详解AAV空壳率检测：纯化优势哪家强？

2024-03-06

基因疗法

嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769腺相关病毒(Adeno-Associated Virus, AAV) 载体是以 AAV 基因组为骨架改造而来的基因递送工具，同时也是研究和临床试验中最受欢迎的基因递送载体之一。与慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体等其他常用病毒载体相比，AAV 载体在没有辅助病毒的情况下并不发生产毒性感染，具有高安全性、低免疫原性、宿主细胞范围广（感染分裂和非分裂细胞）、易生产、高穿透性、长时表达、定点整合等优点，在基因治疗领域具有极大的应用前景。AAV载体生产制备过程中质量稳定性、纯度也越来越受到人们的重视。AAV载体由两部分组成：二十面体样的衣壳及其包裹着的单链转基因DNA。在AAV载体组装过程中，会产生三种衣壳：完整衣壳（full capsid）、部分衣壳（partial capsid），和空衣壳（empty capsid）。其中完整衣壳包含正确的DNA序列，是我们所需要的产品；部分衣壳和空衣壳则属于生产中的杂质，有如下几种危害：1)影响产品的纯度，2)增加最终产品的免疫原性，3)会与完整衣壳竞争感染细胞上的载体结合受体，从而抑制完整衣壳的转导，增加总体病毒载量。部分衣壳与空衣壳的存在严重地影响了AAV产品的安全性和有效性，因此监管机构强烈建议在整个生产过程中监控空/完整衣壳比（空壳率）。▲ AAV制备过程中所产生的病毒颗粒类型（图片来源：参考资料1）在AAV载体生产过程中，产品同质性、载体纯度和批次一致性是质控的重要方面，除了确保AAV载体的滴度、产量和生物活性外，最重要的是提高AAV载体的纯度。所以需要通过GMP级的生产体系优化，尽量降低缺乏目的基因的空壳颗粒、包含片段化或者部分基因组的病毒载体颗粒，以尽可能纯化获得更多高质量的包含完整基因组的病毒载体颗粒。分析AAV载体空壳率的方法有qPCR、ELISA、光密度法、透射电子显微镜法、阴离子交换色谱法和分析型超速离心技术等。几种分析方法的技术特点 ① qPCRqPCR是分子生物学实验的常规技术，目的是在每次聚合酶链式反应（PCR）期间监测目标DNA分子(DNA或cDNA)的扩增，其实时检测可以通过使用DNA结合染料和荧光PCR引物或探针两种方法来实现。由于实验简便和特异性，它也广泛用于量化AAV载体基因组的滴度。虽然有着高灵敏性、高精确度、方便省时等特点，并可以在短时间内，将一个微量的特种DNA扩增到一个足以监测到的数量级；但它极其容易受到污染，所以对实验室的配置和操作人员的要求更为苛刻，通常需要对样本进行化学或酶处理，以消化样本中未包装的DNA以及通过将衣壳蛋白变性以暴露出被包装的基因组DNA。一般来说，qPCR对未经纯化或者处理过程中的样本也适合，不影响对AAV载体基因组含量的滴定，且不适合大规模制备。 ② 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA）ELISA为免疫学中的经典实验，它利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，通过底物酶促反应显色来测定衣壳蛋白的滴度。首先捕获抗体和AAV载体衣壳蛋白上的抗原构象表位结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中AAV的量呈一定的比例，然后通过和检测抗体结合并加入底物实现酶促显色反应，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。目前rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV5、rAAV6、rAAV8和rAAV9等血清型抗原表位的特异性单克隆抗体已经商业化应用，这些血清型AAV载体的衣壳蛋白含量相应能进行量化。此外，ELISA实验重复性不佳，需注意这三个原因：1）样品数量多少不一，加样时间有长有短；2）保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致；3）加样量不一致。解决方案：1）重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近；2）重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；3）样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。 ③ 光密度法（Optical Density, OD）OD也叫紫外线吸收测量法，基于衣壳蛋白血清型和基因组预先确定的消光系数，它通过测量260 nm和280 nm处核酸和蛋白的吸收来定量衣壳蛋白的滴度和AAV载体的含量比。它通常需要用洗涤剂将衣壳蛋白变性以及通过加热来暴露载体基因组。该方法并没有特异于AAV载体测量，其精确度受到样本中残余核酸和蛋白质的影响，因此需要去除样本中其它所有吸收杂质。样本需要进行纯化和浓缩，浓缩样本的浓度要求高于5x1011vg/ml，因此该方法比较适合检测分析纯化过的AAV样本。由于OD线性范围小，和qPCR/ELISA的结果验证比较，OD法精确度的重复性不高，其变异系数CV为15%。OD法实验操作简便，仪器简单，从方法学上它本质是一个检测器，可以方便整合到阴离子交换色谱技术或者分析型超速离心技术中。 ④ 透射电子显微镜法（Transmission Electron Microscopy, TEM）TEM是测量AAV空衣壳相对数量的直接工具，也是比较常用的测定空壳率的参考方法，常常用于识别聚集物、变形衣壳和非衣壳颗粒（如宿主细胞碎片）。TEM是利用加速电子束通过电磁透镜穿透样品，聚焦生成纳米级分辨率图像。TEM使用阴性染色（负染色），观测样品为亮，背景为暗。对于AAV (直径约25 nm)来说，样品图像中染色衣壳、部分染色衣壳和未染色衣壳分别代表空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳。▲ 透射电子显微镜法下的图片（来源：公开网站）TEM常用于检测AAV样品空壳率、聚集和纯度等指标。这一方法样品制备简单，可直接目视检测，但是也存在局限性。TEM只应用于纯化后的样品，样品中的蛋白质和细胞碎片会干扰TEM图像中AAV衣壳的准确识别。TEM依赖于人工视觉识别进行量化。为了统计学的显著性，工作人员必须对数千个衣壳进行成像和分析（单个图像的衣壳含量变化约为2%）。另外，颗粒部分填充以及染色不均匀会无法清晰识别各类衣壳亚种。 ⑤ 阴离子交换色谱法（Anion-Exchange Chromatography, AEC）AEC可以用于多种血清型空衣壳颗粒和完整衣壳颗粒的分离，是AAV载体下游生产工艺中广泛使用的纯化方式。因为不同血清型的衣壳颗粒所带的负电荷，与其封装了完整基因组DNA后的病毒颗粒所带的负电荷有差异，导致不同的衣壳亚种之间的等电点存在差异。AEC就是基于这一差异在正电荷固定相上进行样品的分离。应用紫外检测器的AEC具有较高的重复性(<1% ~ 4% CV)和中等精确度(2% ~ 5% CV)，其精确度可以通过与TEM和AUC测试结果相比较来评估，但是受限于检测器的灵敏度，样品浓度不得低于1x10^11 vg/mL。因此如果样品浓度足够，AEC的高通量和可重复性非常适于在工艺开发中常规使用。将AEC应用于HPLC系统（需配备OD/FS检测器），可检测洗脱液的含量比，是宜明细胞AAV下游生产工艺中最主要的纯化方式之一。不过AEC分辨率还有待提高，空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳的基线分离仍未解决。且不同血清型的病毒颗粒的空壳率表征需要摸索不同的流动相条件，需要建立不同的分析方法。▲ AEC分离空壳与完整衣壳（数据源自：宜明细胞） ⑥ 分析型超速离心技术（Analytical UltraCentrifugation, AUC）AUC是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性质的主要技术手段，也是目前能够精确表征AAV病毒颗粒特性，测定聚合物，量化空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳的相对含量的重要手段之一。因其远高于其他技术手段的数据分辨率，AUC被业界视为检测空壳率的金标准。AUC可以通过紫外线吸收或Raleigh干涉实时扫描离心过程中样品各个组分的分布状态，通过分析其随时间其沉降剖面分布状态的变化过程，以根据分子量大小和扩散系数计算出各个组分的沉降系数。然后再依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，精确地测定出AAV载体的空壳率。AUC同时可以检测样本中其他产物的相对含量，如病毒载体碎片、基因组碎片、病毒颗粒聚集体等。AUC在定量含量比方面有显著优势，一是可重复性高，变异系数（coefficient of variation，CV）仅为2%；二是分辨率高，可有效区分部分完整衣壳、空衣壳和完整衣壳。但是AUC也有自身的限制。首先只能用于无残留杂质或赋形剂的纯化样品的检测。其次检测样品用量很大，比如样品滴度须在2～5×1012cp/mL（CP：capsid particle）物理滴度水平上进行以及400-500μL的使用量，这在生产的早期阶段无疑是不小的损失。另外AUC测试用时较长，通常在6小时左右，而且每次只能测试3个或者7个样品，因此在工艺开发过程中常规使用AUC也是极具挑战性的。事实上，AUC非常适合作为正交方法来验证其他更快但是分辨率较低的方法，比如AEC。▲ 6种检测方法的优缺点（星耀研究院整理）此外，星耀研究院还整理了国内具有代表性的CDMO企业的AAV纯化优势及相关平台规模。大家觉得哪家强呢？▲ 代表性CDMO企业的纯化优势及相关平台规模（星耀研究院整理）结语综上所述，在AAV空壳率的检测过程中，每种量化含量比的方法都要在通量和分辨率之间进行权衡，每种分析方法有一定的适用性。在快速的高通量方法中，AEC是最具前景的；TEM则可以提供更直观的数据；在高分辨率的方法中，AUC独领风骚，是目前唯一可行的、可定量部分完整衣壳的“金标准”。AUC虽然通量不高，但可提供高分辨率AAV样品分析信息，可实现定量鉴别空心、实心、部分实心颗粒及聚集体。除了上述的分析方法，其它的一些分析方法如毛细管等电聚焦技术和电荷检测质谱法也在不断发展中，目的都是为了更好地表征AAV载体的纯度、均一性和批次一致性等。整个AAV基因治疗行业的发展，离不开CDMO企业在CMC生产中的技术创新助力。希望CDMO企业可以全面提高空壳率检测方法的验证能力和放行检测的速度，确保高品质AAV产品的持续稳定供应；生产更安全更高质量的临床级AAV载体产品，帮助药物研发企业更好地走向商业化，以更好地满足临床需求。参考来源：1、 https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1016/j.omtm.2021.02.0102、公开网站3、各家公司官网嘉宾阵容以及授课话题已曝光，点击图片查询，合作热线：王晨 180 1628 8769