一文了解如何优化您的优质细胞系？

2023-12-15

疫苗细胞疗法核酸药物寡核苷酸

在过去的十年中，采用哺乳动物细胞生产单克隆抗体（mAb）和重组蛋白促进了生物治疗蛋白繁荣。1982 年至 2017 年首次获批期间，US-FDA 共批准了 239 种治疗性蛋白质和肽用于临床1,2。推动增长的一些关键因素包括对有效疗法的需求不断增加、癌症治疗领域的单克隆抗体以及疫苗产量的增加。随着增长的持续，降低细胞系开发成本并缩短上市时间的需求变得愈发迫切。在本文我们概述了细胞系开发工作流程，以及高通量解决方案，从而能够更轻松、更快速地开发高产细胞系。1. Salman Sadullah Usmani, Gursimran Bedi, Jesse S. Samuel, et al. THPdb: Database of FDA-approved peptide and protein therapeutics. PLoSOne. 2017; 12(7): e0181748.2. George, K., Woollett, G. Insulins as Drugs or Biologics in the USA: What it Matter?. BioDrugs 33, 447–451 (2019).细胞系开发工作流程★CHO、杂交瘤或 HEK 293 等细胞系是常见的宿主细胞用于表达重组蛋白药物。开发稳定细胞系的过程第一步用重组质粒转染宿主细胞（CHO 或 HEK 293）或进行细胞融合形成杂交瘤细胞。转染或细胞融合后，根据目标蛋白（治疗性生物制剂）的表达情况对大量克隆进行筛选。确定候选克隆后，通过 DNA 测序和各种下游分析测定，对每个“候选物”进行确认、验证和表征。完成后，细胞克隆放大培养，并开展工艺化。杂交瘤细胞★杂交瘤细胞技术是一种将分泌抗体的免疫B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞融合后所产生的杂交细胞系（现称为杂交瘤细胞）用于抗体大量生产的方法。由于每一个 B 细胞都能产生一种独特抗体，因此杂交瘤细胞的单细胞克隆可用来大规模生产独特单克隆抗体的多样文库，这些抗体常被用于疾病的预防、诊断和治疗。重组蛋白生产细胞株开发流程★杂交瘤细胞株开发流程★HAT法筛选杂交瘤细胞★杂交瘤细胞来自骨髓瘤细胞和脾细胞的体外融合，用于生产抗体。将这两种细胞类型融合的原因是脾细胞能够产生感兴趣的抗体但无法增殖，而骨髓瘤细胞能够无限增殖但无法分泌抗体。因此，融合的杂交瘤细胞兼具两种细胞类型的特性，可大规模产生目标抗体。在融合过程中，将杂交瘤细胞从骨髓瘤和脾细胞筛选出来非常重要，以便更大限度地提高抗体产量。脾细胞不能在体外增殖因此可以很容易被筛除。骨髓瘤的筛除比较具有挑战性，但可通过使用含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶（HAT）的培养基来实现。其背后生理学机制为，哺乳动物细胞可以通过两种不同的途径合成 DNA 核苷酸：从头合成途径和补救途径。正常条件下，哺乳动物细胞采用从头合成途径进行DNA复制。当从头成途径被阻断时，在提供次黄嘌呤和胸腺嘧啶条件下，细胞将利用补救途径进行复制。这种方法的关键是在于选用 HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞，而HGPRT是补救途径所必须的一个酶。在从头合成途径被氨基蝶呤抑制的情况下，骨髓瘤细胞因HGPRT缺陷而不能增殖。杂交瘤细胞从脾细胞获得正常功能的HGPRT酶而能继续增殖。在选择杂交瘤细胞后，不再需要氨基蝶呤作为选择剂。随着细胞从氨基蝶呤的选择压力中恢复，它们仍将利用补救途径作为复制手段。HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶）在培养基中维持，直至杂交瘤细胞完全恢复。具有单克隆性保证的自动化细胞系开发工作流程★如果要筛选10000个克隆，传统工作可能需要30周到2年的时间，而自动化方式可能会缩短到几个月。更具体地说，自动化可以加速细胞系开发和克隆筛选，并从一开始就评估克隆的稳定性。通过自动化技术的集成，您可以筛选数十万个克隆，找到能够为您感兴趣的蛋白质产生更高产量的优质克隆。更重要的是，它可以帮助您从第一天开始就充分记录开发过程的每一步。最终，您可以避免由于缺乏单克隆性保证或产品质量不一致而导致的未来冲突，从而节省资金和时间。Molecular Devices拥有强大的产品组合，可以自动化您的细胞系开发工作流程和技术，以确保单克隆性，包括克隆挑选、单细胞分离和成像验证，以及微孔板读板机。会议推荐2023年12月21日晚19:00开始，由美谷分子仪器和药融圈共同组织，邀请到 3 位行业专家，围绕包括商业细胞株的选择、载体构建&转染、单克隆筛选策略及单克隆源性、细胞株稳定性评估等细胞株开发难点展开分享，以期从具体的案例分析中学习如何解决细胞株开发中遇到的难点和痛点，立体的掌握如何快速开发稳定的细胞株。