【JMC】盛春泉团队实现NAMPT蛋白可视化降解PROTAC的设计，体内有效

2024-04-18

蛋白降解靶向嵌合体抗体药物偶联物

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis Targeting Chimeras，PROTACs）技术作为一种新兴的、革命性的靶向蛋白质降解方法，为蛋白质降解研究开辟了新的途径。目前，大多数用于评价蛋白质降解活性的测定依赖于蛋白质印迹。为了开发更方便有效的监测方式，将荧光团引入PROTAC是实现可视化的主要途径。为了避免PROTAC上的额外荧光标记可能会损害蛋白降解活性、膜渗透性及物理化学性质等问题，盛春泉教授团队在Journal of Medicinal Chemistry在线发表了题为“Making Protein Degradation Visible: Discovery of Theranostic PROTACs for Detecting and Degrading NAMPT”的文章（doi: 10.1021/acs.jmedchem.2c01243），直接将NAMPT的荧光配体P5设计成为一种环境敏感型的荧光探针B4，PROTAC B4通过形成三元复合物有效地降解NAMPT，实现了A2780细胞中NAMPT降解的可视化（图1）。图1. PROTAC B4结构示意图NAMPT通过促进5-磷酸核糖-1-焦磷酸中的核糖组分与NAM可逆性结合，使NAM转化为NMN，进而在NMNAT作用下转化为NAD。如细胞内NAMPT含量不足或酶活性降低，则NAD的合成途径及NAD参与的细胞代谢被阻断，导致肿瘤细胞产生ATP等生物大分子的能力下降，对细胞外葡萄糖缺乏的耐受能力减弱。因此NAMPT是已知重要的抗肿瘤靶点，目前针对于该靶点的抗肿瘤治疗策略受到越来越多的重视，包括ADCs、PROTACs等。一代NAMPT抑制剂FK866、CHS828正处于临床阶段（图2）。图2. NAMPT信号通路及代表性抑制剂（图来源：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.ejmech.2023.115607）基于PROTAC B4的设计作者通过监测由NAMPT酶促产物NMN通过简单化学反应产生的烟酰胺单核苷酸（NMN）衍生物的荧光强度，在30000个小分子的化合物库中高通量筛选获得NAMPT荧光配体M049-0244（A1）。该化合物具有优异的体外活性（IC 50：170 nM）和抗HepG2细胞增殖活性，能显著染色活HepG2细胞并具有较好的NAMPT依赖性细胞成像性质（图3）。图3. 荧光配体M049-0244（A1）的高通量筛选及荧光成像作者将化合物A1对NAMPT进行分子对接（图4A），从暴露于溶剂域的末端丙基喹喔啉基团不同位置引出linker为E3连接酶VHL配体1，以设计PROTAC B1-B4和PROTAC C1-C6（图4B）。图4. （A）NAMPT对荧光配体A1的分子对接（B）PROTAC B1-B4和PROTAC C1-C6的理性设计在初步的构效关系探讨中，化合物B1-B4比化合物C1-C6更有效，且化合物C1-C6未能引起NAMPT降解。系列B中随着碳链长度的增加，NAMPT的抑制活性也相应提高，具有12个碳原子的接头长度的化合物B4显示出最好的NAMPT抑制活性（图5A）。除化合物B1外，所有化合物在30 nM的浓度下都能够降解A2780细胞中的NAMPT，并且降解效率随着接头长度的延长而增加（图5B）。在1和30 nM之间的浓度范围内，化合物B4以剂量依赖性方式降解NAMPT，DC50值为8.4 nM（图5C）。在1 μM浓度下，NAMPT降解剂B4在下调NAD+水平方面比抑制剂A1更有效（图5D）。抑制A2780细胞增殖方面B4同样显示出最佳的抗肿瘤活性（IC 50 = 12.1 nM，图5E）。图5. NAMPT降解剂B1-B4的筛选与表征PROTAC B4的NAMPT降解机制通过阴性对照评价、竞争结合实验和直接结合试验，作者进一步证明化合物B4同时与NAMPT和VHL结合形成三元复合物，随后通过UPS诱导降解（图6）。阴性对照分子D1（VHL配体1为S构型）仅表现出低于B4 10倍的抑制活性，证实化合物B4的优异抗肿瘤活性来源于NAMPT的降解（图5E）。NAMPT的降解同时被抑制剂Al、VHL配体1、MG132及泛素连接酶抑制剂MLN 4924阻断（图6G）。细胞热位移测定（CETSA）验证化合物B4与NAMPT和VHL直接结合（图6H）。图6. PROTAC B4的NAMPT降解机制探究 NAMPT降解剂B4的光谱性质、环境敏感性及成像性能化合物B1-B4显示比抑制剂A1及VHL配体1荧光强度增强的5倍（图7B、C）。随着溶剂极性的降低，化合物B4的荧光强度增强，在乙腈中，化合物B4的荧光强度比在PBS缓冲液中高约5倍（图7D、E）。且随着NAMPT浓度的增加（从500至1000 nM），化合物B4荧光强度的明显增强（图7F）。化合物B4具有较大Stokes位移值（图7G），对环境极性敏感，并对NAMPT蛋白浓度响应。图7. NAMPT降解剂B4的光谱特性及环境敏感性作者使用化合物B4或A1分别处理A2780细胞验证成像性能，结果显示用化合物B4处理的A2780细胞显示出更显著的蓝色荧光（图8A）。同时延长时间发现，在6小时内，A2780细胞中的蓝色荧光信号由于化合物B4的细胞摄入增加和与NAMPT的结合而显著增强。6小时后，由于NAMPT的降解，蓝色荧光明显减弱（图8E）。流式细胞术实验也证明了化合物B4和NAMPT之间的特异性结合。随着化合物B4浓度的增加，荧光相应增强（图8B）。此外，孵育12小时的B4的荧光比孵育4小时的化合物B4（图8C）和孵育12小时的化合物D1（图8D）的荧光弱，作者认为是由于NAMPT降解。图8. NAMPT降解剂B4的荧光成像和流式细胞术分析。用anti-NAMPT（红色）和化合物B4（500 nM，蓝色）对A2780细胞进行免疫染色 NAMPT降解剂B4的体内药代动力学特征和抗肿瘤疗效作者在SD大鼠体内评价B4的药代动力学特征（图9A）；化合物B4处理以剂量依赖性方式实现了优异的抗肿瘤效果（图9B、9D）；10或30 mg/kg剂量下的肿瘤生长抑制（TGI）值分别为53%和73%。同时化合物B4显著降低肿瘤中的NAMPT水平（图9E）。以上数据说明化合物B4能在体内有效降解NAMPT，产生抗肿瘤功效。图9. NAMPT降解剂B4的体内药代动力学特征和抗肿瘤疗效至此，作者通过使用荧光配体连接E3泛素连接酶设计了第一个荧光治疗诊断PROTAC，用于实时检测和跟踪活细胞中的蛋白质降解。虽然PROTAC B4暂时还未实现体内成像和精确蛋白跟踪等，但PROTAC B4能有效降解NAMPT展示良好的体内外抗肿瘤活性的同时，兼顾了良好的成像性，这有助于我们对蛋白质降解机制的开发，也有利于新型PROTAC药物开发。另外，武汉大学周海兵教授在European Journal of Medicinal Chemistry在线发表了题为“Fluorescence theranostic PROTACs for real-time visualization of ERα degradation”的工作，利用ER高选择性靶向荧光探针做POI的配体，报道了一种NIR荧光治疗诊断PROTAC A3（图10），能有效降解ERα蛋白（DC50值为0.3 μM）的同时Stokes位移值为116 nm，实现目前治疗诊断PROTAC应用领域中最长的波长发射（原文链接：https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.ejmech.2024.116184）。图10. PROTAC A3的结构及性质参数综上所述，荧光配体引入PROTAC设计兼顾监测和降解的双功能抑制剂，在取得一些标志性进展的同时，也仍然面临着巨大的挑战，例如特异性与选择性、细胞内稳定性及体内生物评估等。荧光的治疗诊断PROTAC是否能确保在生物医学研究和临床应用中的有效性和可行性仍需要进一步的优化与验证。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手觉得本文好看，请点这里↓