CRISPR/Cas蛋白在基因工程中的原理和应用

2023-08-11

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摘要规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）及CRISPR相关蛋白（CRISPR-Cas）系统，为生命科学研究中操纵、删除、成像、注释多种生物体的特定DNA或RNA序列提供了众多可选方法。该系统将外源DNA（spacer）结合进CRISPR盒中，进一步被转录成CRISPR序列，形成引导RNA（gRNA）。CRISPR基因可编码Cas蛋白。Cas蛋白起催化作用，可将新的外源DNA片段靶向插入CRISPR盒。根据可特异性识别的编码序列的不同，Cas蛋白也分为多种，例、如Cas9、Cas12、Cas13和Cas14等，他们在基因工程的新工具中均有所应用。多种的Cas蛋白促进了基因学研究的发展，并促使大家使用CRISPR/Cas工具来操纵、编辑多种生物体活细胞中的特定核酸碱基序列。本综述旨在提供两类CRISPR/Cas系统的细节信息、迄今发现的所有Cas蛋白，包括Cas12、Cas13和Cas14的作用机制。此外，本文还介绍了近期不同领域中使用Cas蛋白的优势及缺点，包括SARS-Cov-2病毒检测。本综述还可以使研究人员了解多种Cas蛋白及其应用，此蛋白在下一代精准基因工程技术中具有应用潜力。引言基因组编辑或基因编辑技术，在医学、药学、传染病研究、农业生物技术领域中被广泛应用。基因组编辑工具通过在特定程序化基因位点上插入、删除或替换特定核酸碱基，来剪切、置换特定基因，从而准确研究该基因的功能。在初始阶段，传统的基因编辑工具如同源重组（homologous recombination，HR）用来失活基因，但有效性很低且费时费力。随后，敲除特定基因的RNA干扰技术为研究者提供了一种快速且低成本的基因静默技术，以研究特定基因功能；然而该技术仍然不能完全敲除靶基因，不能预测实际敲除效果，只能暂时性、部分性抑制基因功能。基因编辑技术需要一种可以特异性识别编码序列的内切酶，在靶区域产生特定单链缺口或双链缺口，然后细胞内源性修复机制可修复此缺口，一般存在两种主要的修复机制，同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端连接修复（non-homologous end-joining repair，NHEJ）。为促进特异性DNA断裂，历史曾出现多种基因编辑工具，例如巨核酶/归巢内切酶、锌指核酸酶(ZFNs)、和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，但这些工具仍需要克隆技术和蛋白质合成技术以产生双链缺口，这也就限制了它们成为基因编辑的常规工具。在2012年，科学家发展出基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）及CRISPR相关蛋白（CRISPR-Cas）系统的基因编辑工具。CRISPR/Cas系统介导噬菌体和原核生物的适应性免疫过程。基于其设计简单、性价比高的独特特性，研究界立即采用CRISPR/Cas系统作为一种用户友好且强大的rna引导DNA靶向工具，应用于各物种的基因组编辑。根据作用机制，CRISPR系统被分为两类(1类和2类)六种（I-VI)。I、II、III被广泛研究，IV和VI是最近才发现的。I、II、V可切割DNA, VI可切割RNA, III可同时切割DNA和RNA, IV的切割活性尚未确定。除了靶向切割双链DNA外，Cas9蛋白已被广泛应用于荧光成像、碱基编辑和转录激活等领域。与Cas9类似，Cas10蛋白也在荧光成像、碱基编辑和RNA跟踪中有所应用。作为Cas9和Cas10的替代品，Cas12蛋白仅通过靶向富含T的模体而非tracrRNA，提高了基因组编辑效率。因此Cas12系统大大扩展了其在基因编辑，例如碱基编辑和检测转录变异中的应用。Cas13蛋白也有多种应用，如成像、碱基编辑和转录变异检测。近期发现Cas14蛋白在需要临近的原间隔序列(PAM)的情况下，仍可以进行转录和碱基编辑，仍具有较高的基因组编辑效率。本文对用于基因组编辑的两类CRISPR系统的Cas蛋白进行综述。 CRISPR/Cas系统的历史一些研究人员通过分析大肠杆菌K-12菌株中碱性磷酸酶同工酶(iap)转化的碱性磷酸酶基因来检测CRISPR。他们发现了一个基因组区域，该区域包含32个核苷酸，为一独特的回文重复序列，出现在iap基因3 '端。此后，在其他大肠杆菌菌株和肠杆菌(痢疾志贺氏菌和肠沙门氏菌)中首也发现了类似的独特序列。同样，在对结核分枝杆菌菌株的研究中，研究人员发现了36个碱基对的重复序列，这些重复序列之间存在由35-41个碱基对组成的间隔区。在随后的研究中，CRISPR阵列在古细菌(地中海盐藻和热电链球菌)中被发现，在90%的细菌和40%的古细菌基因组中也存在类似情况。然而，这个奇怪的基因组序列最初被证明是CRISPR阵列的轮廓。然而，由于缺乏必要的基因组序列数据，CRISPR的生物学功能仍然难以捉摸。Jansen等人在2002年描述了CRISPR相关基因。随后，几个CRISPR/Cas基因被鉴定出来。2005年，在许多基因组中发现了间隔区序列，在CRISPR阵列中也发现了独特的间隔区。这些结果表明，CRISPR是一种由RNA引导的、以保护原核细胞免受噬菌体感染的适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统的分类CRISPR系统主要被分为两大类。在1类系统中，RNA引导靶向切割需要几种效应蛋白，而2类系统只需要一种RNA引导的内切酶来切割DNA序列。CRISPR的1类系统分为I、III、IV三种，2类系统分为II、V、VI三类。I类系统中，CRISPR/Cas位点包含Cas3标志基因，该基因编码一个带有解旋酶的大蛋白，以解开DNA-DNA和RNA-DNA双链。II类基因座编码多结构域蛋白，靶向切割双链DNA。III型CRISPR/Cas具有Cas10特征基因，编码以棕榈结构域为靶点的多结构域蛋白，切割单链DNA。IV型系统含有CRISPR相关剪接因子1 (Csf1)，其编码一种核糖核蛋白，但该系统的详细功能尚不清楚。V型位点具有Cas12特征基因(来自普雷沃氏菌和弗朗西斯氏菌1号(Cpf1)的CRISPR)，C2c1或C2c3蛋白，编码RuvC(一种参与DNA修复的大肠杆菌蛋白)结构域，双链DNA和单链DNA均可切割。VI型含有Cas13 (C2c2)，编码高级真核生物和原核生物的核苷酸结合域(HEPN)，切割单链RNA（表1)。表1 对CRISPR/Cas系统的蛋白、靶分子、间隔子获取机制、Pre CRISPR处理、自我与非自我辨别及其效应物进行分类，并对分离的生物名称进行参考CRISPR/Cas系统通过三个阶段来防御病毒或外来遗传物质 (图1)。在第一阶段，原间隔区被整合入宿主CRISPR位点，作为crRNA重复序列之间的间隔物；接下来，表达Cas蛋白，将间隔物转录成pre-crRNA, pre-crRNA被Cas蛋白切割，成为具有功能的成熟crRNA。在第三阶段，Cas蛋白在crRNA的帮助下识别靶标并产生基因组的切割。许多CRISPR系统基于序列特异性PAM的存在而起作用，该PAM与目标基因组中的crRNA特异性位点相邻。图1 CRISPR/Cas适应性免疫系统。本文图解说明了三个阶段，如CRISPR适应(阶段1)、CRISPR RNA生物发生(阶段2)和CRISPR干扰(阶段3)。在适应阶段，向细菌细胞内注入遗传物质(病毒)会触发Cas1和Cas2适应模块蛋白，该蛋白切割入侵序列(间隔区)，然后纳入CRISPR阵列。在CRISPR/RNA生物发生阶段，CRISPR阵列被转录成crRNA分子的前体(pre-crRNA)，然后这些分子被切割成成熟的crRNA。这些成熟的crrna与Cas蛋白形成效应物复合物。当外源遗传物质序列匹配CRISPR间隔序列时，匹配的crRNA与入侵链结合，在Cas核酸酶的帮助下切割入侵链ing链(CRISPR干扰阶段)CRISPR/Cas系统科学家们发现了一种新的微生物防御系统，可以保护自己免受病毒和移动基因的侵害。在细菌和古细菌中发现的一种防御机制被称为CRISPR/Cas系统。通过将与先前入侵者相同的DNA序列整合到基因组中，细菌和古细菌产生了对它们的细胞记忆。这些获得的序列使它们能够发现病毒或移动的遗传入侵者，从而降解入侵序列，并作为适应性免疫系统发挥作用。CRISPR免疫分为几个特定阶段。在适应阶段，细菌和古细菌获得了入侵噬菌体的细胞记忆。噬菌体基因组序列被整合到细菌或古细菌基因组的CRISPR位点，由24至47个重复碱基对组成，并由间隔区隔开。CRISPR系统的独特基因座于1987年首次被发现。随后，Bolotin等人在2005年发现CRISPR的功能(编码Cas基因的酶产生的DNA片段)，与保护细菌和古细菌免受外来入侵者的侵害相关。后来，科学家发现CRISPR/Cas系统是一种适应性免疫系统，最终被采用为可编程RNA的基因组编辑的通用系统。CRISPR系统的Cas蛋白Cas蛋白已经在基因组工程应用研究领域被广泛知晓。目前在各个领域均有应用，包括生物技术、农业和医学研究。最近发现的可编程Cas蛋白，如Cas 12、Cas 13和Cas 14，提高了CRISPR/Cas介导的基因组编辑的精度(表2)。下面详细总结了这些不同Cas蛋白的作用机制、优缺点及其应用。表2 各种CRISPR/Cas蛋白及其宿主生物，sgRNA大小，PAM序列及其靶分子和切割位点的详情Cas1和Cas2蛋白Cas1和Cas2在原核适应性免疫系统中通常是保守蛋白。CRISPR/Cas系统包含间隔物分隔的重复序列（30-40个碱基对）的CRISPR阵列、相邻的Cas1和Cas2、不同的特征蛋白。Cas1和Cas2蛋白的作用机制。Cas1和Cas2属于II型CRISPR系统，在大肠杆菌中发现。大肠杆菌Cas1-Cas2复合体可介导细胞体获取间隔区序列，但这些蛋白在整个免疫过程中的分子机制尚不清楚。Cas1和Cas2蛋白形成了一个整合酶复合体，两个远端Cas1二聚体由一个Cas2二聚体桥接。Cas1和Cas2蛋白像双重折叠DNA一样与pre-spacer结合。通过引导序列和在CRISPR重复序列之内的一对插入重复序列，pre-spacer可以与CRISPR近端区域整合。图2 CRISPR/Cas9机制示意图。A Cas9蛋白复合物包含六个结构域(REC I, REC II，富含精氨酸的桥螺旋，PAM Interacting, HNH和RuvC)。REC I是与gRNA结合的主要结构域，REC II的功能尚未研究。富含精氨酸的桥螺旋与目标序列结合后启动裂解活性。与PAM的相互作用赋予PAM特异性，这是负责与目标序列结合。HNH和RuvC是用于切割靶序列的核酸酶结构域。由于gRNA的缺失，Cas9蛋白仍然没有活性。B 程序化的gRNA与Cas9结合并使蛋白发生变化，从而使无活性的Cas9蛋白变成有活性的形式。一旦被触发，它将通过绑定与PAM序列(5 ' -NGG-3 ')匹配的序列来搜索目标序列。然后Cas9通过其HNH和RuvC结构域在PAM上游3 bp处生成dsb。Cas1和Cas2蛋白的应用。Cas1和Cas2是CRISPR/Cas系统中的保守蛋白。Cas1和Cas2蛋白的分子机制尚不清楚。因此，研究人员尚未将这些蛋白质应用于基因组编辑。Cas1和Cas2蛋白的优缺点。迄今为止，还没有通过Cas1和Cas2蛋白进行基因组编辑的研究；因此，在将Cas1和Cas2蛋白应用于不同领域之前，应该评估它们的优缺点。Cas9蛋白Cas9是一种与化脓性链球菌的CRISPR适应性免疫系统相关的蛋白质，被称为SpyCas9蛋白。SpyCas9蛋白具有1368个氨基酸的多功能结构域，在天然和人工CRISPR/Cas系统中，扮演DNA内切酶角色。Cas9蛋白的作用机制。Cas9蛋白的作用机制已被广泛研究。Cas9蛋白有6个结构域（1）识别叶(REC I) （2）REC II (3)富含精氨酸的桥式螺旋（4）PAM相互作用区（5）HNH (6) RuvC。REC I是与gRNA结合的主要结构域；REC II的功能尚未研究。富含精氨酸的桥式螺旋在与目标序列结合时启动裂解活性。与PAM的相互作用赋予PAM特异性，它负责与目标序列结合。HNH和RuvC是切割靶序列的核酸酶结构域 (图2)。在缺乏gRNA时, Cas9蛋白处于失活状态。设计好的gRNA形成T字形，包含1个四环和3个茎环。gRNA被设计成5 '端与目标序列互补。设计好的gRNA与Cas9结合，并在蛋白质中产生变化，使得失活的Cas9蛋白具有活性。Cas9一旦被触发，可通过结合与PAM序列(5 ' -NGG-3 ')匹配的序列，进而搜索目标序列。然后Cas9通过HNH和RuvC结构域在PAM上游3个碱基处切割双链DNA。HNH结构域切割与crRNA的20个核苷酸序列(gRNA)互补的DNA链(目标链)，RuvC结构域切割与互补链相反的DNA链(非目标DNA链)。用于切割靶DNA的spyCas9系统识别含有PAM的5'-NGG-3'二核苷酸的短“种子”序列。双tracrRNA:将crRNA融合到单个引导RNA (sgRNA)中，使CRISPR/Cas9系统切割目标双链DNA或单链DNA序列。Cas9蛋白的应用。Cas9蛋白在研究、医学和生物技术中，具有高效、靶向特点，在基因组工程应用中具有广泛前景。与TALEN和ZFN等传统基因编辑技术相比，通过简单地设计gRNA序列就可以轻松地对许多物种进行基因组修饰，这使得大规模的基因组编辑实验能够更容易地探测基因组功能。此外，Cas9蛋白还通过失活核酸酶结构域来限制转录，从而转化为RNA引导的归巢装置(dCas9)。利用效应融合(Cas9蛋白或sgRNA)改变特定基因组位点的转录状态，或重新排列基因组，可以显著扩展CRISPR/Cas9系统的应用范围，进行基因组工程的修饰。CRISPR/Cas9系统已被研究人员广泛采用并应用于多种领域，包括微生物、植物、动物、昆虫、人类细胞系等(图3)。图3 CRISPR/Cas9系统的应用。CRISPR/Cas9系统彻底改变了基因组工程:其准确性、快速性和可接受性使其在几乎无限的应用范围内使用。自从它被发现以来，研究人员一直在使用CRISPR/Cas9系统来治疗疾病，发现新的治疗方法，以及用于前切割医学。它不止于此;除了治疗人类疾病病例，CRISPR/Cas9还被用于研究模式昆虫和非模式昆虫的生物学、体细胞基因组编辑、制造生物燃料和改造更好的作物(水稻、小麦等)等。CRISPR/Cas9系统的发明使这些进步成为可能，这将改变全球人民的生活。Cas9蛋白的优缺点。CRISPR/Cas9系统的优势在于设计简单，比现有的ZFN和TALEN系统效率更高。多重基因组编辑是Cas9的另一个显著优势，它可以通过同时设计多个序列特异性gRNA来实现。尽管取得了许多进步，CRISPR/Cas9系统仍面临着一些缺点，也引发了许多关于编辑风险的质疑。其中一个例子是gRNA，它引导Cas9切割双链DNA或单链DNA，在靶生物体中表现了出更高的靶向和脱靶突变。即使是使用HDR的最好的CRISPR/Cas系统，也会诱导产生本不希望发生的突变。然而，这些脱靶效应可以通过使用被称为空Cas9 (nCas9)的改良Cas9版本来减少，相比双链DNA切割，可以只切割单链。然而，使用nCas9也不能100%消除脱靶，这需要在未来对Cas9进行升级改造。Cas12蛋白Cas12是一种多功能蛋白，具有更多的应用场景，如表观基因组编辑。Cas12蛋白属于V型CRISPR系统。最近发现Cas12蛋白可作为一种由效应RNA引导的DNA内切酶，成为Cas9蛋白基因组编辑的另一选择。Cas12蛋白从酸胺球菌(AsCas12a)和毛螺科细菌(LbCas12a)中分离出来。Cas9蛋白对PAM序列近端RNA-DNA螺旋起始约10个碱基对内的错配判别更为准确，但Cas12并不像Cas9蛋白，它可以自己加工前体crRNA，而不需要tracrRNA或RNase III。这一过程促进了研究者使用Cas12蛋白进行复杂的基因组编辑。Cas12蛋白的作用机制。Cas12蛋白只需要识别crRNA就能有效切割单链DNA和双链DNA。Cas12蛋白含有RuvC和核酸酶叶(NUC)结构域，具有裂解活性。与Cas9相同，Cas12在PAM序列旁边存在一个潜在靶点，一旦与Cas12相遇，就可以启动R-loop，在crRNA和目标DNA链之间形成碱基对杂交。在这一步骤中，Cas12匹配目标序列的< 17个碱基对，形成 R-loop。一旦R-loop形成，Cas12蛋白利用其活性RuvC结构域，在PAM序列的帮助下切割非目标链 (图4)。然而，Cas12蛋白的RuvC结构域在切割目标DNA链中的作用尚不明确。图4 CRISPR/Cas12机制示意图。Cas12蛋白只需要crRNA来产生双链断裂。Cas12蛋白在RuvC和核酸酶叶(NUC)结构域的帮助下，在PAM序列(CTA, TTN, TTTN)旁边切割目标区域。一旦Cas12开始相遇，它就启动R-loop，在crRNA和目标DNA链之间形成碱基对杂交。在这一步骤中，Cas12与目标序列的< 17bp匹配，并导致R-loop的形成。一旦R-loop形成，Cas12蛋白使用其活性RuvC结构域，并在PAM序列的帮助下在非靶链中产生一个惊人的切割.Cas12蛋白的应用。这是一个更简洁的系统，CRISPR/Cas12通过RuvC结构域切割双链DNA或单链DNA，不需要tracrRNA。最近，Doudna的团队推出了一种新的CRISPR/Cas诊断工具，称为基于Cas12蛋白的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)（图5b）。DETECTR技术使用V型酶切割单链DNA序列，分为三个阶段：（1）将Cas12a蛋白和靶crRNA整合进DNA报告探针中;一旦crRNA通过Cas12a蛋白识别其靶序列，Cas12a蛋白就会在侧面结合，靶向切割单链或双链DNA（2）靶DNA探针与荧光团和猝灭分子结合（3）DNA探针降解释放荧光团和猝灭剂，产生强大的荧光信号，用于检测靶向单链或双链DNA的切割。此外，该系统甚至可以检测到单个病毒颗粒分子(图5b)。例如，Chen等（2018）使用DETECTR技术检测了人乳头瘤病毒（HPV）。他们将Cas12的非特异性单链DNA与DETECTR结合，可在1小时内从临床样品的粗DNA提取物中分离出几种HPV16和HPV18毒株。此外，他们利用CRISPR/Cas12系统检测非洲猪瘟病毒（ASFV）。他们将POC系统与CRISPR/Cas12相结合，在2小时内检测到了ASFV。根据这一结果，他们称CRISPR/Cas12具有很强的特异性，甚至可以检测到目标病毒的单个核苷酸。最近，DETECTR还被用于检测SARS-Cov-2病毒。Mammoth Biosciences公司以SARS-Cov-2病毒的两个核衣壳（N）和包膜（E）基因为靶点，在1小时内更快地检测到了病毒。简而言之，他们生成了特异性靶向SARS-CoV-2的Cas12 - gRNA，并优化了E和N基因的DETECTR检测。他们利用这种升级的DETECTR检测方法，在1小时内检测到横向流动条上的SARS-CoV-2。与此类似，阿根廷和CASPR Biotech采用了基于CRISPR/Cas12系统的快速便携式SARS-CoV-2诊断方法。他们收集了COVID-19患者的唾液样本，并报道唾液中天然存在的蛋白质不会对基于CRISPR/Cas12的检测产生抑制作用。此外，中国的一个机构也使用基于CRISPR/Cas12的DETECTR的系统检测出了SARS-CoV-2。他们设计了靶向SARS（Wuhan-Hu-1毒株）和相关病毒的orf1a、orf1b、N和E基因的gRNA，并在其中检测到单核苷酸多态性(SNP)。根据这些结果，研究人员表示，基于CRISPR/Cas12系统，可高效、快速诊断COVID-19。Jiang等（2021）最近开发了一种与CRISPR/Cas12系统耦合的磁下拉辅助比色法(M-CDC)技术来检测SARS-CoV-2。他们使用金纳米颗粒(AuNP)探针来检测SARS-CoV-2。此外，他们筛选了41个病毒样本，报道M-CDC是一种有用的筛查SARS-CoV-2变体的技术，无需先进的仪器。Cas12核酸酶的这些应用使科学家们能够扩大基因组编辑在各个领域的范围，包括诊断新型病毒。图5 SHERLOCK和DETECTR系统的机理。(A) 通过重组酶聚合酶扩增(RPA)或逆转录(RT)-RPA扩增靶向双链DNA (dsDNA)或RNA。RPA与T7转录偶联，以隐蔽靶向RNA，通过Cas13系统检测。该扩增步骤与报告探针相结合，使特异的高灵敏度酶解报告基因(SHERLOCK)能够检测目标序列；(B) 在DNA核酸内切酶靶向的CRISPR转导报告基因(DETECTR)中，DNA用RPA扩增。Cas12系统tem与感兴趣的单链DNA (ssDNA)配对，启动Cas12系统的DNA酶活性。该扩增步骤结合报告探针，使DETECR能够检测目标序列Cas12蛋白的优缺点。与Cas9一样，Cas12蛋白也被认为是基因组编辑CRISPR家族的唯一成员。但在大多数情况下，Cas12被认为优于Cas9蛋白，因为Cas12蛋白可双链DNA断裂并仅促进HDR修复，而非NHEJ和HDR共同修复。Cas12系统也克服了与诊断策略相关的缺点。例如，使用定量qRT-PCR诊断SARS-COV-2需要较长的时间才能得到结果。但基于CRISPR/Cas12的DETECTR可在1小时内就检测SARS-CoV-2。这些结果证明了CRISPR/Cas12系统的优势，可以未来用于检测新出现的病毒。用于基因组编辑的CRISPR/Cas12系统的快速发展，对生命科学具有革命性意义。尽管这项技术的应用领域很广泛，但CRISPR/Cas12系统仍存在几个显著缺陷。例如，无论是否存在模板，CRISPR/Cas12系统都依赖于宿主细胞的DNA修复机制。尽管该系统已成功地用于获得精确的DNA插入到所需的基因组位点，但其有效性仍取决于细胞类型。通过HDR的DNA修复也与细胞分裂有关，这使得这些工具在分裂不活跃的细胞（如神经元）中无效。但研究仍在持续，旨在进一步定制Cas12系统，以确保DNA准确插入目标基因组。除了这个缺点之外，该系统具有广泛的适用性，加强版CRISPR/Cas12也在进一步研究中，确保基因组工程可稳健发展进行。Cas13蛋白最近发现的Cas蛋白是Cas13蛋白。CRISPR/Cas13系统在古细菌和细菌中作为一种“适应性”免疫系统来防御入侵RNA。Cas13蛋白家族包含两个亚型：（1）来自沙希纤毛菌的Cas13a蛋白(LshCas13a)，正式名称为C2c2，属于VI型（2）来自普雷沃氏菌的Cas13b 蛋白(PspCas13b)，属于III型，该系统仅靶向和切割单链RNA，而不是单链或双链DNA。Cas13a蛋白的作用机制。Cas13a蛋白通过单个crRNA被激活，就像Cas12蛋白通过pre-crRNA开始加工一样。Cas13a蛋白与crRNA、NUC和两个核苷酸结合(HEPN) RNA酶结构域组成，用于靶向RNA（图6）。LshCas13a在识别目标后切割单链RNA与crRNA间隔片段互补的序列（22-28nt）。靶序列在3'端有一个原间隔侧翼位点(protospacerflanking site, PFS)，一般是腺苷(A)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。LshCas13a和crRNA结合在一起，在无tracrRNA时靶向切割单链RNA。图6 CRISPR/Cas13a机制示意图。Cas13a蛋白通过单个crRNA被激活。Cas13a蛋白由crRNA、NUC叶和两个用于靶向RNA的核肽结合(HEPN)核糖核酸酶结构域组成。Cas13a识别与crRNA间隔区互补的目标序列(22-28 nt)后切割ssRNA。靶序列在3 '端由一个原间隔序列(PFS)组成，crRNA结合在一起并切割ssRNA的靶区域，而不需要tracrRNA。 Cas13b蛋白的作用机制。Cas13b蛋白比Cas13a蛋白更精准，因为PFS侧翼的RNA在5'端靶向A、U或G，在3'端靶向PAM （NAN/NNA）。Cas13b蛋白与成熟的crRNA相关。CRISPR/Cas13b复合体搜索目标单链RNA并诱导其靶点产生构象变化，进行非特异性的RNA切割。然而，Cas13b蛋白的机制尚未完全明确，但科学家们已经Cas13b蛋白进行RNA编辑的能力（图7）。图7 CRISPR/Cas13b机制示意图。Cas13b蛋白与成熟crRNA相关。这个ÇRISPR/Cas13b复合物搜索目标ssRNA，并在原间隔区fanking位点(PFS)的帮助下在ssRNA目标处诱导精确的构象变化位点，该位点将RNA定位于5 '端和PAM序列(NAN/NNA)定位于3 '端，从而导致非特异性RNA切割。Cas13蛋白的应用。Cas13蛋白在基因组编辑和诊断领域有着广泛的应用。除了碱基编辑等其他应用外，Cas13a还可检测靶序列上任意位点的单核苷酸。与DETECTR系统依赖于Cas12蛋白的活性一样，特异性高灵敏度酶促报告蛋白解锁（SHERLOCK）技术也依赖于Cas13蛋白（图5a）。SHERLOCK系统的工作原理是将靶向RNA片段与Cas13 crRNA和荧光RNA探针结合。如果样品中存在相应的靶序列，Cas13通过crRNA识别并切割荧光DNA探针，对荧光团和猝灭剂产生影响，可通过荧光信号检测到。此外，SHERLOCK与逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)或等温-RPA结合时，crRNA-Cas13a复合体可高特异性结合并切割特定的靶序列。SHERLOCK应用于多个领域，包括RNA检测、敏感检测核酸污染、RNA/DNA定量。此外，Cas13核酸酶也可追踪等位基因特异性转录表达或检测细胞中疾病相关的突变。这些吸引人的特征，为灵敏区分各生物体（包括病毒在内的）单核苷酸变化开辟了新的途径（图5a)。例Gootenberg等（2018）使用SHERLOCK系统分离DNA，诊断了大肠杆菌和铜绿假单胞菌感染。他们还区分出肺炎克雷伯菌具有两种耐药基因KPC和New Delhi metallo-β-lactamase 1。此外，还通过SHERLOCK法鉴定出了非洲和美洲的寨卡病毒、登革热病毒血清型和癌症相关DNA靶点。此外，SHERLOCK可在30分钟内，更灵敏地检测出检测寨卡病毒和登革热病毒。研究者还开发了一种独特的检测病毒感染的技术，将SHERLOCK与加热未提取的诊断样本相结合，以消除核酸酶的影响（HUDSON）。在2小时内，SHERLOCK系统在患者的唾液、血液和血清中发现了登革热病毒。根据这些现有结果，SHERLOCK Biosciences公司和Mammoth Biosciences公司开始使用SHERLOCK技术检测SARS-CoV-2。通过靶向S和Orf1ab基因，在1小时内检测到了SARS-Cov- 2 RNA序列。Metsky等（2020）也利用Cas13a蛋白检测了SARS-CoV-2 RNA。他们将合成的RNA靶点与荧光剂结合，检测出了SARS-CoV-2-RNA。为了测试SARS-CoV-2检测的有效性，最近Rauch等（2020）使用了基于Cas13的CREST)法。这项技术使用便携式和轻型LED可视化器内置塑料过滤器。研究人员也可以使用横向流动免疫层析条带来检测目标RNA，但这些条带很昂贵。因此，他们创造了一种P51纸板荧光可视化器，它更便宜，每毫升可以检测10个拷贝的目标RNA。此外，他们利用智能手机摄像头捕捉数据，然后将数据上传到云端，以进行POC测试。它改进了基于CRISPR的核酸检测，并展示了它通过可以直接筛查，甚至对大量人口进行筛查，体现了该系统可以改变目前的诊断和检测现状。后来，Tian等（2020）开发了基于单分子RNA诊断的CRISPR/Cas13a检测系统，免除了逆转录酶和核酸延伸程序。他们指出，使用CRISPR/Cas13a检测系统可以很容易地检测到SARS-CoV-2。Cas13蛋白的这些优势，使研究人员能够在不同的生物体中靶向任何非靶向序列。Cas13蛋白的优缺点。与Cas9和Cas12一样，CRISPR/Cas13也是一种强大、精确、多功能的RNA靶向系统，在多个领域开辟了新的研究视野。与早期的RNA操作系统相比，CRISPR/Cas13具有许多优势。例如，其模块化结构由单个蛋白质效应模块和RNA引导模块组成，除了易于快速设计外，还可以生产各种引导RNA，显著扩大了其应用范围。最近发现的Cas13突变版本(dCas13, Cas13x)作为RNA结合蛋白，可有效地将不同的效应物靶向到特定的RNA上，诱导特定的突变。由于crRNA固有的生物学来源，Cas13可以精确靶向多种RNA。与RNAi相比，CRISPR/Cas13介导的基因组修饰并不局限于靶向细胞质转录物。此外，Cas13通过直接敲除细胞质mRNA转录物，能够更快地下调基因表达。最近，基于CRISPR/ cas13的SHERLOCK和SHERLOCK v2在开发病毒检测新型分子诊断工具（包括SARS-CoV-2）方面也发挥了至关重要的作用。除了这些主要优势外，CRISPR/Cas13还面临脱靶突变，这是该系统的主要缺点。然而，未来的研究将有助于克服这一障碍，并有助于开发更具特异性和效率的新型RNA敲除方法。Cas14蛋白Doudna的团队研究了自然界中存在的其他相似类型的Cas系统（Cas9、Cas12和Cas13）。他们通过创建细菌基因组的宏基因组数据库，来寻找未表达的Cas基因。令人惊讶的是，他们发现了Cas14蛋白，该蛋白编码分子量为40-70 kD的更小的Cas蛋白。该Cas14蛋白比其他已知的Cas14蛋白要小得多（仅有400-700个氨基酸）。由于其体积小，Doudna的实验室报道Cas14蛋白可以靶向不含PAM的单链DNA。Cas14蛋白的作用机制。这种Cas14可切割单链DNA，并赋予对具有单链DNA基因组或移动遗传元件（MGEs）的病毒的免疫力。Cas14蛋白识别单链DNA，介导种子序列与目标单链DNA的相互作用，并切割单链DNA，而不是双链DNA或单链RNA。与Cas9一样，Cas14蛋白也需要tracrRNA和crRNA来靶向单链DNA（图8）。在不存在PAM区域的情况下，Cas14蛋白的切割比Cas9、Cas12和cas13蛋白更具特异性。因此，该系统满足高保真基因组编辑的所有标准。图8 CRISPR/Cas14机制示意图。Cas14蛋白包含tracrRNA和crRNA以靶向ssDNA。Cas14蛋白在tracrRNA和crRNA的帮助下识别ssDNA，介导种子序列与目标ssDNA的相互作用，并切割ssDNA，而不是dsDNA或ssRNA。在不存在PAM区域的情况下，Cas14蛋白的切割效率比Cas9、Cas12、cas13蛋白更具有特异性。Cas14蛋白的应用。CRISPR/Cas14系统现在被认为优于Cas13系统。研究人员将CRISPR/Cas14系统与DETECTR结合起来，作为一种高保真检测单链DNA的诊断方法。Harrington等（2018）首次将CRISPR/Cas14系统与DETECTR技术结合使用。他们设计的gRNA靶向蓝眼单核苷酸多态性(SNP)个体唾液样本中含有E3泛素蛋白连接酶2（HERC2）基因的HECT和RLD结构域，Cas14表现出了对蓝眼SNP的强激活识别，而Cas12系统未能检测到蓝眼SNP。这一结果展示了一种高性价比的筛选致病突变的方法，并为绘制与不同病原体相关的候选基因提供了机会。另一组研究人员提出将Cas14用于简化核酸提取和病毒诊断，不涉及加热未提取的诊断样本以消除核酸酶等复杂的样品提取过程（HUDSON）。研究结果表明，Cas14可以为未来的病毒筛选提供一个先进的平台。这种新颖的CRISPR/Cas14系统更用户友好、更敏感、更特异，未来可应用于基因组工程及其他方面包括诊断、探索进化关联（新病毒）、探索与其他病原体的流行病学关联、分类分析。Cas14蛋白的优缺点。Cas14蛋白可以编辑双链DNA、单链DNA和单链RNA，与传统的Cas9蛋白相比，它具有多种优势。例如，大约有500个氨基酸的Cas14蛋白非常小，不同于Cas9蛋白，它可以很容易地递送进任何组织。此外，Cas14蛋白的选择性提高了单核苷酸多态性（SNP）检测的保真度。最后，Cas14蛋白对PAM的限制性要求更少（只使用富含T碱基的序列），使其能够更有针对性地编辑基因组序列。然而，只有少数研究得到证实，后续这需要更广泛领域的研究来探索Cas14的功能。结论与展望近年来，CRISPR/Cas工具的开发在基因组工程领域取得了突破性进展。Cas蛋白的发现使自然科学研究发生了革命性的变化，基础研究、治疗和诊断也取得了不错的进展。使用方便，设备要求少，成本低，使得许多实验室利用这些基于CRISPR/Cas的系统来研究各种生物的基因功能成为可能。Cas9蛋白在CRISPR系统中的首次发现，促进了研究人员发现不同的Cas变体，如Cas12、Cas13和Cas14蛋白。Cas蛋白的研究进展为基因组工程提供了基础，包括检测植物、动物和人类的RNA病毒以及治疗感染。目前有几项研究正在从自然界中寻找新的Cas变体。然而，我们对Cas蛋白的许多机制仍缺乏足够的了解。因此，了解Cas蛋白背后的分子机制，鉴定无PAM的Cas蛋白，以及更精确、更特异地靶向，最大限度地减少脱靶效应，将显著提升Cas蛋白在基因组工程中的潜力。此外，可能存在于许多细菌或古细菌中的未表达的高级Cas蛋白将彻底改变多个领域，包括诊断新型病毒，治疗，农业，育种等。如果能够完全了解这些蛋白质被改进的基因组编辑能力，它可能会启动新的CRISPR“热”，在不久的将来，在主流领域提供有影响力和突破性的CRISPR技术。END