CAR-T细胞治疗相关的复制型慢病毒（RCL）潜在风险检测

2022-12-02

细胞疗法免疫疗法基因疗法

慢病毒及其包装系统慢病毒（Lentivirus, LV）是逆转录病毒科下的一个属，是一种有包膜的RNA病毒，直径约80-120nm，呈二十面体对称结构、球形。它的病毒颗粒最外层是包膜（包膜蛋白决定了感染细胞的类型），再往里依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和酶。通常，对慢病毒的利用，更多的是通过慢病毒载体来进行的。慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达，是体外和体内基因传递的有效工具。此外，与其他的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体可以将转基因技术整合到分裂和非分裂细胞的基因组中。慢病毒感染宿主细胞，需要先进行病毒包装。慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物（Mix）共两部分组成：慢病毒表达载体（即穿梭载体）含包装、转染、稳定整合所需要的全部遗传信息，是慢病毒包装系统的主要组成部分；慢病毒包装质粒混合物（Mix）含一个包装元件质粒，表达gag/pol以及各种辅助蛋白，还含有一个包膜蛋白质粒，表达VSV-G包膜糖蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到包装所用的细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。慢病毒感染体系完整保留了原本逆转录病毒高表达效率和长表达时间的优点，并且在感染能力上有了巨大的提升。慢病毒载体是目前产业应用最成熟的病毒载体类型，尤其是在免疫细胞治疗，如CAR-T疗法中起到了关键性的作用。且从目前为止的表现上看，CAR-T发生的部分安全性问题都与慢病毒的使用无关。复制型慢病毒（RCL）概念及法规监管要求大多数应用于细胞基因治疗的逆转录病毒和慢病毒均被设计为复制缺陷型病毒载体。对于复制缺陷型病毒载体，在生产中可能发生经缺失改造的载体与野生型病毒序列之间的同源重组，导致产生复制型病毒。终产品中复制型病毒的存在有可能引起病人不良反应，构成临床隐患和潜在危险，甚至引发肿瘤，故对复制型病毒检测是安全性检测中非常重要的项目。尽管目前慢病毒载体的设计和生产系统的保障措施基本消除了复制型慢病(Replication competent lentivirus，RCL)重组产生的可能性，但仍不能完全排除污染的风险。因此应进行RCL的检测。目前，中国、美国及欧洲的药品监管相关机构对于RCL的检测都出台了明确的指导原则用于慢病毒生产及应用的不同阶段监测是否存在RCL。国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布的《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》中提到病毒载体制备工艺中，复制型病毒是过程控制中的安全性风险关注点之一，应采用经验证的方法开展检测。常见的检测方法包括指示细胞培养法、直接qPCR法等。建议采用指示细胞培养法对慢病毒载体进行RCL检测。RCL检测指标方面，通常认为p24蛋白、逆转录酶活性、psi-gag和VSV-G序列等的检出可反映RCL的存在，结合病毒载体具体情况和研究情况，选择合适的检测指标。美国FDA 2020年发布的关于RCR/RCL检测指南提出：对于RCR/RCL的检测包含指示细胞培养法、ELISA法(p24蛋白测定)、PCR/Q-PCR法（通过psi-gag或VSV-G聚合酶链反应）、PERT法（产物增强性逆转录检测法）共4种检测方法。其中，指示细胞培养法和Q-PCR法较常用，但各国监管机构推荐并且可以接受的方法还是以指示细胞培养法为准。由于细胞产品一般要新鲜输注或快速冻存的特殊性，可使用Q-PCR法先进行质控放行，但指示细胞培养法应同时进行确认。复制型慢病毒RCL检测鉴于RCL的潜在威胁，从慢病毒载体生产工艺的各个环节：主细胞库(MCB)、工作细胞库(WCB)、终末端细胞(EOPC)、慢病毒收获液(UPB)、转导细胞甚至CAR-T治疗病人的临床样本都需要进行严格的质控检测来核实是否存在RCL，从而可以最大限度地避免病人因CAR-T治疗发生二次肿瘤。复制型慢病毒RCL的指示细胞培养法检测需28天，耗时较长；而基于VSV-G序列的Q-PCR方法和基于gag序列的PCR方法具有检测时间短、灵敏度高、可重复性强等优点。目前，许多CAR-T申报企业采用Q-PCR/PCR方法直接测定终产品中的VSV-G序列或psi-gag序列，作为快速放行方法。针对上述情况，翌圣生物自主研发了复制型慢病毒RCL检测试剂盒，采用荧光探针qPCR法特异性扩增慢病毒的包膜蛋白VSV-G基因序列，专一快速的检测各种使用慢病毒载体相关的细胞产品中可能发生的复制型慢病毒的潜在风险。还研发了与之配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。下图就复制型慢病毒RCL检测工作流程，进行了详细介绍：产品性能：符合法规：按照法规要求进行全面验证，可提供验证报告；保障品质：试剂盒原材料全自主研发，qPCR Mix等酶产品在超洁净酶工厂生产；灵敏度高：定量限可达101copies/μL水平；精密度高：批内重复性高，批间差异小；专属性强：特异性检测VSV-G基因，不受其他外源基因组DNA干扰；防干扰强：添加内部对照（IC），便于排除样本干扰、反应配制异常等因素。产品信息参考文献[1] Naldini L, Blömer U, Gallay P,etc. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector[J]. Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7. PubMed PMID: 8602510.[2]万海粟,周清华.慢病毒载体及其研究进展[J].中国肺癌杂志,2014,12(17):12.DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.12.09.[3]国家药品监督管理局药品审评中心，体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）, 2022.[4]FDA．Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up［EB/OL］(2018 )．[5]EMA. Guideline on quality，non-clinical and clinical requirements for investigational advanced therapy medicinal products in clinical trials［EB/OL］．(2019)．福利大放送翌圣为您提供MolPure®磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（货号18461ES25)和复制型慢病毒(RCL)检测试剂盒（货号41311ES）试用装，每个客户限申请1套（即2种试剂盒各1个），总量限购20个（最终解释权归翌圣生物所有）。扫码填写您的试用申请工作人员收到信息后，会在2天内审核，并在5个工作日内派发产品。业务联系电话：18186211438（微信同号）关于翌圣翌圣生物科技（上海）股份有限公司是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事分子、蛋白和细胞三大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。核心产品覆盖qPCR系列、NGS系列、逆转录系列、核酸提取与纯化系列、PCR系列、分子克隆系列、体外转录系列、抗体、蛋白纯化系列、蛋白分析系列、重组蛋白、细胞分析系列、细胞培养系列、细胞转染系列、报告基因检测系列等多个品类，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。