如何避免CAR-T杀死造血干细胞

2023-09-07

免疫疗法细胞疗法信使RNA

在急性髓系白血病（AML）中，许多情况下患者首选的疗法是通过造血干/祖细胞(HSPCs)移植，尽管如此，移植后仍然会有30-40%的可能复发。而面对这种情况，在血液瘤中“大杀四方”的CAR-T却显得束手无策，原因在于AML肿瘤与正常HSPCs或分化的髓样细胞共享大多数表面抗原标记（例如两者上都有CD33 ，那么CD33 CAR-T CD33 CAR-T就很难有用武之地。）靶向/非肿瘤毒性将导致髓样再生障碍和造血重建受损。此外，由于AML肿瘤内的异质性和可塑性。可能需要靶向一种以上的表面抗原，因此还会加剧了重叠毒性的风险。这一情况导致现在大部分针对AML的CAR-T疗法都是在接受异基因HSPC移植（HSCT）之前的过渡治疗，反而会致使患者白白浪费接受造血干细胞移植，根除AML的机会。那么有没有可能让造血干细胞和CAR-T共存呢？近日，发表于Nature上的一项研究可能为这一问题提供解答。而该研究团队的答案是通过基因编辑HSPCs来逃避CAR-T攻击。基因编辑的造血干细胞事实上，早先的研究已有人通过CRISPR–Cas敲除或外显子跳跃从HSCT使用的供体HSPCs中去除靶抗原CD33以减少与抗CD33治疗相关的副作用，但该研究团队担忧的是，CD33本身的长期机制机理尚且没有得到很好的了解。敲除CD33的人类骨髓细胞长期会发生什么，没人知道。虽然已有相关的CD33敲除+CAR-T的研究（NCT04849910）在进行，但他们选择了更加稳妥的方案，去修改FMS样酪氨酸激酶3(FLT 3；也称为CD135)、KIT(也称为CD117)和IL-3受体的α亚单位(IL-3RA；也称为CD123)这三个蛋白质的机制机理相对来说了解多一点，且他们的工程化改造还保留了这些蛋白的表达，确保他们的功能依旧，还能够进行调节和细胞内信号传导。为何要选取FLT3、KIT、CD123FLT3和原癌基因KIT是野生型或突变型的III类受体酪氨酸激酶，分别在93%和85%的AML病例中表达。CD123是一种I型细胞因子受体，在超过75%的AML病例中发现，包括白血病干细胞。这些基因在正常造血发育的不同阶段表达，它们在AML细胞上的过度表达与HSCT后较高的复发率和较低的总生存率相关。然而，虽然几种靶向FLT3、CD123或KIT的药物正在开发中，但临床前和临床报告已经强调了由于靶向/非靶向肿瘤毒性而导致的骨髓抑制的风险，并且当需要长期抗白血病效果或当靶向多种抗原时，预计该问题会加剧。因此编辑这些基因使之不会被CAR-T或者是其他靶向药物，如单克隆抗体识别成为了研究的关键。经过筛选后的FLT3、KIT、CD123研究人员通过mRNA电穿孔将睡美人转座子导入造血干细胞后，以1 bp交错方式进行了编辑。编辑后的FLT3会丧失和典型的FLT3抗体4G8的结合，而类似的还有CD123之于7G3单抗，KIT之于Fab-79D单抗。研究人员证实，FLT3、CD123和KIT ECDs中引入单个氨基酸取代足以消除单克隆抗体和CAR T细胞对它们的识别，而不影响蛋白质功能。此外，虽然他们无法保证取代后的FLT3、CD123和KIT点突变可能是免疫原性的，但在同种异体HSCT环境中，异体移植的造血干细胞本身可能就有免疫原性，而这一点则是移植物抗宿主病（GvHD）的诱因。幸运的是，长久以来经验的累积，使得免疫抑制性的GvHD预防为这些工程蛋白赋予了一定的耐受性，因此免疫原性问题解决起来似乎并不困难。改造方法的好处和其他应用这项研究的研究者认为这种基因编辑的创新工具可以增加AML免疫疗法的治疗效果，并使长期抗白血病维持成为可能，这要归功于CAR T细胞的持久性或ADC或双抗的重复给药。此外，通过将靶向活性限制于白血病细胞，表位编辑可以减少CAR T细胞暴露的抗原负担。这具有减少不期望的CAR T细胞刺激和减少可能过量的细胞因子释放或耗尽的额外益处。作者认为，表位工程不仅可以应用于AML，还可以应用于其他血液恶性肿瘤，并有可能应用于非恶性疾病的非基因毒性调节。改造方案的可能不足因为是基因编辑，很自然地就有另外一个问题——外源基因组插入内源基因。外源DNA模板具有非特异性基因组插入的风险，并且需要克服DNA损伤反应的有害激活的策略。研究人员虽然表明导致旁观者突变或将一部分DNA缺口转化为DSB（双链断裂）的风险极小，但并不能排除这种可能。可能较好的消息是，受碱基编辑影响的区域远离癌症相关变异体的突变热点(即KIT和FLT3的酪氨酸激酶结构域或FLT3的近膜结构域)。因此，主要需要注意的是一部分基因编辑处理过的细胞可能丧失功能。另外，碱基编辑工具方面，碱基编辑工具脱靶的可能性也值得考虑，虽然目前观察到sgRNAs结合的PAM区相关的基序具有相对安全的特性，但在转向临床翻译之前，仍然需要对gRNA和非gRNA依赖性脱靶活性的特异性进行更全面的评估。相关编码区单碱基突变的风险相对较小，尤其是与常规化疗的基因毒性风险或疾病进展本身的风险相比。风险效益评估可能需要具体情况具体分析，包括复发的可能性和替代治疗方案的可用性。最后一个可能的问题是成本，毕竟CAR-T的成本已经够高了，花费可以达到上百万美元，而加入表位编辑则可能带来更加巨额的花费，患者是否愿意花费如此巨额也会是个问题。总结这项研究提供了一个特别的思路来治疗接受了造血干细胞移植的AML患者，不过，目前仍然停留在临床前甚至更早期的阶段，还面临很多问题尚待解决。参考来源：Casirati, G., Cosentino, A., Mucci, A. et al. Epitope editing enables targeted immunotherapy of acute myeloid leukaemia. Nature (2023). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41586-023-06496-5