了优化改造方向。图2 初筛选衍生物结构图3 七种衍生物对IKZF1和IKZF2水平的影响对于为何这些化合物能够识别IKZF2，该课题组认为芳香族官能团的引入与IKZF2 H141会产生π堆积相互作用，以稳定IKZF2和CRBN之间的复合物，同时如果能够设计合适的化合物，有可能因为空间冲突而阻断IKZF1和IKZF3的募集（图4）。图4 来那度胺衍生物与底物蛋白结合示意图（橙色为IKZF2，青色为IKZF1）该课题组在此基础上，进一步研究了引入的芳香族官能团的连接方式对降解能力的影响，结果如图5、图6所示。虽然改变萘或者二苯并呋喃的连接位点并未产生显著影响，但将连接萘的苄基改为羰基之后，不仅显现出了对IKZF2不俗的降解能力，同时对IKZF1的降解有所减弱。   图5 萘连接方式的影响图6 二苯并呋喃连接方式的影响尽管IKZF2降解对萘（3）和二苯并呋喃（7）的结构改变敏感，但所研究的衍生物8-13也降低了IKZF1水平。因此，该课题组继续研究杂芳基和萘基取代基，以确定相对于IKZF1增强IKZF2降解选择性的化合物。最初尝试喹啉和异喹啉类似物，但并未产生显著的优势（图7）。   图7 喹啉与异喹啉官能团的影响为了研究取代基对IKZF2降解的影响，该课题组合成了具有电子性质和大小不同取代基的类似物（图8）。其中，氟、二甲胺、甲氧基取代均诱导IKZF1和IKZF2降解，虽然没有一种取代基相对于IKZF1增强对IKZF2的选择性，但甲氧基取代的衍生物（21）对IKZF2表现出最优的降解效果。图8 取代基对IKZF2降解的影响该课题组评估了包含34个CRBN配体的库，数据表明，甲氧基萘21可以获得所需的π堆积作用来募集IKZF2，但可能在构象上过于灵活而无法抑制IKZF1的募集（图9）。   图9 甲氧基萘21结合示意图在对衍生物21和9进行进一步建模的基础上，该课题组假设通过在甲氧基萘和异吲哚之间引入酰胺来使化合物21僵化会降低整体构象柔韧性，从而可能将化合物固定在有利于IKZF2募集和阻断IKZF1募集的构象中。为了定量检验这一假设，该课题组合成了萘甲酰胺35（图10），发现当处理12小时时，MOLM-13细胞中内源性IKZF2的选择性明显高于IKZF1（图11）。图10 萘甲酰胺衍生物结构    图11 萘甲酰胺衍生物降解能力IKZF2的有效活性促使该课题组对AML细胞中的类似物35（以下称为DEG-35）进行深入表征。对DEG-35的细胞系全组评估（图12）显示，发现其对IKZF2和CK1α降解显著，IKZF1降解不明显，GSPT1中等程度降解。这些发现还表明，DEG-35实际上是IKZF2和CK1α的双重降解剂，通过诱导p53依赖性细胞凋亡和分化来抑制MOLM-13细胞的细胞生长。由于IKZF2和CK1α都是AML的靶标，该课题组设想进一步基于DEG-35开发作为针对IKZF2和CK1α的双靶向降解剂。   图12 DEG-35的细胞系全组评估随着DEG-35体内研究的进展，DEG-35的两个缺陷变得明显。首先，在肝微粒体稳定性测试中，DEG-35在小鼠微粒体中表现出较好的微粒体稳定性，但在人类微粒体中半衰期较短（图13）。相比之下，来那度胺在微粒体中展示出良好的稳定性。图13 肝微粒体稳定性测试结果DEG-35在人微粒体中的代谢功能可能源于甲氧基的氧化去甲基化，这类似于非甾体抗炎药萘普生中甲氧基萘的去甲基化。为了降低氧化去甲基化速率，该课题中合成了一组具有氘代或更精细烷基的化合物（图14）。缺乏甲氧基的萘甲酰胺9和具有较大烷基的类似物增加了这些化合物的微粒体稳定性，对IKZF2和CK1α的降解影响很小。萘酚40代表了DEG-35氧化去甲基化的推定产物，其IKZF2和CK1α的降解显著降低，表明烷基是有效降解所必需的。       图14 甲氧基衍生物的底物范围和代谢稳定性其次，DEG-35的溶解度过低也导致了其有限的生物利用度。通过用喹啉取代萘而不增加DEG-35的疏水性，但这导致对IKZF2和CK1α的降解能力变弱，且没有显着增强人肝微粒体的代谢稳定性（图15）。   图15 喹啉衍生物的底物范围和代谢稳定性接下来，该课题组进行了支架多样化的尝试（图16）。对苯酰胺47和酰基酰胺48的初步尝试表明，双环取代基对IKZF2和CK1α的选择性降解很重要。萘49、乙烯基苯基50、二苯醚51和52、2H-苯并吡喃57和苯并呋喃59对CK1α和IKZF2表现出良好的降解活性。其中，57和59表现出最好的效果，但59的溶解性太差，限制了其应用前景。综合来看，2H-苯并吡喃57是效果最好的化合物。   图16 支架多样化衍生物的底物范围和降解能力令人兴奋的是，基于2H-苯并吡喃57的进一步构效关系研究表明，其对IKZF2和CK1α具有良好的降解能力和选择性。为了进一步探究2H-苯并吡喃核心周围的取代基耐受性，该课题组生成了具有甲氧基、三氟甲氧基、甲基、三氟甲基和溴取代基的类似物（图17）。在这些衍生物中，75-77和80对所需靶标IKZF2和CK1α的选择性最强，对IKFZ1和GSPT1的影响最小。虽然溴化化合物80和81表现出良好的选择性和降解能力，但它们的溶解性相对较差。   图17 2H-苯并吡喃取代基的研究根据这些数据，该课题组认为类似物77（以下简称DEG-77）表现出最好的综合性能，并对其进行更深入的表征。用DEG-77处理的MOLM-13细胞的蛋白质组学（图18）显示CK1α的选择性降解和细胞反应，在2小时时升高的p53蛋白水平。   图18 DEG-77处理MOLM-13细胞的蛋白质组学DEG-77还具有更好的体外代谢稳定性和体内半衰期，这与体内治疗效果相关，使得AML小鼠模型治疗后生存率显着增加。综上所述，DEG-77是一种有效的选择性IKZF2和CK1α降解剂，具有良好的代谢稳定性和溶解性，可用于体内研究。除了研究DEG-77在AML中的疗效外，该课题组还评估了DEG-77是否在AML以外的癌症的细胞系中显示出疗效。为了检查可能对DEG-77敏感的其他癌细胞系，该课题组利用在PRISM筛选的数据，从可能对DEG-77敏感的谱系中选择细胞系。最终筛选发现子宫内膜样卵巢癌细胞系A2780和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系OCI-LY3对DEG-35和DEG-77均高度敏感（图19），并通过蛋白质印迹验证了DEG-77处理后CK1α的降解。此外，通过实时定量聚合酶链反应测量的促凋亡蛋白Bax和细胞周期停滞蛋白p21的转录水平增加表明，在DEG-77处理后，两种细胞系中的p53激活（图20）。这些数据表明，DEG-77降解CK1α会激活AML以外癌症类型的细胞系中的p53。   图19 其他癌细胞系中的疗效    图20 实时定量聚合酶链反应测试DEG-77作用结论与展望该课题组报道了一系列靶向IKZF2和CK1α的分子胶降解剂的设计和合成，进一步研究得到了几种有效降解IKZF2和CK1α的化合物，其中，DEG-77对所需靶标的选择性最高。IKZF2和CK1α双重降解剂的开发提供了在单个化合物中检查这些不同类别蛋白质的多靶点治疗方法的能力。降解多个蛋白质靶标的能力可能会拓宽一个分子可以靶向的途径，并具协同作用的潜力。进一步的研究还揭示了DEG-77及其靶点在AML以外的其他癌症谱系中具有抗增殖作用。未来的研究将证明这类双靶点抑制剂（如DEG-77）对治疗癌症的潜在应用。作者：潘相奕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年1月2日参考文献Miyamoto DK, Curnutt NM, Park SM, Stavropoulos A, Kharas MG, Woo CM. Design and Development of IKZF2 and CK1α Dual Degraders. J Med Chem. 2023;66(24):16953-16979. doi:10.1021/acs.jmedchem.3c01736声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里!