CHO细胞培养工艺的设计及优化

2024-04-20

临床申请

细胞株开发的过程中，一般需要在一定的培养工艺平台基础上进行克隆筛选。中试生产申报药品临床试验(IND) 时，一般会选定2～3个来自不同系列的克隆，其中1～2个克隆作为备选。图1 细胞培养工艺培养基的开发哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，即使基于同一宿主细胞所构建的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此，在培养基的开发过程中需特别强调“个性化培养基”的概念，即：生产细胞系所使用的培养基应根据其代谢特点进行优化、定制。培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有巨大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要。所用物料在满足细胞的营养需求外，要完全符合 cGMP 的规定，选择无动物源成分的化学成分限定的培养基，且满足基因型扩增和相应筛选系统的培养条件。细胞培养基的关键组分：水：哺乳动物细胞对水中的杂质高度敏感，这些杂质可能包括微量元素、细菌、内毒素（来源于细菌细胞膜）、微量有机物和颗粒。水净化系统包括蒸馏/去离子、微滤和反渗透。水的纯度通常根据电导率或电阻（>18 MΩcm）以及低有机碳含量（≤15 ppb），并且不含内毒素。碳水化合物：葡萄糖是主要的能量和碳源。CHO细胞通过糖酵解将葡萄糖转化为丙酮酸盐，并在Krebs循环中进一步氧化丙酮酸，以产生36摩尔ATP的能量。在无血清培养基中，CHO细胞可以在葡萄糖浓度低于3 mM（0.540 g/L）的葡萄糖限制培养基中保持较高的活率。但葡萄糖的消耗通常导致丙酮酸积累和乳酸浓度增加，可能抑制细胞生长。为了降低由于葡萄糖浓度对细胞的代谢产物的影响，半乳糖和果糖是两种重要的替代碳源，可用于CHO细胞培养基。谷氨酰胺：谷氨酰胺也是CHO细胞培养中的主要能量来源。谷氨酰胺通过谷氨酰胺分解代谢，并以α-酮戊二酸的形式进入TCA循环。谷氨酰胺是CHO细胞培养中的一种必需营养素，它的缺乏往往会推迟细胞指数生长阶段的开始。氨基酸：氨基酸是CHO细胞培养基中的关键成分，尤其是在化学成分降解的培养基中。研究表明，细胞培养基氨基酸组成的微小变化可以改变细胞生长和滴度，也可以显著影响产物的糖基化修饰。使用代谢流分析以优化培养基中的氨基酸浓度，在融合蛋白生产过程中，显示细胞密度最高值增加大于50％，蛋白含量大于25％。脂质：脂质是生物膜的主要成分，也可以作为哺乳动物细胞的能量来源和信号分子。它们是内质网和高尔基体的关键组成部分，可以负责蛋白质合成、折叠、翻译后修饰和分泌。维生素：维生素在信号级联以及酶抑制和激活中起辅酶、辅基或辅因子的作用。维生素的高还原能力可以保护细胞免受氧化自由基的伤害。在CHO细胞培养中，添加维生素已被证明可使mAb体积产量增加3倍。微量元素：细胞培养基中微量元素的有效浓度通常很低，在许多情况下，它们可能低于标准分析的检测仪器仪表阈值。许多痕量金属元素对代谢途径的调节，对某些酶和信号分子的活性起关键作用。在CHO细胞培养中，缺铜会导致乳酸脱氢酶和其他线粒体氧化酶的下调，从而导致组织毒性缺氧。因此，相对高铜浓度可以改变CHO细胞的乳酸代谢，从净乳酸产量到净乳酸消耗，并随后增强细胞生长和蛋白含量。然而，高铜浓度也可以增加抗体产物的基本变体的相对量。铁被广泛认为是化学成分确定的培养基中必不可少的成分。铁在通过血红素，线粒体氧化途径和其他重要酶转移氧的过程中中起着关键作用。然而，游离铁，尤其是游离铁离子，即使是微量的，也会导致高氧化应力。无机盐：盐在CHO细胞培养基中起着重要的化学和生物作用，包括维持细胞膜电位，重量摩尔渗透压浓度和缓冲作用。通常，大量添加到CHO培养基中的离子包括钠，钾，镁，钙，氯化物，磷酸盐，碳酸盐，硫酸盐和硝酸盐。所有哺乳动物细胞都使用钠和钾离子梯度来产生跨膜电位，支持信号传递以及营养和离子富集。在许多常用的CHO细胞培养基中，钠离子与钾离子的比例约为20-40：1。同时，据报道钠钾比例较低（6-8：1）或钾浓度较高的培养基，有利于CHO细胞提高活力和提高生产力。培养基中钙和镁离子的浓度通常分别设计为约1-3mM和0.2-1mM，钙和镁的缺乏已被证明通过清除剂受体BI在CHO细胞中触发细胞凋亡。生长因子：生长因子通常是肽，小分子蛋白质和激素，充当影响细胞生长，增殖，恢复和分化的信号分子。早期研究表明，生长因子是细胞培养基中不可或缺的一部分，没有生产因子，细胞生长可能会被显著抑制甚至停止。胰岛素及其类似物是无血清培养基中使用最广泛的生长因子之一。使用生长因子的一种可能的替代方案是小分子抗氧化剂螯合剂金羧酸（ATA），其已被证明通过以类似于胰岛素的方式作用于IGF-1受体（与溶血磷脂酸组合）来促进CHO细胞生长。多胺：多胺是哺乳动物细胞中普遍存在的分子，在多种代谢过程中发挥关键作用，包括DNA合成和转录、核糖体功能、离子通道调节和细胞信号传导。非营养成分：在CHO细胞培养基中，含有一些非营养成分，为细胞提供更稳定的物理或化学环境。这些成分可能包括缓冲剂、表面活性剂和消泡剂，对细胞生长和生产力有显著影响。细胞培养方式贴壁培养贴壁培养以培养皿、滚瓶为培养载体，细胞贴附在一定的固定表面进行的培养。主要适用于贴壁依赖性细胞，此类细胞一经贴壁就迅速铺展，开始有丝分裂，进入长期对数生长期。图2 贴壁培养悬浮培养小规模以摇瓶为培养载体，适于非贴壁依赖型细胞，无需支撑面，大规模细胞培养的理想方式。连续式培养是一种常见的悬浮培养方式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该方式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。固定化培养固定化培养把菌体活细胞固定在固体支持介质上的一种发酵培养，是把固体培养和液体深层培养特点相结合的一种方法，可较好保护细胞免受机械力和环境变化的影响均适用于贴壁依赖型与非依赖型细胞。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。细胞培养反应器的操作模式批式操作（batch）批式操作是动物细胞规模培养进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。图3 批式操作具有操作简单、培养周期短、染菌和细胞突变风险小、可直接放大的特点，可直观反映细胞生长代谢的过程。但由于在培养过程中消耗的某些特殊营养物质得不到补充，且细胞代谢废物持续积累，故该法往往存在细胞密度不高、培养时间短和表达量低的缺点。流加式操作（fed-batch culture）流加式操作是在批式操作的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2 ～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高的水平，整个培养过程没有流出或回收。图4 流加式操作流加培养由于其操作的简易性、可放大性、灵活性和可重复性，已被广泛用于众多动物细胞表达产品的生产，成为动物细胞大规模培养的主流工艺。但是该操作方式受到反应器操作容积的限制，培养周期只能控制在较短的时间内。灌流式操作（perfusion culture）灌流培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内。图5 灌流式操作其优点是可解决营养物耗竭和代谢副产物积累之间的矛盾，提高细胞密度和目标蛋白表达量，并有利于保持产品的活性，对生产一些表达不够稳定的产品尤为合适，同时也可以减小设备的尺寸和提高单位体积的产率；缺点是易染菌、工艺控制点多、难操作等。影响细胞培养规模放大的关键工艺条件温度在细胞培养中，温度是细胞生长和代谢的重要因素之一。对CHO细胞的培养，可以在不同生长阶段调整最适温度，例如在细胞扩增阶段提高至37摄氏度，而在表达阶段降至33摄氏度。这样的温度调控能够更好地满足细胞在不同生长阶段的需求，提高生产效率。pH值pH对细胞生长代谢、产物表达及产物质量有显著影响，通常控制在7.0附近。当细胞生长中不断消耗葡萄糖等产生酸性物质时，为维持一定的pH，可采用补加碱性物质（如碳酸钠）的方法，但大量碱液补入会导致培养基渗透压的升高，影响细胞的生长和表达。通气在哺乳动物细胞生物反应器中，通气是一个关键组成部分，特别是在高细胞密度下操作时，因为需要向细胞提供足够的氧气，同时必须去除二氧化碳，以防止其在培养液中积累。图6 哺乳动物细胞培养中的常见通气策略氧气在 CHO 细胞培养中，溶氧水平通常保持在空气饱和度的 10% 到 80% 之间。过高的氧浓度会导致活性氧 (ROS) 的积累，这会导致线粒体呼吸链和细胞内氧化还原的改变，最终导致细胞生长抑制和特异性生产力下降。另一方面，低氧条件也会诱导 ROS 积累。氧气传质系数 (kLa) 用于衡量系统的氧气传输能力。对于给定的生物反应器配置，根据以下公式，kLa主要与单位体积功率输入 (P/V) 和表观气体速度 (vs) 相关，其中 K 是常数，指数 α和 β 分别约为 0.4 和0.5，气泡大小、混合速度、气体流速、体积和生物反应器几何形状等工艺参数都会影响 kLa。各种培养基成分，包括盐、消泡剂和表面活性剂，也已被证明会影响传质系数。二氧化碳在哺乳动物细胞培养中，溶解的二氧化碳 (pCO2) 水平通常保持在 4-10% 的CO2饱和度 (30-70 mmHg)。在 CHO 细胞培养中，高 pCO2 水平可抑制细胞生长、细胞生产力并改变产品质量。溶解在水中的CO2通过与水反应形成碳酸盐，其分解成碳酸，而引起酸化。尽管CO2可能对细胞培养性能产生不利影响，但它仍然是核酸代谢合成所必需的，因此其浓度不得过低。与正常 pCO2 水平（28-54 mmHg）相比，发现超低 pCO2 水平（12.5-24.5 mmHg）在细胞培养 6 天后会降低活细胞密度和细胞活性。搅拌搅拌不仅有助于确保均匀的条件，而且在改善传质方面也起着重要作用，这对于向细胞提供氧气和去除二氧化碳很重要。在增加的空气或氧气喷射流速下，需要较低的搅拌速度以保持气体传质系数 (kLa) 恒定。这反过来又增加了混合时间，并可能在培养液中产生异质性，包括由不同的局部气体传质系数引起的显著溶氧梯度的存在。结语目前，细胞培养技术得到了快速发展，工业化哺乳动物细胞培养技术已经发展到一个成熟的阶段，分批补料工艺生产规模高达25000 L，表达量≥10g/L。因此，细胞培养的生物反应器也从过去的大型化（20 kL）向小型化（1kL）、连续性、一次性转变。这些日益成熟的技术为生物药品的研发提供更为有利的支撑。参考资料1.单克隆抗体生产的细胞培养工艺.生物制品圈.2023-10-182.表达重组蛋白的CHO细胞培养基：历史、关键成分和优化策略.生物制品圈.2022-08-283.探索|细胞培养工艺.法迈制药.2023-07-124.常见的细胞培养方式.百仑生物.2023-09-185.CHO细胞培养中，受规模放大影响的关键工艺条件.生物工艺与技术.2022-08-256.CHO细胞培养基：历史、关键成分和优化策略.抗体圈.2023-11-037.抗体药物研究-细胞培养工艺研究.生物创研社.2022-06-15识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。