药典委：生物制品企业请对氰化物检查法拟新增方法进行扩大再验证

2024-06-01

诊断试剂

转自：国家药典委编辑：水晶5月30日，国家药典委发布通知，药典委设立了生物制品氰化物残留量检查法补充方法的研究课题，现形成了自动化程度更高、灵敏度更高的氰化物残留量检查法草案。现阶段需要相关企业对该方法进行扩大再验证，并提供相关意见。本草案在目前0806氰化物检查法的基础上进行修订，新增1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。主要分为三部分，包括原理、设备、试剂、仪器参数的设置；对照品溶液、供试品溶液的制备；系统适用性要求、测定法、结果计算，并在附注里提出了其他需要关注的问题。各有关单位：为进一步提升《中国药典》生物制品标准的科学性，更好地保障生物制品质量，我委设立了氰化物残留量检查法补充方法的研究课题。该课题已由四川省药品检验研究院承担完成起草工作，并经上海市食品药品检验研究院完成复核工作，形成了自动化程度更高、灵敏度更高的氰化物残留量检查法草案。现阶段需要相关企业对该方法进行扩大再验证，并提供相关意见。请于2024年7月15日前将反馈意见表电子版（见附件2）和氰化物检查法测定结果汇总表（见附件3）发送至指定邮箱。联系人：四川省药品检验研究院张姮婕联系电话：13880070757 联系邮箱：1366009743@qq.com 附件：附件1.氰化物检查法（第四法）草案.docx 附件2.氰化物检查法（第四法）起草说明.docx 附件3.氰化物检查法（第四法）反馈意见表.xlsx 附件4.氰化物检查法（第四法）测定结果汇总表.docx 氰化物检查法(第四法)草案第四法 1.连续流动注射+直流安培法原理通过超滤对样品进行前处理，以去除大分子物质。去除大分子物质后的样品溶液与酸性试剂混合，经连续流动注射分析仪进行在线紫外消解，将待测的总氰化物（溴化氰、氰基硼氢化钠等）转化成氰化氢。氰化氢通过气体扩散膜扩散到碱性溶液中，并在碱性溶液中转化为氰根离子。然后将氰根离子带入直流安培检测器。其中，氰根离子与银/氯化银的参考电极发生配位交换，产生的电流与测量样品的总氰化物浓度成正比。检测器响应显示为峰高。由此产生的峰值高度与样品中的总氰化物浓度成正比，最后通过标准曲线法得到样品溶液中总氰化物的残留量。设备连续流动注射分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、总氰化物分析模块、紫外消解器、膜分离器、直流安培检测器、数据处理系统。试剂（1）含2%次磷酸的1mol/L硫酸溶液：取硫酸55mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加次磷酸20mL，加水稀释至1000mL，摇匀，即得。（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。（3）水。对照品溶液的制备（1）500ng/mL对照品贮备液取水中氰成分分析标准物质（50μg/mL），用水稀释成含氰化物浓度（以CN-计）为500ng/mL的溶液。（2）对照品溶液精密量取500ng/mL对照品贮备液适量，用水逐级稀释成含氰化物浓度（以CN-计）分别为1.25、2.5、5、10、20、40、60、80ng/mL的溶液。（3）灵敏度溶液精密量取500ng/mL对照品贮备液适量，用水逐级稀释成含氰化物浓度（以CN-计）为1.25ng/mL的溶液。供试品溶液的制备取供试品2mL，置3KD超滤离心管中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液1mL，以每分钟4000×g离心45分钟（采用水平转头）或每分钟7500×g离心45分钟（采用固定转头）后，再加水1mL，自“以每分钟4000×g离心45分钟（采用水平转头）或每分钟7500×g离心45分钟（采用固定转头）”起，重复操作两次，离心结束后合并滤液，混匀，即得。仪器参数的设置一般参考条件：进样时间为35s；进样体积为200μL；40%泵速；样品周期时间为160s；紫外波长为312nm；直流安培检测器。系统适用性要求灵敏度溶液色谱图中，主成分峰峰高的信噪比应大于10。测定法将酸性试剂管路插入含2%次磷酸的1mol/L硫酸溶液中，将碱性试剂管路插入0.1mol/L氢氧化钠溶液中，将载液管路插入水中。开启蠕动泵，让溶液流经整个系统，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录峰高。结果计算以对照品溶液中氰化物浓度（以CN-计）（ng/mL）对其相应的峰高作线性回归，求得线性回归方程，将供试品溶液的峰高带入线性回归方程，求得供试品溶液中氰化物浓度（以CN-计）B（ng/mL），再通过换算得出供试品中氰化物浓度（以CN-计）（ng/mL），最后除以多糖含量（mg/mL）得到供试品中氰化物残留量（ng/mg）。计算公式为：供试品中氰化物残留量（ng/mg）=（B×稀释倍数）/多糖含量 2.连续流动注射+光度法原理本法仍以超滤对样品进行前处理，以去除大分子物质。去除大分子物质后的样品溶液，在酸性条件下，通过在线蒸馏释放出氰化氢。氰化氢通过膜分离器分离，然后被碱性溶液吸收变成氰根离子。在弱酸性条件下，氰根离子与氯胺T反应生成氯化氰，再与异烟酸反应经水解生成戊烯二醛，戊烯二醛与巴比妥酸缩合生成紫蓝色化合物，于波长600nm处进行比色测定。设备连续流动分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、氰化物反应单元、蒸馏模块、膜分离器、600nm比色检测器、数据处理系统。试剂（1）蒸馏试剂：取枸橼酸50g，加水800mL使溶解，加氢氧化钠12g，加水稀释至1000mL，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至3.8。（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。（3）30%十二烷基聚乙二醇醚溶液：取十二烷基聚乙二醇醚（（C2H4O）nC12H26O）30g，加水50mL，在70℃下搅拌至充分溶解，放冷，加水使成100mL，即得。（4）缓冲溶液（pH5.2）：取氢氧化钠2g与邻苯二甲酸氢钾20.5g，加水1000mL使溶解，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.2，加试剂（3）1mL，摇匀，即得。（5）氯胺T溶液：取氯胺T2g，加水1000mL使溶解，即得。（6）异烟酸-巴比妥酸试剂：取氢氧化钠7g、二甲基巴比妥酸（C6H8O3N2）16.8g与异烟酸（C6H5NO2）13.6g，加水1000mL使溶解，用1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至5.2，即得。对照品溶液、灵敏度溶液、供试品溶液的制备见1.连续流动注射+直流安培法项下。仪器参数的设置一般参考条件：蒸馏模块温度为125℃，检测波长为600nm。其余见1.连续流动注射+直流安培法项下。系统适用性要求见1.连续流动注射+直流安培法项下。测定法按照仪器说明，依次将指定管路放入对应的溶液中，并按照最佳工作参数进行仪器调试，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录吸光度。 3.流动注射+光度法原理本法样品前处理、化学反应原理与2.连续流动注射+光度法相同，仅是样品分析方式不同：连续流动分析是利用连续流、通过蠕动泵将样品和试剂泵入分析模块中混合、反应，并泵入气泡将流体分割成片段，使反应达到完全的稳态后，进入检测器进行测定。流动注射分析是在封闭的管路中，将一定体积的样品注入连续流动的载液中，样品与试剂在化学反应模块中按特定的顺序和比例混合、反应，在非完全反应的条件下，进入检测器进行测定。设备流动注射分析仪：自动进样器、多通道蠕动泵、氰化物反应单元、蒸馏模块、膜分离器、600nm比色检测器、数据处理系统。试剂（1）蒸馏试剂：取磷酸50mL，加水稀释至1000mL，即得。（2）0.025mol/L氢氧化钠溶液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液1.4mL，加水使成1000mL，摇匀，即得。（3）磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）：取磷酸二氢钾97g，加水1000mL使溶解，即得。（4）氯胺T溶液：取氯胺T2g，加水500mL使溶解，即得。（5）异烟酸-巴比妥酸试剂：取氢氧化钠12g、二甲基巴比妥酸（C6H8O3N2）16.8g与异烟酸（C6H5NO2）13.6g，加水1000mL使溶解，即得。对照品溶液、灵敏度溶液、供试品溶液的制备见1.连续流动注射+直流安培法项下。仪器参数的设置见2.连续流动注射+光度法项下。系统适用性要求见1.连续流动注射+直流安培法项下。测定法按照仪器说明，依次将指定管路放入对应的溶液中，并按照最佳工作参数进行仪器调试，待基线平稳后，分别取对照品溶液、供试品溶液注入全自动化学分析仪，记录吸光度。【附注】（1）不同品牌或型号仪器的试剂配制有所不同，可根据试剂情况进行调整，经完整的方法学验证后使用。（2）当采用光度法进行测定时，供试品溶液的吸光度读数，以在0.3-0.7之间为宜。（3）应注意仪器管路系统的保养，经常清洗管路；每次实验前都应检查泵管是否磨损，并及时更换已损坏的泵管。（4）供试品溶液超滤完成后，膜上液体应不大于100μL，若剩余较多，可延长超滤时间。（5）供试品溶液需当日配制，当日使用。（6）可用0.01mol/L溶液氢氧化钠代替水制备对照品溶液。氰化物检查法（第四法）起草说明一、修订目的目前各国药典逐渐由传统化学检查法向现代仪器分析法转变，因此，0806氰化物检查法新增：1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。推荐使用第1法。此外，为解决溴化氰对照品剧毒且不易购买的问题，增加用水中氰成分分析标准物质制备对照品溶液的方法；为解决疫苗中蛋白质等大分子物质对检测结果的干扰，增加对样品进行超滤的前处理方法。二、修订思路本草案在目前0806氰化物检查法的基础上进行修订，新增1.连续流动注射+直流安培法、2.连续流动注射+光度法、3.流动注射+光度法作为第四法。主要分为三部分，包括原理、设备、试剂、仪器参数的设置；对照品溶液、供试品溶液的制备；系统适用性要求、测定法、结果计算，并在附注里提出了其他需要关注的问题。三、主要内容（一）原理、设备、试剂、仪器参数的设置本部分内容由调研市面上主流仪器结合具体实验结果汇总得出。通过不同厂家型号间的仪器试验对比结果，明确了方法的试剂配制方法，并详细列出了各仪器参数，提供指导性意见。（二）对照品溶液、供试品溶液的制备本部分分为对照品溶液的制备、供试品溶液的制备两部分内容。对照品选用国家标准物质：水中氰成分分析标准物质（标准物质编号：GBW（E）080115；中国计量科学研究院）在对照品溶液中，参考色谱法增订了灵敏度溶液的制备方法。（三）系统适用性要求、测定法、结果计算氰化物检查属于痕量分析，为更好的评价色谱系统检测痕量物质的能力，参考《中国药典》2020年版高效液相色谱法（通则0512）及离子色谱法（通则0513）中系统适用性要求，设置了灵敏度溶液来评价色谱系统的检测能力。此外，当采用光度法（即本草案所述第2小法及第3小法）进行测定时，参考《中国药典》2020年版紫外-可见分光光度法（通则0401）中相关要求，供试品溶液的吸光度读数应在0.3-0.7之间。因疫苗中氰化物残留量高低不一，本草案采用了标准曲线法。在结果计算公式中明确了氰化物浓度（ng/mL）与供试品中氰化物残留量（ng/mg）的换算关系。