Quratis, Inc.

近日ADC领域出现一笔特殊收购：食品工业巨头好丽友以5500亿韩元（约30亿人民币）收购韩国ADC龙头公司LegoChem Biosciences（LCB）25.7%的股份，成为这家科斯达克（韩国创业板市场KOSDAQ）上市的生物技术公司最大股东。不过，收购消息放出后，好丽友股价当日下跌18%。原因可能是这起跨界收购和好丽友的主业相差过大，且LCB作为一家Biotech尚未盈利。尽管好丽友现金流在近年达到了高峰，2022年公司实现了有史以来最高的营业利润4667亿韩元，LCB也算得上是ADC赛道中的佼佼者，只是在这个极其烧钱的领域，好丽友能不能和LCB一起打造理想中的“世界级药企”还是未知。和很多韩国集团一样，好丽友的业务范畴已远不止本行。2019年，好丽友就表示在专注食品主业的同时也在关注生物技术行业，集团业务线将从食品扩展到提高生活质量的医疗保健。2021年，好丽友首先在中国进行了一笔生物医药收购：出资7800万元收购山东鲁抗生物65%的股权，后者更名为鲁抗好丽友生物公司。2022年，好丽友与疫苗企业Quratis签订合同，共同研发结核疫苗。同年，好丽友和HySenseBio成立了牙科疾病公司Orion Biologics。其中，鲁抗好丽友是好丽友在癌症诊断市场的布局。鲁抗好丽友先后从韩国癌症早期诊断技术公司Genomictree引进了大肠癌早期诊断技术，并与LDT Bioscience在肿瘤早筛、肿瘤伴随诊断、肿瘤复发监测等展开合作，希望由此切入医疗市场。好丽友在2023年开始接洽可能的ADC资产，最后通过对LegoChem的收购，好丽友将业务扩展到癌症新药开发，从诊到疗逐步扩大集团的生物医药版图。九万亿韩元对外合作的ADC Biotech欧美第一波ADC生物技术公司纷纷被并购之后，中国、韩国等的生物技术公司开始成为MNC追逐的关键。LCB是韩国ADC领域中不可忽视的存在：通过将自有平台的技术和新药候选物转让给全球大型制药公司，LCB已经收到超九万亿韩元、近70亿美元的累计合同。最近一笔也是最引人注目的一笔是去年底和强生的17亿美元在研Trop2授权，LCB84这款还在1期临床的Trop2 ADC的全球权益被强生开出了1亿美元预付款、2亿美元选择权行权费、14.225亿美元里程碑金额高价。Trop2是HER2之后ADC最为火爆的靶点之一，虽然LCB的这款产品和市场上众多在研管线相比并无进度优势，但用临床前研究数据和吉利德上市产品Trodelvy与第一三共的Dato-DXd相比，强生认为LCB的Trop2 ADC或有Best-in-Class潜力。LCB84的毒素为MMAE，DAR为4，进行了充分的差异化设计，包括结合肿瘤组织特异性的Trop2表位，肿瘤微环境特异酶AMAM10裂解，Linker的独特设计保证更小的脱靶毒性。LCB84与Trodelvy和Dato-DXd对比，来源：公司官网临床前研究的多种肿瘤模型中，LCB84表现出优异的抗肿瘤活性，公司称其在三阴性乳腺癌（TNBC）、胰腺导管腺癌（PDAC）、胃癌（GC）和非小细胞肺癌(NSCLC)的异种移植模型(CDX)中优于Trodelvy和Dato-DXd相比。有这样的管线并非偶然，而是来自LCB自有技术平台的哺育。LCB的自研ADC平台技术ConjuALL是公司的骄傲，重点解决如何降低毒性又能提高疗效：● LCB的Conjugation-Linkers Platform可以在肿瘤细胞中特异切割，具有血浆稳定性和非肿瘤细胞不释放的特点，但在肿瘤细胞内快速有效地释放毒素● LCB的Toxin Platform通过在PBD毒素上添加可去除的亲水性掩蔽基团实现其在肿瘤细胞内的选择性激活，达到降低毒副作用、提高抗肿瘤疗效的目的这些创新使ConjuALL富有吸引力，在公司的对外合作授权中，有不少公司出高价为这一平台技术付费，包括英国公司Iksuda、捷克公司Sotio以及安进。LCB部分对外授权除以上对外授权，LCB还与BostonGene、Elthera AG、NextCure、Glycotope、和铂医药、映恩生物、德琪医药、韩美药品集团、药明合联、药明康德、Pyxis等生物技术公司达成多项合作协议。而从LCB的合作伙伴名单看，不难发现这是一家全球化程度很高的公司。在北美，LCB于2022年在波士顿设立子公司AntibodyChem Biosciences（ACB），旨在通过与生物领域的全球领导者和制药公司建立持续且紧密的联系来扩大业务范围。在亚洲，中国是LCB的重要的阵地。在管线上，LCB自2015年就开始与复星医药有BD合作。CDMO业务中，药明合联和LCB也保持了多年的合作关系。在去年药明合联主办的XDC大会上，LCB CTO Chul-Woong Chung现身称：日后将会和中国公司保持更紧密的合作及共同拓展更大的市场。持续烧钱，BD也不够用？尽管在BD战场上LCB捷报频传，合作金额不断攀升，但面对高昂的ADC药物研发费用，缺乏商业化阶段产品的LCB依然捉襟见肘，在此时寻找财力雄厚的靠山也顺理成章。LCB称在未来五年内要获得约一万亿韩元（60亿人民币）的研发资金，以实现公司的“2030愿景”。这项宏伟计划包括：到2030年，每年4到5个ADC候选药物，建立10条临床管线，自有管线进入后期临床及商业化阶段，成为癌症领域的领先公司。ADC的开发成本极为高昂，开发到IND阶段的费用为5000至7000万元人民币。若采用定点偶联技术，还需特殊酶的参与，成本更高，一个ADC自研发至IND阶段的投入要接近1亿元人民币，相当于两到三个单抗或双抗从开发至IND期的总投入。将ADC管线推进至临床2期，花费则成倍增长，5亿元人民币仅能在资金充分利用的情况下支持两到三条ADC管线达到2期。到了后期商业化生产的阶段，ADC的费用是以往单抗产品的两倍多，“做单抗基本只要2000万元人民币左右，但ADC可以达到5000万元人民币。”一家Biotech靠自己显然是无法支撑如此烧钱的ADC管线开发的，BD几乎是ADC Biotech必选项，但BD的合同总金额看起来数目庞大，能确切为Biotech及时补充现金流的只有首付款。LCB在一年数款BD交易的加持下，净利仍然长期为负：2023年前三个季度，LCB的净利润分别为-177亿韩元、-200亿韩元，以及-197亿韩元。BD后的管线推进是更加漫长的过程，例如早早BD出去的HER2产品LCB-14，合作方复星医药至今最后期的进度是一项对照3期临床研究，对比和T-DM1在HER2阳性不可手术切除的局部晚期或转移性乳腺癌患者中的疗效和安全性，其他针对小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌等的进度仍停留在临床2期。LCB14管线进度，来源：公司官网还有之后可能会出现的管线退回。根据医药魔方数据，截至12月18日，2023年全球生物医药行业终止合作的医药BD交易共56笔，其中71%为创新药项目。即便交易对手是资金相对更充裕，风险能力承受度更高的MNC，决定是否继续推进一个资产也要多方面综合考虑。甚至可以说，越是身经百战的MNC，做削减的决定就越果断，例如去年科伦博泰两款非核心临床前ADC产品被默沙东退货，后者同期高价新引入了第一三共的项目。即使是去年卖出天价的Seagen，自1997年成立以来也一直没能摆脱亏损的命运，即使到了后来有两款ADC产品在售，也未能扭亏为盈。Seagen从2019年开始寻求外部资本的支持，在2019年的年报中Seagen委婉地说：公司一部分收入来自与企业合作者达成的协议，但其自身无法控制合作企业在相关产品上投入的意愿和资源。老牌ADC Biotech尚且如此，后生ADC Biotech经历的合作波折以及行业内卷只会更甚，或许是感受到ADC赛道竞争逐渐激烈，收首付款、卖平台的模式越发不好做，LCB选择不再单干。由于不是兼并收购，收购程序结束后，LCB将被好丽友编入子公司，现有的管理层和运营系统保持不变。尽管好丽友认为生物医药和食品工业之间的界限将会越来越模糊，但以目前好丽友在生物医药产业中的积累，LCB的技术实力和专业能力需要在相对独立的运营中得以继续发挥。反观国内Biotech，出海BD刚刚开始成为现金流来源，据统计2023年出海交易首付款金额超过300亿元，远高于历年首付款总和，一些Biotech还依靠BD首付款带来的现金流交出了盈利的成绩。但从药物研发角度来看，一笔BD的达成仅仅是开始，且BD提供的资金是有限的、有条件的。BD带来的肾上腺素飙升之后，是残酷的运作效率和速度竞争，以及未来的商业化竞争。不论如何，新的一年，ADC战场将会更加复杂。参考资料1.健识局，https://mp.weixin.qq.com/s/hKyL4FDGPOBkZbOVdrJeuw2.AntiBody Research，https://mp.weixin.qq.com/s/qmKY3q2M1GDSuq8ayku4-A3.生物制药小编，https://mp.weixin.qq.com/s/gGI4dHa5angBKURLDFedUg*封面图片来源：123rf文|张珏微信|13240321829添加时请注明：姓名-公司-职位网站、公众号等转载请联系授权：Rekkiiie近期推荐声明：动脉网所刊载内容之知识产权为动脉网及相关权利人专属所有或持有。未经许可，禁止进行转载、摘编、复制及建立镜像等任何使用。动脉网，未来医疗服务平台

2023 年 8 月 10 号，据 Bussiness Korea 报道，EYEGENE 公司正在计划一旦 EG-COVID-001—韩国首款新冠 mRNA 疫苗下个月在澳大利亚完成临床 2a 期试验就立即寻求外部投资进行联合开发或者技术转让。目前，EYEGENE 公司研发资金匮乏，仅澳大利亚进行的 2a 期试验就投入了 200 亿韩元的自有资金，三期临床还需要超过 1000 亿韩元的大窟窿填补，雪上加霜的是，韩国政府对 mRNA 疫苗的政策资金支持也已停止。随着新冠 mRNA 疫苗风口的过去，众多从事新冠 mRNA 疫苗研发的公司资金短缺，尤其是先前已进入临床试验的公司，更是面临进退维谷的窘境。遥想当初，韩国业内锣鼓喧天，人人撸起袖子准备大干一场。2021 年 9 月，Hanmi Pharmaceutical、GC Pharma 和 ST Pharm 三家韩国制药巨头成立 K-mRNA 联盟，其中 Hanmi 负责原料生产，GC 负责罐装，ST 负责 CDMO，旨在推进新冠 mRNA 疫苗的开发和大规模生产。同时，还有 3 家冉冉升起的 mRNA 疫苗研发初创企业也仅跟着成立 mRNA Bio 初创联盟，分别是 EYEGENE，GeneOne Life Science，Quratis。如今，聚义竖起的大旗已倒下，联盟里的成员只能各回各家，各找各妈。当初谁也不会想到，新冠 mRNA 疫苗的一片蓝海还就只容得下最早吃螃蟹的两家，对于后来者，你追的越紧，打水漂的银子越多。我们曾经介绍过 mRNA 疫苗在澳大利亚本土化的过程，本期内容主要回顾一下，从一片火热到遭遇冰点，两年多以来，mRNA 技术在韩国这片制造业发达的土地上经历了怎样的进程。2021 年 5 月 22 号，三星生物制品公司与 Moderna 公司达成协议，为其新冠 mRNA 疫苗提供大规模、商业化的灌装生产，但是，并不涉及 mRNA 疫苗本身的生产。同年 10 月，韩国卫生部批准三星生物制品公司生产的 Moderna 新冠 mRNA 疫苗用于国内紧急使用。韩国当然不会满足仅仅作为 Moderna 的初级代工，在政府资金的大力支持下，谋求短期内快速实现国产新冠 mRNA 疫苗的突破。2022 年 6 月 23 号，嘉泉大学主办并且发起新变种传染病 mRNA 疫苗项目（KmVAC），由医学院洪基钟教授任主任。该项目计划到 2025 年投资总计 900 亿韩元的研究资金，其中包括 688 亿韩元的政府捐款，宗旨是扶持韩国国内 mRNA 疫苗研发企业，完成国产 mRNA 疫苗平台的快速搭建，两年内产生进入临床试验的 mRNA 疫苗。在启动会上，多家韩国疫苗公司和研究机构对于未来 mRNA 疫苗的研究计划作了详细阐述。通过这些报告，我们能够对韩国 mRNA 疫苗行业的发展情况有一个大致的了解。👀   QuratisQuratis 成立于 2016 年，是韩国一家专门从事免疫相关疫苗开发的公司。目前，主要开发项目为适用于成人和青少年的结核病疫苗 QTP101 和自复制新冠 mRNA 疫苗 QTP104，公司正在全力加速这两款疫苗的商业化上市。QTP101 是一款针对成人和青少年的结核菌蛋白亚单位疫苗，由 ID93 和 GLA-SA 佐剂组成。ID93 是一种融合蛋白，由强毒抗原（Rv2608、Rv3619、Rv3620）和潜伏抗原（Rv1813）组成。GLA 是单磷酰脂质 A 的衍生物，是脂多糖 (LPS) 的解毒形式。它作为TLR4激动剂发挥作用，有效诱导 Th1 介导的免疫反应。QTP101 能增强人体由卡介苗形成的免疫反应，只需三剂即可预防结核病，显示出更高的安全性。QTP101 于 2021 年在韩国完成成人和青少年的 I 期临床试验，并于去年获准开展 2b/3 期临床试验。QTP104 目前正在韩国完成一期临床试验，是韩国开发的首个自复制 mRNA 疫苗。此外，Quratis 还在计划开发基于自复制 RNA 技术的下一代结核菌疫苗 QTP102。👀   国际疫苗研究所与 SK Bioscience国际疫苗研究所（Internation Vaccine Institute,IVI）是一个独立的非营利性国际组织，由联合国开发计划署 (UNDP) 倡议于 1997 年成立，其宗旨是为全球公共卫生发现、开发和提供安全、有效且负担得起的疫苗。IVI 总部位于首尔，由韩国及 39 个成员国和世界卫生组织共同主办。IVI 希望与嘉泉大学、SK Bioscience 共同来开发拉沙热 mRNA 疫苗项目。SK Bioscience 是韩国一家大型疫苗研发生产公司，于 2018 年从 SK 化学拆分出来。多年来，SK Bioscience 在疫苗领域取得众多成就，例如，于 2015 年推出韩国首个基于细胞培养的三价流感疫苗，世界上第一个基于细胞培养的四价流感疫苗，世界上第二个带状疱疹病毒疫苗和韩国第二个水痘疫苗。👀   Quad MedicineQuad Medicine 是一家拥有医疗微针平台技术的公司，该技术可用于多种用途，包括可透皮给药的疫苗、合成药物和诊断医疗设备。微针（MAP）免疫是一种通过皮肤传递抗原的方法，同时产生全身和局部免疫。Quad Medicine 希望与嘉泉大学、ST PHARM 共同协作来生产基于微针技术的新冠 mRNA 疫苗。👀   RNAGENERNAGENE 成立于 2018 年，是韩国首家从事 mRNA 疫苗/药物研发的生物公司，主要开发基于 mRNA 技术的预防性疫苗、癌症免疫疗法及蛋白替代疗法。在 2022 年，RNAGENE 与韩国国立卫生研究院签订 2 项服务合同，一个是生产编码结核分枝杆菌抗原的 mRNA，一个是开发增强适应性免疫，提升免疫持续时间的 RNA 疫苗技术。遗憾的是，迄今为止，这家公司在新冠 mRNA 疫苗研发方面并未取得任何值得引入注意的成绩，在其他管线也没有进入临床试验阶段的项目。👀   西江大学与 PhytoMabSeong-Ryong Kim (金成龍)教授是韩国首尔西江大学生命科学系植物分子生物实验室的领导者，研究方向主要集中在利用光合生物合成蛋白质，例如，利用植物表达系统生产日本脑炎病毒疫苗或者抗体药物等。2022 年，他开始主持研发寨卡病毒 mRNA 疫苗研发项目。比较特别的是，他意图将 RNA 聚合酶与加帽酶融合在一起，形成 ctDdRp，同时实现转录和加帽反应。PhytoMab 是韩国一家合成生物学公司，利用 Crispr/Cas9 技术开发了首个生产人源化生物制品的植物干细胞系。金成龍教授希望与 PhytoMab 展开合作，利用其无细胞表达体系来生产体外转录翻译所需的酶。👀   ST PHARMST PHARM 是一家成立于 1983 年的老牌韩国 CDMO 公司，为许多大型制药公司和生物公司提供 GMP 级别的活性药物成分、中间体的顶级定制化服务，拥有非常可靠的工艺开发及放大优化方面的经验。从 2020 年开始，随着新冠 mRNA 疫苗的崛起，ST PHARM 开始重点布局 mRNA 方向， 主要包括 3 个方面：mRNA 疫苗的生产制造，帽类似物生产，LNP 脂质体成分生产。👀   逆水行舟尽管今年以来韩国 mRNA 行业逐渐进入冷静期，但是，依然有人逆水行舟，持续推进。新变种染病 mRNA 疫苗项目组（KmVAC）与韩国资深 CDMO 公司 BMI Korea 签订协议，双方计划共同推进 mRNA 疫苗相关的研究和基础设施建设，该公司在 2022 年建设了年产能超过 5000 万剂的新冠 mRNA 疫苗生产线。此外，今年 3 月份，KmVAC 还与 Moderna 建立合作伙伴关系，以便更加有效地开发新发传染病 mRNA 疫苗的研发。三养生物制药公司 (Samyang Biopharmaceuticals Corporation) 成立于 1995 年，前身是三养社的制药业务。今年 4 月份，三养生物制药公司将 NanoReady 药物递送技术授权给 LG 化学，负责向其提供关键原料，双方共同开发基于 mRNA 技术的癌症疗法。👀   结论新冠 mRNA 疫苗的成功使得韩国政府、制药巨头以及初创新秀意识到 mRNA 技术即将掀起的医药革新浪潮，因此，政府牵头成立专门的项目组，给予高校和企业资金政策支持，寄希望于搭建完全国产化的 mRNA 疫苗生产线，以应对将来可能出现的新变种传染病。早期，人们普遍觉得 mRNA 疫苗研发周期短，生产简单快速，所以全部扎进国产新冠 RNA 疫苗的研发赛道，野蛮扩张产能，自信短期内便能取得突破进行商业化生产。潮水褪去，韩国首个新冠 mRNA 疫苗的临床试验面临资金不足，难以维系的困境，那些扩张的生产线也是空等一场。很多时候人们充满激情的时候，经验是远远不足的，但是，至少这种蛮干开启了韩国 mRNA 技术国产化之路。相比澳大利亚来说，韩国自身拥有非常深厚的制造业基础，因此，整个 mRNA 技术产业化要走得更加成熟。比较遗憾的是，除了新冠 mRNA 疫苗，韩国企业并未在其他方向取得任何突破性的进展。对于 mRNA 技术来说，未来两三年如果不能有其他方向的产品上市，依然只有一朵新冠 mRNA 疫苗的过气红花，那么，不仅是韩国，其他各国的 mRNA 研发/生产企业都可能会面临更加严酷的寒冬。由生物制品圈&抗体圈主办的“2023生物制品工艺发展大会”将于9月22-23日在上海举办，本次大会将主要聚焦生物制品前沿技术、CMC、生产、工艺等热点话题进行探讨交流，涉及人用疫苗、兽用疫苗、抗体药、细胞治疗、基因治疗等生物制品领域。届时将邀请生物制品领域经验权威的专家进行报告，欢迎各界同仁参会学习交流。1.会议名称：2023生物制品工艺发展大会2.会议时间：2023年9月22-23日（周五、周六）3.会议地点：上海（酒店定向通知）4.主办单位：生物制品圈、抗体圈5.媒体支持：药时空、药创客、细胞基因研究圈6.报名方式及费用：扫描识别下方二维码进行报名登记。转发分享福利：生物医药研发企业、科研院校和监管机构人员，前100位报名人员转发分享本通知至朋友圈可免费参会（不含餐饮）报名后，加微信13585867695发截图给工作人员即可。组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请，最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。各类商务合作咨询：13585867695（同微信）大会日程识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：自信使核糖核酸（mRNA）作为疫苗制剂首次在临床研究中成功应用以来，经过近30年的发展，mRNA治疗技术领域取得了许多进展。本文揭示了mRNA疫苗独特的优点，包括产生无毒、有效免疫反应的能力以及可快速设计和规模化扩增的潜力。这些优点使mRNA疫苗成为2019冠状病毒病（COVID-19）大流行期间的优势候选疫苗。事实上，最早获得监管机构加速授权的两种COVID-19疫苗是核苷修饰的mRNA疫苗，它们对症状性严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的感染显示出90%以上的保护效力，并在关键的III期临床试验中表现出较好的安全性。利用mRNA疫苗开展全球疫苗接种活动的实际证据支持了临床试验证据，并进一步表明这种技术可以安全有效地用于抗击COVID-19。这一前所未有的成功也强调了该种新药类别更广泛的应用潜力，不仅可用于其他传染病，也可用于其他适应症，如癌症和遗传疾病。本文简要介绍了核苷修饰和未修饰mRNA、环状RNA和自扩增RNA这四种mRNA疫苗平台的发展历史和现状，并对COVID-19 mRNA疫苗近年来的研究进展和现状进行了综述。我们还讨论了这些技术目前和预期的挑战。这对未来的研究方向和临床应用是很重要的。引言疫苗是预防、控制和/或根除传染病的重要工具，是全球公共卫生规划的基本组成部分。有效的2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的研发和批准是当前大流行期间的一个重要里程碑。为抗击由一种此前未知的病原体——严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 （SARS-CoV-2）引起的疾病，大量疫苗研发项目同时启动。根据世界卫生组织的疫苗跟踪报告，截至2022年1月14日，有333种候选疫苗正在研发中，其中139种已进入临床阶段。mRNA技术的快速发展和高效的免疫反应使其跻身新冠病毒疫苗竞争的前列。主要原因是该技术需要的是已知序列的病毒基因组，而不是活病毒，而且设计仅需几天时间。此外，无细胞疫苗的规模化生产相对简单，因此为快速应对流行病和大流行提供了一种先进的工具。在此论文撰写时，已经进入临床的COVID-19疫苗中，23个（17%）是基于mRNA的疫苗。此外，最早获得欧洲药品管理局（EMA）有条件上市许可（CMA）或美国食品药品管理局（FDA）紧急使用许可（EUA）的两种疫苗分别是BioNTech/Pfizer和Moderna公司的核苷修饰mRNA疫苗，其在Ⅲ期临床试验中对症状性SARS-CoV-2感染的保护效率超过90%，超出了预期。在此综述中，我们总结了mRNA疫苗的临床前和临床数据，这些疫苗分为四种mRNA疫苗平台：非复制线性核苷修饰和未修饰mRNA、环状RNA（circRNA）和自扩增RNA（saRNA）。此外，我们还讨论了可能阻碍未来疫苗研发计划的潜在挑战。新冠mRNA疫苗发展之路与研发相对缓慢和费力的传统疫苗相比，基于mRNA的疫苗具有快速设计和快速规模化扩增的特点，同时具有高效力和低成本的优点。尽管mRNA疫苗已经在其他疾病（如癌症）的临床试验中进行了研究，但其深远的潜力直到COVID-19大流行时才被认识到——mRNA疫苗是首批进入临床试验并加速获得监管部门批准的疫苗。如果没有过去30年的广泛研究和技术进步，这一成就是不可能实现的。本节重点介绍最终促成COVID-19 mRNA疫苗发展和批准的一些最重要的突破。随着mRNA的发现，该领域的研究激增，并产生了多项科学突破，最终导致了RNA疫苗的发展。此前，由于细胞对裸mRNA的摄取极少，使得mRNA特性的检测受到阻碍。然而，保护性脂质制剂的发展使后续的mRNA研究工作变得不那么复杂了。保护性脂质制剂在1978年的一项研究中首次成功使用。这项研究将兔网织红细胞9S mRNA引入小鼠淋巴细胞，导致球蛋白合成。同年，在人细胞中也诱导了脂质体mRNA转运后的蛋白表达。后来，转染的有效性进一步提高，合成的阳离子脂质融合入脂质体，用于mRNA的递送。脱氧核糖核酸（DNA）依赖性RNA聚合酶的鉴定是利用DNA模板进行体外mRNA转录（IVT）的关键步骤。IVT于1984年首次发表，它能使从模板中选择的功能mRNA的转录达到所需的量。直到1993年，mRNA才首次被用作疫苗，在临床前试验中使用脂质运送的方式诱导出针对编码的致病抗原的特异性免疫反应。又过了20年，对抗传染病的mRNA疫苗在Ⅰ期临床试验，即概念验证阶段中被研究。由于脂质体在临床应用中具有潜在的毒性，因此首个小干扰RNA -脂质纳米颗粒（LNP）治疗药物和mRNA COVID-19疫苗的成功获批仅源于它们使用电离化含脂LNP进行递送，其在静脉注射（i.v.）后肝细胞或肌肉注射（i.m.）后肌肉细胞中的传递效率明显更高。此外，最近发现LNPs具有强大的佐剂功能，这进一步证明了其在疫苗应用中的有益作用。在mRNA作为一种药物的研发过程中，缺乏稳定性以及天然免疫激活是多年来的重要问题。含尿苷的mRNA能刺激天然免疫应答，并在用作疫苗时具有确定的佐剂功能。然而，将修饰过的核苷加入mRNA可以显著提高mRNA的生物稳定性和翻译能力，同时降低天然免疫应答。进一步提高mRNA质量可以利用纤维素、高效液相色谱（HPLC）、快速蛋白液相色谱（FPLC）、低聚物（dT）纯化或正切流动过滤（TFF）来纯化IVT mRNA。由于现有mRNA疫苗的细节尚未披露，因此只能进行推测。与LNP结合，修饰mRNA是目前独立mRNA疫苗平台的基础。由于能产生最佳的免疫应答，该平台被证明是最成功的mRNA疫苗平台。其最佳免疫应答源自LNP佐剂功能和修饰mRNA之间的平衡，从而提高有效性和安全性。尽管mRNA-LNP平台提供了多种优势，但仍有改进的空间，我们可能会看到这项技术的进一步迭代。最近，基于小鼠模型数据的临床结果预测的局限性被发现。该局限性来自于mRNA脂质体刺激toll样受体（TLR）7/8，从而诱导系统性炎症的下游效应。据报道，人类分泌促炎白细胞介素（IL）-1b，而小鼠通过诱导上调IL-1受体拮抗剂来控制炎症。这一领域的另一个挑战是脂质成分本身可能激活免疫应答，而免疫应答可能因成分和制剂的类型而不同。一项比较LNP和脂质体的研究发现，二者的差异来自于细胞因子诱导，表明LNP制剂的可电离脂质可能是导致差异的原因。考虑到这一点，未来对mRNA应用后免疫下游效应的研究需要谨慎，这可能会影响mRNA的安全性，并且需要根据疾病仔细选择mRNA制剂的类型和组成。除了线性mRNA，其他mRNA疫苗平台也受到了关注。circRNA最早于1976年被发现，后来在人类细胞中被检测到。虽然最初认为它不是翻译模板，但后来的报告反驳了这一假设，引发了进一步的研究。与线性RNA相比，由于缺乏防止降解的末端，circRNA的生物稳定性增强，因此circRNA可能是一个有前途的研究方向。另一种降低剂量水平的方法是使用能够自我放大的mRNA平台。随后的病毒生物学研究利用在抗原编码序列旁插入一个RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）序列，导致兴趣抗原在细胞质中扩增。随着兴趣抗原的细胞内RNA复制，saRNA可以实现低mRNA剂量下的高抗原产量。mRNA疫苗的免疫机制及SARS-CoV-2抗原的筛选用mRNA疫苗免疫需要抗原编码的mRNA转录形成LNPs，并运送到抗原呈递细胞（APCs）（图1）。LNP-mRNA被内吞，并通过内体逃逸到细胞质而释放。在被转染细胞（包括肌肉细胞和APCs）的细胞质中，兴趣抗原作为膜结合抗原提呈，导致B细胞、CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞应答的激活（图1）。生发中心B细胞及CD4+ T滤泡辅助细胞（Tfh）的调节对高亲和力中和抗体滴度和持久的B细胞应答至关重要。Tfh细胞识别APC表面的抗原，帮助激活B细胞，从而产生高亲和力的病毒中和抗体。最近，研究发现LNP- mRNA疫苗的LNP成分具有佐剂活性，这取决于其可电离的脂质成分和IL-6细胞因子的诱导。这种LNP驱动的佐剂活性导致了强烈的Tfh细胞反应和体液免疫，从而增强了mRNA疫苗的有效性。Tfh细胞进一步帮助激活CD8+细胞毒性T细胞，特异性识别并清除病毒感染的细胞（图1）。事实上，在人体内接种SARS-CoV-2 LNP-mRNA后，会引发一种持久的抗原特异性生发中心B细胞反应以及血液和引流淋巴结中的质粒反应，导致强烈而持久的体液免疫。图1 用mRNA疫苗免疫对抗COVID-19mRNA疫苗免疫需要抗原编码的mRNA转录物。线性非复制mRNA由一个编码抗原的序列（如SARS-CoV-2的S蛋白）组成，其两侧是5'和3' utr，5'端有帽状结构，3' 端有poly（A）尾。根据IVT过程中使用的未修饰或修饰核苷，产生未修饰或修饰的mRNA。saRNA由相同的序列团组成，但还包含：（1）编码4个非结构蛋白（nsP1-4）的序列，它们形成一个复制酶，负责saRNA的扩增（2）病毒源的亚基因组启动子（黑色箭头），可启动抗原的转录。用于疫苗的circRNA由包含抗原序列的共价闭合单链RNA和允许抗原翻译起始的IRES组成。抗原编码mRNA形成LNPs，内吞，并通过内体小泡逃逸到细胞质而释放。S蛋白由APCs（红色圆圈）的翻译机制产生，被蛋白酶体（粉色圆圈）降解，并呈递至MHC I（粉色圆圈）上，导致对SARS-CoV-2的特异性CD8+细胞毒性T细胞反应。抗原也可以锚定在APC的膜上，并直接被BCRs识别，导致B细胞反应；然而，这种途径及其对抗体生产的贡献目前仍有争议。最后，抗原蛋白可以从细胞输出，被内吞回相同或另一个APC，被内吞蛋白酶降解，并呈递至MHC II结构上，导致CD4+辅助T细胞应答。CD4+辅助T细胞进一步帮助（1）激活产生SARS-CoV-2中和抗体的B细胞，（2）激活可能特异性识别和消除病毒感染细胞的CD8+细胞毒性T细胞。APC，抗原呈递细胞；BCR，B细胞受体；circRNA，环状RNA；IRES，内部核糖体进入位点；IVT，体外翻译；LNP，脂质纳米颗粒；MHC，主要组织相容性复合体；mRNA，信使核糖核酸；saRNA，自扩增核糖核酸；SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2；S蛋白，纤突蛋白；TCR，T细胞受体；UTR，非翻译区。SARS-CoV-2的整个表面刺突（S）糖蛋白或S蛋白的受体结合域是病毒进入宿主细胞的关键，代表着新冠肺炎疫苗开发中选择最广泛和最合适的抗原靶点。全长S蛋白和RBD本身都具有免疫原性，并在被免疫系统识别后诱导强大的保护性中和抗体反应。免疫反应可通过引入两个连续的脯氨酸残基（2P）来改善，已知这两个残基将全长S蛋白保留在预融合构象中。S蛋白被宿主细胞蛋白酶Furin切割成支持进入细胞的亚基（S1和S2）。有趣的是，切割完成的S1亚基的C末端基序可以与神经肽-1（NRP-1）结合，从而对T细胞记忆产生负面影响。因此，在疫苗开发过程中，S蛋白的Furin蛋白酶切割位点的修饰功能丧失或缺失可能是有益的。病毒抗原编码的信使核糖核酸疫苗的效力受到编码序列密码子优化的影响，但不仅与稳定性和可译性有关。最近的一项研究表明，来自SARS-CoV-2感染过程中框外开放阅读框翻译的隐蔽表位在密码子优化过程中可能被修改或丢失，导致免疫原性反应增强或减弱。核苷修饰的mRNA疫苗在COVID-19大流行的早期阶段正在研究许多候选疫苗，包括核苷修饰的LNP-mRNA疫苗，这些疫苗率先进入临床试验并获得EUA、CMA以及后来的全面监管批准。目前，共有8种候选核苷基因修饰的LNPmRNA疫苗处于临床试验中，所有这些疫苗都具有一个关键特征，即能够用1-甲基伪尿苷（M1J）取代信使核糖核酸中的所有尿氨酸（表1）。核苷修饰的mRNA疫苗和LNP特征已在其他地方进行了广泛的总结。在这里，我们重点介绍已披露的mRNA结构特征的主要差异（图2）。BioNTech/Pfizer的modRNA平台RNA序列（用于BNT162b2）由人α-珠蛋白5’非翻译区（UTR）、氨基末端分裂增强子（AES）和mtRNR13’UTR基序和由A30LA70组成的Poly（A）尾部组成（连接铰链[L]：GCAUAUGACU），而由Moderna（mRNA-1273、mRNA-1273.211、mRNA-1273.351）、武田（Tak-919）和朱拉隆功大学（ChulaCov19）开发的序列尚未完全公开。BNT162b2使用三核苷酸Cap1类似物（（m27，3’-O）Gppp（M2’-O）APG）（TriLink）进行共转录加帽，而Moderna使用酶法加帽来获得其临床前mRNA12733。所有八种核苷修饰的mRNAs都是使用来自Acuitas、Modernna和Genevant的三种类型的LNP中的一种来形成的，这三种LNP由四种成分组成：可电离脂质、结构脂质、隐形脂质和胆固醇。图2 广泛使用的COVID-19 mRNA疫苗：成分比较 BNT162b2（BioNTech/Pfizer）和mRNA-1273（Moderna）由1-甲基假尿苷修饰的全长尖峰mRNA组成，具有脯氨酸取代即富含GC、密码子优化的特点，并由标准mRNA成分组成：帽、5’UTR、编码序列、3’UTR和poly（A）尾。BNT162b2与（（m27，3’-O）Gppp（M2’-O）APG）Cap1共转录加帽，并具有人类α-珠蛋白5’UTR、AES和mtRNR1 3’UTR基序、两个终止密码子和由A30LA70mRNA-1273组成的poly（A）尾91,92。mRNA-1273是酶加帽的，具有未公开的5’UTR和基于人类β-珠蛋白基因的3’UTR、三个终止密码子和未公开长度的poly（A）尾。在这两种情况下，mRNA都是使用由可电离脂质、结构脂质、隐形脂质和胆固醇组成的LNP制成的。两种mRNA疫苗的LNP都含有DSPC和胆固醇。BNT162b2和mRNA-1273LNP配方的独特之处在于使用ALC-0315和SM-102可电离脂质以及ALC-0159和PEG2000-DMG，分别是基于PEG的隐形脂质。脂质以特定的摩尔比整合到LNP中。除了mRNA和LNP成分外，唯一的成分是盐（分别用于BNT162b2和mRNA-1273的PBS和Tris缓冲液）和10%蔗糖用作两种mRNA疫苗的冷冻保护剂。ALC-0159,2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺；DSPC，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；K，赖氨酸；mRNA，信使核糖核酸；LNP，脂质纳米颗粒；P，脯氨酸；PEG2000-DMG，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇；UTR，未翻译区；V，缬氨酸；AES，氨基末端分裂增强子；mtRNR1，线粒体编码的12SrRNA；ALC-3015,（（4-羟基丁基）氮杂二基）双（己烷-6,1-二基）双；SM-102,9-十七烷基8-{（2-羟乙基）[6-氧代-6-（十一烷氧基）己基]氨基}辛酸酯。图是使用BioRender.com创建的。核苷修饰的mRNA疫苗的设计和临床前测试基于多年的研究；因此，在COVID-19大流行开始时，它们已经做好了快速调整和应用于SARS-CoV-2的准备。然而，需要重大创新的瓶颈之一是制造、工艺开发和放大方法，以满足大规模临床试验和随后的全球营销的供应需求。制造过程的细节是生产核苷修饰mRNA疫苗的公司专有的，没有在文献中披露。Figure3概述了这种制造和放大的基本步骤：IVT、mRNA纯化、配制过程以及填充和完成的下游步骤。此过程中的关键步骤之一是mRNA纯化，它可以去除双链RNA（dsRNA）污染物。通过识别内体中的TLR3或视黄酸诱导基因I、黑色素瘤分化相关蛋白5和细胞质中的炎性体，dsRNA会过度激活先天免疫并导致不良事件的概率取决于数量。用于大规模生产的BNT162b2和mRNA-1273的确切纯化过程尚未公开。HPLC是实验室环境中mRNA纯化的黄金标准；然而，在扩大规模时会遇到挑战，因此只能推测必须在mRNA疫苗纯度和规模扩大的制造工艺之间进行某些调整，以允许生产足够的疫苗以满足大流行期间的全球需求。另一种可能性是IVT水平的创新（例如，通过使用工程RNA聚合酶和特定反应条件），这可能导致IVT反应过程中dsRNA形成的显着减少，从而通过标准工业纯化方法实现出色的纯度。最近，一种热稳定的RNA聚合酶被用于mRNAIVT并防止dsRNA的形成，无需纯化步骤即可降低对此类mRNA的免疫反应。2021年，Moderna提供了其T7RNA聚合酶的详细信息，该酶能够最大限度地减少dsRNA形成；然而，它在mRNA-1273疫苗生产中的潜在用途目前尚未公开披露，只能推测。临床试验中应用的核苷修饰的抗新冠肺炎LNP mRNA的剂量范围为10至250 mg RNA（表1）。为预防新冠肺炎，FDA于2020年12月11日授予BNT162b2 30 mg剂量的EUA，并于2020年11月18日不久授予mRNA-1273 EUA，用于18岁及以上的个人，剂量为100 mg。2021年8月23日和2022年1月31日，FDA分别批准了16岁及以上个体的BNT162b2和18岁及以上的个体的mRNA-1273。表1中所述的所有核苷修饰的LNP mRNA均以预增强（p-b）方案进行IM给药，BNT162b2和ChulaCov19的间隔为3周，mRNA-1273和TAK-919的间隔为4周。图3 核苷修饰mRNA疫苗的制造和放大核苷修饰的mRNA疫苗生产的第一步包括IVT反应在特定条件下进行的该反应基于混合线性化质粒模板、噬菌体RNA聚合酶、核苷三磷酸盐（包括m1J）和Cap1结构（当使用共转录封端过程时）。IVT反应可以在不同的规模下进行，通常随后是DNA酶I消化，这允许DNA模板耗尽。mRNA的纯化是一个允许消耗不需要的IVT反应副产物和其他杂质的过程。通过不同类型的色谱（如HPLC或TFF技术）在IVT反应期间形成的dsRNA的耗竭意味着mRNA疫苗引发的由系统先天免疫系统反应引起的不良事件保持在最低水平。纯化的mRNA在适当的缓冲液中稀释，然后用脂质组分配制，脂质组分通过微混合技术溶解在乙醇中。下游工艺包括进一步纯化、缓冲液交换和填充和完成前的无菌过滤。在需求高的情况下，如在大流行期间，原材料的可用性对于持续大规模生产至关重要。该过程由LNP、mRNA和LNP mRNA水平的大量质量评估严格控制。高效液相色谱法；LNP，脂质纳米颗粒；1-甲基假尿苷；信使核糖核酸；RNA聚合酶；TFF，切向流过滤。图是用BioRender.com创建的。在临床前研究中，一次体内注射BNT162b1或BNT162b2足以引发高滴度的抑制性抗体应答以及CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞应答。给恒河猴注射两次BNT162b2，导致SARS-CoV-2中和抗体滴度比恢复期人血清高8.2至18.2倍。BNT162b1和BNT162b2的I/II期试验的安全性和免疫原性数据支持基于较温和的全身反应和针对不同SARS-CoV-2病毒变体中保守表位的强适应性体液和多特异性细胞免疫应答，选择BNT162b2进行II/III期试验。在BNT162b2 II/III期试验中，共有43548名16岁或16岁以上的参与者，两剂BNT162b2证实了良好的安全性和95%的疫苗有效性（预防新冠肺炎）。在12至15岁的儿童中，两次30 mg剂量的BNT162b2显示出良好的安全性，并导致100%的疫苗有效性。最近，作为在5至11岁儿童中检测BNT162b2的临床试验（NCT04816643）的一部分，发现两种10 mg剂量的BNT162b2可提高90.7%的疫苗效力（预防新冠肺炎）。由于LNP mRNA疫苗的效力随着时间的推移而降低，并且出现了高度传染性的SARS-CoV-2变体，如delta（B.1.617.2）和omi-cron（B.2.1.529），正在检查加强接种的效果。以色列一项针对60岁以上人群的研究表明，在完成p-b初级方案后至少5个月给予BNT162b2单一增强剂，重症报告减少95%，确诊新冠肺炎病例的比率显著降低。最近，多个试验研究了针对德尔塔（B.1.617.2）和奥密克戎（B.2.1.529）变体的疫苗诱导免疫。在所有情况下，与delta（B.1.617.2）相比，尤其是与野生型变体相比，第二剂基于mRNA的疫苗后，奥密克戎的中和抗体滴度（B.2.1.529）显著降低，而第三剂显著提高了抗体中和滴度。这表明，mRNA疫苗的加强剂量的应用可能会防止这些高传染性变体，并支持目前正在全球推广的加强疫苗剂量。2021 9月22日，美国食品和药物管理局（FDA）通过EUA获得了BNT162b2的增强剂量，用于R65岁或R18岁的重度COVID19高危人群。目前，在特定人群（包括6个月至4岁的儿童、孕妇、免疫功能低下的个人和癌症患者）中使用授权疫苗的临床试验正在进行中（表2）。mRNA-1273经历了类似于BNT162b2的临床开发过程，3在关键的临床II/III期试验中证明，对于18岁的儿童，其具有良好的安全性和94.1%的疫苗有效性（预防新冠肺炎疾病，包括严重疾病）。在对p-b疫苗接种后单次加强剂量的中期分析中，Moderna测试了mRNA-1273和多种变体修饰形式，发现了高安全性和耐受性，以及针对关键变体和感兴趣变体的中和滴度增加SARS-CoV-2，包括β（b.1.351），γ（p.1），δ（b.1.617.2）和omicron（b.1.1.529）。在12至17岁的儿童中，mRNA-1273显示出95%的疫苗有效性，并具有可接受的安全性。2021年10月20日，美国食品和药物管理局获得了单次增强剂量的mRNA-1273，同时目前正在招募针对特定人群的多项临床试验（表2）。虽然最初的临床试验包括健康志愿者，但一个重要的方面是孕妇的安全性和有效性，他们没有包括在内。最近对10861名孕妇进行的一项观察性研究表明，BNT162b2在预防新冠肺炎方面有96%的有效性。在一个有131人的较小患者队列中，对怀孕或哺乳期妇女的BNT162b2和mRNA-1273进行了研究，两种疫苗都能产生强大的体液免疫，孕妇和非孕妇在接种后的反应原性方面没有显著差异。重要的是，在婴儿脐带血和接种疫苗的孕妇的母乳中发现了针对SARS-CoV-2的功能性中和抗体，这表明对新生儿有保护作用。2022年1月，欧洲药物管理局的新冠肺炎工作组完成了对孕妇多项研究的详细审查，包括约65000例妊娠。根据研究结果，鼓励在怀孕期间使用基于mRNA的新冠肺炎疫苗，因为未发现孕妇及其未出生婴儿发生妊娠并发症的风险增加，并且与非孕妇相比，有效性没有降低。未修饰mRNA疫苗mRNA构建体（包括编码序列）的优化可以调节免疫原性，而无需掺入修饰的核苷。通过密码子优化替换尿苷可以实现尿苷的消耗以减少反作用免疫反应，但这必须与转移RNA丰度平衡。目前，还没有上市的未修饰mRNA疫苗，但正在临床试验中研究候选疫苗（表3）。未修饰的信使核糖核酸疫苗信使核糖核酸结构的优化，包括编码序列，可以在不掺入修饰核苷的情况下调节免疫原性。通过密码子优化替换尿苷，来去除尿苷以减少适得其反的免疫反应，但这必须与转译核糖核酸的丰度相平衡。现阶段，还没有已上市的未修饰信使核糖核酸疫苗，但已有候选疫苗已在进行临床试验评估。由Cure-Vac 使用RNActive信使核糖核酸开发平台选出有着良好安全性的CvnCoV 候选疫苗，其剂量可达12mg，但在临床IIb/III 阶段，间隔 4 周施打第二剂 12mg，在 39,680 名参与者中，所有年龄组的任何严重程度计分之COVID-19的预防效果仅48%，最终导致其退出监管审批程序。针对COVID-19的未经修饰的信使核糖核酸疫苗仍有些固有局限性待克服。这些限制是基于由于细胞内检测和I型干扰素(IFN)产生而导致的未修饰信使核糖核酸 的内在免疫原性，而 I 型干扰素(IFN)反过来又导致转译抑制、CD8+ 细胞活化减少和抑制T辅助细胞产生。这些改变可能导致减弱的特异性免疫反应。然而，CureVac进一步改造了信使核糖核酸的UTRs，并在临床前测试中显示出优异的免疫学特征。随后，CureVac计划与葛兰素史克合作在临床项目中研究第二代候选疫苗。由 Translate Bio和赛诺菲开发的MRT5500在I/II期试验，其中不同剂量（15、45或135 mg）以3周的间隔施打第二剂，没有安全性或耐受性问题。有趣的是，MRT5500 候选疫苗是使用具有丧失修饰功能的弗林蛋白酶切割的全长棘蛋白位点（RRAR682-685GSAS）-编码序列。然而，开发人员却决定不进行候选疫苗的临床 III 期试验。BioNTech/辉瑞公司开始在三种不同的信使核糖核酸疫苗平台上开发COVID-19疫苗，其中一种是利用未修饰的信使核糖核酸。BNT162a2是一种由未修饰线性信使核糖核酸编码的全长棘蛋白，但没有被选择用于后期临床试验。而由云南沃森、苏州艾博与中国人民解放军军事科学院合作研发的ArCoV候选疫苗已注册进入后期临床评估。其研究的产品为受体结合域编码的脂质纳米颗粒-信使核糖核酸，以15 mg剂量施打第二剂。开发人员强调热稳定性，因为他们的疫苗可以在室温下储存至少1周，并且在临床前研究中得到了证实。由Providence Therapeutics开发的PTX-COVID19-B随着临床前测试和成功的 I 期试验后已进入II期临床试验，显示了在血清阴性个体中内高达100 mg的剂量是具有可耐受的安全性，并诱导了很高的中和抗体水平。2022年1月，开始将PTX-COVID19-B与授权的BNT162b2 COVID-19疫苗进行临床试验比较。由第一三共开发的DS5670在日本人群体中进行四种不同剂量的测试，最高达100 mg，并着重于I/II期临床试验中的年龄特异性免疫原性反应。最近，该公司披露，在不同年龄组中未观察到相关的安全问题，并具有适当的免疫原性反应。在I期临床试验中，斯微生物与上海东方医院合作并正在测试他们的SW-0123候选疫苗。有着天然全长棘蛋白编码的信使核糖核酸并非为融合稳定的形式，是需要配制成核状结构的脂多聚复合物(LPP)，其在临床前研究结果显示对树突状细胞具有高度选择性。EyeGene开发了一种使用阳离子脂质体的专有配方，以避免使用聚乙二醇并促进生产过程中的冷冻干燥。他们的候选药物计划于2021年底在韩国进行I/IIa期试验。此外，许多处于临床前阶段的开发项目用意在于使用未修改的线性信使核糖核酸 平台创建有效的 COVID-19 疫苗，包括德国马克斯-普朗克研究所(德国)、塞尔库克大学(土耳其)、康希诺(中国)与Precision Nanosystems合作、BIOCAD(俄罗斯)、RNAimmune(美国)、Greenlight Biosciences(美国)、IDIBAPS(西班牙)、Cell Tech Pharmed(伊朗)、ReNAP(伊朗)与Globe Biotech(孟加拉)。特别是，由eTheRNA开发的独特配方使其候选疫苗适用于鼻内给药，这可证明通过激活粘膜免疫对SARS-CoV-2疫苗接种是具有优势。上海蓝鹊生物医药、复旦大学和上海交通大学联合开发三种疫苗药品，除了棘蛋白外，还包括一种编码膜(M)和包膜(N)蛋白的蛋白，這三种蛋白會產生類病毒顆粒，与其他信使核糖核酸候选疫苗相比是标的不同的抗原。环状信使核糖核酸circRNA环状信使核糖核酸（也称为endless RNA）可以在真核生物执行转译，其结构为环形封闭，与线性相比更可以抵挡核酸外切酶避免降解。尽管有这些潜在的好处，但目前也只有一种环状信使核糖核酸的COVID-19候选疫苗正在开发，其生产是利用第一组核酶自催化策略。但截至2022年1月31日，尚未进入临床试验。此环状信使核糖核酸的受体结合域抗原编码序列被包裹在脂质纳米颗粒中，并与信号肽序列融合，确保抗原分泌产生并提高结合能力。为了驱驶转译，将未公开的内部核糖体进入位点(IRES)设计于抗原编码序列的前面。在临床前研究中，将候选疫苗以肌肉注射至小鼠体内，在相隔2周的增强方案中以两种不同的剂量（10和50mg）施打，以剂量依赖性方式引发高浓度，有着TH1辅助细胞反应的中和抗体。saRNA疫苗与其他信使核糖核酸 疫苗平台类似，saRNA 有助于快速候选药物设计和开发，以及可做到无细胞的分子合成。此外，由于其自我复制的性质，其中编码的复制酶可以让抗原编码核糖核酸的有多个拷贝，与非复制性信使核糖核酸相比，可以用更低的剂量达到相同的转译水平。saRNA 疫苗本质上是自带佐剂的功能，其中是因为复制酶活性让双股信使核糖核酸和复制子中间体在转录过中像是模拟病毒感染。这引发了更广泛的免疫反应，也被认为是最有潜力通过单剂量接种的药物。许多临床试验正在评估saRNA 疫苗对 COVID-19的安全性和有效性(表四)。目前领先与公开的候选疫苗是设计由委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV) 衍生复制酶，其中一个信使核糖核酸分子是带有抗原编码序列主要为全长棘蛋白。大多数临床试验都使用主要增强免疫方案或将单剂量与主要增强免疫方案进行比较。只有一个候选疫苗 EXG5003 正在接受单剂量给药的测试。此平台的其中一个障碍来自于saRNA的分子较大，它包含源自复制活动所必需的甲病毒基因组中的非结构蛋白编码序列。RNA 的长度极大地影响了递送的稳定性和难易程度。然而，目前还没有一个saRNA COVID-19候选疫苗是使用先前有成功将尺寸缩小的方法。经过前临床的体内实验证实了saRNA候选疫苗有效对抗COVID-19，伦敦帝国理工学院将脂质纳米颗粒-nCoVsaRNA 纳入 I/II 期临床试验。0.1-10 mg 的剂量都显示出剂量依赖性免疫反应；然而，大部分试验参与者没有血清转化，这些人在纳入 SARS-CoV-2 感染时均为血清阴性，因此，临床的开发进程就此停止。saRNA的自带佐剂作用部分与 I 型和 III 型 IFN 的激活有关，有可能引起负反馈循环并抑制转译。尽管剂量较低，使用 saRNA 疫苗会导致更高的反应原性。为了避免这种情况，一个未公开重新设计的抑制IFN生产的saRNA候选者，在COVAC-Uganda临床一期试验(LNP-nCOV saRNA-02)中被研究，用来评估在SARS-CoV-2抗体血清阴性和抗体血清阳性个体中的免疫反应。但是不直 接测试对COVID-19的效力。BNT162c2作为第一批进入临床阶段的疫苗候选株，由BioNTech开发和测试，然而，这种形式的疫苗没有被选去做进一步的临床研究调查。Arcturus Therapeutics与杜克-新加坡国立大学医学院合作，使用他们的STARR mRNA saRNA平台对三种候选药物(ARCT-021，ARCT-154，ARCT-165)进行研究。该公司的第一种候选药物ARCT-021在临床I/II期试验中被测试，采用单剂量给药法，p-b剂量范围为在1-10 mg。目前，单剂量治疗方案正在II期试验中被研究。ARCT-154已开始在越南进行I/II/III期试验，使用改良的抗原编码序列，重点针对最近的alpha (B.1.1.7)、beta (B.1.351)、gamma (P.1)和delta (B.1.617.2)病毒变异。为了解决saRNA加强应用的问题，在所有美国和新加坡接种及未接种个体的I/II期临床试验中对三种候选药物进行直接比较。第一批24名参与者的结果已经公布，在BNT162b2免疫接种5个月后，5 mg的ARCT-154或ARCT-165加强针注射剂量会显著增加对omicron变种(B.1.1.529)的中和抗体反应164在临床实验中，所有被测试的saRNA候选株针对肌肉注射的应用进行了设计，除了EXG-5003 (Elixirgen Therapeutics)外，它是为了皮内给药而配制的，使其仅在注射部位以温度敏感的方式有效，在SENAI Cimatec、Gennova Biopharmaceuticals、HDT Biotech和Quratis的广泛合作中，另一种候选者，HDT301(也称为repRNA-CoV2S或HGCO19)正在进行I/II期试验。在临床前，p-b方案已被证明比单剂量给药能诱导更强的T细胞反应，然而，在正在进行的临床试验中，单剂量方案也正在测试。来自印度一期试验的数据表明，Gennova’s COVID-19 RNA疫苗候选株HGCO19具有可接受的安全性和耐受性。近期，另一个关于促进不同疫苗形式潜在增长的重要的问题已经浮现出来，特别是针对两种不同产品采取不同的管理方式。在临床前，对一种异源的包含saRNA的腺病毒载体(ChAdOx1 nCoV-19/AZD1222)疫苗疗法进行了测试。结果表明，与p-b同源疫苗方案相比，增强了抗原特异性抗体反应，并具有更高的中和效果。类似的，Gritstone Bio公司也有一种saRNA候选疫苗(SAM-SARS-CoV-2)，该疫苗正在进行I期临床试验，研究对象是此前接种过腺病毒载体疫苗的个体。169SAM-SARSCoV-2被设计用于诱导对S蛋白和核蛋白、膜蛋白和开放阅读框3的免疫反应，这可能会增强相关变异的效果。还有其他几种候选疫苗即将在不久的将来进入临床试验，例如由根特大学的Ziphius 疫苗公司开发的疫苗，以及由Amyris(美国)与传染病研究所合作开发的疫苗，已经获得有希望的临床前数据，对临床开发计划做出了解释。结论和展望COVID-19大流行导致了历史上最快的疫苗开发速度，尽管mRNA的治疗潜力之前被研究了数十年，但仍未能够作为一种上市的医疗手段，与传统疫苗方法相比，利用其独特特性的时机现在已经成熟。在这篇综述中，我们旨在概述已获批的COVID19 mRNA疫苗和候选疫苗，以及它们在这一快速发展的领域中的不同分子生物学方法。如果有一个合适的目标抗原序列，mRNA疫苗技术可以快速进行设计和生产，因为它不涉及病原体，也不需要通过特定的细胞培养过程或发酵来生产疫苗。相比之下，这些挑战使传统疫苗的研究、开发和生产工艺更加复杂和漫长。首先获得加速批准并满足所需安全性和有效性标准的两种COVID-19疫苗是mRNA疫苗。8,81,82从临床效力和安全性数据来看，LNPs中核苷修饰的mRNA相比未修饰的mRNA，似乎是更好的选择，这也被临床效力和安全数据所证实。而相似剂量水平的未修饰mRNA和saRNA疫苗候选株在临床一期被测试，在使用比核苷修饰mRNA疫苗更低剂量的情况下，未修饰的mRNA疫苗在临床测试阶段可持续到更晚阶段，截至本文撰写时，由于没有一个未修饰的mRNA和saRNA候选株进入审批阶段，可以推测这是由于产品未修饰核苷造成的内在不良反应造成的。circRNA代表了一个好的概念，但似乎在继续开发它们作为候选药物之前，进一步的改进是必要的。circRNA平台理论上可以替代尿苷；然而，据我们所知，IRES元素与修饰核苷结合的功能尚未被证实。与传统技术相比，基于LNP-mRNA的灵活设性的疫苗设计与生产的可扩展性，在原始毒株疫苗设计效力低的情况下，允许针对其他新型SARS-CoV-2变种的做出快速反应。如今，不同的方法正在研究中，它们使用mRNA平台，旨在产生变种的特异性反应，包括对新毒株或异源疫苗的改良、调整编码序列。2022年1月，BioNTech和辉瑞公司宣布，一项新的临床试验已经在健康成人中开始测试omicron(B.1.1.529) mRNA疫苗特异性，Moderna开始了一项II期研究，以测试他们的omicron变体特异性疫苗候选毒株(mRNA-1273.529)mRNA疫苗在COVID-19疫苗竞赛中的成功表明了该技术在未来各种各样应用方面的潜力，包括其它传染病、癌症治疗、和蛋白质替代疗法，这反映在目前开发人员的管线中。然而，必须考虑到，除了第一批mRNA疫苗的成功之外，还必须提供这种技术未来用途广泛的证据。在非炎症环境治疗中的深入的免疫原性数据仍然缺失。同样也会预计，世界将不得不应对更频繁的新的大流行，就COVID-19而言，可能会出现令人担忧的新型病毒变体，并在人群中表现出来。在这里，在适应新的序列甚至其他疾病时，mRNA技术可以证明其在设计速度、放大和成本效率方面的优势。由于快速的疫苗推广，以色列拥有了大量关于COVID-19疫苗有效性的真实数据。据以色列报告称，在接种疫苗后，中和抗体滴度下降了初始滴度的10%以下，这引起了关于高度相似mRNA疫苗额外增加剂量的关注，以及是否可能造成宿主耐受，尤其在如果疫苗一年或每个季度注射几次的情况下。虽然已经报道了omicron (B.1.1.529)变体的免疫逃逸，但来自以色列的183数据表明，初次接种两剂后进行加强免疫，SARS-CoV-2感染率明显降低，最终，世界将同时需要多种适应性强的疫苗技术来满足供应需求。在mRNA疫苗用于其他疾病方面，已经建立了在实验性自身免疫性脑脊髓炎(多发性硬化症的小鼠模型)治疗中诱导抗原特异性耐受的治疗性mRNA疫苗的基本原理。mRNA技术的一些未来应用包括个性化癌症疫苗，协同刺激配体受体，细胞因子，免疫调节剂，mRNA编码的抗体，以及嵌合抗原受体(CARs)，并在其他地方进行了广泛的综述。尽管目前对mRNA技术的大肆宣传，许多研究人员已经在寻求改善mRNA组成的新方法，并扩展到他们的应用领域。mRNA治疗的给药途径主要局限于肌肉注射和静脉注射;但是，针对不同的注射方式，已经取得了令人鼓舞的结果。它看起来有益于空气传播病毒到达呼吸道上皮后产生肺部驻留记忆T细胞。除了不同适应症外，COVID-19候选株通过鼻内递送正在被研究。针对肠道使用，一种有趣的方法是使用含有纳米核酸配方的微注射胶囊，这种胶囊能够输送到胃上皮细胞。此外，诺如病毒和SARS-CoV-2序列已经被结合来产生一种口服saRNA疫苗。重组鼠巨细胞病毒被成功用于小鼠体内，作为对抗流感和SARS-CoV-2.193的载体疫苗。其他人则在研究以DNA为基础的疫苗来对抗癌症的耐药性。以腺病毒为基础的药物传递是一种传递核酸的选择；然而，由于宿主诱导产生抗腺病毒抗体，重复给药可能不能诱导或大大降低期待的免疫反应。新的mRNA疫苗还必须克服几个挑战，以满足世界市场的需求。进一步开发一种可调节的配方平台，从而降低甚至不产生不良影响，这是至关重要的，特别是在选择脂类、它们的电荷和生物降解性方面。持续生产的障碍可能是必要试剂的可用性和可扩展性。此外，低收入国家应能公平地获得这些新疫苗，这将有助于应对这一大流行病。BioNTech和辉瑞公司根据一个国家的收入水平设计了一个三步价格体系，其中最低的价格是非营利性的价格，由高收入国家(如美国或欧盟)的较高价格提供资金。同样，Moderna表示，他们的目标是“为所有人口提供有效和负担得起的疫苗和治疗”综上所述，基于mRNA的治疗方法在其通用性和适应性方面具有关键优势，这不仅可能产生有前景的治疗方法，也可能通往其他适应症，如癌症，因此，对该技术的进一步研究和投资是有必要的。鉴于这项技术迄今为止的成功，人们对它的期望很高，回报可能也很高。原文来源：COVID-19 mRNA vaccines: Platforms and current developments