《Nat. Commun》| 集成功能性血管化类器官芯片的微流控平台

2024-03-11

临床1期

点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769文章来源：逸芯生命科学血管化类器官一直是组织工程领域的一项挑战，事实上，大多数厚度超过400微米的组织都需要特定的功能性脉管系统，以确保足够的营养和氧气供应，以及清除二氧化碳和细胞废物的能力，防止坏死的内核形成。尽管目前已经有复杂的类器官模型，但对于脉管系统和功能性血管循环仍然是很有必要的。为解决这个问题，通过芯片上生成可灌注的血管网络，或者与其他芯片结合形成功能性的血管化器官芯片。这种方法通常是将水凝胶和内皮细胞接种到中央的微流控腔室中，培养基连徐流入，提供长期的营养物质和气体交换，但这种情况不允许观察到其中的液体通量，因此仍然是一个挑战。为解决这类问题，来自法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学（Univ. Grenoble Alpes）的Xavier Gidrol课题组开发了一种由人成纤维包和内皮写细胞产生球状体以及由人iPSC产生3D类器官的器官芯片，证明了血管类器官的有效温和和受控灌注，以及增强类器官生长、成熟和脉管系统发育。相关论文“A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip”于2024年2月16日发表于期刊《Nature Communication》上。01 用于类器官精准封装的微流控装置设计本研究中，使用COC制造芯片，每个芯片芯片包含10个通道，并使用一台10通道注射泵进行灌注通过设计蛇形通道，可以将类器官球体封装至特定位置。嵌入的纤维蛋白水凝胶中的类器官可以精确定位到预定的位置，且捕获微店的大小可以根据需要进行调整。利用纤维蛋白水凝胶和空气注入，可以使得整个蛇形通道具有纤维蛋白水凝胶黏附，从而为完整的血管化打下基础。该平台的优势之一是稳定性、可扩展性和可靠性，在具体操作时，可以实现10秒完成一个通道的构建，并实现接近100%的捕获率。另外，该芯片也可以相对容易的修改为多个通道并行，以便研究多个多种类器官。总体而言，本研究设计了一种蛇形几何芯片用于微流体通道中精确可控的捕获类器官和其他3D细胞结构。图1：设备设计以及类器官和细胞配置概述02建立相互联系的灌注内皮网络首先通过在静态（每天更换培养基）或流动条件下单独培养间充质球体来检查流体流动的影响。观察到动态灌注下内皮网络的形成增强，与静态条件相比，血管连接处数量、网孔数量、节段数和总节段长度分别显着增加4.4倍、6.5倍、5.0倍和4.8倍。因此，流动条件可以直接驱动这些间充质球状体分化为血管状结构。接下来将HUVEC掺入水凝胶混合物中（如上所述），以在HUVEC衬里微通道和捕获的间充质球体之间建立功能连接。在第0天，间充质球状体被引入微通道并捕获在正确的位置，在那里它保持其球形。在第3天，研究者观察到内皮细胞的初始组织，到第7天，具有三维构型的网络样结构发育并保持稳定直到第13天。观察到RFP-HUVEC内皮床和间充质球体脉管系统之间的自发吻合，在陷阱站点上建立互连网络。为了证明相互连接的内皮网络的功能，研究者使用荧光微珠进行了灌注测定。在培养的第13天，将直径为1μm的珠子以Q = 10μl/ min的流速注入微通道中。珠子示踪覆盖在内皮网络从陷阱入口到出口产生的图案上，表明形成的网络支持灌注的能力。最后通过对网络中的流体性质进行表征，发现器官芯片中的灌注类似于人体毛细胞血管中观察到的生理流。图2：通过间充质球体的功能性血管化产生吻合内皮网络03 血管类器官的血管化此部分使用人iPSC产生3D类器官（BVO），并植入芯片。与在孔中培养的BVOs类似，这些BVOs在芯片上自组织成真正的毛细血管的三维互连网络，该毛细血管包含内皮细胞内衬的管腔，周细胞和平滑肌细胞覆盖，以及紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin的表达。类器官形成毛细血管，毛细血管中空管腔被原型基底膜包围。将成熟的BVO、HUVEC和成纤维细胞嵌入水凝胶中并引入微通道。研究者观察到，从第二天到第十天，内皮细胞逐渐组织生成一个互联的网络。这些网络形成了包含BVO的内皮床，并表现出延伸到陷阱位点的三维组织，在2周的实验期结束后，发现HUVEC可以稳定保持30天以上，证明本器官芯片可以形成稳定可灌注的内皮网络并可以将BVO捕获并血管化。图3：芯片上血管类器官（BVOs）的血管化04HUVEC网络和BVO实现功能吻合为了证明“功能性血管化”，检查了HUVEC内皮网络和接种的BVO之间的吻合。先前表明，移植到小鼠肾囊中的BVO与宿主脉管系统形成功能连接，测试了是否可以通过使用中间HUVEC内皮床来实现类似的体外吻合。结果表明，在HUVEC网络附近观察到许多BVOs血管（CD31GFP），表明从HUVEC内皮床到类器官血管的功能性吻合，当在流动条件下培养时，血管化的BVOs表现出生理分层组织，BVO上游和下游的HUVEC血管较大。小动脉-小静脉大小血管的上游和下游区域表现出平滑肌细胞SM22标志物的强烈表达，而BVOs中狭窄的毛细血管具有被周细胞包围的中空管腔结构。测量BVO上游和下游区域的HUVEC血管的平均直径为37 μm，对应于小动脉-小静脉大小，而BVO内的血管平均直径为8 μm，与体内毛细血管大小一致。重要的是，还能够识别出几个界面，显示HUVEC内皮网络和BVO脉管系统之间的吻合。这些结果表明，此方法适用于将HUVEC内皮网络与真正的血管类器官连接起来，以组织可灌注的功能性维管树。图4：建立包含血管类器官的可灌注HUVEC内皮网络05增强芯片上血管类器官的生长和成熟为了证明该方法在解决该领域有关通过血管化改善3D组织生长和功能的关键问题的适用性，研究者进行了实验，比较了在静态和流动条件下的类器官生长，以及有或没有相邻的HUVEC内皮床（分别称为“有血管”和“无血管”）。反复拍摄明场和GFP荧光图像，以观察BVOs和周围内皮网络的发展。在没有HUVEC和成纤维细胞的纤维蛋白水凝胶中培养的BVOs显示出生长受损，导致凝胶降解，BVO收缩和过早死亡。当在相同条件下在孔中培养时，这些BVO的生长和发芽不受影响，因为它们被封装在大量凝胶中，在培养的最初几天可以防止任何凝胶降解。与流动条件相比，HUVEC内皮网络在静态条件下未能正常成熟。ECM重塑在流动条件下显著增强，导致结构的形成，这些结构随着时间的推移在靠近陷阱位点的微通道中逐渐膨胀。相比之下，在静态培养条件下未观察到ECM重塑和血管重组。进行RNA测序，结果显示，在芯片中形成的类器官中有关血管生成、血管发育和血压调节过程中的关键基因均上调明显，这些结果表明，此方法构建的器官芯片提供的灌注和流动可以促进血管类器官成熟。图5：HUVEC内皮床和干细胞衍生血管类器官之间的功能吻合评估06芯片上血管化胰岛球体的增强功能为验证该系统的血管功能化能力，研究者生成了血管前分泌胰岛素的胰岛球体，作为原理验证。使用与BVO相同的方法，在静态或流动条件下，无论是否有相邻的HUVEC内皮床，在芯片上培养胰岛。在第5天，进行了葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定。结果显示胰岛素分泌因高血糖激发而显著增加。值得注意的是，与芯片上的所有其他条件相比，以及与在常规孔中培养的胰岛相比，具有流动和血管形成的胰岛球状体的相应刺激指数（[高葡萄糖溶液]/[低葡萄糖溶液]）显着更高。具有流动和血管化的胰岛球体的刺激指数表现出较大的变化，这可能归因于血管网络的质量或范围的差异。然而，当仅引入血流或HUVEC内皮床时，刺激指数没有改善。这些数据表明，当在流动条件下在芯片上培养并嵌入 HUVEC 血管床中时，胰岛球体的葡萄糖刺激会改善胰岛素分泌，从而创造改善的功能性β细胞生态位。图6：类器官通过流动和血管形成增强的生长和成熟讨论在本研究中，研究者提出了一个微流控平台，该平台提供了简单、灵活和稳健的解决方案，以形成血管化类器官芯片，并精确控制短期和长期灌注过程中产生的通量。通过这种方法，克服了类器官生长、成熟和器官芯片技术中的常见障碍。细胞和水凝胶上样，以及使用特定生长培养基的长期类器官灌注，通过单个流体入口进行。研究者在该系统中的流体处理自动化促进了工业和医疗环境中微流体设备的广泛使用、分配和适应。所展示的微流控平台通过创新的封装技术提供稳健性，该技术依赖于在很大程度上独立于工作压力的流体动力学和毛细管效应。这里描述的芯片配置导致HUVEC内皮床和人类血管类器官的毛细血管之间的吻合。因此，该系统可以生成灌注的分层网络，这些网络包括从小动脉到小静脉和毛细血管大小不等的血管。目前该研究已经完成血管类器官的血管内灌注，可以以说是第一个在整个微流控捕获嵌入式3D类器官结构中整合功能性脉管系统的设备，也会在生物医学的各个领域有更广泛的应用。论文链接：https://www-nature-com.libproxy1.nus.edu.sg/articles/s41467-024-45710-4点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769