重组单克隆抗体强制降解指南

2024-04-26

一、技术背景强制降解是重组单克隆抗体（mAb）治疗研究与开发中的重要组成部分。重组mAb的降解可能对产品的质量、安全性和功效产生负面影响，因此需要及时检测。因此，从早期候选物选择到批准后的阶段，强制降解研究经常用于支持可制造性评估、配方开发、建立稳定指示方法和比较性评估（表1）。强制降解研究提供了深入了解分子的生化和生物物理性质的机会，包括在实时和加速条件下的稳定性研究中未观察到的主要降解途径。尽管强制降解研究在相对严苛的条件下进行，并在短时间内完成，但可所获得的信息可以提供高度相关的数据，以支持实际环境条件的预测。表1. 强迫降解研究的目的和合理性二、常见的强制降解条件下的主要降解途径常用的强制降解条件包括高温、冻融循环、搅拌、高pH、低pH、光照暴露、氧化和糖基化。尽管与实际存储和加速稳定条件相比，这些条件相对更为严苛，但它们可以在短时间内产生相关的降解趋势和降解产物。选择这些不同条件的目的是基于产品在加工、包装、运输和处理过程中可能接触到这些有害条件的可能性。主要的降解途径如图2所示。最常见的降解途径包括聚集、断裂、去酰胺化和氧化。在特定条件下，有限的降解途径可能会变得主导。例如，高pH条件可以触发与二硫键相关的降解途径，如由于二硫键重排而形成硫醚或共价聚集体。与还原糖一起孵育主要导致表面暴露的赖氨酸残基的糖基化。各种条件下常见以及独特的降解途径在以下章节中进一步讨论。图2：重组单克隆抗体的主要降解途径。箭头表示主要的降解位点。括号中显示了常用的检测降解产物的方法。高温稳定性研究通常在正常存储、加速或中间温度条件下进行。相比之下，热应力下的强制降解通常在超过标称存储和加速稳定条件的温度下进行。例如，如果一种单克隆抗体产品的预期长期存储条件为2-8摄氏度，加速稳定条件为25摄氏度，那么热应力条件可能是35摄氏度或更高。使用高温的目标是在短时间内生成大量的降解产物，例如一周内。可以通过热稳定性技术（如差示扫描量热法）测量的变性温度或进行预筛选研究来选择适当的高温。高温应力是提供关于预期存储条件下潜在长期降解的信息的最相关条件之一。高温加速了各种降解途径。由于高温条件，其中一个主要的降解途径是聚集物的形成，包括不溶性聚集物（沉淀物和颗粒）和可溶性聚集物，它们可以是共价的或非共价的。聚集物的机制和类型因pH和盐等因素而异。另一个主要由高温引起的降解途径是通过肽键断裂导致的断裂。抗体的断裂主要是由非酶促反应催化的（由于药物物质通常高度纯化，很少有断裂由污染的蛋白酶催化）。冻融冻融常被用作一种强制降解条件，以确定单克隆抗体对温度循环的敏感性。冻结和解冻是单克隆抗体产品经常遭受的应力。例如，药物物质经常被冷冻以实现长期储存。作为冻干过程开发的一部分，药物制剂可能会暴露于冷冻温度。由于药物物质与室温接触时间较短，化学降解不是冻融应力的主要降解途径。相反，在冻融过程中，主要的降解途径是形成各种聚集物，包括沉淀物和颗粒，但主要由二聚体和多聚体组成。冻融诱导的聚集主要是非共价的，并且高度依赖于pH、缓冲液浓度、辅料、盐、蛋白质浓度和冷却和升温速率等操作参数。搅拌在生产过程中，单克隆抗体（mAb）遇到的另一种物理应力是搅拌应力。了解mAb对搅拌的敏感性很重要，因为在细胞培养、纯化、制剂、产品灌装和运输等单元操作过程中可能会接触到这种条件。评估mAb对搅拌（如搅拌或震荡）的敏感性常用于支持配方和工艺开发。第二个应用就是评估mAb由于震荡抗体引起的主要降解。震动诱导的聚集还高度依赖于样品的pH、盐、头空间、辅料（如聚山梨酯醇酸酯）、震动速率和容器类型和大小。通常观察到搅拌和震荡之间的降解产物和动力学存在微小差异。例如，一项研究表明，震荡和搅拌都产生了沉淀物，震荡产生了可溶性聚集物和颗粒，而搅拌产生了更多的颗粒，但较少的可溶性聚集物。另一项研究表明，震荡导致了不溶性和可溶性聚集物，而搅拌主要导致了不溶性聚集物。在设计搅拌研究时，根据工艺相关性同时考虑搅拌和震荡是重要的。低pH低pH是一个需要评估的重要应力条件，因为单克隆抗体（mAb）纯化过程通常涉及暴露于酸性溶液条件，例如在蛋白A层析洗脱和常用的低pH病毒灭活过程中。因此，使用低pH进行强制降解研究时，可以将纯化过程中的pH值作为参考点。低pH引起可溶性和不溶性聚集，同时加速断裂。在实践中，将mAb暴露于低pH可能会导致沉淀，尤其是在药物物质中发现的高蛋白质浓度下。虽然了解产品在特定低pH值下是否容易完全沉淀很重要，但建议在评估pH对产品稳定性的影响和帮助确定降解途径时，包含一个略高的pH条件，该条件不会导致完全沉淀。高pH和强制去酰胺化类似于低pH，评估高pH条件对于全面理解工艺和确定降解途径非常重要。在纯化过程中，阴离子交换色谱操作中使用高pH洗脱缓冲液。此外，在蛋白A洗脱和低pH病毒灭活后的pH中和步骤中，mAb可能会短暂地暴露于高pH条件。高pH应力通常使用pH值为8或9进行。然而，在某些情况下，可能需要更高的pH值，如pH 10，以确定位于不同位点的天冬酰胺残基的去酰胺化敏感性。光稳定性光照是一个关键的环境因素，通常影响从细胞培养到给患者的产品的各个阶段。因此，研究光照对产品质量的影响非常重要。与其他强制降解条件不同，光稳定性在ICH指南ICH Q1B中有定义。然而，为了使mAb达到适当的降解水平，应调整条件。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸以及肽骨架是光诱导降解最易受影响的位点。由于光照暴露，主要的降解途径是聚集物的形成，这些聚集物主要是共价的。还经常观察到光照导致铰链区域周围的断裂。预期地几个残基，包括色氨酸、蛋氨酸、甲硫氨酸和组氨酸都非常敏感，并在光照暴露下发生氧化。氧化重组mAb不断暴露于氧化环境中，包括溶解氧、空气中的氧气以及与金属和原料杂质（如过氧化物）反应产生的自由基。因此，强制氧化可用于探测易受氧化的残基，并了解这种降解途径是否会产生实际影响。例如，CDR中的残基氧化可能会影响结合和效力。最常用的方法是将重组mAb与过氧化氢或叔丁基过氧化氢孵育以进行蛋氨酸残基的氧化研究，以及使用2,20-偶氮二(2-胺基丙烷)二盐酸盐进行色氨酸的氧化研究。糖基化糖基化是还原糖与抗体轻链和重链的赖氨酸侧链和N-末端主要胺基团之间的非酶反应。糖基化的直接效应是修饰蛋白质的N-末端胺基和赖氨酸侧链，每个糖基化位点使分子量增加162 Da。糖基化水平高度依赖于蛋白质浓度、温度、pH值、糖类类型、糖浓度、暴露时间和游离氨基酸浓度。如果存在暴露的赖氨酸残基（例如在CDR中），则在强制降解研究中应考虑糖基化，因为它可能会影响结合和功效。此外，糖基化可以导致聚集，并使分子更酸性。高级糖基化终产物的形成也可能导致产品变色，并与各种疾病状态相关的蛋白质有关。三、预筛选和强制降解研究的应用在强制降解研究中，除了在Q1B中定义的光稳定性条件，监管指南没有对具体条件进行明确规定。然而，对于重组抗体来说，Q1B的条件过于严苛，因此光稳定性强制降解研究应该通过实验确定。预筛选的目标是确定能够产生有意义的降解水平的最佳条件。过少的降解无法清晰地展示降解途径和动力学，而过多的降解不符合真实情况。预筛选通常使用较少的时间点、选择的释放和表征分析方法来进行，如表2所示。选择适当的分析方法非常重要，因为每种方法都有其自身的优点和局限性。敏感的纯度分析方法，如凝胶过滤色谱（SEC）和毛细管电泳-十二烷基硫酸钠（CE-SDS），都可以测量单体/主要物种。但SEC可能对聚集物更敏感，因为它可以检测到共价和非共价聚集物，而CE-SDS只能检测到共价聚集物。这两种方法都是在预筛选中合理的选择。相反，结合测定可能对纯度中的非显著变化的表征不敏感。因此，在预筛选中可能不需要结合测定。SEC是检测聚集和部分程度的断裂的首选方法。基于电荷的方法，如阳离子交换色谱或等电聚焦电泳，对于检测分子的整体变化非常敏感，主要是由于去酰胺化以及其他修饰引起的变化。液相色谱-质谱（LC-MS）分析完整的或降解后的分子量对于检测氧化和糖基化等修饰非常有用。表2. 推荐的预筛选条件和方法预筛选期间评估的样品应尽可能接近最终制定的产品。这一要求的理由有多个方面。首先，降解途径和动力学高度依赖于样品的性质，如浓度、pH值、盐和辅料。其次，从强制降解研究获得的数据应与最终的药物物质或药物产品相关。第三，针对特定配方体系开发的检测方法，如离子交换色谱，可能对不同的溶液条件不具有稳健性。如果在科学上可以证明，也可以有例外情况。在支持可比性研究的情况下，使用与药物物质浓度不同的预变更和后变更批次进行强制降解研究是可以接受的，只要预变更和后变更的浓度相互匹配即可进行相对比较。强制降解研究的应用领域强制降解研究是基于研究目标和预筛选结果设计的。例如，在预配方阶段，通常使用搅拌来确定适当的聚山梨酸酯水平以防止聚集。该研究可以简单地通过应力测试不同水平的聚山梨酸酯样品并监测聚集物的生成来进行。另一方面，为了支持可比性，可以根据工艺变更对产品质量的潜在影响使用多个强制降解研究。在这种情况下，最有可能需要进行预筛选研究，以确定导致大量降解的条件，从而对降解动力学和降解途径进行评估。表3：mAb生命周期中强制降解研究的应用领域、目标和分析工具四、监管指南由于强制降解研究可以用于多种目的，因此强制降解的各个方面在各种监管指南文件中都有所涉及。相关指南以及指南中的关键要点和应用领域在表4中进行了总结，并在下文中进一步讨论。包括美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的生物制品相关指南文件在内。国际药物技术要求协调会议（ICH）的指南文件也是特别重要的，因为这些文件反映了监管机构和行业之间通过科学的可靠过程实现的协调。表4. 强制降解相关指南文件在重组mAb治疗药物以及相关产品如抗体药物偶联物的开发过程中，强制降解是一种广泛使用的有用工具。在开发的早期阶段，简单的强制降解研究可以提供关于候选药物的可制造性的有用信息，并有助于选择最适合进一步开发的候选药物。强制降解是早期配方开发的重要组成部分，可以确定药物物质和药物制剂的长期储存的适当条件。在方法开发中，建议尽早包含强制降解样品，以便更好地了解方法的能力和限制。降解产物的生成可以极大地帮助杂质的分离和表征，因为这些杂质通常在药物物质中以极低的水平存在。不同降解产物的分离和表征提供了评估降解或修饰对产品功效影响的机会，从而定义关键质量属性。在可比性研究中，强制降解有潜力揭示常规分析无法检测到的差异，从而进一步确保可比性。强制降解研究的数据可以用来证明在处理、运输和操作过程中可能发生的偏差。总体而言，强制降解提供了对分子的生化和生物物理性质的深入了解，以确保产品在能够快速进行临床和商业开发的时间范围内得到充分表征。文章来源于：https://www-tandfonline-com.libproxy1.nus.edu.sg/doi/full/10.1080/19420862.2017.1368602识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。