tRNA治疗：mRNA时代下的新选择

2023-12-13

信使RNA基因疗法寡核苷酸疫苗

近年来，基因治疗方法的快速进展使现代医学发生了显著转变。通过应用先进的分子生物学技术和增强的递送系统，个体化基因精准药物治疗时代已经到来。其中一个引人注目的突破是在全球抗击SARS-CoV-2大流行中，两种mRNA疫苗的非凡成功，开启了无数可能性的大门，激发了对一系列以前无法治疗的人类疾病进行创新RNA治疗的探索。mRNA有助于将遗传信息从DNA传递到核糖体--细胞生物合成的大分子机器。为了准确解读嵌入在mRNA中的遗传信息，核糖体需要得到转运RNA（tRNA）的帮助。tRNA经典上被认为是基因密码的解析者，通过mRNA密码子与相应tRNA的反密码子的互补碱基配对，将核酸身份转化为氨基酸。mRNA中的四个核苷酸形成了64个独特的三联体（密码子）。其中61个是有义密码子，3个终止密码子。有些基因突变会将61个有义密码子中的18个转化为终止密码子，导致蛋白质翻译的过早终止和失去功能的疾病表型的发展。这些突变占据了遗传疾病的约11%，成为整个人类群体中引起疾病的主要突变类型之一。而tRNA疗法可以通过补充已受到影响的tRNA来抵消突变的影响，从而恢复蛋白质合成和功能。但tRNA作为治疗药物面临着许多挑战，如低效性、不稳定性、免疫原性和安全性问题，这些挑战阻碍了它们的临床应用。然而，过去三十年来mRNA和小RNA治疗方面的技术突破已经开始解决了许多这些挑战，包括通过使用修饰核苷酸来增强稳定性和降低免疫原性，以及开发各种材料来有效地封装和递送RNA。这些技术突破同样适用于tRNA治疗，并重新引起了科学界和产业界对于利用tRNA作为创新基因治疗方法治疗单基因疾病的兴趣。本文将简要介绍利用tRNA作为治疗药物治疗单基因疾病的关键策略，并评估最近发展的用于系统和特异性递送tRNA的递送平台。tRNA 治疗简史半个世纪以前，三项重要的研究为tRNA基因治疗奠定了基础（图1）。Sveda等人将预先装载异源天然sup-tRNA（大肠杆菌或酵母）的红细胞与表达截短的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的小鼠细胞融合，恢复了完整长度的蛋白质表达。Kan等人将天然酵母sup-tRNASer加入从β-地中海贫血患者中得到的红细胞溶液，该患者的β-珠蛋白基因在赖氨酸AAG密码子处有一个无义突变，成功地修复了最多10%的完整长度β-珠蛋白。图1. tRNA疗法的关键里程碑为了扩大sup-tRNA在不同组织和疾病背景下的应用，人们采用了两种途径进行sup-tRNA补充：（1）作为质粒编码的sup-tRNA基因，在细胞核中进行外显子表达；（2）将体外转录（IVT）的sup-tRNA转染到接受细胞的细胞质中。然而，这些sup-tRNA在临床相关模型系统中的活性低效，即使在较高剂量下进行多基因拷贝补充，以及临床应用的早期阶段的递送平台的开发，都阻碍了临床进展。过去十年见证了将tRNA与病理相关的异常联系起来的新的机制性发现，并提出了tRNA作为一种新的治疗方式。两项最近的研究表明，在预临床实验中使用AAV或LNPs递送tRNA，可以获得很好的治疗效果。未来，开发更多的RNA基因治疗递送系统，将会促进tRNA-based therapy在治疗其他疾病方面的应用。tRNA疗法的应用有两类单基因疾病可能可以通过tRNA基因治疗来解决：（1）与无义突变相关的疾病（2）与tRNA耗竭相关的AARS突变相关的疾病（图2）。图2. 基于tRNA的治疗方式利用sup-tRNAs进行矫正治疗无义突变是一种常见的疾病相关突变类型，它引入了早停密码子（PTC），导致蛋白质合成过程中的终止。为了抑制与无义突变相关的PTC，并引入正确的氨基酸，需要使用19种sup-tRNA（图3）。这些sup-tRNA具有足够的活性，可以在翻译过程中支持所需蛋白质的产生，以达到治疗所需的阈值。图3. 人群中与各种遗传病相关的无义突变频率sup-tRNA的一个显著优势是，单个治疗制剂可以用于治疗多种与无义突变相关的疾病。例如，最常见的无义突变是将精氨酸CGA密码子突变为UGA PTC。因此，一种强效的sup-tRNA可以用于治疗与精氨酸密码子相关的各种疾病中的无义突变。然而，序列上下文驱动的读过效率变化和组织特异性递送的差异是需要解决的障碍。sup-tRNA仅作用于受影响基因的自然转录本库，这消除了过表达的风险。因此，sup-tRNA非常适合治疗与基因中的无义突变相关的疾病，这些基因需要精确调节。一个例子是MeCP2基因，该基因是一个众所周知的Goldilocks基因。缺乏MeCP2导致Rett综合征，而MeCP2的过度表达导致MECP2复制综合征。在某些情况下，由于tRNA的进化年龄和选择性，工程改造可能无法使其抵抗解码PTC，或者抑制的效力可能不足以获得治疗效果。在这种情况下，可以使用携带不同氨基酸的强效sup-tRNA来恢复PTC的翻译。这种策略模仿了错义突变，可能适用于特定的蛋白质。例如，与杜氏肌营养不良相关的肌营养素基因可以容忍错义突变，而Dravet综合征或囊性纤维化中的疾病相关蛋白对错义突变敏感。将sup-tRNA与经过批准的治疗方法相结合，可以减轻由sup-tRNA引起的错误插入氨基酸的错误折叠效应。tRNA补充疗法根据最近的研究，一些与不同病理学相关的疾病共享了tRNA同义密码子家族的短暂或永久耗竭的特征。这种耗竭会导致受影响密码子的翻译异常。例如，与几个AARS基因中的杂合突变相关的Charcot-Marie-Tooth (CMT)病理学就是一个典型例子。这种病理学的特征是长度依赖性轴突萎缩和退化。在大多数情况下，AARS基因的突变不会改变酶的氨酰化活性，这表明酶活性的丧失并不是导致疾病的必要条件。最近的研究发现，CMT相关的甘氨酸-tRNA合成酶突变引起了tRNAsGly释放动力学的改变。这种短暂的tRNAsGly固定显著降低了所有四个甘氨酸密码子的翻译速度，改变了含甘氨酸的转录本的表达，并激活了整合应激反应。在CMT小鼠中增加最丰富的tRNAGly(GCC)的拷贝数减轻了萎缩和退化，这表明补充相应的tRNA可能是一种合适的治疗策略。增加主要tRNA同义密码子的水平足以克服突变的甘氨酸-tRNA合成酶引起的tRNA固定。然而，更有利的做法是使用包括所有由突变AARS充电的相应tRNA同义密码子的混合物，其比例模拟其自然浓度。这将确保在所有甘氨酸密码子上恢复翻译功能的整体平衡和更好的疗效。tRNA治疗药物的递送为了充分发挥tRNA在单基因疾病精准治疗中的潜力，需要开发和定制与tRNA荷载相关的特定限制的制剂策略。tRNA具有负电荷且容易受到降解，使其进入细胞变得困难。因此，实现对特定组织或细胞类型的高效递送是确保tRNA基因治疗临床有效性的关键。在病毒和非病毒递送系统领域已经取得了显著进展，为递送不同RNA荷载和靶向不同组织提供了可行的选择。尽管tRNA作为治疗药物的潜力直到最近才被认识到，并且尚未进行任何临床研究，但最近的研究表明使用为其他RNA开发的递送平台可以成功给药sup-tRNA，从而支持了tRNA治疗药物的潜在适用性。为了设计临床相关的药物递送载体以输送tRNA，考虑到作用机制和相应病理的组织起始点是非常重要的。病毒衍生的载体或外泌体对穿越血脑屏障（BBB）具有天然的趋性（图4），对于治疗中枢或外周神经系统作为主要起始组织的疾病非常有吸引力。合成载体（如脂质体和生物相容性聚合物）可能更适合于重复的全身给药，并为对AAV载体不可及的组织提供了一种补充选择（如肾脏和肺部）。图4. 治疗性tRNA递送方法生物相容的聚氧氯丙胺共聚物最近有望替代LNPs或AAV作为tRNA的载体。利用聚氧乙烯的低免疫原性和良好的安全性，已经开发出一种用于将质粒DNA载荷递送到肺部的自组装颗粒。该系统包含三种合成肽，一个锚定肽具有来自聚氧乙烯的疏水区块，一个阳离子部分含有碱性氨基酸用于封装核酸并促进内体逃逸，以及一个靶向区块用于将颗粒靶向特定组织。这些颗粒在体外、细胞模型和小鼠模型中进行了测试，用于囊性纤维化的mRNA替代疗法。tRNA的临床试验之路tRNA治疗是一种新兴的治疗方法，其潜力和前景备受期待。目前，所有tRNA治疗平台仍处于发现阶段或临床前开发阶段，但已经取得了一定的进展（图5）。随着tRNA治疗的研究不断深入，进行tRNA治疗的临床试验已经成为必然趋势。图5. tRNA的潜在应用总结进行使用tRNA治疗的临床试验需要考虑安全性、有效性和符合监管要求。临床前研究对于建立tRNA治疗的药理学和毒理学特性至关重要。这些研究需要全面评估tRNA分子的生物分布、代谢和潜在的不良反应，为临床试验提供安全性和有效性的支持。对于罕见疾病的临床试验面临的挑战是患有相同疾病指征的患者人数较少，考虑到特定的突变特征，这一数量甚至更少。因此，适合使用tRNA治疗的疾病需要独特的临床试验方法。在这方面，已经应用于癌症精确治疗的basket trials可能适用于tRNA治疗。对于中枢神经系统障碍等导致共同症状的疾病，如Dravet综合征、Rett综合征、CDKL5缺陷和Angelman综合征，可能适合使用共同制剂的basket trials。通过这种方式，可以触及更大规模的患者群体。确定对照组可能困难，因为正在研究的多种疾病的症状异质性。因此，进行无安慰剂对照组的单臂basket trials可能更为合适。临床试验在确定剂量方案和长期安全性和有效性方面起着至关重要的作用，需通过在长时间内（>15年）进行监测，并建立终身监测体系。外源tRNA分子的潜在免疫原性和免疫反应风险必须进行仔细评估。应建立可量化的疾病生物标志物以及在生物样本中定量和表征tRNA分子的可靠方法，以确保在临床试验期间进行准确的分析和比较。重要的是，在整个试验过程中与监管机构密切合作并遵守伦理指南，以确保tRNA治疗的安全性和可靠性。通过解决这些问题，涉及tRNA治疗的临床试验可以为其安全性和有效性提供宝贵的见解，为最终批准和将其纳入临床实践铺平道路。小结tRNA疗法是一种具有治疗各种疾病潜力的新型基因治疗方法。目前，大部分研究还处于临床前阶段，但已经有几家公司在探索tRNA的治疗潜力。尽管距离第一个tRNA治疗获得临床试验批准可能还需要几年时间，但随着tRNA生物学和设计、核苷酸化学、递送系统和生物信息学的不断突破，基于tRNA的基因治疗正在形成。这个已有半个多世纪历史的tRNA治疗概念可能很快进入一个新的领域，用于作为单基因疾病的新型治疗模式。参考资料1.tRNA therapeutics for genetic diseases.2.Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease.3.The expanding world of tRNA modifications and their disease relevance.