靶向自噬降解的抗体嵌合体设计

2023-11-06

靶向蛋白降解技术(targeted protein degradation, TPD)在药物发现过程中具有着重要地位，有别于传统抑制剂的占位-驱动方式，它通过直接降低靶向蛋白的水平来发挥作用，并且可以解决传统药物对突变蛋白靶点治疗效果不佳的问题。从机制上来看，TPD可被分为泛素-蛋白酶体 (ubiquitin-proteasomesystem, UPS) 途径和溶酶体降解(lysosome-associated degradations) 途径。二者的降解底物范围有所不同，其中，UPS需要借助蛋白酶体来降解泛素化的兴趣蛋白，对非泛素化蛋白的降解能力受限；而溶酶体途径有着更为广泛的降解底物范围，其不仅可以降解蛋白底物，还可以降解一些非蛋白生物分子和细胞器，当降解底物被自噬体包裹，即可实现蛋白的降解。来自哈尔滨工业大学的研究人员聚焦于溶酶体降解途径中的自噬(autophagy)途径，设计了一种靶向自噬的纳米抗体嵌合体(autophagy-targeting nanobody chimeras, ATNCs)，该类嵌合体可靶向降解多种缺乏配体的蛋白和细胞器。在此基础上，研究人员还进一步发展了化学诱导邻近(chemically induced proximity, CIP）触发的自噬降解方法。以上工作使得基于自噬降解的多功能嵌合体更为通用和模块化。更重要的是，基于以上设计思路衍生的可透膜吞噬体能够成功降解不可成药性的肿瘤生物标记物人附睾蛋白4(Human Epididymis Protein 4, HE4) 。LC3蛋白是自噬的关键标记，在自噬体形成过程中定位于自噬体结构（preautophagosomal structures, PAS）。首先，研究团队先在细胞内表达该嵌合体来验证功能：从ATG4B的C端截取了其与LC3相互作用区域（LIR）基序短肽基序DSEDEDFEILSL作为自噬泡上LC3的结合部件，成功设计了一种nanobody-LIR嵌合体(LIR ATNC)，该嵌合体能够成功与LC3B标记的自噬泡形成共定位。同样地，将LIR片段直接替换成了LC3B，得到的LC3 ATNC也如预期所料，能够将POI的自噬降解。与现有的小分子自噬降解剂相比，这类LC3 ATNC靶向的是吞噬体，并不依赖于内源性的LC3和p62蛋白。随后，他们使用这个通用的降解系统来研究细胞过程。通过质粒的构建，胞内GBP-LC3B ATNC可以在Hela细胞内表达。Rac1蛋白是一类Rho GTP酶，主要通过调节细胞骨架的运动来调节细胞锥的生长。从共聚焦显微镜图像和WB分析都可以看出，EGFP-Rac1被有效降解。同时，细胞面积明显减少，这表明Rac1的存在促进了细胞的扩张，这一结果与Rac1在下游肌动蛋白聚合中最终诱导片状足形成的关键作用相一致。此外，他们还尝试了多样化的靶向POI的弹头，验证这类纳米抗体嵌合体通过自噬途径降解多种标签蛋白、内源性蛋白和融合蛋白的通用性。其中，带有双特异性纳米抗体的GBP-RBP-LC3B ANTC能够同时降解两种标签蛋白。在共表达GBP-mCherry-LC3B和 EGFP的细胞中，研究人员发现随着处理时间的增长，EGFP蛋白的降解效果更好。为彻研究ATNC降解系统的作用机制，作者设计了相关实验。研究表明，随着雷帕霉素（Rap，一种自噬激活剂）加入浓度的增加，体系的自噬降解效果并无明显差异；而氯喹（CQ，一种自噬抑制剂）的加入则会使体系的降解效果几乎完全消失。以上结果共同说明，该系统是通过自噬途径实现靶标蛋白的降解。在确认这一系统是通过自噬降解途径来实现靶蛋白降解后，他们尝试将其用于降解非蛋白底物线粒体或蛋白聚集物Tau蛋白，并且均取得了成功。为了考察这类ATNC开发成自噬降解药物的潜力，研究人员设计了一种外源性给药的途径，即GBP-LC3B-CysSS-cR10*(GLR)的细胞渗透性ATNC药物，用于降解EGFP。GLR可通过简单的步骤组装而成。其中，环状穿膜肽是通过二硫键连接于上，发挥透膜作用后，可在细胞内被GSH等还原性物质切割掉落，随后被蛋白质水解酶降解。实验结果表明，GLR可以剂量依赖的方式降解EGFP。进一步，研究团队还设计了另一种吞噬体HE4 nanobody-LC3B-Cys-SS-cR10*(HLR),研究结果表明，这中透膜性吞噬体首次实现了不可成药蛋白人附睾蛋白4 （HE4）自噬降解，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。纳米抗体嵌合体ATNC的合成较现报道的小分子自噬降解剂更为简单，但由于其分子量较大，这类自噬降解剂可能须在较大的剂量下才能实现较好的降解效果。综上，研究人员开发了基于自噬降解途径开发了一种模块化、通用性的基于自噬降解的纳米抗体嵌合体ATNC；通过引入CIP触发靶标蛋白自噬降解，创建了可控性的降自噬降解体系；开发了一种具有应用价值的透膜性自噬体，可实现不可成药蛋白的降解，这类ATNC有着较大的应用前景，值得继续开展后续的相关研究。参考文献：He H, Zhou C, Chen X. ATNC: Versatile Nanobody Chimeras for Autophagic Degradation of Intracellular Unligandable and Undruggable Proteins. J Am Chem Soc. 2023 Oct 12. doi: 10.1021/jacs.3c08843.