PGRMC1

文章解读+创新点拓展，给您带来科研新体验！ 导读 口腔鳞状细胞癌（OSCC）是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其治疗策略一直备受关注。一项发表于Nature Communications的研究“A pilot study of neoadjuvant combination of anti-PD-1 camrelizumab and VEGFR2 inhibitorm apatinib for locally advanced resectable oral squamous cell carcinoma”探讨了一种新辅助治疗方案——卡瑞利珠单抗（一种抗PD-1抗体）联合阿帕替尼（一种VEGFR2抑制剂）用于局部晚期可切除OSCC患者的疗效及安全性。 研究背景 口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，特别是在亚洲地区，发病率相对较高。这类癌症通常发生在口腔黏膜上皮层，可以影响舌头、口底、牙龈、颊粘膜等多个部位。尽管外科手术是治疗口腔鳞状细胞癌的主要手段，但局部晚期的患者往往需要综合治疗，包括术前的新辅助化疗或放疗，以期减少肿瘤负荷、提高手术切除的可能性并改善预后。 传统的治疗方案中，新辅助化疗通常采用顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物，虽然能够使一部分患者受益，但仍有不少患者对治疗不敏感或治疗后复发。因此，开发针对局部晚期可切除OSCC的有效新辅助治疗手段是一个迫切的临床需求。近年来，免疫治疗作为一种新兴的治疗方式，已经在多种癌症类型中显示出显著的临床效益。 免疫检查点抑制剂，尤其是针对PD-1/PD-L1途径的抗体，能够解除肿瘤对免疫系统的抑制作用，激活机体自身的抗肿瘤免疫反应。然而，在口腔鳞状细胞癌中，单独使用免疫检查点抑制剂的有效率有限，而联合抗血管生成药物可能会增强免疫治疗的效果。 抗血管生成药物，如抗VEGFR药物，被认为能够通过肿瘤血管正常化和改善氧化代谢途径，增强抗PD-1免疫治疗的效果，并减少不良反应。基于此背景，来自中国上海交通大学医学院附属第九人民医院的研究团队开展了一项前瞻性I期临床试验，旨在探索PD-1抗体卡瑞利珠单抗联合VEGFR2抑制剂阿帕替尼作为新辅助治疗方案的安全性和有效性。 研究设计与结果 图1：实验流程图 这项由第九人民医院等多家机构合作完成的I期临床试验纳入了20位局部晚期可手术的OSCC患者，他们接受了三周期的卡瑞利珠单抗（每两周200mg）和阿帕替尼（每日250mg）治疗，随后进行了手术。主要终点包括安全性和主要病理反应（MPR，定义为≤10%残留活性肿瘤细胞）。次要终点包括2年的生存率和局部复发率（由于随访时间不足未报道）。探索性终点则涉及PD-L1综合阳性评分（CPS）与其他免疫学和基因组学生物标志物之间的关系及其与疗效的相关性。 图2：新辅助治疗的疗效 结果显示，新辅助治疗方案耐受性良好，MPR率为40%（8例），达到主要终点（图2）。值得注意的是，所有PD-L1 CPS大于10的五名患者均达到了MPR。18个月时的局部区域复发率和生存率分别为10.5%和95%。 图3：基因和肿瘤浸润淋巴细胞分析 对15例治疗前样本组织进行了下一代测序（NGS），发现突变最常见的基因是TP53（15%中14%，93%），其次是TERT（15%中9%，60%）和CDKN2A（15%中6%，40%）（图3A）。MPR组和非MPR组之间的基因突变、经典途径富集或肿瘤突变负担均无显著差异（图3B）。 图4：MPR组和非MPR组在新辅助治疗中TILs变化的比较 基于多色免疫荧光技术对新辅助治疗前后样本肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）进行分析，结果发现治疗后CD163+CD68+细胞增加、CD8+细胞/FoxP3+细胞比例上升，而CD3+细胞和FoxP3+细胞减少，说明该治疗方式显著改善了肿瘤免疫微环境（图4）。进一步分析发现，获得MPR的患者表现出更多的CD4+ T细胞浸润（图3D），而CD8+T细胞浸润相较非MPR患者则没有差异，提示CD4+与更好的治疗结果有关。 值得注意的是，一例非MPR患者在影像学评估中发现肿瘤进展，生长动力学变化超过50%，颈部淋巴结转移，并证实为疾病超进展（图5）。基于多色免疫荧光的分析显示该患者在治疗前展现出较高的CD163+细胞和CD8+T细胞浸润浸润水平，经新辅助治疗后CD163+细胞增加而CD8+T细胞减少（图5C & 5D），提示超进展与M2巨噬细胞的浸润有关。  图5：高进展性疾病的特征 免疫组化结果显示治疗前后CD31和ɑ-SMA表达水平下降（图6），从而证实了阿帕替尼的抗血管生成作用。但CD31和ɑ-SMA的表达水平在MPR和非MPR患者间没有差异。 图6：抗血管生成评估 拓展延伸 在本研究中，多色免疫荧光（mIHC）技术被用于评估治疗前后肿瘤微环境的变化，为进一步探究导致疗效差异的免疫机制提供了良好的基础。多色免疫荧光技术在评估肿瘤免疫微环境上具有独特的优势： 1）多重标记能力 多重免疫荧光技术能够在同一组织切片上同步检测和可视化多个不同的蛋白质或细胞类型。这对于理解肿瘤微环境中的复杂相互作用至关重要。在本研究中，研究人员能够同时检测CD3、CD4、CD8、PD-L1、CD163、CD68、FoxP3等多种标记物，从而更全面地评估治疗后的免疫学特征。 2）保留空间信息 组织切片保留了各细胞的空间信息，研究者可以使用不同的标记物进行标记，在一张切片上观察不同细胞和分子之间在空间上的相互作用。如果采用连续切片，还能提取三维空间信息。 3）提供定量数据 多重免疫荧光技术不仅可以提供定性的图像，还可以通过图像分析软件获得定量的数据，用于评估治疗效果和生物标志物的临床意义。本研究中通过量化CD4+ T细胞的密度，发现这些细胞的浸润程度与病理反应率有关联。另外，通过量化PD-L1的表达水平，研究者发现高表达PD-L1的患者有更好的病理反应率。 4）评估预后的新型方法 基于多重免疫荧光技术对治疗前后肿瘤免疫微环境的评估，明确免疫微环境变化与治疗效果或预后的相关性，可以为基于肿瘤免疫微环境的疗效或预后模型提供基础，为医疗决策提供帮助。 总之，多重免疫荧光技术不仅为我们提供了一种强大的工具，让我们能够深入理解肿瘤微环境中的动态变化，而且也为我们开启了评估治疗效果和预后的新途径。随着技术的不断发展和完善，我们期待它将在肿瘤学研究和临床实践中发挥更大的作用。 临床价值与展望 这项研究首次证明了卡瑞利珠单抗联合阿帕替尼作为新辅助治疗方案的安全性和有效性。对于局部晚期的OSCC患者来说，这一发现可能意味着一种新的治疗选择，有望提高患者的生存质量并降低复发风险。尽管如此，还需要更大规模、更长时间的临床试验来进一步验证这些初步发现，并探索最佳的治疗策略。 综上所述，这项研究为OSCC的新辅助治疗领域带来了新的希望。随着对肿瘤免疫学理解的不断深入和技术的进步，相信未来会有更多创新的治疗方案出现，为患者带来福音。 注：本文旨在介绍医学研究进展，不做治疗方案推荐。如有需要，请咨询专业临床医生。 参考文献： Ju WT, Xia RH, Zhu DW, Dou SJ, Zhu GP, Dong MJ, Wang LZ, Sun Q, Zhao TC, Zhou ZH, Liang SY, Huang YY, Tang Y, Wu SC, Xia J, Chen SQ, Bai YZ, Li J, Zhu Q, Zhong LP. A pilot study of neoadjuvant combination of anti-PD-1 camrelizumab and VEGFR2 inhibitor apatinib for locally advanced resectable oral squamous cell carcinoma. Nat Commun. 2022 Sep 14;13(1):5378. 点击下方「阅读原文」，前往梅斯官网查询更多实验技术服务支持~

A new study identified a set of 140 genes that may help predict enhanced disease-free survival in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) treated with a combination of immunotherapy and low-dose radiation. The results suggested that this 'gene signature' could be used to identify a subclass of lung tumors that is more likely to be eradicated by immunotherapies. A new study identified a set of 140 genes that may help predict enhanced disease-free survival in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) treated with a combination of immunotherapy and low-dose radiation. The results, published in Cell Reports Medicine on Feb. 23, suggested that this "gene signature" could be used to identify a subclass of lung tumors that is more likely to be eradicated by immunotherapies. Immunotherapy has saved countless lives but only 20 to 25 percent of patients respond to this treatment that activates a person's own immune system to attack their cancer. Predicting who would benefit from this approach and why could help patients who have exhausted other options such as chemotherapy. Studying a cohort of 60 patients with NSCLC, the team determined previously that adding a low dose of radiation to a course of durvalumab, an immune-boosting drug, promoted cancer-free survival in most of these individuals. Now, to assess why some tumors didn't respond to the therapy, the researchers examined pretreatment tumor biopsies from this study cohort. They determined the gene expression pro which showed the specific genes that are turned up and those that turned down in each sample. They compared the gene expression profiles of ten tumors that reached major pathologic response (MPR) -- the elimination of more than 90 percent of the cancer cells in patients' tumors -- with combination treatment versus six that did not. They discovered the two groups of pretreatment tumors could be reliably distinguished by a set of genes with 135 of the genes turned up and 5 turned down. The majority of the 135 genes were associated with enhanced cell growth, suggesting the tumors that responded to the dual therapy were particularly aggressive. The researchers were also able to examine how the gene expression pro in the responsive cancers before and after treatment. They found that in tumors displaying MPR, dual therapy not only reversed the activity of this 140-gene set, it also increased the activation of genes associated with cellular pathways involved in immunity and tissue repair. The activity of the 140 genes which correlated with treatment response is particularly promising as clinicians could use the signature to identify people who would gain the maximum benefit from immunotherapy. The researchers plan to test whether tumors with this aggressive gene signature have a better response to the combination therapy in a larger patient study.

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2受体（σ2R）在特定癌症中过度表达，视为肿瘤增殖的生物标志物。σ2R配体正在成为癌症和神经退行性疾病有前景的治疗诊断剂。密歇根大学设计和合成一系列新型喹啉基吡嗪酰胺类化合物作为高选择且有效的σ2R配体，在胰腺癌细胞系中显示出微摩尔效力。化合物14（JR1-157）和17（JR2-298）与σ2R结合亲和力Ki分别为47nM和10nM。化合物14的口服生物利用度为60%，在非同基因胰腺癌模型中具有显著的体内疗效，且没有明显的毒性。喹啉基吡嗪酰胺的细胞毒性在铜的存在下显著增强，而在铜螯合剂四硫代钼酸铜的存在下显著减弱。化合物14具有水溶性、代谢稳定的、可以口服并且增加自噬标记物LC3B的表达，值得进一步开发用于治疗胰腺癌。图1.化合物14和17发现和分子优化过程胰腺癌是一种侵袭性疾病，占美国第三大死亡原因，约占癌症的3%和死亡原因的7%。到2022年，大约62,210患者被诊断患有胰腺癌，约有49,830患者死于该疾病。由于胰腺癌早期发现困难、预后差、有效治疗方案有限、化疗耐药等，迫切需要开发有效治疗方式。近年来，σ受体（σR）已经成为治疗胰腺癌的潜在靶点。σ受体最初分为阿片受体（μ、κ和σ）的亚型，是定位于血浆中G蛋白偶联受体相关受体膜、内质网、细胞核、溶酶体和线粒体。σR分为两种亚型，σ1和σ2受体作为伴侣蛋白，干扰离子通道和GPCR受体活性，通过内质网应激和控制细胞内Ca2+稳态调节多种生理途径。σR与各种CNS疾病、神经涂星星疾病、创伤性脑损伤、药物滥用和癌症相关。σ1受体（σ1R）和σ2受体（σ2R）已被确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的潜在治疗方式。SIGMAR1基因编码σ1R，在中枢神经系统内外的多种组织中表达，其表达的蛋白除与酵母C8-C7甾醇异构酶有66.4%同源性外，与任何已知的蛋白序列均无相似性。已经有σ1R与选择性拮抗剂PD144418和选择性激动剂4-IBP共晶结构如Fig1所示。另一方面，σ2R分子结构长期以来一直不清楚。2017年，跨膜蛋白97（TMEM97）被鉴定为编码多功能四次跨膜σ2R的基因，也称为脑膜瘤相关蛋白（MAC30）。TMEM97与激素、钙和神经元信号传导相关，通过调节胆固醇的运输，在胆固醇稳态中发挥重要作用。调节胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1型（NPC1）。值得注意的是，σ2R可以作为黄体酮受体膜成分1（PGRMC1）与低密度脂蛋白受体（LDLR）三元复合物的结合位点。首批高分辨率晶体结构牛σ2R复合物如σ2R和5-HT2A拮抗剂roluperidone（PDB：7M94）和σ2R激动剂PB28（PDB：7M93）被解析出来（Fig1）。多种的化学结构具有碱性氨基和疏水片段以不同的亲和力与σR结合以及选择性公开报道出来。Siramesine是一种有效且具有选择性的σ2R激动剂。SW43在胰腺癌小鼠模型中表现出活性，PB221（PB28的阿哌嗪同系物）对脑肿瘤细胞具有抗增殖活性，在小鼠模型中显示出体内活性。直到现在，只有少数的σR配体能够进入临床阶段，包括神经退行性疾病、精神障碍、疼痛或诊断试剂。然而，目前尚没有治疗癌症临床试验的σR配体，这可能是由于对σR信号通路了解不足，以及关于σRs配体在临床前癌症模型中的活性的数据不一致。然而，越来越多的证据支持σR小分子配体作为药物治疗癌症的潜在用途。SIGMAR1转录物，σ1R蛋白水平的提升和特定的σ1R拮抗剂死亡诱导作用表明功能性σ1R是肿瘤发生和发展所必需的。另一方面，TMEM97似乎在肿瘤进展中发挥作用，并且σ2R在包括乳腺癌和胰腺癌在内的多种癌细胞系中过度表达。此外，σ2R已被用作增殖的生物标志物，并且σ2R放射性配体已用于肿瘤成像。几种σ2R配体在胰腺癌小鼠异种移植模型中显示出体内活性。虽然σ1R通过增强各种离子通道功能来控制癌细胞的电可塑性，但σ2R配体的细胞毒性可归因于ROS在内的多种致癌途径、p53和半胱天冬酶单独/依赖性细胞凋亡途径。因此，σR配体在癌症中的确切作用机制仍然不清楚。此前，已有研究发现氯喹与σ1R结合，Ki=109nM，但没有发现与σ2R结合的报道。密歇根大学假设氯喹中的5-(5-(二乙氨基)戊-2基)胺片段与σ1R结合。最近，鉴定出喹啉基吡嗪酰胺衍生物QN523作为有前途的先导化合物，在胰腺癌细胞中表现出显著的活性。因此，考虑将氯喹的片段结合到QN523上，以探索该分子结构1与σR亲和力。嫁接氯喹尾部部分可以形成盐，并可能提高整个分子的溶解度。密歇根大学提供了一类新的σ2R配体，其与σ1R相比具有纳摩尔效力和选择性，在胰腺癌异种移植模型中表现出显著的抗肿瘤活性。 确认杂交分子1与σR结合亲和力首先，将杂交分子1和氯喹对接到人σ1R与PD144418（PDB：5HK1）复合物的晶体结构中。σ1R晶体结构显示了每个聚合物中具有单个跨膜结构域的三聚体结构，其中羧基末端结构域显示出广泛的平坦、疏水性膜近端表面与内质网膜的胞质表面密切相关，在其中心有一个大的疏水性配体结合腔，使得配体具有较强的可塑性。这种结构使σ1R能够与多种蛋白相互作用，最广为人知的是其伴侣功能和与多种化学结构类型配体相结合，产生不同的σ1R配体结合模式。因此，σ1R配体的碱性氮原子与σ1R中的E172之间除了与形成结合口袋内部边缘的疏水残基形成多个疏水作用外，还会形成强的离子相互作用。密歇根大学的模型表明，与氯喹分子对接打分相比，分子1与σ1R的结合亲和力更高（化合物1为-10.69kcal/mol，氯喹为-8.74kcal/mol）（Fig3）。分子1和氯喹中带正电的碱性尾部均参与σ1R中的E172的阴离子相互作用，并且两个配体的喹啉环与L95和L182存在相互作用。分子1有较高的对接分数可能是由于与σ1R形成更多的疏水作用，尤其是与V84和F107有疏水作用。为了验证假设，合成了分子1并测试了其σR结合亲和力。与建模结果一致，与氯喹（Ki=741nM）相比，分子1对σ1R显示出更高的结合亲和力（Ki=196nM）。令人惊讶的是，分子1对σ2R表现出结合亲和力，Ki=22nM，而氯喹为5719nM。由于分子1对σ2R的高亲和力，接下来探索1的构效关系，旨在发现一类具有理想理化性质的新型选择性σ2R配体。 人类σ2R的同源模建和杂化结构1的分子对接首先用最近发布的牛σ2R与PB28（PDB：7M93）复合物的晶体结构作为模板，同源模建人σ2R模型。σ2R牛晶体结构揭示了深深嵌入膜中的配体结合位点，其中配体结合腔被溶剂阻挡。口袋横向开口进入脂质双分子层，而不是开口到内质网内腔。结合口袋的开口与疏水性和芳香族残基对齐。配体以中性、去质子化形式通过此开口进入腔穴，然后在结合位点质子化，从而与保守的D29形成盐桥。另一个保守的酸性氨基酸残基E73距D29约3Å，表明这些残基彼此通过氢键结合，E73可能被质子化。此外，位于细胞外loop环的D56参与氢键网络，该网络可能对受体的正确折叠很重要，但并不直接参与配体识别。人σ2R同源模型的结合位点与已发表的牛σ2R晶体结构几乎相同（对于22个口袋残基的主链α碳，RMSD=0.077）（Fig4）。与报道的晶体结构类似，该模型在与入口相对的结合腔内侧的一个结合子位点中包含有序分子。这种有序水分子是结合口袋的组成部分，与H21、Q77和Y103形成氢键桥接相互作用，并被认为参与了部分σ2R配体的高亲和力结合。与PB28相比，分子1对σ2R采用了不同的结合模式（Fig4）。分子1的喹啉环位置靠近由F66、L70、E73、T107、L111、I114和Y150包围的有序水分子（Fig4A）。分子1的吡嗪环面向结合腔中心的保守D29。带正电荷的末端N和分子1的吡嗪氮之间的分子内氢键正在形成假环，占据I24、M28、Y50、F54、L59、V146和Y147残基相互作用的结合腔的入口（结合模式A，Fig 4A）。因此，喹啉环取代可能会通过与σ2R残基相互作用而在很大程度上影响σ2R结合。或者，分子1以替代结合姿势翻转，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口。附加尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电荷的末端氮参与E73的阴离子相互作用（结合模式B，Fig4B）。根据这种结合模式，喹啉环上的取代可能通过与σ2R嵌入的膜成分相互作用而影响观察到的与σ2R的结合亲和力，但不与σ2R本身的残基相互作用。使用以PB28（PDB：7M93）作为模板的牛晶体结构的人σ2R同源模型的结合位点上σ2R上的分子1与PB28的对接模式比较。（A）分子1的喹啉环（橙色）靠近由F66、L70、E73、T107、T110、L111、I114和Y147相互作用的结合腔穴的入口。（B）分子1的替代对接模式，其中喹啉环占据σ2R结合位点的入口（结合模式B）。附件尾部中的NH基团与D29形成氢键，而带正电的末端氮参与E73的离子相互作用。（C）质子化哌嗪PB28（绿色）通过多个离子和氢键与D29相互作用，而甲氧基取代的芳香环与M28相互作用。与对接模式A中类似，在分子动力学（MD）模拟中主要的相互作用如下：与D29形成水桥氢键作用，与E73形成疏水作用，与Y147和Y150形成多种相互作用。对接模式B，MD模拟结果如下：D29参与多种相互作用，Y50、Y147和Y150主要为疏水作用，而E73参与相互作用，但非常弱。通过MD模拟检测到两种对接模式但针对不同氨基酸的离子相互作用，即D56用于模式A，D29用于模式B。有趣的是，D29和D56都与PB28相互作用。在没有获得σ2R与喹啉基吡嗪酰胺1的晶体结构情况下，MD模拟的结果模拟了两个对接模式看起来较为合理。因此，分子的两端都可能影响其σ2R的结合亲和力。密歇根大学准备探索取代基对喹啉吡嗪酰胺骨架的影响以及附加的氯喹尾部的性质。测试了所有合成的化合物对σR的结合亲和力，并在MIA PaCa-2胰腺癌细胞中测定其细胞毒性。 除喹啉基吡嗪酰胺的C7位外，环取代耐受性良好通过在喹啉环的不同位置引入甲基、甲氧基或卤素基团来选择喹啉环中最合适的取代位置。喹啉环2-5中带有甲基的化合物与σ2R具有显著的结合亲和力，Ki为16nM至85nM。但化合物6除外（Ki=2664nM），7-Me取代对结合亲和力不利。与σ1R相比，甲氧基类似物7-9对σ2R表现出良好的结合亲和力，Ki为13至40nM，而7-甲氧基衍生物10对σ1R表现出较差的结合亲和力（Ki=1626nM）。化合物11-15中具有吸电子氯取代的衍生物表现出显著的结合亲和力，σ2R结合亲和力（Ki为12nM-51nM）。然而，对σ2R的结合选择性较低。5-氟衍生物16和6-氟衍生物17保留了对σ2R的高结合亲和力，并且化合物17最有效（Ki=10nM）和选择性（σ1/σ2=16.5）。另一方面，大体积的6-溴衍生物18分别对σ1R和σ2R表现出中等的结合亲和力，Ki分别为46nM和27nM，在这组衍生物中表现出最低的选择性。LLE对应于pIC50（pKi）和由clogP表达的亲脂性之间的差异，多数配体与靶蛋白结合具有合理的LLE≥3，这意味着良好的药物特性。密歇根大学认为空间位阻可能是σR亲和力丧失的主要原因，如C7取代的衍生物观察到的实验结果。化合物2-6的构象分析结果表明，除了7-甲基取代的化合物6外，喹啉基吡嗪酰胺骨架需要保留平面性。化合物6的吡嗪酰胺核心骨架不是平面性，可能是由于7-甲基和C8上的羰基之间的形成冲突，导致构象变化（Fig5）。这也合理解释与7-甲氧基衍生物10一样，可以扩展到C7位的任何取代基。然而，不能排除与两个σR的空间位阻。经SAR分析C6是最适合替换的位点。因此，进一步合成了化合物19-22（表2）。与化合物6相比，化合物19-21中的这些取代对两种受体亚型的效力均较弱。而环丙基衍生物22表现出显著的结合亲和力（Ki=27nM），但其选择性较低（σ1/σ2=2.6）。在探索单取代的喹啉衍生物之后，密歇根大学开始研究双取代类似物23-26，结合单取代化合物中最好的取代基，23-26的Ki值分别为36nM、70nM、79nM和28nM。然而，对σ2R的选择性较差。通过以上的结构修饰认为，除了C7位置的分子平面性破坏造成结合活性丧失外，喹啉环中的取代都具有良好的耐受性。 碱性尾部部分对于σ2R结合至关重要接下来进一步调节尾部的链长和碱性对σ2R结合亲和力的影响。选择6-甲基和6-F取代的喹啉作为尾部片段变异的模板，它们对σ2R具有高亲和力和/或选择性，以及与其他衍生物相比具有更高的LLE。首先合成了不同链结构的衍生物（表3）。没有末端碱基中心的衍生物27、30和34-36没有与σ2R的结合亲和力。与二甲基乙基氨衍生物28（Ki=471nM）或吡咯烷乙基氨基32（Ki=165nM）相比，二甲基丙氨衍生物29（Ki=105nM）对σR表现出更高的结合亲和力，这说明链长度影响σ2R结合。如果尾部中有吸电子基团大大降低对σ2R的结合亲和力，如二甲基氨基乙氧基衍生物31（Ki=1344nM）和砜衍生物33和37（Ki=3770nM和2147nM），说明尾部的碱性是σ2R结合所必需的。与哌嗪基乙基氨基化合物39相比，氨基乙基哌嗪基38表现出更高的结合亲和力（Ki=129nM vs. 400nM）。与5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链密切相似的羟基取代的尾部40表现出与σ2R的显着结合(Ki=71nM)，而化合物41中的哌啶氧基尾部具有较低的σ2R结合亲和力(Ki=134nM)。通过SAR分析，5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链非常适合与σ2R结合，并且结合亲和力取决于尾部片段的碱性和链长。 羰基和吡嗪环对于喹啉基吡嗪酰胺的σ2R结合不是必需的接下来，密歇根大学合成了化合物42和化合物43，分别考察去掉吡嗪基团和羰基的影响，这些化合物保持了显著的σ2R结合亲和力（Ki=52nM和65nM），说明结合亲和力主要来源于5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部与σ2R结合位点相互作用的贡献。用其它杂环替换吡嗪环合成了一些恶唑类似物，但由于稳定性较差没有进一步探索。用化合物44中的噻唑替换吡嗪保持了与化合物17相同的活性。作为酰胺的生物电子等排体，合成了磺酰胺连接子的化合物45，与化合物17相比，亲和力提高了3倍（表4）。化合物42-45维持了σ2R的选择性，并再次验证了5-((5(二乙氨基)戊-2-基)氨基)尾部负责与σ2R结合。 吡嗪酰胺杂合体抑制胰腺癌细胞的生长筛选合成的化合物在MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中的细胞毒性（表1-4）。对带有氯喹尾部的单取代衍生物SAR分析表明，6-甲基类似物5是最有效的化合物（IC50=1.1±0.3μM），而7-甲基衍生物6则无活性（IC50>30μM）（表1）。同时观察到氯的类似趋势和甲氧基类似物。与2-Me或2-Cl同系物相比，化合物7中仅C2位的甲氧基取代保留了效力 (IC50=1.9±0.5μM)。5-Cl、6-Cl、6-F和6-Br衍生物14-18显示出显著的细胞毒性（表1）。显示出σ2R结合亲和力减弱的化合物（如化合物6和10）的细胞毒性明显低于具有良好结合亲和力的化合物。双取代化合物与单取代化合物相比，类似物23、25-26的细胞毒性降低了3-4倍（表2）。密歇根大学同时还研究了尾部片段的取代基的耐受性。然而，在细胞毒性方面，烷基氨基链（27-32）没有观察到太大的差别（表3）。另一方面，分别在33和34中带有尾部的二氧硫代吗啉和异羟肟酸没有细胞毒性。在探索了与吡嗪环直接C、N和O键合的化合物的活性之后，又检测了硫和磺酰基键合类似物的活性。尽管NH−SO2−基团导致35和36的效力完全丧失（IC50>30μM）；与之前合成的类似物相比，具有SO2−NH−基团的化合物37表现出更高的细胞毒性（IC50=0.6±0.3μM）。哌啶氧基类似物41中的醚键 (IC50=6.5±3.5μM) 并未改善细胞毒性。经过对不同尾部基团的探索，观察到细胞毒性与σ2R结合亲和力没有明显的相关性，后者似乎仅取决于尾部基团的链长和碱性。化合物42 和43的效力丧失表明吡嗪环和酰胺官能团对于细胞毒性至关重要（表4）。噻唑类似物44显示 IC50=1.5±1.6μM（表4）。磺酰胺衍生物45的细胞毒性低4-5倍（IC50=3.8±0.9μM），与17相比（IC50=0.9±0.3μM）（表4）。最具细胞毒性的类似物14和17对σ2R的Ki分别为47nM和10nM，尽管它们与化合物6相比选择性较低。从SAR分析结果，可以得出结论：5- ((5-(二乙氨基)戊-2-基)氨基)链负责σ2R的结合亲和力，但不负责细胞毒性。两个类似物42和43尽管不具有细胞毒性，但仍显示纳摩尔范围内的σ2R结合。这与之前的研究一致，即几种σ2R配体发挥的细胞毒性与σ2R的调节无关。在TMEM97或PGRMC1敲除细胞系或 TMEM97/PGRMC1双敲除细胞系中，σ2R配体对细胞死亡的诱导不受阻碍，表明细胞毒性作用不是由TMEM97或PGRMC1直接介导的。 吡嗪酰胺类衍生物对σ2R的选择性由于σR与GPCR家族相关，密歇根大学针对一组45种GPCRs和相关跨膜靶标筛选了合成的化合物。化合物14和17相对于其他GPCRs（前20个）的选择性概况如表5所示。一般来说，大多数类似物合成的1-5、7-9、11-18和22-26表现出低纳摩尔结合，并且对σ2R的选择性比σ1R高5-10倍。 化合物14和17在人和小鼠肝微粒体中稳定在小鼠肝微粒体（MLM）和人肝微粒体（HLM）存在下，测试了对σ2R表现出高结合亲和力并在MIA PaCa-2细胞（约1μM）中为有效细胞毒性的化合物的微粒体稳定性。在MLM中，6-甲基类似物5的t1/2为21.0分钟，而相应的2-MeO类似物7, 5-氯类似物14和化合物17的t1/2分别为54.0、60.0和45.3min（表6）。6-甲基喹啉类似物5的微粒体稳定性低可能归因于苄基甲基的氧化。化合物44（MLM中t1/2=3.3min和HLM中t1/2=23.0min）和45（MLM中t1/2=15.0min和HLM中t1/2=39.2min），与化合物17（MLM中t1/2=45.3min 和HLM中t1/2>60分钟的比较，表明吡嗪具有更高的代谢稳定性。不幸的是，化合物37在MIA PaCa-2细胞中表现出所有测试化合物中最高的效力，但其微粒体稳定性较差（MLM中的t1/2=6.0min），这阻碍了进一步的探索。因此，选择化合物14和17进入体内研究。化合物14抑制多种胰腺癌细胞系的生长在人（MIA PaCa-2、PANC1和BxPC3）和鼠（PAN02和KPC-2）胰腺癌细胞中进一步评估了化合物14和17的细胞毒活性。化合物14和17在所有测试的细胞系中显示出低微摩尔细胞毒性，具有不同的效力，其中MIA PaCa-2细胞系最敏感（表7）。化合物14和17在其它五种胰腺细胞系中的MIA PaCa-2中活性更高，如集落形成测定中所示（Fig6）。化合物14对正常细胞的毒性低于吉西他滨为了评估化合物14对癌细胞的优先作用，密歇根大学在三种正常细胞系[人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人包皮成纤维细胞（HFF-1）、人HPDE细胞系高于HFF-1细胞系(表8)。在HEK-293和HPDE细胞中，化合物14的毒性显著低于吉西他滨。化合物14与σ2R激动剂西拉美辛有轻微拮抗作用，与σ2R拮抗剂CYR-101有叠加作用为了进一步阐明细胞死亡机制，密歇根大学将14种信号抑制剂联合使用，包括铁死亡[铁他汀和去铁胺（DFO）]、细胞凋亡（Z-VAD）、坏死性凋亡（Necrostatin）、自噬（氯喹）、m-TOR（雷帕霉素）以及活性氧（ROS）、抑制剂 N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 和铁死亡诱导剂（erastin和FIN56）。化合14与铁死亡抑制剂ferrostatin和DFO具有相加或轻微协同作用。此外，化合物14还可以通过与铁死亡诱导剂erastin和FIN56表现出叠加/协同作用来诱导铁死亡。化合物14在 MIA PaCa-2 细胞中与氯喹（自噬抑制剂）具有协同作用。然而化合14与其他9种化疗药物没有表现出显著的协同作用。σ2激动剂西拉美辛和σ2R拮抗剂罗潘立酮 (CYR-101) 的联合研究表明，化合物14与roluperidone具有添加剂作用（Fig7）。化合物14提高ER应激标记GRP78的水平σ2受体存在于ER中，已知是引起未折叠蛋白反应（UPR）的ER应激诱导剂。在MIA PaCa-2细胞中评估了用化合物14（JR1-157）处理后的GRP78蛋白水平。蛋白质印迹分析显示，化合物14在24小时后增加了10μM的GRP78水平（Fig8A-C）。用σ2R配体西拉美辛和roluperidone治疗后，GRP78水平也增加（Fig8C）。化合物14增加LC3-B的蛋白质水平化合物14在结构上与氯喹相关，具有相似的氨基链，并且自噬已被证实是氯喹活性的主要作用机制。从SAR研究表明，氨基链对于该系列化合物的σ2R结合至关重要。σ2R配体可通过激活自噬途径促进细胞死亡。为了确定这一系列喹啉吡嗪酰胺的作用机制，密歇根大学进一步测试了14种自噬途径生物标志物LC3B水平的变化。观察到PANC1和MIA PaCa-2细胞中LC3-B水平呈剂量依赖性上调（Fig9）。化合物14诱导细胞凋亡据报道，σ2R配体可通过多种信号通路（包括细胞凋亡和自噬）促进细胞死亡。证实膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色分析。与对照相比，化合物14处理后凋亡群体增加（Fig10）。当MIA PaCa-2细胞用化合物14处理48小时时，观察到早期和晚期凋亡中膜联蛋白V阳性细胞的分布。这个实验结果与之前的报道一致，即σ2R配体通过两者促进细胞死亡凋亡和自噬途径。化合物14将细胞阻滞于G0/G1期为了评估对细胞周期的影响，用10μM浓度的14处理MIA PaCa-2和HCT116细胞24小时，并通过流式细胞仪分析细胞周期分布。与未处理的细胞相比，密歇根大学观察到停滞在G0/G1期的细胞呈剂量依赖性增加，而在S期则减少（Fig11）。化合物14是水溶性分子，可以与铜配位与QN523相关的N-喹啉-8-基吡嗪酰胺衍生物以其金属螯合特性而闻名。通过喹啉环中的氮原子、酰胺基团和吡嗪环的邻位氮原子与过渡金属发生配位，形成配体的两个分子与金属的一个分子的化学计量比的络合物。因此，测试了化合物5、14和17与各种金属（包括 Cu+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Cr3+）形成配位络合物的能力，并使用LC-MS。化合物5、14和17与不同盐形式的铜形成配位络合物，如LC-MS光谱中化学计量比为1:1的变化所示。与7-甲基衍生物6的平面能量最小化结构不一致，没有观察到与Cu2+的金属配合物（Fig12）。尽管吡嗪和喹啉部分具有共平面性，但2-OMe类似物7并未显示出完全转化为Cu配合物，表明该位置的甲基破坏了金属配合物的形成推测是二体配体的原因。5-氯衍生物14和6-氟同系物17也仅与不同盐形式的铜形成络合物。然后测试了化合物14和17的铜配合物在MIA PaCa-2细胞中的细胞毒性。与相应的母体化合物相比，它们的效力提高了5-7倍（表9）。与正常细胞相比，铜是对铜有较高需求的癌细胞生长和增殖的限制性营养物质。铜螯合被认为可以通过减少线粒体中ATP的产生来杀死癌细胞。铜螯合似乎限制了铜结合MEK1/2酶的活性，这些酶通过KRAS或BRAF致癌突变驱动肿瘤发生。铜螯合剂四硫代钼酸铵（TTM）治疗乳腺癌患者的临床试验正在进行临床II期试验（NCT00195091）。与氯异喹啉相比，铜-氯异喹啉还显示出增强的抗癌活性。除此之外，补充有铜的双硫仑（DSF）[二乙基二硫代氨基甲酸铜复合物 (Cu(DDC)2)] 正在临床试验中进行测试，用于治疗不同的癌症，并已证明比单独使用DSF更有效。同样，密歇根大学的铜复合物比其母体具有更强的细胞毒性还测试了化合物14：CuCl2的各种化学计量比（4:1、2:1和1:1）；然而，观察到它们的细胞毒性是相当的，表明在所有情况下都形成相同的铜络合物。为了证实化合物14对MIA PaCa-2细胞的细胞毒性作用是Cu依赖性的，使用氯化铜和TTM与化合物14的组合进行集落形成测定（Fig13）。密歇根大学通过将化合物14与氯化铜组合（Fig13A）观察到强的叠加效应或协同作用，而TTM作为铜螯合剂显著挽救了化合物14的细胞毒性（Fig13B）。此外，QN523与氯化铜表现出协同作用，与TTM表现出显著的拮抗作用（Fig13C-D）。接下来，密歇根大学对化合物14与临床批准的铜螯合剂（如DSF或Andelesclomol）进行了类似的组合研究。化合物14与DSF或Orelesclomol没有表现出任何拮抗作用，这可能归因于以下事实：与TTM不同，DSF和elesclomol都是离子载体，能够螯合细胞外的铜，将形成的铜复合物在细胞内转运到不同的细胞区室，特别是线粒体，从而增加细胞内铜的浓度。另一方面，TTM预计会降低细胞内可用铜的浓度。用TTM降低Cu水平会影响MEK1/2激酶活性和BRAF驱动的肿瘤发生；而DSF通过影响ALDH活性和MEK-ERK途径来减少肿瘤生长。为了验证化合物14是选择性铜螯合剂，密歇根大学将14与醋酸金盐和醋酸银盐进行组合。另外，将化合物14、QN523和氯喹与TTM组合进行测试（Fig14）。通过用TTM预处理来挽救化合物14或QN523对MIA PaCa-2和HCT116细胞中集落形成的抑制作用。化合物14及其铜络合物（14-Cu）处理72小时后，分别在2.5和0.5μM下观察到LC3-B表达水平的剂量依赖性上调。 吡嗪酰胺杂合物的Cu配合物与σ2R结合密歇根大学进一步评估了 化合物14和17的Cu配合物的结合。结果表明，与其母体（Ki=47nM和Ki=10nM）相比，它们具有较低的σ2R结合亲和力（Ki=216nM和Ki=182nM）。然而，对于14-Cu和17-Cu配合物，观察到σ2R选择性高于σ1R的类似趋势（表9、Fig15）。 化合物14可口服密歇根大学测试了静脉内（i.v.）（10mg/kg）和口服（20mg/kg）给药后化合物14在CD-1小鼠中的药代动力学性质（表10）。静脉内给药后，化合物14表现出21L/kg的高分布体积，高分布体积。全身清除率为3730mL/h/kg，消除半衰期为4.7h。化合物14口服后也很容易吸收，AUC(0-inf)为3392h·ng/mL，口服生物利用度为60%。化合物14具有口服活性。基于其对σ2R的选择性（IC50<100nM）、良好的溶解度（>5mg/mL）和良好的微粒体稳定性（t1/2>30min），选择化合物14进行体内活性研究。MTD研究揭示化合物14和其与硫酸铜的组合可以分别以60mg/kg单独和30mg/kg（化合物14）+3mg/kg（硫酸铜）施用，而不影响小鼠的体重（Fig16A、B）。最初，每天通过腹膜内（i.p.）途径用化合物14以60mg/kg处理6至8周龄、携带Pan02细胞的雌性C57BL/6小鼠。经由腹膜内施用的化合物14显著延迟肿瘤生长（p＝0.017；Fig16C）。继续对相同剂量水平（60mg/kg/天）的化合物14的口服体内活性进行评估。类似地，化合物14具有口服活性（p=0.002；图16D）。在单独的研究中，小鼠同时接受化合物14（30mg/kg/天）和硫酸铜（3mg/kg/天）治疗32天。除了第4天和第7天外，没有观察到体重有任何显著变化。化合物14显著延迟肿瘤生长（p＜0.05 p.o. Fig16D）。这些结果表明化合物14是一种有前途的工具化合物，可以更好地阐明胰腺癌中的σ2R抑制和铜配位。 结论密歇根大学设计了一系列新型喹啉基吡嗪酰胺作为σ2R的有效配体。先导化合物14在多种胰腺癌细胞系中具有细胞毒性，并增加ER应激标记物GRP78和自噬标记物LC3-B的表达。化合物14的口服生物利用度为60%，t1/2为6h，在胰腺癌Pan02模型中显示出显著的肿瘤抑制作用。同时还证实此类化合物具有优异的铜配位特性并且是水溶性的。该系列喹啉基吡嗪酰胺的铜配合物也与σ2R结合。喹啉基吡嗪酰胺类化合物可以作为新型抗癌药物值得临床开发。文章来源https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1021/acs.jmedchem.2c01769请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程1.药渡CyberSAR结合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性的结构，通过CyberSAR以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）举例如下：2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“母核结构聚类”的形式展示。其中“绿色字体高亮的”为文献报道的体外酶、细胞活性测试实验中IC50<100nM的活性分子结构、具体实验、实验结果及实验来源。3.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“原始结构视图”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献具有关于Sigma intracellular receptor 2（Homo sapiens）相关实验测试活性的分子以“研发阶段时光轴”的形式展示。其中绿色字体高亮的“数据挖掘”即为潜力Hit。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。