基于多重PCR法的细胞种属鉴别

2023-05-13

微生物疗法临床研究基因疗法

体外培养的动物细胞是生物制品生产的重要起始材料，然而由于有些细胞有着相同的营养成分和培养环境需求，导致其在培养和传代过程中容易发生细胞间的交叉污染。这种污染不同于容易辨识的微生物污染，如细菌、真菌或酵母等引起的污染直接可通过培养基颜色变化、显微镜下观察以及细胞的生长状态等便可判断。细胞交叉污染长期以来未引起人们的重视，导致细胞生物学历史上发生了多起重大的细胞交叉污染而导致细胞误用的事件:2016年中国科学院昆明细胞库公布了多达50多株的错误鉴定和交叉污染的细胞株。著名的污染事件是1967年HEp-2和INT 407这两种细胞系被发现其实都是Hela细胞，据不完全统计这导致直接或间接浪费了约14亿美元，涉及发表SCI文章约7400篇。2017科隆（Kolon）生命科学（音译）骨关节炎基因治疗药物“Invossa-K注射液”被发现是293细胞而不是软骨细胞。随后韩国食品药品安全处对该公司提起刑事诉讼，到目前为止已有438家医院和诊所注射了3707剂该药物（超过3000名患者）患者需要15年随访（费用约为6690万美元）。目前，细胞种属鉴别和交叉污染检测受到诸多机构的重视，特别是对于生物制品用工程细胞来讲尤其重要。图1 细胞被误用的历史事件概览相关法律法规❏ 2020 版《中国药典》规定新建细胞系/株、细胞库（MCB、WCB）和生产终末细胞（EOPC）均应进行鉴别试验，以确认为本细胞，且无其他细胞的交叉污染。表1 中国药典-细胞鉴定项目的基本要求（部分）❏ FDA、ICH、WHO 要求对用于制药领域的实验中所使用细胞系应进行“身份鉴定”和纯度测试，包括细胞库（MCB、WCB）和生产终末细胞（EOPC）。表2 FDA、ICH、WHO关于细胞鉴定项目相关的法律条文摘录细胞种属鉴别的方法2020版中国药典《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及鉴定规程》提到细胞鉴别试验方法：• 细胞形态• 生物化学法：如同工酶试验• 免疫学检测：如组织相容性抗原、特异性免疫血清• 细胞遗传学检测：如染色体核型、标记染色体检测• 遗传标志检测：如DNA指纹图谱，包括短串联重复序列STR、限制片段长度多态性RFLP-PCR和内含子多态性EPIC-PCR法等• 其他方法：如杂交法、PCR法、报告基因法等应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。其中STR图谱分析法是目前细胞鉴别及交叉污染检测的常用方法，但该方法仅适用于人源及鼠源细胞种属鉴别的检测，所以应用范围受到很大限制。染色体核型分析和同工酶技术也常被用于细胞鉴别及交叉污染检测，但此类检测方法具有细胞用量大、操作复杂、耗时长及成本高且检测灵敏度低的缺点。因此湖州申科开发一种灵敏、快速、稳定且操作简便、特异性强的方法，用于生物制品生产涉及到的多细胞鉴别和种属间交叉污染检测。细胞种属鉴别检测--多重PCR法HZSKBio针对10个生物制品常用细胞种属:研发设计了特异性PCR多重扩增引物和反应体系，可以根据给定的10组引物是否存在PCR扩增条带以及PCR扩增子的大小进行细胞种属鉴定和交叉污染检测（图2）。注：泳道1～10是单一细胞系为模板的PCR扩增子；泳道11是以10种细胞系为模板PCR扩增产物电泳分布。图2 HZSKBio细胞种属鉴别检测PCR产物电泳图◉ 细胞种属鉴别检测试剂盒技术特点：◆ 特异性高：PCR扩增子明确单一。◆ 操作简单：试剂盒含提取缓冲液，提取细胞DNA后直接进行PCR扩增，免去了复杂的细胞DNA提取纯化过程。◆ 检测灵敏度高：交叉污染检测限可达到1%及以下，细胞用量可少至5×10⁵。◆ 检测效率高：采用单孔10重反应体系，提高了检测效率。◆ 真实客观：以细胞数量为单位来反应可能存在的污染情况。◆ 结果确定：根据扩增子的条带数量和条带大小进行结果判定，更清晰明了。◆ 自主研发和稳定供应：组分自主研发，可保证供货和批次间质量稳定。产品订购咨询：0572-2115083参考文献：[1] ASN-0002 A. T. C. C. S. D. W.(2010). Cell line misidentification: the beginning of the end. Nat Rev Cancer 10(6): 441-448[2] Gartler, S M. (1967). Genetic markers as tracers in cell culture. Natl Cancer Inst Monogr 26: 167-195[3] Nardone, R. M. (2007). Eradication of cross-contaminated cell line: a call for action Cell Biol Toxicol 23(6): 367-372[4] Capes-Davis, A, et al. (2010) Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. Int J Cancer 127(1): 1-8.[5] OECD (2018). Guidance Document on Good in Vitro Method Practices (GIVIMP) OECD Series on Testing and Assessment, No 286, OECD Publishing, Paris.[6] Almeida, J. L et al. (2019). interlaboratory study to validate a STR profilling method for intraspecies identification of mouse cell lines. PLOS ONE 14(6): e0218412.一键查看