狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测的优化及验证

2023-12-29

疫苗临床研究并购

中文摘要目的对狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测（direct immunofluorescence assay，DFA）进行优化及验证，使其更好地应用于规模化生产中的质量控制。方法采用不同的病毒培养温度（35、37 ℃）、培养时间（24、48 h）、接种细胞（Vero细胞、BSR细胞）以及稀释倍数（3、5、10倍）对狂犬病病毒滴度进行DFA，并对病毒滴度结果进行统计学分析。对优化方法进行重复性和中间精密度验证，并对多个批次样品采用小鼠颅内滴定法和DFA进行滴度检测，分析其相关性。结果优化的条件为37 °C培养24 h、接种BSR细胞、5倍系列稀释病毒。DFA重复性和中间精密度变异系数均小于2%。16份样品的小鼠颅内滴定法与DFA滴度显著相关，相关系数为0.952，且P值小于0.000 1。结论优化后的DFA快速、准确，且与小鼠颅内滴定法一致性较好，能够替代后者作为狂犬病疫苗规模化生产的质量控制方法。正文狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的一种人畜共患、急性、高度致死性的传染病，疫苗是预防狂犬病最主要的手段。在人用狂犬病疫苗生产中，RABV滴度是衡量毒种及其收获液质量的重要指标。在我国目前RABV滴度的检定方法为小鼠颅内滴定法，该方法试验周期长，操作繁琐，且受试验动物个体差异以及试验人员操作差异等影响，试验重复性较差。因此，建立一种快速有效、重复性良好、简便易行的检测方法，对于规模化生产十分必要。20 世纪 50 年代末，Goldwasser和Kissling证明了荧光抗体技术在检测狂犬病动物中枢神经系统中的RABV抗原方面的实用性，其基本原理是使抗原与异硫氰酸荧光素结合的抗RABV抗体特异性结合。随后，RABV滴度的直接免疫荧光检测（direct immunofluorescence assay，DFA）得到了广泛应用。该方法快速、稳定、准确，且易于标准化。目前国外已广泛使用DFA进行RABV滴定检测，国内也有相关研究证明DFA替代小鼠颅内滴定法的可行性。本研究旨在对DFA进行方法学确认，进一步证明其替代小鼠颅内滴定法的可行性，并对该方法进行进一步优化。1材料与方法1.1病毒及细胞RABV CTN-1株与BSR细胞、Vero细胞均由武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病疫苗室保存。1.2实验动物无特定病原体级昆明小鼠（无性别要求），11~13 g，由武汉生物制品研究所有限责任公司实验动物室提供，动物许可证号为SCXK（鄂）2021-0026。1.3主要仪器及试剂异硫氰酸荧光素标记的小鼠抗RABV核蛋白单克隆抗体，购自美国Millipore公司；S6UNIV荧光化学发光分析仪购自美国CTL公司。1.4DFA检测RABV滴度方法的建立在96孔微量培养板中5倍系列稀释病毒样品，即100 μl细胞培养液中加入25 μl样品，每个样品设置1个复孔，随后每孔加入BSR单细胞悬液，每孔106细胞，同时设细胞对照（只加培养液的BSR细胞），混匀后置37 °C、5% CO2孵箱中培养24 h。弃培养液，PBS洗板孔1次，晾干后加入80%冷丙酮固定10 min后，弃丙酮，晾干，加入工作浓度的抗RABV荧光抗体50 μl/孔，37 °C孵育1 h，PBS洗板孔3次，使用荧光化学发光分析仪观察结果并计数每孔中荧光灶数。病毒滴度（荧光灶单位/ml）=（最高稀释倍数孔荧光灶个数的均值×稀释倍数+相邻较低稀释倍数孔荧光灶个数的均值）÷2×相邻较低稀释倍数×10。1.5方法优化1.5.1 孵育温度取1份病毒样品分别于2个96孔板上进行5倍梯度稀释，每板各重复3次试验，每孔加入1×106细胞，其中1个96孔板在37 ℃培养24 h，另1个在35 ℃培养24 h，丙酮固定，抗体孵育后读取荧光灶数，对比结果，具体操作同1.4。1.5.2 孵育时间取1份病毒样品分别于2个96孔板上进行5倍梯度稀释，每板各重复3次试验，每孔加入1×106细胞，均放入37 ℃培养，其中1个96孔板培养24 h，另1个培养48 h，对比结果。1.5.3 稀释倍数分别设置3、5、10倍梯度稀释，3、5倍梯度稀释组分别为100 μl培养液中加入50、25 μl样品，10倍梯度稀释组为180 μl培养液中加入20 μl样品（最终每孔弃去80 μl）。每个稀释度重复3次试验，放入37 ℃培养24 h，对比结果。1.5.4 接种细胞在2个96孔板上，分别将同一样品进行3次稀释（每次设置复孔），每孔加入1×106 BSR细胞或Vero细胞，均放入37 ℃培养24 h，对比结果。1.6方法学验证1.6.1 重复性由1名检测人员采用优化后的方法对同一样品重复进行6次检测，计算6次结果的x̅±s、变异系数（coefficient of variation， CV）。1.6.2 中间精密度由2名检测人员采用优化后的方法对同一样品分别进行3次检测，计算2名检测人员6次结果的 x̅±s、CV。1.7与小鼠颅内滴定法对比选取16个病毒样品，分别使用优化后的DFA和小鼠颅内滴定法进行检测。颅内滴定法：将样品进行10倍梯度稀释，每个稀释度脑内接种至少6只小鼠，每只脑内接种0.03 ml。连续观察14 d，记录小鼠发病和死亡情况。根据小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算半数致死剂量。1.8统计学分析使用SPSS 21.0软件，分别对不同孵育温度、不同孵育时间、不同稀释度、不同接种细胞检测数据进行独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1孵育温度对结果的影响试验结果显示，35 ℃培养的病毒滴度结果虽略高于37 ℃，但二者间差异无统计学意义（t=-1.98，P=0.118），见表1。由图1可见，荧光明亮，边缘清晰，二者亮度及形态无明显差异，可认为35 ℃或37 ℃培养对病毒滴度的结果无影响。由于37 ℃更适合BSR细胞生长，因此选择37 ℃作为优化后的孵育温度。2.2孵育时间对结果的影响试验结果显示，24 h病毒滴度检测结果显著高于 48 h（t=3.14，P=0.035），见表2。由图2可见，二者亮度及形态无明显差异，后续选择24 h作为优化后的孵育时间。2.3接种细胞对结果的影响试验结果显示，接种BSR细胞的病毒滴度略高于Vero细胞，但差异无统计学意义（t=1.44，P=0.222），见表3。由图3可见，由于Vero细胞相较于BSR细胞，荧光亮度稍暗，且边缘较不清晰，因此选择BSR细胞作为接种细胞。2.4不同病毒稀释度对结果的影响将同一份病毒样本分别进行3、5、10倍梯度稀释，结果如表4所示，对3组结果进行单因素方差分析，组间F值为0.55，P值为0.602，3组结果差异无统计学意义。但通过组内CV值对比，3倍与5倍梯度稀释的CV值分别为0.6%和0.4%，远小于10倍梯度稀释的CV值（2.6%），说明10倍梯度稀释的误差较大。由于3倍需要设置较多梯度，而5倍稀释与3倍稀释结果差异较小且操作简便，因此选择5倍稀释为优化后的稀释度。2.5方法学验证2.5.1 重复性同一检测人员6次检测的滴度分别为6.50、6.70、6.47、6.52、6.45、6.47 IgFFU/ml，均值为6.56 lgFFU/ml，标准差小于0.5 lgFFU/ml，CV值为1.9%，显示较好的重复性。2.5.2 中间精密度 2名检测人员在不同试验日期分别检测3次，结果如表5所示，6次试验结果的CV值为1.7%，2名检测人员之间进行t检验，t=0.32，P值为0.763，差异无统计学意义，显示较好的中间精密度。2.6与小鼠颅内滴定法结果对比选取16个病毒样品，分别使用DFA和小鼠颅内滴定法进行检测，二者滴度结果见图4。经Pearson相关性分析可知，DFA与小鼠颅内滴定法滴度结果相关系数为0.952，且P值小于0.000 1，表明小鼠颅内滴定法与DFA存在极显著的强正相关关系。3讨论已有相关研究使用DFA与小鼠颅内滴定法对大量样本进行检测结果分析对比，结果证明二者趋势基本一致，存在一定的数量关系，且成正相关，可用DFA替代颅内滴定法检测RABV滴度。另外，有研究用DFA、细胞病变感染技术、噬斑法以及小鼠颅内滴定法等方法检测不同毒株的滴度，结果发现DFA显示出最高的灵敏度。本实验对病毒培养时间的优化结果表明，24 h优于48 h，而王梦舒等的研究在病毒培养6~96 h过程中进行检测分析，结果显示48 h检测的滴度达到高峰，直到96 h稳定在较高水平。这一差异可能与细胞接种密度有关。本研究中接种的细胞密度为1×106，37 ℃下24 h能长满单层细胞，48 h可能存在局部细胞脱落现象而导致荧光灶减少。因此本研究采用24 h培养既能节约时间亦能满足实验需求。在病毒培养温度的研究中，35 °C比37 °C培养的滴度结果略高但差异无统计学意义，王梦舒等对34 ℃与37 ℃的对比结果相似，34 ℃比37 ℃的结果略高但差异无统计学意义。对于DFA中不同稀释度对结果的影响，10倍梯度稀释组内差异明显大于3倍与5倍梯度稀释，其他相关研究中也多采用3倍或5倍梯度稀释。另外，李幸乐等亦在快速荧光灶抑制试验中对不同稀释倍数的结果进行研究，结果显示5倍梯度稀释更能反映个体实际免疫水平，有利于指导临床样本RABV特异性中和抗体检测。本研究对不同细胞的滴定结果对比显示，BSR细胞滴度略高于Vero细胞，而除了本研究的CTN株外，其他RABV株也显示出BSR细胞较Vero细胞更为敏感，但病毒滴度结果差异不明显。另外，有研究证明BHK-21细胞可替代BSR细胞应用于快速荧光灶抑制试验检测体系，二者表现出良好的相关性和一致性。还有研究利用MRC-5细胞进行DFA检测RABV滴度的方法学验证，亦表现出良好的重复性，且与小鼠颅内滴定法检测结果一致性较好。除此以外，对DFA的优化还有稀释液特性、细胞接种方式等方面的研究。DFA利用荧光素标记的已知抗体与RABV特异性结合，具有重复性好、操作简便快捷、检测周期短等优势，适用于疫苗生产大量病毒收获液样本的检测。目前，DFA在国内亦逐渐得到应用，应用DFA替代动物实验检测RABV滴度前景可观。作者李榆杨彭小欢张爽庞德钦梁婧武汉生物制品研究所有限责任公司狂犬病疫苗室，武汉 430207通信作者：梁婧，Email：952949903@qq.com引用本文：李榆杨, 彭小欢, 张爽, 等. 狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测的优化及验证 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 258-262. DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230104-00003识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。