ITR结构对腺相关病毒（AAV）产量的影响

2024-03-13

▲ 金斯瑞蓬勃镇江新厂房开幕论坛将于2024年4月18-19日盛大启幕，点击图片了解更多活动资讯腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属成员，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与其复制。野生型AAV基因组编码两个开放阅读框(open reading frames，ORF) rep和cap，它们位于两侧的倒转末端重复序列(inverted terminal repeats，ITRs)之间。ITR参与AAV整合、复制、拯救和包装等过程，并具有转录启动子活性，因而对于AAV包装至关重要。 01AAV基因组复制AAV基因组复制起始于3' ITR。由于ITR形成发卡样结构，会以3' ITR为引物、以单链基因组为模板、在宿主DNA聚合酶作用下进行基因组复制。当完成第二条基因组复制后，新形成的ITR会以3' ITR为引物继续进行复制。为了形成完整的单体基因组，具有核酸内切酶功能的Rep蛋白会在下游ITR trs (terminal resolution site)位点切割。游离的单体基因组在被完全置换前会以另一条链为模板复制出完整的基因组末端。游离的单股基因组会被包裹进AAV衣壳中，另一条双链基因组则会继续以链置换的方式进行复制，从而合成大量的AAV基因组。当Rep未能切开trs时，就会产生二倍体基因组。为了制备自互补型AAV(self-complementary AAV，scAAV)一般会通过抑制trs切割来提高二倍体基因组的产量。图1. AAV复制周期和scAAV基因组的形成机制[参考文献1] 02AAV ITR结构ITR序列长度145 bp，形成T形发夹结构。ITR由125个核苷酸组成回文序列，包括 AA' 、BB' 和 CC' 区域，后跟有20个核苷酸组成的D区或D' 区。在末端125 bp序列内，BB' 和CC' 富含GC序列，两端通过三个连续的腺嘌呤或胸腺嘧啶形成两个内部回文序列，以此构建成ITR基本结构。FLIP方向的BB' 区域更接近3' 端，FLOP则是CC' 区域在靠近3' 端位置。两个ITR侧翼包含所有FLIP和FLOP结构组合，包括镜像FLIP/FLOP，FLOP/FLIP，以及单向FLIP/FLIP 或 FLOP/FLOP。ITR是AAV基因组中唯一顺式产生病毒颗粒所必需的元件。它参与了病毒生命周期的许多阶段，如基因组复制和衣壳化，外体病毒基因组拼接和整合到宿主基因组中。ITR结构在病毒生命周期的每个阶段都有决定性作用。图2. 野生型ITR结构[参考文献2] 03 ITR结构变化对AAV产量的影响ITR的序列变化会显著影响AAV的复制和封装，影响AAV产量。目前，已有很多研究组进行了不同ITR结构修改（部分案例如表1），发现对AAV产量有不同程度影响。表1：ITR结构修改对AAV产量的影响[参考文献2]删除一侧TRS序列McCarty等通过删除一侧ITR中的TRS序列(ITRΔtrs），构建scAAV，以克服体内转导限速步骤[参考文献3]。scAAV转导靶细胞后其基因组，可以在细胞核中通过自退火形成双链DNA结构，而不需要合成第二条链，因此，可以缩短目的基因的转录和表达时间。ITRΔtrs不改变产生的载体滴度，但是其他多数TRS结构修改会降低载体滴度（案例见下文）。删除或改变非必要的 ITR 结构改造 ITR 序列的另一种方法是删除或改变非必要的 ITR 结构元素。大多数情况下，改变ITR序列会导致病毒基因组复制和/或封装的破坏。但是，也有一些ITR序列的缺失可能不影响AAV基因组的包装能力。2017年，Zhou等发现BB' 和CC' 区域可能不是rAAV复制和封装的必要条件，因此构建了一种改良的ITR（ITRΔBC rAAV）[参考文献4]。虽然两个ITR缺失不影响封装，但使载体滴度降低了75%，可能与RBE'（Rep 结合元件）的缺失有关。使用ITRΔBC质粒导致rAAV基因组复制减少8倍。CpG-free ITR2020年，Earley及其同事发现了多个转录起始位点（transcription start sites，TSS），主要集中在含有RBE的40 bp区域，除了高含量的胞嘧啶和鸟嘌呤（64–70%）和高频率CpG二核苷（83–95%）外，ITR序列中TSS的存在类似于转录激活CpG岛（CGI），后者是脊椎动物中最常见的启动子类型。Pan实验室发现，完全不含CpG基序的ITR，虽然实现与野生型ITR相同的基因组封装水平，但使载体产量降低约3倍[参考文献5]，没有CGI的载体滴度较低可能是载体基因组复制减少导致的。截短型ITR使用PCR扩增的含1拷贝AD序列转基因（一种ITR的截短形式），也可有效包装rAAV（rAAV-pAD/L-AD），且允许包装更长的转基因（~230个核苷酸）。rAAV-pAD/L-AD的包装效率与scAAV相当，而rAAV-pAD/L-AD的转导效率低于scAAV。rAAV-pAD/L-AD减少病毒颗粒中DNA污染物的数量，但是载体滴度降低3倍[参考文献6]。不完整的ITR（截短型ITR、CpG-free ITR、删除非必要ITR等）降低了载体滴度3倍以上，因而AAV生产需要尽可能保证ITR的完整性。 04 ITR质粒生产的挑战和解决方案ITR序列由于其GC含量高和回文结构复杂导致rAAV质粒在大肠杆菌复制时非常容易出现部分ITR序列缺失。ITR序列不完整会导致重组AAV病毒包装效率降低，并增加下游实验的变异性。影响ITR稳定性的机制非常复杂，目前还没有可以适合所有ITR质粒的商业化大肠杆菌菌株。金斯瑞蓬勃生物自主开发的PowerSTM-ITRrs菌株能够抑制ITR质粒DNA分子重排、提高ITR质粒的稳定性，将有些质粒的ITR突变率从50%以上降低至6%。PowerSTM-ITRrs菌株除了可以提高ITR稳定性外，在质粒产量上也显著优化其他商业化菌株，可以降低AAV生产成本，助力基因治疗产业发展。图3. PowerSTM-ITRrs菌株表现 05关于金斯瑞蓬勃生物金斯瑞蓬勃生物是中国首个细胞基因治疗载体CDMO供应商及中国领先的慢病毒载体（LVV），腺相关病毒载体（AAV）供应商，拥有稳定且高产的病毒载体平台，并且，金斯瑞蓬勃生物也开发了具有自主权益的悬浮细胞系PowerS™-293T和PowerSTM-293，使用该高产细胞株可以实现慢病毒载体1E+11 TU/L的产量和AAV载体1E+14 VG/L的产量，能大幅度降低病毒载体的生产成本。镇江病毒载体商业化生产中心占地约2000m²，年产能可达42个批次。病毒商业化车间建有两条悬浮线，一条贴壁生产线，贴壁线可支持48L至96L规模的生产，悬浮线可支持50L或200L生产规模，原液生产工艺采用一次性生产工艺，实现了全过程密闭操作。制剂灌装线采用了全自动灌装、加塞、轧盖生产线，支持COP材质西林瓶、预充针和冻存袋等多种容器灌装，配套灯检和全自动贴标，最高可以达到2400支每小时的产能。本次在镇江建成的商业化GMP级别的病毒载体工厂投产后，在扩大病毒载体产能的同时，实现了为客户提供从临床前研究(IIT)、IND申报、临床试验阶段、商业化生产阶段的病毒一站式服务的全流程能力。参考文献1. Douglas M McCarty，Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications，Mol Ther. 2008 Oct;16(10):1648-56. doi: 10.1038/mt.2008.171. Epub 2008 Aug 5.2. Walaa Asaad et al, AAV genome modification for efficient AAV production, Heliyon. 2023 Apr 1;9(4):e15071. doi: 10.1016/j.heliyon.2023.e15071.3. McCarty, D., Fu, H., Monahan, P. et al. Adeno-associated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementary vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo. Gene Ther 10, 2112–2118 (2003). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/sj.gt.33021344. Q. Zhou, et al., Deletion of the B-B’ and C-C’ regions of inverted terminal repeats reduces rAAV productivity but increases transgene expression, Sci. Rep. 7 (2017) 5432.5. X. Pan, et al., Rational Engineering of a Dunctional CpG-free ITR for AAV Gene Therapy, 2022, pp. 333–345, 29.6. K. Adachi, T. Tomono, A PCR-Amplified Transgene Fragment Flanked By A Single Copy Of A Truncated Inverted Terminal Repeat For Recombinant Adeno-Associated Virus Production Prevents Unnecessary Plasmid DNA Packaging, 2022, pp. 449–457, 29.点击"阅读原文"，进入官网报名~