抗体高表达CHO细胞株的构建策略

2024-04-20

疫苗

细胞株开发是抗体药物CMC的基础工作，关系到整个抗体药物的质量及药效。细胞株的好坏直接决定生产成本、工艺复杂度和产品质量。一个好的细胞株往往能使得后续的工艺开发工作事半功倍，大幅降低抗体的生产成本。CHO细胞大部分治疗性抗体药物由哺乳动物细胞表达，哺乳动物细胞表达系统主要包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、幼仓鼠胚肾细胞（BHK）、小鼠骨髓瘤细胞（SP0/2），非洲绿猴肾细胞（Vero）以及人胚肾脏293细胞（HEK293）等。其中70%的治疗性抗体表达系统为CHO细胞，对比其他哺乳动物细胞，CHO细胞的优点主要包括：（1）CHO细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强,可根据培养要求选择贴壁培养或悬浮培养的方式；（2）CHO细胞遗传背景清晰，不易传播人类病毒，具有很高的安全性；（3）CHO细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能，其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；（4）表达目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且CHO细胞只表达少量的内源蛋白；（5）整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达（6）CHO细胞系易于产生基因工程细胞克隆，能够稳定地表达一个感兴趣的基因（GOI），以足够的产量和良好的质量供人类使用。不同品系的CHO细胞被用于抗体的表达，其中有代表性的包括：表1.常用商业化宿主细胞株各种CHO细胞均有各自优劣，使用者需要考虑包括表达水平、蛋白质量、商业授权等各方面因素，例如优势方面，GS系统在蛋白表达量和Qp方面显示出明细的优势，DG44系统细胞株稳定性好，K1 筛选周期短且表达量高，CHO-S商业授权清晰；反过来缺点方面GS系统价格昂贵，DG44表达量较低，K1细胞株稳定性较差，CHO-S相对易结团等等。随着基因工程技术的进步，科研者在改良宿主细胞也不断创新，用于满足跟高的生产目的需求。通过稳定表达有利于细胞增殖、抗凋亡、抗应激的基因，增加细胞自身的生长状态和代谢性能；利用已知的信号通路改造参与蛋白质生物合成和糖基化的关键基因，提升蛋白生产力和产品质量属性。其中糖基化的改造进展颇丰，已有多款新型细胞株用于稳定的低/无岩藻糖修饰的抗体表达，提升蛋白药效。如日本麒麟制药公司通过对FUT8进行基因干扰，得到了完全无岩藻糖抗体的CHO细胞株，Roche通过过表达2种酶（GlcNAc T III& GMⅡ）获得了明显降低抗体岩藻糖的含量的宿主细胞。当然市场上Lonza和Revvity（Horizon Discovery）也相继推出了ADCC+ CHO宿主细胞，丰富了使用者的不同选择。表达载体的构建和转染生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始。整个细胞株构建的流程如下（图1）。图1.细胞株构建流程图（以GS系统为例）（来源：Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selectionfor the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies.）高效表达载体的选择是影响重组蛋白（抗体）在哺乳动物细胞表达水平的关键因素。常规的表达载体必倍元件包括：一个高活性的启动子（如CMV，SV40）、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号。可以通过优化和增加调控元件，包括启动子、信号肽、翻译促进元件（延长因子EF1α或IRES）和抗阻遏元件（MAR序列、UCOE、绝缘子）等提升载体对目标蛋白的表达性能。载体通过转染进入宿主细胞的方式主要有磷酸钙转染、电穿孔转染、脂质体转染和逆转录病毒转染。DNA进入宿主细胞核后将会整合到宿主细胞基因组当中去，因此表达水平与目标基因拷贝数、基因整合位点的转录活性等有关。按照目标基因存在于宿主细胞中的时间，转染可分为稳定转染和瞬时转染两种。瞬时转染：外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。两者的应用场景：稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。在单抗细胞株筛选稳定转染前通常通过瞬时转染得到一些抗体，进行质量分析，以初步判断抗体是否满足需要。稳定转染后，通过筛选获得外源DNA稳定整合到CHO染色体上的高产单克隆。然后进行克隆传代稳定性验证，稳定的高产克隆才能进入下游细胞培养工艺开发阶段。载体面临的问题：传统的载体依赖于随机整合的方式插入宿主细胞基因组中，通过筛选从重组细胞池中合适的单克隆，这种方法有两大缺点: 整合效率低以及整合位点的位置效应。位置效应指的是异染色质区会有效地阻止插入的基因的表达，随机整合载体常常需要大量的克隆筛选工作，稳定性验证工作，费时费力。第二代载体技术：转座子载体系统的出现解决了传统随机整合载体效率低、克隆继代稳定性弱的瓶颈问题，转座子载体一般由转座酶+转座载体两部分组成，常见的工业应用的转座子系统有Sleeping Beauty，PiggyBac，Leap-in，Tol2等。不同转座酶能够将识别的特定的末端序列(TIR)，并准确的将TIR间的目标DNA剪切并粘贴到宿主细胞基因组的特定位点上，实现了目标基因的高效和完整整合它们在生物医药领域崭露头角的应用，已经验证了这个新载体的优势。利用转座技术获得的重组CHO pool仅在2-3周内即可生成，单克隆的稳定性也超过了90%(PDL60)，显著加速了细胞株开发周期。在产能上，据报道，仅利用pool就能够达到非常高的蛋白产能 (3~7g/L)，因此可用于快速生产大量蛋白质。大家可以自己钻研如何提升转座子载体的性能，也可以直接采用商品化的成熟转座子载体平台，如piggybac Vector(Lonza)，leap-in(ATUM)，TnT transposon(Revvity)。高表达细胞株的筛选筛选高表达单克隆细胞株是细胞株构建的关键步骤，衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞稳定性等。CHO细胞转染之后，通常会做一个克隆池(pool)，然后进行筛选。筛选策略主要涉及抗生素或药物的代谢途径，常见的筛选试剂包括puromycin、G418、MTX和MSX等（图2）。图2.Puromycin、G418、MTX以及MSX等筛选原理及浓度范围抗生素筛选是最早的一代筛选体系，随着技术进步，代谢型筛选体系逐渐取代抗生素。目前，谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统已发展成为最为高效的筛选系统。利用MSX进行GS筛选时，一般MSX浓度范围为25~500umol/L；在使用GS敲除的CHO宿主细胞时，不再需要高浓度的筛选压，一般MSX浓度可为0~75umol/L，赋予重组细胞更温和的生长环境。常用的筛选克隆的方法包括：有限稀释法（limiting dilution cloning，LDC）、半固体培养基筛选法、流式细胞仪分选法（fluorescence activated cell sorter，FACS）等。其中有限稀释法因为其低成本和易于操作，曾广泛运用于克隆的筛选。该法是将细胞稀释到极低的细胞密度，并将稀释好的细胞置于96孔板中培养，使孔板中每个孔的理论细胞数小于1个，稀释后使用显微镜对96孔板整板拍照，以确保单克隆。经过一段时间的培养后使用酶联免疫吸附反应选取表达量高的细胞扩大培养。需要注意的是，为符合FDA的申报要求需进行两轮LDC，且细胞密度<0.5细胞每孔或者一轮LDC结合图像证明，以验证单克隆性。另一种开始广泛使用的方法是流式细胞仪分选法。将带有荧光标记的二抗和分泌抗体的CHO细胞混合孵育，分泌到细胞表面的抗体就能够被流式细胞仪检测到，从而利用其分选功能筛选出分泌多的细胞。为了使分泌到胞外的抗体能够维持在细胞膜表面，还可以使用微囊将细胞以及分泌的抗体包裹起来。结语优势的单克隆细胞株构建首先要考虑选择优秀的宿主细胞，最好选择性能优良的1-3个宿主细胞进行初期尝试，找到适合目标分子的特定宿主。其次，高效稳定的载体系统是目标基因的高效整合和表达的坚实基础。在克隆筛选过程中，通过对单克隆生长代谢特性、蛋白表达情况，以及蛋白关键质量属性的检测，初步遴选出第一批候选单克隆，期间，关注克隆在生长过程中乳酸和氧的代谢状态，高乳酸和高耗氧可能为细胞株在反应器的培养扩增埋下隐患。高效稳定的细胞株构建是CMC的第一步，也是细胞株的工艺优化的基础，从CLD各项因素的源头抓起，精耕细作，科研者都可以制备出优势的单细胞克隆。抗体药从研发到CMC的过程中，还有有很多的痛点，我们诚邀大家参与4月23日瑞孚迪（Revvity）举办的新技术应用交流会，让我们以新技术和优势方案的视角，帮助大家解决抗体药从研发到CMC中的一些难点。资料来源：1.单克隆抗体CHO细胞株筛选策略探讨（一）.生物制药小编.2018-09-302.干货+福利|抗体药物中CHO细胞株的构建策略.生物制品圈.2019-10-303.高表达细胞株是怎么练成的？.抗体圈.2022-06-204.甲贝课堂 I 治疗性抗体高表达 CHO 细胞株构建策略.甲贝医药.2023-06-28 5. Generation of high expressing Chinese hamster ovary cell pools using the leap-in transposon system. Biotechnol J 2018;13(10)6. Contemporary Transposon Tools: A Review and Guide through Mechanisms and Applications of Sleeping Beauty, piggyBac and Tol2 for Genome Engineering. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 50847. Generation of stable CHO pools yielding antibody titers of up to 7.6 g/L using the piggyBac transposon system. Biotechnol. Prog., 2016, Vol. 32, No. 5识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。