Ancora Biotech LLC

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式使得bpAbs除了单特异性抗体和双特异性抗体（bsAbs）之外，还能发挥新的机制作用，使其成为多种适应症（包括肿瘤学和传染病）的有效治疗手段。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致高阶目标聚集。这些抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增强免疫效应功能，或导致目标快速下调调节和溶酶体转运。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程上的进展已经使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上显示出希望。 1.引言 在2022年美国新批准的药物中，抗体疗法占了30%。在开发中的抗体中，观察到高度工程化分子的数量显著增加，包括双特异性抗体（bsAbs）。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子靶标的特有、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式建立于30多年前，能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（表1）。本综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线和前景的概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得组装针对不同表位的结合域的bpAb格式越来越复杂，这些格式采用不同的架构。格式的选择取决于目标生物学和提议的MoA。关键的设计考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装成功能性bpAb的策略。后者可以简单到将单个域与灵活的链接器串联在一个单一蛋白中，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，取决于多达四个不同蛋白与相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中的配对。预测有效的表位对是困难的，无论是通过理性设计还是通过抗体混合物。因此，能够高效地生成和筛选给定bpAb格式中的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性之外，在选择bpAb格式时，开发性考虑至关重要。早期对bpAbs的生物物理责任进行测试可以减少动物研究和临床试验中失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能影响下游制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或由于bpAb格式复杂性导致的错配副产品。 迄今为止在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，而且还涉及大量单个结合域（图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs）特别容易在双特异性格式中配对。因此，首批进入临床的两种bpAbs，ALX-0651和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中的半衰期较短，需要进一步工程化以提高暴露量。小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块，如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）和OriCAR-017所突出的。 迄今为止在临床上测试的大多数bpAbs具有更规范的、含有Fc的架构，可以根据HC轴的对称性进行分类（图1）。对称bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部分组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。 图1. 在临床试验中评估的双特异性抗体结构。条纹域代表常见的轻链VL或IgG4 Fc。REGN5093-M114每个抗体平均含有3.2个非特异性结合的药物。MBS301不包含增强六聚体化的突变；*药物与抗体的比例和结合位点与所示示例不同。 对称型双特异性抗体（bpAbs）由相同的重链（HC）或重链/轻链（HC/LC）对组成，而不对称型分子则由不同的两半组成，具有不同的结合域。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称型bpAbs的例子，具有2+2的价数（每个整数描述分子中存在的相同亲和位点的数量），并且单链可变区片段（scFv）或单域抗体（sdAb）分别附加在HC的N端或C端。 另一方面，KN060是一个对称型双特异性抗体，具有串联的sdAb臂，没有轻链。类似于KN060，三特异性抗体TAVO412通过串联的sdAb臂实现双亲和位点靶向，该臂嵌入在更复杂的不对称格式中。 不对称型双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个HC被设计成对蛋白A具有不同的亲和力，允许纯化异二聚体产品。 另一方面，GEN3009是一个不对称型双特异性抗体，具有Fc域导向突变，确保两个不同的HC正确配对。除了HC异二聚体外，正确的LC配对对不对称型双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，允许HC重组而不打乱原始的LC配对。REGN5093展示了一种避免LC配对问题的整体策略，它由两个不同的HC与两个相同的LC配对组成。这些共同的LC可以直接从具有定义的LC多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者从现有的LC中工程化，如anbenitamab和GR2002。 ISB 1442和SAR441236是不对称型双特异性抗体的例子，它们通过增加Fab或scFv结构域扩展了免疫球蛋白G（IgG）结构，分别实现更高的价数，甚至在SAR441236的情况下实现三亲和位点结合。较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatamab或基于片段的TNB-738也可以被利用。Zanidatamab将scFv结构域与完整的Fab臂配对，而TNB-738从两个sdAb中衍生出其结合臂，并添加了一个惰性的LC以便于制造。除了免疫球蛋白折叠，双亲和位点设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代框架的潜力。 Labrijn等人全面回顾了所有双特异性格式。 图2. 双特异性抗体的作用机制。(a) 双特异性抗体在顺式或反式中的强靶标结合的示意图。双特异性抗体可以解锁新的生物学活性，例如 (b) 双通路抑制，(c) 锁定外域在酶学上不活跃的状态，或 (d) 双特异性受体靶向以形成更高阶的复合物并引发激动作用。 (e) 另外，双特异性抗体在反式中的结合可以导致受体和Fc结构域聚集，从而快速内化和溶酶体运输或强烈的效应功能，特别是补体依赖的细胞毒性。 3.双特异性抗体的作用机制 3.1.双亲和位点靶向通过亲和力增强结合 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，导致双特异性抗体与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体显示出比它们的单亲和位点亲本抗体更强的结合力和更慢的解离速度。这是由于对同一（顺式）或不同（反式）目标分子上的两个不同表位的亲和力结合。亲和力定义为单个分子通过多个非共价相互作用的组合以及一旦建立了第一次相互作用，结合和重新结合事件的可能性增加。 针对不同表位的抗体片段可以通过亲和力链接来增加目标亲和力，如基于sdAb的、临床评估的双特异性抗体ALX-0651和BI 1034020所强调的。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著更慢，使它们成为优越的拮抗剂、反向激动剂或反向拮抗剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用来说可能很重要，以避免不需要的激动剂活性。 除了表位选择，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制（MoA）和最大化效果至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于人表皮生长因子受体2（HER2）的双特异性及四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，针对表皮生长因子受体（EGFR）的三价抗纤维连接蛋白融合蛋白的不同结构在受体下调中显示出不同的效果。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的取向和连接属性可以通过顺式结合实现超高亲和力。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节的CD38和CD47亲和力以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已被设计为弱亲和力，以实现对CD47阳性红细胞的最小反应性。高亲和力的双特异性抗CD38臂能够在CD38低表达的肿瘤细胞上实现强烈的目标参与和高特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适合于招募免疫细胞。例如，刘及其同事通过融合两个针对不重叠表位的sdAbs与一个抗CD3 Fab，设计了一种T细胞结合抗HER2双特异性抗体。得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合比相应的单特异性亲本分子增加了30倍，并在体内HER2低表达模型中显示出优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一种针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由其分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增强的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，如cilta-cel和OriCAR-017所示。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以实现增强和持久的效果。如上所述，对于基于sdAb的拮抗剂，仔细选择表位和连接优化可能是关键。3.2.双特异性抗体能够实现双途径抑制，并且可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）解锁独特的活性。例如，通过针对低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双通路抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-连环蛋白信号通路，显著地没有激动剂活性。 或者，双特异性抗体可以通过物理限制其靶标来使其失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构揭示了结合和扭曲两个HER2受体，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号能力的二聚体。 此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，被证明通过将各自的细胞外结构域锁定在催化非活性状态来作为酶抑制剂。 尽管单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动剂活性、快速目标内化、溶酶体运输和改善的免疫效应功能。 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时在反式中结合两个不重叠的表位来形成高阶免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动剂活性、Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调。 双特异性抗体的聚集可以促进激动剂活性，特别是对于依赖交联以实现有效下游信号传导的受体。 双特异性抗体也可能独特地激活多组分受体复合物。例如，Shi等人设计了一种针对β-klotho的两个不同表位的双特异性抗体，β-klotho是成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体。 双特异性靶向既必要又足以引发强大的激动剂活性。双特异性抗体通过双特异性抗体增加Fc结构域的局部浓度，从而可以改善效应功能。 这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如被治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。 双特异性抗体的结合可以扩展这种机制到更多的目标。例如，zanidatamab形成的大HER2聚集被证明比亲本单克隆抗体的组合导致更强的补体依赖性细胞毒性（CDC），这是由于Fc结构域的预组织和C1q沉积的增加。 这种效应在引入六聚体增强点突变的Fc结构域的针对CD37的双特异性抗体GEN3009中进一步放大。 尽管Fc聚集的效果不那么明显，但双特异性抗体已被证明也可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，通过针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体聚集，增加了Fcγ受体在吞噬细胞上的结合，并促进了可溶性目标的快速清除。 交联的受体筏已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标的快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。 快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒素有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatamab zovodotin所示。 与单特异性药物相比，针对叶酸受体α（FRα）的双特异性ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。 由于这种效应与细胞表面FRα密度无关，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，这应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种机制并不是相互排斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。3.3.同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染中常见的挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它结合在衣壳蛋白的保守区域，并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易受到突变逃逸的影响，因为它们对病毒施加了选择性压力。类似于小分子药物的鸡尾酒疗法，bnAbs的组合已被证明通过降低单次突变逃逸变体的机会，有效减少单药治疗的抗性。 双特异性广泛中和抗体结合了鸡尾酒疗法的临床益处和单一药物剂量使用的便利性，使它们成为开发中令人兴奋的领域。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性广泛中和抗体BAT2022，被证明能够结合所有主要的关注变体，包括一个不再被一个亲本抗体识别的受体结合域（RBD）突变体。 对于HIV，三特异性广泛中和抗体SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能是临床上有用的。肿瘤细胞可以通过选择性剪接消除靶向的表位。人们推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。 虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法是一个有趣的前景。虽然概念上不同，Spangler和同事证明了针对EGFR的三特异性靶向可以恢复对西妥昔单抗耐药的异种移植模型的疗效，这些模型在下游信号通路中有突变。 最有效的三特异性构建物实现了单独使用双特异性或单特异性构建物无法实现的受体下调水平。3.4.治疗应用和模式 迄今为止，大多数双特异性抗体已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于双特异性抗体的细胞疗法已获批用于复发和难治性多发性骨髓瘤。 许多其他双特异性抗体目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多双特异性抗体针对HER2，HER2是一种受体酪氨酸激酶，涉及包括细胞增殖在内的多种细胞功能。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。 通过结合临床单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗靶向不重叠的结构域IV和II，分别针对两个不同的HER2表位，以前已被证明可以显著改善治疗结果和预后。 HER2的重要性和双表位靶向的临床先例可能解释了管线中大量的抗HER2双特异性抗体，包括anbenitamab和zanidatamab，这是两个最先进的针对HER2的双特异性抗体。 其他杰出的肿瘤学靶标也通过双特异性抗体进行追求，包括通过REGN5093（-M114）和IMGN151分别针对间充质-上皮转化因子（MET）和叶酸受体α（FRα）。 在肿瘤学之外，临床候选药物SAR441236和BAT2022突显了双特异性抗体在传染病中的潜力。阻碍广泛实施针对急性感染的bnAbs的一个挑战是逃逸变体的出现，正如最近的SARS-CoV-2大流行所说明的那样。 针对单一表位的单克隆抗体只在突变逃逸变体发展并广泛传播之前有效，这使得既定的疗法无效。针对多个表位的bnAbs，如针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022或针对HIV的三特异性抗体SAR441236，可以克服急性和慢性疾病中单突变逃逸变体的出现，允许持续使用和更持久的患者反应。 大多数临床双特异性抗体作为裸抗体发挥作用，以治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738通过抑制酶活性。越来越多地，双特异性抗体被用于作为ADCs的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输，如上所述。目前有六种双特异性ADC正在临床评估中，其中三种也在作为裸双特异性抗体进行研究。此外，双特异性抗体的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募者和CARs的有吸引力的选择。 在本节中，我们讨论了已在临床中进行测试或正在测试的双特异性抗体的结构、作用机制和活性，这些分子的数据是可用的。3.5.ALX-0651 Ablynx的ALX-0651，一种针对CXCR4的双特异性串联单域抗体，是第一个针对GPCRs的临床使用的生物制剂，并且据我们所知，是第一个进入临床的双特异性抗体（2011年）。虽然ALX-0651的单个单域抗体构建模块显示出中性拮抗剂活性，但双特异性ALX-0651不仅显示出更高的亲和力，而且还显示出针对CXCR4的反向激动剂活性。 临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。尽管临床前数据支持开发，但由于缺乏对标准护理的优越性，ALX-0651已被终止。3.6.BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和勃林格殷格翰开发的一种双特异性、半衰期延长的串联单域抗体。这种双特异性抗体针对大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。3.7.MEDI4276 MEDI4276是由Medimmune开发的一种针对HER2的抗体药物偶联物（ADC），于2015年进入临床。MEDI4276由一种基于曲妥珠单抗scFv的四价双特异性抗体组成，该抗体靶向HER2的域IV，并在mAb 39S的重链N端融合，后者靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，在那里ADC被内化并运输到溶酶体以释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效实现细胞质输送。异种移植肿瘤模型显示，MEDI4276对HER2低表达肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤都具有高效性，从而满足了高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性概况而被终止。3.8.西他卡苯自溶 Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel），据我们所知，是迄今为止第一个也是唯一一个获批的基于双特异性抗体的治疗。cilta-cel最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，是一种第二代自体CAR-T疗法，特点是具有两个单域抗体的双特异性外结构域，这些单域抗体针对B细胞成熟抗原（BCMA）的不同表位。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和卓越的功效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207）的深度和持久反应以及可管理的安全性概况，cilta-cel在2022年获得批准。总体反应率高达97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）批准后的一年，ide-cel是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间方面都优于单特异性的ide-cel。3.9.Zanidatamab和zanidatamab zovodotin Zanidatamab（ZW25）是一种由Zymeworks专有的Azymetric Fc平台衍生的双特异性抗体，它结合了一个针对HER2域IV的scFv和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨细胞膜结合两个HER2分子，引起细胞膜上受体的明显重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引起了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中是观察不到的。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在具有不同HER2表达水平的多种肿瘤患者中显示出安全性。目前正在进行多项临床试验，包括针对乳腺癌的II期试验(NCT04224272)和针对晚期胃食管腺癌的III期试验(NCT05152147)。Zanidatamab也在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。这种双特异性ADC，zanidatamab zovodotin(ZW49)，已被证明是免疫原性细胞死亡标志物的强诱导剂，并且对一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者衍生的异种移植模型非常活跃。目前正在进行I期临床试验(NCT03821233)。3.10.MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代框架。四价MP0274分子包含一个分别针对HER2域I和IV的DARPin，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。像基于IgG的抗HER2双特异性抗体一样，MP0274交联HER2受体，在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中显示出与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡，展现出独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性概况。一位先前接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析揭示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传标志的患者，且在最高剂量水平，这表明在良好的MP0274暴露下，患者选择可能导致更高的反应率。然而，由于战略原因，MP0274的进一步临床开发已被停止。3.11.Anbenitamab和JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种双特异性HER2靶向抗体anbenitamab(KN026)。通过组合旋钮-入-孔和静电导向突变实现了相应HCs的异二聚体Fc配对。基于HER2相互作用残基的结构阐明，设计了一种可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗HC分别有效配对的通用LC。由安进公司开发的双特异性抗体anbenitamab显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更强的抗肿瘤活性，这一效果在不同HER2水平的多种肿瘤细胞系中均有体现，并且在小鼠模型中活性相当。初步特性分析表明，anbenitamab保留了其亲本单克隆抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时能够同时结合HER2的两个不同表位。anbenitamab于2018年进入临床试验，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。 在第二项临床试验中，anbenitamab在HER2表达的晚期胃癌和胃食管结合部癌患者中表现出良好的耐受性。基于初步的积极活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括两项注册研究：作为HER2阳性晚期或转移性胃癌的二线治疗（NCT05427383），以及作为HER2阳性复发或转移性乳腺癌的一线治疗（NCT05838066），两者均与化疗联合使用。将anbenitamab与拓扑异构酶I抑制剂结合，得到了双特异性抗HER2抗体药物偶联物JSKN003，目前正在进行首次人体I期研究，针对晚期实体瘤（NCT05494918）。 3.12.额外的HER2靶向bpAbs 此外，MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的四种额外的临床阶段抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的去岩藻糖化半抗体，它们在工程CHO细胞系中分别生产，并通过体外使用结-洞突变异二聚体化。从Fc结构域中去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，可在不同HER2水平的肿瘤细胞系中以及在小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究（NCT03842085），评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤的效果。Biocad的BCD-147采用了一种不对称scFv-Fab格式，并已在健康志愿者中进行了I期研究（NCT03912441）。结构相似的TQB2930由泰国天晴药业开发，正在研究用于HER2阳性实体瘤的裸抗体（NCT05380882）以及作为抗体药物偶联物（TQB2102）在HER2阳性乳腺癌（NCT06115902）和胃癌中的应用。最后，轩竹生物制药正在开发不对称的通用LC双特异性抗体KM257，目前正在临床研究中，用于HER2阳性实体瘤（NCT05320874）以及作为抗体药物偶联物（KM501）在HER2阳性晚期实体瘤（NCT05804864）中的应用。 3.13.SAR441236 针对HIV的有效广谱中和抗体（bnAbs）的识别和开发由于病毒的高遗传多样性而面临挑战。大型和小分子单一疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，靶向多个表位可以提高疗效。 SAR441236，由赛诺菲公司进行的I期临床开发（NCT03705169），由具有双重特异性的交叉双变量Ig样（CODV-Ig）臂与具有第三独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性广谱中和抗体。临床前体内数据表明，三特异性广谱中和抗体在减少病毒载量和预防非人灵长类动物（NHP）类似的人类免疫缺陷病毒（SHIV）病毒挑战模型中的感染方面更为有效。3.14.GEN3009 Genmab结合其专有的DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种针对CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，这些突变引导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向加上增强的六聚体化导致的Fc结构域密度的局部增加，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，在B细胞淋巴瘤细胞系以及患者来源的慢性淋巴细胞白血病样本中均显示出优越的补体依赖性细胞毒性（CDC）。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及患者来源的非霍奇金淋巴瘤异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验（NCT04358458），但由于战略原因，最近停止了进一步的临床开发。3.15.REGN5093和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET常见轻链抗体，REGN5093，作为抗体（NCT04077099）和作为抗体药物偶联物（NCT04982224）已进入临床。源自Regeneron专有的VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制了配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创造了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与单特异性抗体形成1:2复合物形成对比。这些更大的复合物可能导致REGN5093所见的MET降解，这是由于回收效率降低和bpAb：受体复合物的溶酶体流量增加所致。Regeneron进一步利用REGN5093的这一特性，通过在其上结合专有的细胞毒素美登素载荷来开发REGN5093-M114。该分子在MET依赖性和MET非依赖性肿瘤模型中均显示出疗效，进一步证明了双特异性抗体药物偶联物方法的效用。3.16.OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法，OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤（NCT05016778）。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的单域抗体，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。报告了有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。3.17.SARS-CoV-2 中和双特异性抗体（bpAbs） MABS由SARS-CoV-2引起的全球大流行促使全球范围内的大量研究工作，多个研究小组展示了使用单域抗体（sdAbs）等抗体片段作为构建双特异性抗体（bpAbs）的基石的效用。 一些研究表明，双特异性抗体通过要求多个同时突变，大大减少了突变逃逸的发生率。与通常限于通过阻断RBD-ACE2界面来阻断的传统单价结合物不同，双特异性抗体的顺式结合显示了阻断和构象变化，而双特异性结合则在多聚体中进行了阻断和多聚体化。已进入临床的最先进的针对SARS-CoV-2的双特异性抗体BAT2022已完成了I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc含量分子，由一个sdAb分子连接到HC的C末端。BAT2022保持了其作为广谱中和抗体对抗多种SARS-CoV-2亚变体的有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。多余的。3.18.ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有的BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性抗体，它与一个串联Fab臂上的两个不同的CD38表位具有高亲和力结合，并结合一个低亲和力的CD47 Fab臂以阻断吞噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下结合时实现强大的抗肿瘤活性。结合Fc突变以增强效应功能，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，这种复杂的MoA可能比单一靶点药物具有更高的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行一项针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。3.19.TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由Teneobio的专有转基因UniRat平台衍生的两个sdAbs组成的不对称抗CD38双特异性抗体，它们与不同的CD38表位具有高亲和力结合。TNB-738使用结-洞突变实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc以消除效应功能，以及在一个臂上使用惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。3.20.IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂与一个mirvetuximab Fab臂配对，每个臂都结合FRα的独特和不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了优越的载荷传递。双特异性抗体结合增加的传递以及更有效的连接子-载荷可能允许IMGN151比mirvetuximab soravtansine治疗更广泛的患者群体。 4.结论和展望 从单特异性单克隆抗体的组合中演变而来，双特异性抗体已通过2022年FDA批准的首个基于双特异性抗体的疗法证明了其临床安全性和有效性。临床管线中的双特异性抗体基于多种格式，除了存在Fc结构域以增强稳定性和效应功能外，没有明确的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体甚至针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为多种适应症有吸引力的治疗选择。双特异性抗体结合的亲和力可以实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442的特性，这些特性还可以使T细胞引导者或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的那样。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明可以影响TAA聚集以改善受体激动、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合改善向肿瘤的细胞毒性载荷传递，正如目前正在评估的六种ADC所说明的那样。或者，双特异性结合可能通过增强结合事件来改善载荷传递，正如对IMGN151的推测。除了高亲和力结合和受体聚集，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双通路抑制、多组分靶标的激活，或者如抗CD38双特异性抗体TNB-738的例子，锁定一个在酶学上不活跃的状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增强持久反应、对多样化病毒景观更广泛有效，并且可能大大限制突变逃逸变体出现的广谱中和抗体。该领域正从双特异性抗体转向三特异性抗体甚至更高级的抗体，以应对一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。随着进入临床的双特异性抗体数量的增加，双特异性抗体在靶向治疗中具有巨大的潜力。目前的双特异性抗体临床格局显示出对HER2靶向药物及其依赖于受体聚集的相关作用机制的强大集中。HER2的突出可能可以用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法的临床先例来解释。然而，随着新技术使更复杂的结构更容易获得，我们预计双特异性抗体的靶标和适应症的数量将大幅增加。以前用传统单克隆抗体在临床上失败的靶标可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可获得，并且可能出现特别适用于双特异性抗体的新靶标。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩展双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。通过首个双特异性抗体治疗的批准得到验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激发对这个独特的抗体类别进行更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

BOSTON--( BUSINESS WIRE )--Scorpion Therapeutics, Inc. (“Scorpion”), a pioneering clinical-stage oncology company dedicated to transforming the lives of cancer patients by redefining the frontier of precision oncology, today announced the closing of a $150 million Series C financing. The financing was co-led by Frazier Life Sciences and Lightspeed Venture Partners, and included additional new support from Willett Advisors and leading healthcare institutional investors, along with existing investors Omega Funds, Vida Ventures, Atlas Venture, Abingworth, Fidelity Management & Research Company, Boxer Capital, EcoR1 Capital, LLC, Surveyor Capital (a Citadel company), Invus, Wellington Management, Nextech Invest Ltd. (on behalf of one or more funds managed by it), OrbiMed, Logos Capital, Woodline Partners LP, and Casdin Capital, LLC. In connection with the financing, Shelley Chu, M.D., Ph.D., Partner at Lightspeed Venture Partners, will transition to an investor board member and Albert Cha, M.D., Ph.D., Managing Partner at Frazier Life Sciences, will join Scorpion's board as an observer. “The robust demand for this capital raise is a testament to Scorpion's continued clinical execution, the strength of our emerging clinical data, and the quality of our rapidly advancing pipeline,” said Adam Friedman, M.D., Ph.D., Chief Executive Officer of Scorpion. “We are pleased to strengthen the Company's financial position and expand Scorpion’s existing blue-chip investor syndicate with these additional leaders in life sciences who share our commitment to improving outcomes for people living with cancer by broadening the reach and impact of precision medicines.” “At Frazier Life Sciences, our goal is to invest in and develop transformational therapeutics companies. Scorpion continues to display an impressive track record of developing potentially best-in-class and first-in-class selective small molecule compounds for cancer,” said Dr. Albert Cha. “With the combination of Scorpion's clinical progress, advancing pipeline, validating partnerships and veteran leadership team, we believe the Company is well-positioned to rapidly develop therapeutics that will make a meaningful difference in patients’ lives.” “Lightspeed is pleased to support Scorpion through this important next phase of growth,” said Dr. Shelley Chu. “The team has made remarkable progress since inception, and we believe Scorpion's targeted approach may be able to overcome the selectivity challenges that plague existing treatment options, ultimately providing better outcomes to patients by offering improvements in both efficacy and safety. In particular, Scorpion’s mutant-selective PI3K α inhibitor, STX-478, has the potential to become a best-in-class treatment for patients with PI3K α -mutated breast cancer and other solid tumors, and we look forward to partnering with management to further explore STX-478 in mid-stage clinical trials.” Scorpion plans to use the proceeds from this financing to advance its pipeline of differentiated small molecule oncology programs, in particular, to expand clinical development of its allosteric, differentiated, mutant-selective PI3K α inhibitor, STX-478. Further, the Company will continue to advance its clinical-stage EGFR inhibitor franchise, including STX-721 and STX-241, and its discovery pipeline of next-generation precision oncology therapies. About STX-478 STX-478 was designed to improve outcomes in patients harboring PI3Kα mutations, one of the most prevalent drivers of cancer, occurring in over 166,000 patients per year with breast, gynecological and other solid tumors in the United States alone. In preclinical models, STX-478 demonstrated robust activity across a range of PI3Kα mutations while sparing wild-type PI3Kα inhibition in normal tissues; previous generations of non-selective PI3Kα inhibitors have limited patient benefit due to these on-target toxicities. Scorpion’s Phase 1/2 clinical trial is a multi-center, global, open-label study designed to evaluate the safety and tolerability of STX-478 in multiple ascending doses for patients with locally advanced or metastatic HR+/HER2- breast cancer and other solid tumors driven by PI3Kα mutations. The program entered the clinic in 2023 and has rapidly advanced, now in multiple expansion cohorts across a range of solid tumors and in breast cancer as monotherapy and in combinations with fulvestrant and CDK4/6 inhibitors. The Company remains on-track to disclose initial safety, pharmacokinetic and pharmacodynamic data, and preliminary efficacy data at a future academic conference. To learn more about the first-in-human trial of STX-478, please visit this page . About Scorpion Therapeutics Scorpion is a pioneering clinical-stage oncology company redefining the frontier of precision medicine to deliver optimized and transformational therapies for larger populations of patients with cancer. Scorpion has built a proprietary and fully-integrated platform of the most advanced technologies across cancer biology, medicinal chemistry, and data sciences, with the goal of consistently and rapidly creating exquisitely selective small molecule compounds against an unprecedented spectrum of targets. Scorpion aims to leverage its platform to advance a broad pipeline of wholly-owned, optimized compounds across three target categories: best-in-class molecules targeting validated oncogene targets; first-in-class molecules for previously undruggable targets; and first-in-class molecules for novel cancer targets. For more information, visit www.scorpiontx.com . About Frazier Life Sciences Frazier Life Sciences invests globally in private and publicly-traded companies that discover, develop, and commercialize innovative biopharmaceuticals. Frazier Life Sciences manages over $3.9 billion in capital, including venture funds focusing on company creation and private companies and a public fund focused on small and mid-cap public companies. Since 2005, over 60 Frazier Life Sciences portfolio companies, many of which were created or seeded by Frazier, have completed IPOs or M&As. The Frazier Life Sciences team consists of over 40 professionals with deep expertise in biopharmaceuticals, primarily located in Palo Alto, Calif. (headquarters), San Diego, Seattle, Boston, New York and London. About Lightspeed Venture Partners Lightspeed Venture Partners is a multi-stage venture capital firm focused on accelerating disruptive innovations and trends in the Enterprise, Consumer, Health, and Fintech sectors. Over the past two decades, the Lightspeed team has backed hundreds of entrepreneurs and helped build more than 500 companies globally including biotechnology companies such as Abata, Ancora, Diagonal, Enlaza, Forty Seven, Personalis, Pheon, Teneobio, Triana, Scorpion, Seismic, Ultima Genomics, Xaira, and more. Lightspeed and its global team currently manage $25B in AUM across the Lightspeed platform, with investment professionals and advisors in the U.S., Europe, India, Israel, and Southeast Asia. www.lsvp.com

摘要：双特异性抗体（bpAbs）能够结合抗原上不同且不重叠的表位。这种独特的结合模式能够实现超越单特异性和双特异性抗体（bsAbs）的新作用机制，使得bpAbs成为针对肿瘤学和传染病在内的各种疾病的有效治疗剂。双特异性结合可以带来更高的亲和力和特异性，促进拮抗作用，锁定目标构象，并导致更高高效的目标聚集。这样的抗体-目标复合物可以引发强烈的激动作用，增加免疫效应功能，或导致快速的目标下调调节和溶酶体运输。这些特性不仅对治疗性抗体具有吸引力，而且越来越多地被探索用于其他模式，如抗体-药物偶联物、T细胞接合器和嵌合抗原受体。近期在bpAb工程方面的进展使得构建越来越复杂的格式成为可能，这些格式开始在临床上展现出良好前景。 1.引言 抗体治疗在2022年美国新药批准中占据了30%的比例。在开发中的抗体中，观察到包括双特异性抗体（bsAbs）在内的高度工程化分子数量显著增加。双特异性抗体（bpAbs）是bsAbs的一个子集，对同一分子目标上的独特、不重叠的表位具有特异性。这种独特的结合模式是在30多年前建立的，它能够实现差异化的作用机制（MoAs）。在过去的十年中，随着临床试验中首次取得成功，bpAbs的治疗潜力已经变得明显。这些开创性的分子为当今临床开发中越来越多的bpAbs铺平了道路（见表1）。这篇综述提供了bpAbs的不同格式和MoAs、当前的临床管线以及bpAbs的前景概述。 2.双特异性格式 在抗体发现和工程方面的进展使得构建日益复杂的结合不同表位结合域的bpAb格式成为可能。格式的选择取决于目标生物学和MoA。设计的关键考虑因素包括目标表位、单个结合域的数量和性质、半衰期延长和效应功能介导域的添加，以及确保所有域正确组装。后者可以在一个单一蛋白中用柔性连接链串联单个域，或者在含有结晶片段（Fc）域的bpAbs中，依赖于高达四种不同蛋白的正确配对以及相应的引导突变在重链（HCs）和轻链（LCs）中。有效的表位对很难合理预测或用抗体混合物实现。因此，有效地生成并筛选给定bpAb格式下的大量表位对矩阵是关键。除了功能性和可行性，开发性考虑在选择bpAb格式时至关重要。早期对bpAb的生物物理负债进行测试可以降低动物研究和临床试验失败的风险。同样，bpAb格式的选择可能会影响下游的制造和质量控制，因为bpAb格式复杂性可能导致不良的开发性或错误配对的副产品。 到目前为止，在临床上测试的bpAbs不仅具有多样的格式，还利用了大量不同的单个结合域（见图1）。单链抗体格式，如单域抗体（sdAbs）和单链可变片段（scFvs），特别容易在双特异性格式中配对。进入临床的前两个bpAbs，ALX-06517和BI 1034020，由串联的sdAbs组成。基于抗体片段的bpAbs通常在循环中具有短暂的半衰期，并且需要进一步的工程化以提高暴露量。如双特异性CAR-T疗法ciltacabtagene autoleucel和OriCAR-017所强调的，小尺寸使sdAbs成为嵌合抗原受体（CARs）的理想构建块。 到目前为止，在临床上测试的大多数bpAbs具有更典型的含Fc的结构，可以通过HC轴对面称性进行分类。对称的bpAbs由相同的HC或HC/LC对组成，而不对称分子由具有不同结合域的不同半部组成。四价分子MEDI4276和BAT2022是对称bpAbs的例子。具有2+2价态（每个整数表示分子中存在的相同副位点的数量）以及分别附加在重链（HC）的N-或C-末端的单链可变区（scFv）或单域抗体（sdAb）。11,12 KN060则是一个对称的双特异性抗体（bpAb），具有串联的sdAb臂和没有轻链（LC）。类似于KN060，三特异性TAVO412通过一个串联的sdAb臂实现双特异性靶向，该臂嵌入在一个更复杂的不对称格式中。不对称的双特异性抗体通常依赖于Fc突变，以促进双特异性抗体产品的纯化或指导异二聚体形成。例如，REGN5093的两个重链被设计成对蛋白表现出不同的亲和力，并允许纯化异二聚体产品。另一方面，GEN3009是一个不对称的双特异性抗体，其Fc区域的引导突变确保了两个不同的重链的正确配对。除了重链异二聚体化外，正确的轻链配对对于不对称双特异性抗体来说可能是一个挑战。在GEN3009的例子中，通过两个亲本抗体的温和体外反应实现正确的配对，这允许重链重组而不打乱原始的轻链配对。REGN5093展示了一种避免轻链配对问题的根本性策略，它由两个不同的重链与两个相同的轻链配对组成。这样的通用轻链可以直接从具有定义的轻链多样性的发现平台中获得，如REGN5093的例子，或者像anbenitamab和GR2002那样从现有的轻链中工程化改造而来。18–20 ISB 1442和SAR441236是不对称双特异性抗体的例子，它们分别通过增加额外的Fab或scFv结构域来扩展免疫球蛋白G（IgG）的结构，以实现更高的价态，甚至在SAR441236的情况下实现三价结合。也可以利用较小的不对称格式，如基于片段-Fab的zanidatmab23或基于片段-片段的TNB-73824。Zanidatamab将scFv结构域与一个完整的Fab臂配对，而TNB-738则从两个sdAb衍生其结合臂，并添加了一个惰性的LC以提高可制造性。在免疫球蛋白折叠之外，双特异性设计的ankyrin重复蛋白（DARPin），MP0274，突出了替代支架的潜力。 3.MoAs of bpAbs 3.1双特异性靶向通过亲和性增强了结合能力 与同一目标上的两个不同、不重叠的表位结合，使得双特异性抗体（bpAbs）与其它抗体相比具有独特的属性。许多双特异性抗体与其单特异性亲本抗体相比，显示出更优越的结合能力和更慢的解离速度。这是由于其能够通过亲和性与两个不同的表位结合在同一分子（顺式）还是不同分子（反式）上（见图2a）。与单价或双价单克隆抗体（mAbs）相比，双特异性抗体的解离可以显著变慢，使它们成为更优越的拮抗剂或反向激动剂。顺式结合形成1:1的双特异性抗体目标复合物对于这些应用很重要，以避免不必要的激动剂活性。除了表位选择外，结合域的几何排列、sdAb连接优化和亲和力调节对于实现期望的作用机制和最大化效力至关重要。Kast及其同事证明，结合域的几何形状对于HER2的双特异性和四价融合蛋白的拮抗作用至关重要，某些配置显示出激动剂活性。同样，不同的三价抗表皮生长因子受体（EGFR）IgG-纤维连接蛋白融合体的结构显示出在受体下调中不同的效力。对于基于sdAb的拮抗剂，最佳的方向和连接属性可以通过顺式亲和结合实现超高性能。最后，临床双特异性抗体ISB 1442依赖于仔细调节CD38和CD47的亲和力，以减少靶向毒性。ISB 1442的抗CD47 Fab已工程化为弱亲和力，以实现与CD47阳性红细胞的最小反应性。一个高亲和力的双特异性抗CD38臂能够实现亲和目标参与和对CD38低肿瘤细胞的高度特异性。 双特异性抗体的高亲和力和缓慢解离也适用于免疫细胞的招募。例如，Liu及其同事通过将两个针对非重叠表位的sdAbs与抗CD3 Fab融合，设计了一个抗HER2的T细胞接合双特异性抗体。与相应的单特异性亲本分子相比，所得到的构建物在HER2阳性细胞上的结合增加了30倍，并在体内在HER2低表达模型中显示出更优越的肿瘤抑制活性。同样，Rennert等人设计了一个针对C型凝集素结构域家族12成员A（CLEC12A）的双特异性桥接蛋白，该蛋白由分泌并招募抗CD19 CAR-T细胞。双特异性靶向实现的高亲和力导致增加的抗CD19 CAR-T细胞毒性。由于sdAbs的小尺寸，CAR可以直接配备双特异性抗体，正如cilta-cel9和OriCAR-017所强调的。这些CAR的高亲和力双特异性结合可以导致增强和持久的效力。 双特异性抗体能够实现双途径抑制，并可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体解锁独特的活动。例如，通过双特异性抗体靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）实现了双途径抑制，同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-catenin信号通路，显著地没有激动剂活性（见图2b）。 3.2 双特异性抗体能够实现双途径抑制，并可以锁定受体和外酶的构象 结合两个不重叠的表位可以为双特异性抗体（bpAbs）实现额外的功能。例如，通过同时靶向低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）的双特异性抗体实现了双途径抑制，它可以同时阻断Wnt1和Wnt3a介导的β-catenin信号通路，且这种阻断没有激动剂活性（见图2b）。 另外，双特异性抗体可以通过物理上限制它们来使目标失活。针对HER2的双特异性DARPin的晶体结构，靶向I和IV亚域，揭示了两个HER2受体的结合和扭曲，阻止了与EGFR家族成员形成具有信号传导能力的二聚体。此外，针对CD38和CD73的双特异性抗体，包括临床双特异性抗体TNB-738，在锁定各自的外细胞域于催化非活性状态时，被证明作为酶抑制剂发挥作用（见图2c）。虽然单独的亲本抗体没有显示出任何活性，但针对CD73的双特异性抗体具有亚纳摩尔级的活性，并实现了超过90%的抑制。 3.3 双特异性抗体可以形成免疫复合物，导致激动作用、快速目标内化、溶酶体运输和提高的免疫效应功能 双特异性抗体的一个独特特性是它们能够通过同时结合两个非重叠的表位在反式中形成更高阶的免疫复合物。目标交联是多种作用机制的基础，包括增强的激动作用、通过Fc介导的效应功能或清除可溶性目标以及受体下调调节。 由双特异性抗体介导的聚集可以促进激动作用，特别是对于那些依赖交联以实现有效下游信号传导的受体（见图2d）。例如，肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）的成员由于其在免疫调节和细胞增殖中的作用而成为重要的治疗靶点。针对TNFRSF的单克隆抗体通常依赖于Fc受体介导的更高阶聚集，这阻碍了它们的治疗应用。杨等人最近展示了针对TNFRSF成员OX40和死亡受体5（DR5）的四价双特异性抗体实现了强大的内在激动作用，优于外在交联的亲本单克隆抗体，突出了双特异性抗体激动剂的潜力。 双特异性抗体也可能独特地定位于激活多组分受体复合物。例如，史等人设计了一种双特异性抗体，针对成纤维细胞生长因子受体1c（FGFR1c）的共受体β-klotho的两个不同表位。 双特异性抗体通过聚集受体增加了Fc结构域的局部浓度，从而可以提高效应功能（见图2e）。这种效应已在被单克隆抗体靶向的多价复合物中观察到，例如治疗性单克隆抗体利妥昔单抗靶向的B细胞标记CD20。双特异性抗体的结合将这种作用机制扩展到更多目标。例如，zanidatmab形成的大HER2聚集体被证明由于Fc结构域的预组织和随之而来的C1q沉积增加，导致比亲本单克隆抗体组合更强的补体依赖性细胞毒性（CDC）。这种效应在引入Fc区域增强六聚体形成的点突变的抗CD37双特异性抗体GEN3009中进一步放大。17 尽管效果不那么显著，双特异性抗体通过聚集Fc还已被证明可以通过增加与自然杀伤（NK）细胞上的FcγRIII受体的结合来提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。 类似地，一个针对白细胞介素6（IL6）的双特异性抗体被用来增加吞噬细胞上的Fcγ受体结合，并促进可溶性目标的快速清除。被交联的受体已被证明可以迅速内化并运输到溶酶体，导致目标快速下调。 值得注意的是，交联效率及其相关效应可能取决于表位选择以及双特异性抗体：目标几何形状。快速内化和溶酶体运输使双特异性抗体成为抗体-药物偶联物（ADCs）中越来越受欢迎的构建模块，它们推动了肿瘤输送和细胞毒性有效载荷的细胞内释放，如MEDI4276、REGN5093-M114和zanidatmab zovodotin所示。与单价剂相比，双特异性抗叶酸受体α（FRα）ADC IMGN151显示出优越的有效载荷输送。由于这种效应独立于细胞表面FRα的密度，人们推测IMGN151增加的有效载荷输送是通过增强FRα阳性细胞上的结合事件而不是聚集，后者应该随着受体密度的增加而减少。然而，这两种作用机制并不是互斥的，需要进一步的研究来阐明IMGN151的作用机制。 3.4 同时结合不同的表位可以克服抗性机制 在治疗病毒感染时，一个常见挑战是找到一种广泛中和抗体（bnAb），它能够结合衣壳蛋白的保守区域并产生持久的反应。单价抗体可以针对保守区域，但容易因突变逃逸而受到选择性压力的影响。与小分子药物的疗法类似，bnAb的组合已被证明在减少单药治疗抗性方面有效，因为它降低了单一突变逃逸变体的机会。 针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的双特异性bnAb BAT2022已被证明能够结合包括受体结合域（RBD）突变体在内的所有主要关注变体，该突变体不再被其中一个亲本抗体识别。对于HIV，三特异性bnAb SAR441236和几个临床前分子通过针对病毒衣壳蛋白上的多个表位显示出前景。 防止抗性的多价靶向在临床上对于肿瘤相关抗原（TAA）的靶向也可能有用。肿瘤细胞可以通过选择性剪接等机制消除靶向表位。有人推测，双特异性CAR-T细胞可以通过同时针对两个表位来防止肿瘤逃逸。虽然进一步的机制研究将很重要，但这对于癌症免疫疗法来说是一个有趣的前景。尽管概念上不同，Spangler等人证明了针对EGFR的三价靶向可以恢复对带有下游信号通路突变的cetuximab耐药异种移植模型的效力。最有效的三价构建物实现了必要的受体下调水平，这是仅用双价或单价构建物无法实现的。 4.治疗应用与方式 迄今为止，大多数双特异性抗体（bpAbs）已开发用于肿瘤学应用，并且随着cilta-cel的批准，首个基于bpAb的细胞疗法已获准用于复发和难治性多发性骨髓瘤。其他一些bpAbs目前正在早期临床试验中，用于血液癌症的治疗，包括ISB 1442和OriCAR-017，它们都处于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤的I期。 对于实体瘤的治疗，许多bpAbs针对HER2，这是一种涉及包括细胞增殖在内的各种细胞功能的受体酪氨酸激酶。在20-25%的乳腺癌患者中观察到HER2的高水平过表达。使用针对非重叠结构域IV和II的临床单克隆抗体trastuzumab和pertuzumab组合靶向两个不同的HER2表位，已被证明可以显著改善治疗结果。HER2的重要性以及双重表位靶向的临床先例可能解释了包括anbenitamab和zanidatmab在内的众多针对HER2的bpAbs在研发管线中，这两种药物是临床进展最领先的针对HER2的bpAbs。其他显著的肿瘤学靶点也在用bpAbs进行研究，包括通过REGN5093 (-M114)和IMGN151分别针对间充质上皮转换因子(MET)和FRα。 大多数临床bpAbs作为裸抗体发挥作用，用于治疗病毒感染，通过相应的受体抑制或促进细胞信号传导，或者如TNB-738,24通过抑制酶活性。bpAbs被用作ADCs11,23,56的一部分进行有效载荷输送，因为它们独特的作用机制促进了内化和溶酶体运输。目前有六种双特异性ADC正在进行临床评估，其中三种也作为裸bpAbs进行研究。此外，bpAbs的高亲和力和选择性使其成为工程化高效T细胞招募剂和CARs的理想选择。 4.1 ALX-0651 Ablynx的ALX-0651是一种靶向CXCR4的双特异性串联单域抗体，是首个用于GPCRs的生物制剂，据我们所知，也是首个进入临床试验的双特异性抗体（2011年）。虽然构成ALX-0651的单个单域抗体显示出中和拮抗活性，但双特异性ALX-0651不仅展现了更高的亲和力，还显示出对CXCR4的反向激动活性。临床前数据表明ALX-0651在阻断CXCR4介导的病毒进入以及诱导快速干细胞动员方面是有效的。 4.2 BI 1034020 BI 1034020是由Ablynx和Boehringer Ingelheim开发的半衰期延长的双特异性串联单域抗体。这种双特异性抗体靶向大脑中淀粉样蛋白（Aβ）的两个独立表位，旨在用于阿尔茨海默病的治疗。BI 1034020的I期研究于2013年开始，但在发生与药物相关的严重不良事件后被终止。 4.3 MEDI4276 由MedImmune开发的针对HER2的抗体药物偶联物MEDI4276于2015年进入临床。MEDI4276由一个四价双特异性抗体组成，基于曲妥珠单抗的scFv靶向域IV，N端融合到mAb 39S的重链上，靶向域II。这种双特异性抗体向HER2过表达的肿瘤细胞输送四个位点特异性结合的tubulysin有效载荷，其中ADC被内化并运输到溶酶体释放细胞毒素。与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合不同，MEDI4276可以交联受体，从而实现快速内化和通过将HER2从循环重定向到溶酶体降解，有效地进行细胞质输送。在异种移植肿瘤模型中，MEDI4276显示出对HER2低肿瘤以及对ado-trastuzumab emtansine耐药的肿瘤具有高效力，从而满足了一个高度未满足的医疗需求。在I期剂量递增研究中，MEDI4276在HER2阳性的乳腺癌和胃癌中显示出临床活性，但最终由于不利的毒性特性而被终止。 4.4 Ciltacabtagene autoleucel Ciltacabtagene autoleucel（cilta-cel）据我们所知，是迄今为止唯一获批的基于双特异性抗体的疗法。最初由Legend Biotech开发为LCAR-B38M，cilta-cel是一种第二代自体CAR-T疗法，其特点是具有两个靶向B细胞成熟抗原（BCMA）不同表位的单域抗体的双特异性外细胞域。双特异性靶向实现了比单特异性构建更高的亲和力结合和优越的疗效。基于CARTITUDE-1 Ib/II期研究（NCT03548207），cilta-cel在2022年获得批准，该研究表明其具有深度和持久的反应以及可管理的安全特性。整体响应率为97.9%，甚至高于初始I期研究（NCT03090659）观察到的87.8%。有趣的是，cilta-cel的批准仅在idecabtagene vicleucel（ide-cel）获批后1年，后者是一种具有单特异性BCMA靶向的类似CAR-T疗法。虽然应该谨慎比较各自的临床试验，但双特异性cilta-cel似乎在反应率和反应持续时间上都优于单特异性ide-cel。 4.5 Zanidatamab and zanidatamab zovodotin 源自Zymeworks专有的Azymetric Fc平台，双特异性抗体zanidatmab（ZW25）结合了一个靶向HER2域IV的单链可变区（scFv）和识别域II的Fab臂。Zanidatamab跨式结合两个HER2分子，引起细胞膜上独特的受体重组。除了快速内化和下调外，Fc结构域的聚集引发了强烈的补体依赖性细胞毒性（CDC），这在曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或它们的组合中均未观察到。双特异性HER2结合在体内异种移植模型中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性。Zanidatamab在患有不同HER2表达水平的各种肿瘤的患者中显示出安全性。Zanidatamab目前正在进行多项临床试验，包括乳腺癌的II期试验（NCT04224272）和晚期胃食管腺癌的III期试验（NCT05152147）。Zanidatamab还在探索用于输送细胞毒性微管抑制剂。57 这种双特异性ADC，zanidatmab zovodotin（ZW49），已被证明是免疫原性细胞死亡标志的强诱导剂，并且在一系列HER2表达水平的乳腺癌和胃癌患者来源的异种移植模型中表现出高度活性。目前正在进行I期临床试验（NCT03821233）。 4.6 MP0274 由Molecular Partners开发的MP0274通过DARPins实现双特异性HER2靶向，DARPins是可像串珠一样串联的替代支架。四价MP0274分子分别包含一个DARPin，用于靶向HER2的域I和域IV，以及两个用于延长半衰期的人类血清白蛋白结合域。与基于IgG的抗HER2双特异性抗体类似，MP0274交联HER2受体，导致在各种HER2阳性细胞系和小鼠模型中与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合相当的抗肿瘤活性。然而，MP0274可能通过稳定AKT调节的叉头转录因子FOX03a导致诱导凋亡来展现独特的作用机制。在HER2阳性实体瘤患者的I期研究中，MP0274显示出良好的暴露和有利的安全性。一位既往接受过曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗的转移性乳腺癌患者对MP0274显示出持续反应，确立了临床概念验证。回顾性生物标志物分析显示，这位患者是唯一一个携带HER2阳性、PI3K野生型遗传特征的患者，并且接受了最高剂量水平的治疗，表明患者选择可以在良好的MP0274暴露下实现更高的反应率。 4.7 Anbenitamab and JSKN003 Alphamab Oncology基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计了一种靶向HER2的双特异性抗体anbenitamab（KN026）。通过组合使用旋钮进入孔和静电引导突变，实现了相应重链的异二聚体Fc配对。基于对HER2相互作用残基的结构阐明，工程化了一个可以与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗重链分别有效配对的通用轻链。结果得到的双特异性抗体anbenitamab在多种HER2水平不同的肿瘤细胞系中显示出比曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合更优越的抗肿瘤活性，并在小鼠模型中显示出相当的活性。初步特性表明，anbenitamab保留了亲本单克隆抗体观察到的ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP），同时结合HER2的两个不同表位。Anbenitamab于2018年进入临床，并在至少接受过一线治疗（包括曲妥珠单抗）的晚期转移性乳腺癌患者中显示出良好的安全性。Anbenitamab在包括HER2表达晚期胃癌和胃食管结合部癌患者的第二项临床试验中耐受性良好。基于有希望的初步活性，anbenitamab目前正在进行多项临床试验的评估，包括作为HER2阳性晚期或转移性胃癌二线治疗的两项注册研究（NCT05427383）和作为HER2阳性复发或转移乳腺癌一线治疗的研究（NCT05838066），均与化疗联合使用。将anbenitamab结合到拓扑异构酶I抑制剂上得到的双特异性抗HER2 ADC JSKN003，目前正在进行针对晚期实体瘤的第一项人体I期研究中。 4.8 Additional HER2-targeted bpAbs MBS301、BCD-147、TQB2930和KM257是四个基于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的额外临床阶段的抗HER2双特异性抗体。MBS301结合了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的半抗体，这些半抗体在工程化的CHO细胞系中分别产生，并通过旋钮进入孔突变在体外异二聚体化。从Fc结构域去除岩藻糖可以增强ADCC活性，结合双特异性靶向，在不同HER2水平的肿瘤细胞系以及小鼠模型中产生强大的活性。目前正在进行一项I期临床研究(NCT03842085)，评估MBS301用于治疗HER2阳性复发或转移性恶性实体瘤。 4.9 SAR441236 由于HIV的高度病毒遗传多样性，鉴定和发展有效的广泛中和抗体(bnAbs)一直是一个挑战。大分子和小分子单一药物疗法在很大程度上失败了，因为选择性压力增加了突变逃逸变体的机会。使用bnAbs组合的临床前和临床研究表明，通过靶向多个表位，可以提高疗效。Sanofi正在进行I期临床开发的SAR441236(NCT03705169)，由一个双特异性交叉双变量Ig样(CODV-Ig)臂与具有第三种独特特异性的Fab臂配对，使其成为一种三特异性bnAb。临床前体内数据表明，三特异性bnAb在减少病毒载量和预防感染方面更有效，在非人灵长类动物(NHP)的猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)病毒挑战模型中。 4.10 GEN3009 Genmab结合了他们的专有DuoBody和HexaBody技术，设计了GEN3009，这是一种靶向CD37的双特异性抗体，具有增强的Fc介导的六聚体化。这种双特异性抗体包含互补的Fc突变，指导体外控制的Fab臂交换反应中的异二聚体化，并通过E430G突变增强六聚体化。由于双表位靶向，局部Fc结构域密度的增加，结合增强的六聚体化，在B细胞淋巴瘤细胞系以及慢性淋巴细胞白血病患者的样本中，与单一亲本单克隆抗体或组合相比，产生了更优越的CDC。Fc结构域聚集进一步增加了ADCC和ADCP，导致在几种细胞系衍生的异种移植模型以及非霍奇金淋巴瘤患者的异种移植中产生强大的抗肿瘤活性。GEN3009已在复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤患者中进行了首次人体试验(NCT04358458)，但由于战略原因，最近已停止进一步的临床开发。 4.11 REGN5093 和REGN5093-M114 Regeneron的双特异性抗MET通用轻链抗体REGN5093，已作为抗体(NCT04077099)和作为ADC(NCT04982224)进入临床。源自Regeneron的专有VelocImmune平台，REGN5093有效地抑制配体独立的MET和HGF诱导的信号传导。DaSilva等人表明，REGN5093创建了具有2:2化学计量比的抗体-受体复合物，与创建1:2复合物的单价抗体形成对比。这些更大的复合物可能导致与REGN5093相关的MET降解，作为bpAb:受体复合物回收效率降低和溶酶体运输增强的产物。Regeneron进一步利用了REGN5093的这一特性，通过将专有的细胞毒素maytansinoid有效载荷结合到REGN5093-M114中。这种分子在MET依赖性和非MET依赖性肿瘤模型中都显示出疗效，进一步证明了双特异性ADC方法的效用。 4.12 OriCAR-017 Oricell的双特异性GPRC5D靶向CAR-T细胞疗法OriCAR-017，已进入临床，用于治疗复发和难治性多发性骨髓瘤(NCT05016778)。类似于cilta-cel，OriCAR-017 CAR包含串联的sdAbs，靶向GPRC5D上的两个不同表位。作者推测，双特异性靶向增加了他们的CAR-T细胞疗法的特异性和亲和力，从而提高了疗效。已报告有利的I期安全性和有效性数据，并支持OriCAR-017的进一步开发。 4.13 SARS-CoV-2 neutralizing bpAbs 几项研究表明，通过要求多个同时发生的突变，bpAbs极大地减少了突变逃逸的发生率。与通常限制通过抑制RBD-ACE2界面来发挥传统阻断作用的单价结合剂不同，顺式结合的bpAb显示出阻断和构象变化，而反式结合的双特异性结合则展示了阻断和多聚化。目前临床进展最领先的针对SARS-CoV-2的bpAb，BAT2022，已完成I期安全性和耐受性研究（NCT05518695）。BAT2022是一个对称的2+2 Fc-含有分子，由一个sdAb分子与HC的C-末端连接。BAT2022作为一种广谱中和抗体，针对多种SARS-CoV-2亚变体保持了其有效性，展示了作为治疗性抗体的效用。 4.14 ISB 1442 Ichnos Sciences的ISB 1442是一种基于专有BEAT 2.0（基于TCR的双特异性抗体结合）平台的双特异性bpAb。ISB 1442在一个串联Fab臂上以高亲和力结合两个不同的CD38表位，并将此与低亲和力的CD47 Fab臂相结合，以阻断巨噬细胞上的信号调节蛋白α（SIRPα）。低CD47亲和力旨在防止对红细胞的靶向毒性，同时在高亲和力双特异性CD38臂的引导下，实现强大的抗肿瘤活性。结合增强效应功能的Fc突变，ISB 1442不仅影响ADCP，还表现出ADCC和CDC。临床前数据表明，与单一靶向药物相比，这种复杂的MoA可能具有增加的疗效和安全性。因此，ISB 1442目前正在进行针对复发/难治性多发性骨髓瘤患者的I/II期临床研究（NCT05427812）。4.15 TNB-738 Ancora Biotech的TNB-738是一种由两个源自Teneobio的专有转基因UniRat平台的sdAbs组成的非对称抗CD38 bpAb，它们以高亲和力结合不同的CD38表位。TNB-738使用旋钮进入孔突变来实现重链配对，一个完全沉默的IgG4 Fc来消除效应功能，以及在一个臂上添加惰性的kappa LC和CH1以提高可制造性。目前正在健康志愿者中进行I期剂量递增（NCT05215912），TNB-738通过酶抑制发挥作用。4.16 IMGN151 Immunogen的下一代FRα ADC已进入临床（NCT05527184），紧随其第一代FRα ADC mirvetuximab-soravtansine之后，该药物于2022年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的加速批准。IMGN151包含一个scFv臂和一个mirvetuximab Fab臂，每个臂结合FRα的独特且不重叠的表位。IMGN151的双特异性靶向模式增强了在FRα阳性细胞上的结合事件，从而在高、中、低FRα表达的细胞系中实现了更优越的有效载荷输送。与mirvetuximab soravtansine相比，由bpAb增加的输送结合更有效的链接-有效载荷，可能使IMGN151能够面向更广泛的患者群体。5.总结 从单价单克隆抗体的组合中演化而来，双特异性抗体已证明其临床安全性和有效性，并且首个基于双特异性抗体的疗法已于2022年获得FDA批准。临床管线中的双特异性抗体基于多样的格式，除了存在Fc结构域以提供稳定性和效应功能外，没有明显的趋势。最终，生物学决定了双特异性抗体的设计。与传统的单克隆抗体、双特异性抗体，甚至是针对不同表位的单克隆抗体组合相比，双特异性抗体提供了独特的作用机制，使它们成为针对多种适应症的有吸引力的治疗剂。双特异性结合所实现的亲和性能够实现高度选择性的肿瘤靶向，如双特异性抗体ISB 1442所展示的特性，这些特性还可以使T细胞接合器或CAR-T细胞等治疗方式受益，正如双特异性CAR-T疗法cilta-cel的临床成功所突出的。目前正在临床测试的大多数双特异性抗体已被证明能够影响肿瘤相关抗原（TAA）的聚集，以改善受体激动作用、效应功能和/或有效的内化和溶酶体运输。除了治疗性单克隆抗体外，这种作用机制特别适合于通过六种目前正在临床评估的ADCs来改善向肿瘤的有效载荷输送。除了亲和结合和受体聚集外，双特异性抗体已被用于其他作用机制，如双途径抑制、多组分目标的刺激，或者像针对CD38的双特异性抗体TNB-738那样，锁定目标处于酶促非活性状态。在传染病领域，双特异性抗体有希望解锁具有增加反应持久性、对多样病毒景观更广泛有效的广泛中和抗体，并可能大大限制突变逃逸变体的出现。该领域正从双特异性转向三特异性以及更高级，以解决一些最具挑战性的人类疾病，如HIV和SARS-CoV-2。 正如临床中越来越多的双特异性抗体所见证的，双特异性抗体对于靶向治疗具有巨大的潜力。当前的临床双特异性抗体格局显示出对靶向HER2的药剂和依赖于受体聚集的相关作用机制的聚焦。HER2的突出地位可能由曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合治疗的临床先例所解释。然而，随着新技术使更复杂的结构工程化变得更加可行，我们预计双特异性抗体的靶点和适应症的数量将大幅增加。以前在临床上用传统抗体未能成功的靶点，可能因双特异性抗体的独特作用机制而变得可行，同时可能会出现特别适用于双特异性抗体的新靶点。正如SAR441236和临床前研究所强调的，三特异性或更高价的结构可以扩大双特异性抗体的效果，甚至解锁新的作用机制。由首个双特异性抗体治疗的批准验证，双特异性抗体的临床管线正在迅速扩展，并将激励对这一类独特抗体的更多研究，以充分利用双特异性抗体在靶向治疗中的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。