Hepatitis B vaccine recombinant(Weizmann Institute of Science)

摘要：佐剂是疫苗不可或缺的组成部分。尽管在疫苗中广泛使用，但其作用机制尚未完全清楚。随着对先天免疫反应如何控制抗原特异性反应机制的更深入了解，佐剂的作用机制开始被阐明。佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向Toll样受体（TLRs）和其他模式识别受体（PRRs），促进抗原信号和共刺激信号的产生，从而增强适应性免疫反应，导致抗原呈递细胞（APCs）的成熟和激活。另一方面，递送系统是载体材料，通过延长装载抗原的生物可用性，以及将抗原靶向淋巴结或APCs，促进抗原呈递。本文综述的开头系统总结了佐剂的作用机制。随后介绍了经典疫苗佐剂的机制、特性和进展。此外，由于一些正在研究的佐剂显示出比经典佐剂更大的免疫激活潜力，这可能弥补经典佐剂的不足，因此随后总结了正在研究的佐剂平台。值得注意的是，我们强调了这些佐剂平台的不同作用机制和免疫学特性，这将为不同疫苗的合理设计提供广泛的选择。在此基础上，本综述指出了疫苗佐剂的发展前景和未来应注意的问题。 1.引言 佐剂被定义为与疫苗抗原联合使用时增强疫苗免疫原性的各种成分（图1）。佐剂可以是合成的小分子化合物，也可以是复杂的天然提取物和颗粒材料。佐剂的第一个证据出现在1926年，当时亚历山大·格伦尼发现将铝盐与抗原混合并注射到豚鼠体内比单独给予抗原诱导出更多的抗体（图2）。随后，在20世纪40年代，弗伦德及其同事开发了水包油乳液，导致了弗伦德佐剂的创建。然而，由于对人类有毒，弗伦德佐剂并未获准用于人类疫苗。与弗伦德佐剂类似，由于局部和系统性副作用，细菌脂多糖（LPS）佐剂在人类疫苗中的使用受到限制。实际上，从20世纪20年代到90年代，尽管努力开发新的人类疫苗佐剂，但只有铝佐剂获得了许可。直到1997年，水包油乳液MF59才作为流感疫苗的佐剂在欧洲获得许可。在接下来的20年里，另外四种佐剂（AS04、AS03、AS01和CpG ODN 1018）获准用于疫苗，改变了人类疫苗佐剂的单调性。此外，在此期间，许多其他不同类别的化合物作为佐剂进行了评估，包括矿物盐、微生物产品、乳液、皂苷、合成小分子激动剂、聚合物、纳米颗粒和脂质体。它们在临床前和临床研究中显示出增强免疫反应的强度、广度和持久性。 图1 佐剂增强疫苗的免疫原性。a 无佐剂的疫苗诱导产生适度的T辅助细胞极化细胞因子、抗体和活化T细胞。b 相比之下，含佐剂的疫苗促进更多APCs（抗原呈递细胞）的成熟，增加APCs与T细胞之间的相互作用，促进产生更多数量和更多类型的T辅助细胞极化细胞因子、多功能T细胞和抗体，从而导致广泛和持久的免疫力，以及剂量和抗原的节省。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 图2 疫苗佐剂研究历史中主要事件的时间线。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 尽管佐剂在疫苗中已广泛使用很长时间，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征。直到揭示了先天免疫反应如何控制适应性免疫反应的机制，科学家们才开始理解佐剂的作用机制。佐剂通过靶向先天免疫细胞并激活模式识别受体（PRRs）信号通路，引导和增强特定的适应性免疫反应。随后，发现一些递送材料也可以通过模仿自然病原体的大小或空间结构，通过促进抗原呈递细胞（APCs）摄取和呈递抗原，作为佐剂通过增强适应性免疫反应发挥作用。尽管在佐剂开发方面取得了上述进展，但由于它们的定义广泛和机制复杂，对佐剂的作用机制缺乏系统的概括和总结。此外，由于缺乏对当前佐剂平台的机制、特性、免疫效果和应用场景的系统深入理解，很难为特定疫苗匹配和设计合适的佐剂。这导致当前疫苗在使用中逐渐显示出不足，例如无法提供长期保护性免疫、老年人群的免疫弱和无法提供有效的细胞免疫。因此，为了解决这些问题，本综述尝试首先总结佐剂的机制。然后，总结了具有潜在发展价值的经典佐剂平台和正在研究的佐剂平台的机制、特性和应用进展。在本文的最后一部分，讨论了佐剂可能的未来发展方向。本综述希望能为佐剂机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计和开发提供有效的参考。 2.佐剂的作用机制 佐剂已广泛用于疫苗中，以促进疫苗接种的成功。佐剂通过激活先天免疫细胞增强疫苗的适应性免疫。核心概念是佐剂通过激活APCs促进抗原呈递信号（信号1）和共刺激信号（信号2）的产生（图3）。抗原呈递信号是抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC），在抗原被摄取和处理后呈现在APCs表面。共刺激信号包括APCs表面表达的共刺激分子（例如CD40、CD80、CD86）和分泌的炎症细胞因子（例如IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α）。这两种信号的产生可以强烈诱导初始T细胞的激活，导致增强的适应性免疫反应。免疫刺激剂，如病原体相关分子模式（PAMPs）、损伤相关分子模式（DAMPs）和化学合成的TLRs小分子激动剂，可以通过APCs产生信号1和信号2。递送系统，如脂质纳米颗粒（LNPs）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和笼状蛋白纳米颗粒，通过促进MHC分子上的抗原呈递（信号1）发挥作用。值得注意的是，一些研究表明，许多纳米颗粒递送系统可以直接靶向B细胞以诱导最佳有效的抗体反应。接下来，我们详细描述免疫刺激剂和递送系统发挥佐剂效力的具体机制。 图3 佐剂作用机制的核心。佐剂被分类为免疫刺激剂和递送系统。像PAMPs（病原体相关分子模式）、DAMPs（损伤相关分子模式）和化学合成的小分子激动剂这样的免疫刺激剂，提供危险信号（信号0），激活APCs（抗原呈递细胞）上的PRRs（模式识别受体），从而增强MHC分子上的抗原呈递（信号1）。此外，PRRs的激活导致细胞因子和共刺激分子表达上调，这导致共刺激信号增强（信号2）。像LNPs（脂质纳米颗粒）、PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物）和自组装蛋白纳米颗粒这样的递送系统，通过促进MHC分子上抗原的呈递（信号1）发挥作用。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 2.1.免疫刺激剂的作用机制 根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂是危险信号分子，通过靶向APCs细胞上特定受体导致APCs的成熟和激活。具体来说，免疫刺激剂作为PAMPs、DAMPs或其模拟物，可以与APCs上的PRRs相互作用，触发先天免疫反应，导致APCs的激活和成熟。成熟的APCs终止其吞噬抗原活性，并增强其呈递抗原和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力。这导致适应性免疫反应的启动和增强。此外，值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂将通过不同的PRRs发出信号，并导致不同的细胞因子分泌，这是适应性免疫反应的主要决定因素（图4）。 图4 免疫刺激剂通过激活模式识别受体(PRRs)调节适应性免疫反应的简化图。不同类型的免疫刺激剂通过不同的PRRs发送信号，导致不同细胞因子的分泌，从而诱导不同的适应性免疫反应。免疫刺激剂通过靶向和激活a TLRs；b cGAS-STING；c CLRs；d 其他PRRs来诱导和调节适应性免疫反应。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 靶向TLRs途径。最初发现，免疫刺激剂通过与APCs上的TLRs相互作用来发挥其作用（图4）。作为佐剂的TLRs激动剂通过激活TLRs，增强抗原呈递、上调共刺激信号和细胞因子表达，最终增强适应性免疫反应，显示出有希望的结果。值得注意的是，不同类型的免疫刺激剂通过与不同的TLRs信号传导，介导不同的适应性免疫反应。总体而言，由于TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表达在细胞表面，它们主要识别微生物膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质。因此，相应的免疫刺激剂激活APCs表面的TLRs通常会导致产生促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α和IL-6，并最终导致产生Th1或Th2型免疫反应。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是细胞内TLRs，它们在细胞内囊泡中表达并与核酸反应。这些细胞内TLRs被相应的免疫刺激剂激活通常会导致产生I型干扰素。I型干扰素可以促进Th1细胞的分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DCs）促进抗原交叉呈递给CD8+ T细胞，并可能直接刺激CD8+ T细胞的增殖。免疫刺激剂通过TLRs发挥作用的具体机制如下：(1)与TLR2异源二聚体（TLR2/1或TLR2/6）结合的免疫刺激剂通过髓样分化初级反应88（MyD88）途径启动信号传导并激活NF-κB，从而诱导产生促炎细胞因子如IL12。IL-12参与将初始T细胞分化为Th1细胞。此外，靶向TLR2的免疫刺激剂还导致增强的细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号传导，结果增强c-Fos蛋白的表达，这将抑制IL-12表达并增强IL-10表达。这推动初始T细胞极化为Th2型细胞。因此，靶向TLR2的免疫刺激剂主要诱导Th2型适应性免疫反应。(2)与TLR3结合的免疫刺激剂通过toll/白介素-1受体结构域包含的适配体诱导干扰素-β（TRIF）途径启动信号传导，激活干扰素调节因子3（IRF3）并刺激APCs产生I型干扰素。这最终导致Th1型反应和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的产生。(3)与TLR4和TLR5结合的免疫刺激剂通过MyD88途径启动信号传导以激活NF-κB，这诱导促炎细胞因子分泌并推动初始T细胞向Th1型细胞极化。此外，值得注意的是，通过TLR4触发适应性免疫的免疫刺激剂也可以通过TRIF信号传导，导致IRF3的激活，从而产生少量I型干扰素。(4)靶向位于内质体的TLR7/8/9的免疫刺激剂通过MyD88途径激活NF-κB和干扰素调节因子7（IRF7），触发APCs产生促炎细胞因子和I型干扰素，并诱导强烈的Th1和CTLs反应。 靶向cGAS-STING途径。随着环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）途径在协调先天和适应性免疫中独特作用的揭示，科学家们越来越有兴趣尝试将cGAS-STING途径的激动剂作为疫苗佐剂。cGAS是一种胞质DNA受体，可被双链DNA激活。cGAS激活后，将胞质腺苷酸和鸟苷酸环化成环鸟苷酸-腺苷酸（cGAMP）。随后，cGAMP锁定到STING二聚体的V形结合口袋中，引起构象变化、聚集和STING的激活。之后，NF-κB和IRF3将被激活，这反过来促进促炎细胞因子和I型干扰素的产生。I型干扰素如IFN-α/β可以诱导APCs的成熟，上调共刺激信号并增强其呈递或交叉呈递抗原的能力。因此，靶向cGAS-STING途径的免疫刺激剂不仅将初始T细胞极化为Th1型细胞，还促进CTLs的产生。靶向cGAS-STING的免疫刺激剂包括核苷酸小分子激动剂和非核苷酸小分子激动剂。其中，核苷酸小分子激动剂通常是基于环二核苷酸（CDNs）的天然配体分子，如环二鸟苷酸（c-di-GMP）、环二腺苷酸（c-di-AMP）、2’,3’-cGAMP和3’,3’-cGAMP。非核苷酸小分子激动剂的例子是DMXAA和CF501。此外，值得注意的是，胞质中的线粒体DNA（mtDNA）也可以被cGAS感知，从而激活STING途径。 靶向CLRs途径。C型凝集素受体（CLRs）是一个包括Dectin-1、Dectin-2、MINCLE、DC-SIGN、CD206、CD205等的超家族。CLRs主要定位在细胞膜上，作为抗原受体参与捕获和呈递抗原。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常激活CLRs，随后诱导APCs启动内吞、处理和呈递抗原，以增强适应性免疫反应的发展。此外，一些免疫刺激剂可以激活CLRs，触发不同的信号传导途径，诱导特定细胞因子的表达，从而控制初始T细胞的极化方向。例如，β-葡聚糖通过Dectin-1的激活导致Syk激酶的磷酸化，进而激活NF-κB，导致制造促炎细胞因子IL12、IL-1β、IL6和IL23，从而诱导初始T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1型细胞诱导强烈的CTLs反应以及驱动B细胞中的免疫球蛋白转换为IgG2a。Th17效应细胞以产生IL-17、IL-17F和IL-22为特征，并通过招募中性粒细胞触发大规模炎症反应。免疫刺激剂激活Dectin-2和MINCLE以及DC-SIGN也可以导致NF-κB激活和促炎细胞因子的产生。然而，由于Dectin-2和MINCLE不具有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAMs），它们需要与携带ITAM的FcRγ结合，才能发生信号传导。值得注意的是，多糖配体对DEC-205和CD206的刺激通常偏向于诱导增强的吞噬作用和抗原呈递，而不是细胞内信号传导。 靶向其他PRRs。在后续研究中，科学家发现免疫刺激剂也可以激活许多其他PRRs，如核苷酸结合寡聚化结构域1（NOD1）、核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关基因5（MDA5）。NOD1、NOD2和NLRP3是核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NLRs）家族的成员。佐剂通过激活它们将导致APCs上调MHC II并有助于增强抗原呈递。此外，这些NLRs的激活将导致产生促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18，驱动初始T细胞偏向极化为Th2型细胞。 Muramyl dipeptide (MDP) 或完全弗伦德佐剂 (CFA) 可以激活NOD1和NOD2，随后刺激NF-κB的转录激活，产生IL1、IL18和IL33的前体。随后，在激活的NLRP3炎症体复合体存在下，caspase1将这些因子切割成其活性形式。NLRP3炎症体复合体由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点蛋白（ASC）、cardinal和caspase1蛋白组成。总的来说，NOD1、NOD2和NLRP3的激活将导致主要产生Th2型的免疫反应。RIG-I和MDA5是视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）家族的成员，主要识别RNA。大多数TLR3激动剂，如polyI:C，也会在APCs中激活MDA5。RIG-I和MDA5的激活导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。因此，靶向这两个受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTLs的产生。 2.2.递送系统的作用机制 递送系统被定义为装载抗原的载体材料，并增加APCs对抗原的摄取和呈递。换句话说，递送系统的主要功能是促进抗原呈递。抗原呈递过程涉及APCs对抗原的识别、摄取和内吞，然后由MHC在APCs表面装载和呈递。递送系统可以通过一种或多种方式增加APCs表面呈递的抗原信号。 延长抗原的生物可用性。递送系统通过(1)允许抗原持续释放，(2)形成免疫微环境，和(3)为抗原提供货物保护来实现延长抗原的生物可用性。延长的抗原生物可用性将确保有足够的抗原可供APCs使用。因此，这将导致更多的MHC-抗原肽信号产生。 递送系统可以通过持续释放抗原来延长免疫系统中抗原的生物可用性。例如，纳米乳液递送系统（例如，MF59、AS03）的作用机制之一被认为是持续的抗原释放。最近，一些正在研究的递送系统也被发现具有缓慢释放抗原的能力，如可注射水凝胶。可注射水凝胶允许APCs通过缓慢释放持续呈递抗原，这有助于生发中心B细胞经历多轮亲和力选择，最终导致产生更大量和高亲和力的抗体。值得注意的是，通过调整水凝胶网格的大小，可以控制疫苗成分在水凝胶中持续释放的时间，从而调节释放时间窗口。此外，由生物可降解的PLGA或聚醚酸聚合物制成的固体聚合物颗粒可以包裹抗原，并在几天到几个月的时间内缓慢释放亚单位抗原。我们也注意到，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力。不仅如此，自组装支架除了抗原外，还可以通过装载免疫刺激剂来释放炎症信号，并增强血清抗体水平和CTLs水平。总之，使用持续释放技术来延长抗原和佐剂在免疫系统中的暴露时间和生物可用性，可以提高适应性免疫反应的效力、持久性和质量。 此外，一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫微环境来实现更高的免疫激活。以这种方式工作的递送系统不仅延长了抗原在免疫系统中的保留时间，还招募了更多的免疫细胞渗透到注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索以激活随后的适应性免疫反应。已证明能够产生炎症免疫微环境的递送系统显著延长了抗原的生物可用性，增加了抗原的摄取，招募了免疫细胞，并增强了抗体滴度和细胞免疫反应。渗透到注射部位的先天免疫细胞的浸润使得形成微环境的递送材料比单独使用持续释放技术制备的递送材料具有更大的免疫激活能力。为了使免疫细胞渗透到递送系统中，可以将一些细胞因子并入递送系统并缓慢释放，从而增加细胞迁移。最常用的细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。最近，Sun等人开发了一种可注射的聚（己内酯）-聚（乙二醇）-聚（己内酯）热敏水凝胶，包裹GM-CSF和卵清蛋白，增加了注射部位DCs的招募并提高了抗原的摄取效率。 此外，封装一些免疫刺激剂如TLR激动剂也可以促进先天免疫细胞的招募和渗透。研究发现，一些自佐剂递送材料也可以促进免疫细胞的渗透。例如，介孔硅棒是一种自佐剂递送材料，可以激活NLRP3先天免疫途径。当注射到小鼠体内时，它增加了先天免疫细胞对注射部位的渗透并增强了免疫反应。 此外，递送系统还可以通过保护抗原（特别是DNA和mRNA）免受体内酶的分解，从而维持其生物活性来延长抗原的生物可用性。例如，mRNA抗原容易受到细胞外血清中RNA酶的降解。因此，它们需要被包裹在密封的载体中以避免酶促水解，并确保mRNA顺利递送到目标细胞。LNPs是一种被证明有效的mRNA递送系统，其基本功能之一是包裹mRNA并保护其免受降解RNA酶的侵害。 值得注意的是，由于佐剂具有多种机制，延长抗原的生物可用性只是佐剂作用机制之一，它占所有作用机制的比例需要仔细研究。例如，通过形成“抗原库”来延长抗原的保留和生物可用性被认为是铝佐剂的关键作用机制。然而，随着研究的深入，一些研究人员发现，在铝佐剂给药后移除“抗原库”并没有显著减少抗原特异性T和B细胞反应的产生。这意味着形成抗原库以保留抗原的机制可能不是铝佐剂的关键作用机制，应该全面准确地理解佐剂的作用机制，以更合理地使用佐剂和开发新型佐剂。 APCs靶向。递送系统可以通过以下两种方法靶向APCs，并使APCs有效摄取抗原（图5）。增加抗原摄取量，反过来又增加了APCs表面呈递的MHC-抗原肽的数量，从而导致更强的适应性免疫反应。 图5 递送系统的的作用机制图。递送系统通过以下方式促进增强的抗原呈递或抗原交叉呈递，以增强适应性免疫反应：a 延长抗原的生物利用度；b 将抗原靶向到抗原呈递细胞(APCs)；c 直接将抗原运送到淋巴结；d 促进内质网逃逸。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 递送系统的第一种方法是通过模仿病原体的尺寸和空间结构来促进APCs对抗原的摄取。由于病毒和细菌是纳米到微米大小的颗粒，免疫系统已经演化出识别和响应颗粒性抗原的能力。微米或纳米材料已被用于递送抗原，增加了抗原的大小，从而在一定程度上改善了APCs的摄取。例如，与可溶性抗原相比，用脂质纳米颗粒封装抗原可以提高APCs对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递并诱导产生更高幅度和更高亲和力的抗体。另一个例子是，装载H5N1流感抗原的新型水凝胶微粒递送系统可以改善体液反应并增强T细胞激活。这一现象的原因之一是水凝胶微粒增加了抗原的大小，进而提高了APCs对抗原的识别和摄取。此外，高度有序和重复的空间结构是病原体的固有特征，免疫系统已经演化出对这类结构高度敏感的识别和响应能力。自组装蛋白纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模仿病原体的高度有序和重复的空间结构，向APCs展示多价抗原，增加了APCs摄取抗原的概率。研究发现，即使在没有其他免疫刺激剂补充的情况下，这些递送系统也能引发强烈的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，递送系统的有序和重复的空间结构非常有利于B细胞受体（BCRs）的共聚集，这可以导致B细胞的强烈激活，最终产生高亲和力抗体和记忆B细胞。 此外，递送系统通过直接靶向APCs上特定的受体（例如，Fc受体、CLRs）来促进更有效的抗原摄取。许多研究表明，靶向APCs上Fc受体的递送系统可以选择性地增强体外和体内的抗原摄取和细胞免疫。此外，CLRs是一类特定于DCs亚群的PRRs。这个家族的成员包括DEC-205、DC-SIGN和甘露糖受体等。使用CLRs配体（通常是碳水化合物）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特定的DCs，从而增强抗原摄取。例如，甘露糖修饰的聚合物用于递送黑色素瘤抗原肽，在黑色素瘤模型中强烈诱导预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。另一个例子是CDX-1401，它是一种疫苗，由特异性结合DEC-205的单克隆抗体与全长肿瘤抗原NY-ESO-1融合而成。研究表明，这种疫苗通过特异性靶向DEC-205受体的DCs，增加了抗原的摄取和呈递，从而增强了抗肿瘤效果。它在与其他药物联合使用时也显示出了有希望的临床价值。 考虑到与淋巴结相关的不同亚群的DCs可能在诱导不同类型的T细胞反应中具有不同的功能，递送系统的靶向免疫细胞群体（尤其是纳米颗粒）是疫苗递送系统开发中的关键考虑因素。从上述对APCs靶向的描述中可以看出，纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群体。首先，纳米颗粒可以通过与功能化配体的耦合来靶向特定的细胞群体。例如，通过将针对CD169的抗体耦合到纳米颗粒的表面，纳米颗粒可以靶向至被膜下窦巨噬细胞。其次，调整纳米颗粒的大小也是靶向特定细胞群体的策略。当纳米颗粒被设计为保持在50-100纳米时，它们将优先靶向滤泡树突状细胞（FDCs）并被保留在FDCs中。这对于产生高亲和力和持久的抗体免疫反应很重要。此外，增加纳米颗粒的抗原价和纳米颗粒的糖基化修饰也将使纳米颗粒优先靶向FDCs。纳米颗粒还可以被设计为展示多价抗原蛋白以靶向和激活B细胞。总之，这些方法允许纳米颗粒主动靶向不同的细胞群体。 淋巴结迁移。大量的先天免疫细胞和淋巴细胞在淋巴结中积累，淋巴结是初始免疫反应的场所。因此，淋巴结是递送系统的关键靶标。一些递送系统可以直接促进抗原迁移到淋巴结，从而增加抗原在淋巴结中遇到APCs的机会，导致APCs摄取和呈递更多的抗原，增加抗原呈递信号。递送系统以两种方式直接将抗原运输到淋巴结。第一种方法是，递送系统通过被动扩散直接运输到淋巴结。具有适当尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）的递送系统可以通过被动扩散进入传入淋巴管，随后进入淋巴结。研究表明，最佳尺寸在5到100纳米之间。如果递送系统的尺寸太小，它倾向于进入毛细血管。然而，如果递送载体佐剂的尺寸太大，它可能无法通过传入淋巴管内皮细胞之间的间隙，因此无法进入传入淋巴管。此外，在这种方法中，递送系统最好带净负电荷，而不是净正电荷，因为传入淋巴管的间质基质主要由胶原纤维和带负电荷的糖胺聚糖组成。此外，递送系统的亲水性影响其在传入淋巴管之间运输疫苗的效率。例如，与非PEG修饰颗粒相比，PEG修饰的50纳米聚合物在大鼠皮下注射后在大鼠淋巴结中的颗粒积累更多。 第二种方法是所谓的白蛋白搭车。由于内源性白蛋白在淋巴系统中循环，如果抗原能够与内源性白蛋白结合，它们就可以通过搭乘白蛋白列车被运输到淋巴结。目前，我们知道白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，可以捕获并结合一些脂质分子。利用这一机制，研究人员设计了一种带有亲脂尾部的肿瘤肽疫苗。实验结果表明，疫苗与白蛋白结合，并在淋巴结中大量积累，导致T细胞产生增加30倍，并在小鼠注射后显著增强抗肿瘤效果。另一个例子是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE），它已被证明可以与内源性白蛋白高效结合，具有高亲和力。秦等人构建了一个基于DSPE的递送系统，装载OVA抗原肽和聚I:C，使疫苗成分能够直接靶向淋巴结，并在淋巴结中大量积累，导致体内产生强烈的CD8+ T细胞反应，从而在小鼠中实现更有效的治疗和延长中位生存时间。此外，内源性白蛋白还可以与一些染料结合，如Evans蓝染料。利用这一特性，朱等人使用临床安全的Evans蓝衍生物与抗原耦合，发现疫苗有效地与白蛋白结合，并随白蛋白的回流被输送到淋巴结。通过体内实验发现，疫苗显著抑制了小鼠原发性或转移性肿瘤的生长。 促进抗原交叉呈递。抗原交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8+ T细胞的过程。这对于针对病毒感染疫苗和癌症疫苗的接种至关重要。然而，在正常情况下，外源性抗原通常只被APCs内吞并由MHC II分子呈递给CD4+ T细胞，而不会发生任何交叉呈递。已经开发了几种递送系统，通过促进抗原从内体或溶酶体逃逸，然后由MHC I分子装载，从而实现抗原交叉呈递。这些递送系统主要通过三种方式实现这一目标。 第一种是质子海绵效应。当一些带有可质子化的胺基的阳离子聚合物或脂质递送系统被APCs内吞时，它们会吸收大量质子以缓冲APCs内体或溶酶体的酸性环境。这导致大量氯离子和水分从细胞质流入内体或溶酶体，引起内体膨胀和破裂。这一过程导致抗原释放到细胞质中，促进了MHC I分子的抗原交叉呈递。例如，在内体酸性条件下，聚乙烯亚胺（PEI）通过其可质子化的氨基吸收质子，导致内体膨胀和破裂。有研究报告称，用PEI修饰的氢氧化铝纳米颗粒显著增加了抗原交叉呈递。今天，其他阳离子聚合物和阳离子脂质体也被发现可以通过质子海绵效应增加抗原交叉呈递。 第二种，一些递送系统通过与内体/溶酶体膜融合或结合来破坏膜的稳定性，从而将抗原释放到细胞质中。通过Pickering乳液（PAPE）颗粒的阳离子颗粒铝佐剂在传递SARS-CoV-2 RBD疫苗抗原时，与铝佐剂组相比，诱导了3倍多的IFN-γ+ T细胞。这表明这种颗粒具有强大的激活细胞免疫反应的能力。这部分是因为它能够与内体/溶酶体膜结合，破坏内体/溶酶体膜的稳定性，导致抗原释放到细胞质中，并呈递给CD8+ T细胞。 第三种方法是光化学内化释放技术。这种技术提供了一种新兴的技术，通过使用光敏剂基于光诱导破坏内体膜，将内吞物质路由到细胞质中。具体来说，光敏剂被纳入递送系统中与抗原一起递送，随后光敏剂在暴露于特定光源后被激发形成单线态氧，这导致脂质过氧化和内体膜的破坏，从而将抗原释放到细胞质中。在一项研究中，Ji等人使用基于精氨酸和苯丙氨酸的聚酯酰胺作为原料制备阳离子纳米颗粒，这些纳米颗粒随后被进一步用于与光敏剂AlPcS2a形成静电复合物并递送抗原。当在660纳米光源下应用时，它显著促进了抗原从内体/溶酶体逃逸到细胞质，并增强了CD8+ T细胞介导的免疫反应。 3.经典佐剂平台 氢氧化铝佐剂、MF59、AS01、AS03、AS04和CpG ODN 1018是人类疫苗的经典佐剂。它们已被广泛批准用于多种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。 3.1.氢氧化铝佐剂 氢氧化铝佐剂是第一个被批准用于人类疫苗的佐剂。在许可疫苗中常用的两种基于铝的佐剂是氢氧化铝和磷酸铝。氢氧化铝佐剂通过促进Th2细胞反应增强IgG1和IgE抗体的产生。然而，氢氧化铝佐剂的作用机制复杂，学术界仍存在持续的争论。目前有两个方面得到了广泛认可。首先，氢氧化铝佐剂作为递送系统与抗原紧密结合并持续释放抗原，从而延长抗原的生物可用性并增加抗原呈递。其次，氢氧化铝佐剂也可以作为免疫刺激剂，诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRRs，导致产生IL-1β等细胞因子和Th2型免疫反应。近年来，一些研究表明，由注射部位的氢氧化铝佐剂诱导的宿主细胞死亡释放的宿主DNA或尿酸可作为内源性危险信号。这些内源性危险信号可以作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。关于氢氧化铝佐剂靶向的PRR，一些科学家认为是NLRP3，而一些人持怀疑态度。然而，这并不妨碍氢氧化铝佐剂成为疫苗行业的佐剂首选，因为其公认的安全性和可靠性。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获食品药品监督管理局（FDA）批准。此外，铝也是新临床开发疫苗的候选佐剂，如SARS-CoV-2疫苗。然而，氢氧化铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和可能的不良反应（红斑、过敏反应）。出于这些原因，通过改进配方或将其制备为纳米铝佐剂，可以使氢氧化铝佐剂更有效。 3.2.乳液佐剂 MF59和AS03都是经典的水包油乳液佐剂。MF59由角鲨烯、Tween 80和Span 85组成。MF59作为流感疫苗的佐剂于1997年获得许可，成为第一个被批准用于人类疫苗的非铝佐剂。MF59乳液具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可以作为乳液递送系统，与抗原共递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用时间，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递。这导致APCs表面呈递更多的抗原信号，因此，身体对抗原产生更强的特异性免疫反应。此外，MF59还作为免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRRs并通过诱导产生内源性危险信号来激活先天免疫细胞。MF59在肌肉中的给药激活了巨噬细胞和DCs等先天免疫细胞，并促进了CCL2、CCL4、CCL5和CXCL8等趋化因子的产生。这些趋化因子反过来招募更多的先天免疫细胞到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，值得注意的是，MF59的确切靶向PRR仍然不清楚，除了MF59可能通过NLRP3独立的ASC激活途径和TLR独立的MyD88激活途径发挥作用。（图6） 图6 经典佐剂主要信号通路的简化图。这张图是用BioRender（https://biorender.com/）创建的。 总之，使用MF59佐剂的疫苗接种会导致体内偏向于Th2的免疫反应，并弱化Th1反应的诱导。目前，MF59已被广泛用于多种人类疫苗，并显示出良好的安全性和有效性。AS03是另一种水包油乳液佐剂，由α-生育酚、角鲨烯和Tween 80组成。AS03和MF59的佐剂效果相似。首先，它作为抗原递送系统，通过缓慢释放来增强APCs表面的抗原信号呈递。其次，AS03也具有免疫刺激作用，因为它也含有角鲨烯。和MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还包含α-生育酚作为额外的免疫刺激成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，这些因子增强APCs对抗原的摄取，并增加引流淋巴结处募集的先天免疫细胞数量。像MF59一样，AS03通常主要诱导偏向于Th2的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03在2009年H1N1大流行期间被欧盟许可用于流感疫苗（Pandemrix, TM,GSK）。随后，在2013年，AS03被美国FDA许可用于H5N1禽流感疫苗，并显示出令人满意的安全性、反应原性和免疫原性。AS03主要用于各种流感疫苗，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004, NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床效益。 3.3.基于TLR激动剂分子的佐剂 AS04和CpG ODN 1018都是经典的基于TLR激动剂分子的佐剂。AS04是通过氢氧化铝吸附TLR4激动剂分子制备的。由于AS04包含氢氧化铝佐剂，它也具有免疫刺激和递送抗原的功能。然而，AS04的免疫刺激功能比氢氧化铝佐剂更强。这是因为AS04包含一种更强效的免疫刺激分子，称为单磷酸脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APCs上的TLR4，导致NK-κB激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当比较补充AS04的疫苗与仅补充氢氧化铝佐剂的疫苗时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明TLR4激动剂MPLA在AS04中发挥重要作用。总的来说，AS04比氢氧化铝佐剂产生更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1/Th2免疫反应。AS04目前主要用于人类乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗（Fendrix），以增加抗体产生和激活抗原特异性T细胞。 CpG ODN 1018是一种合成的单链DNA分子，已被广泛研究作为TLR激动剂。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，导致TRF7激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的产生，最终导致强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞的产生。这使得它比氢氧化铝佐剂产生更好的细胞免疫反应。CpG ODN 1018最初被批准用于乙型肝炎病毒（HBV）疫苗。CpG ODN 1018目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗的潜在佐剂进行评估。最近，一种用CpG ODN 1018佐剂的COVID-19疫苗（SCB-2019）已被评估用于紧急使用。 3.4.颗粒佐剂系统 AS01是一种经典的颗粒佐剂系统，是一种含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria树皮中提取的活性成分QS-21的脂质体佐剂。AS01具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。AS01的抗原呈递功能由脂质体执行。脂质体是一种中空的磷脂双层人工膜，可用于封装和递送抗原。脂质体可以保护抗原免受降解并延长其生物可用性，从而使APCs能够捕获更多的抗原信号。AS01的免疫刺激功能由MPLA和QS-21贡献。MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，导致Th1型反应增加。QS-21激活APCs中的NLRP3，随后激活caspase 1以促进细胞因子IL1β、IL18和IL33的活性形式的产生。此外，QS-21还被发现可以促进内体逃逸并促进交叉呈递。总的来说，这两种免疫刺激成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应，并促进CTLs的产生。AS01是已许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分，促进抗原特异性抗体产生并增强细胞免疫反应。最近，AS01也已应用于新型结核肽疫苗（M72/AS01E）的开发，并已显示出对健康成年人的安全性、有效性和预防结核病的前景。 总之，佐剂是疫苗的重要组成部分。经典佐剂为其他新疫苗的开发提供了相对可翻译的平台。这些佐剂可以优先选择用于新疫苗的临床试验，以便快速获得市场批准。然而，这些佐剂也揭示了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫的能力较弱，不提供长期保护性免疫，并且在老年人群中效果较差。此外，大多数这些批准的佐剂只能诱导抗体反应，并且诱导CD8+ T细胞介导的细胞免疫的能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。最后，大多数许可的佐剂的作用机制仍然不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和不可控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。 4.正在研究的佐剂平台 由于佐剂在疫苗中的突出作用，近年来佐剂科学经历了快速发展。一些正在研究的免疫刺激剂和递送系统显示出良好的佐剂效果。接下来，我们将总结和描述它们。 4.1.正在研究的免疫刺激剂平台 近年来，随着对佐剂的深入研究，一些正在研究的免疫刺激剂显示出良好的佐剂效果。在本节中，我们将总结和描述这些正在研究的免疫刺激剂的作用机制、特性和应用进展。 合成双链RNA（dsRNAs）。合成双链RNA（dsRNAs）能够靶向并激活APCs上的TLR3和MDA5，导致产生IL-12等促炎细胞因子和I型干扰素，促进产生强烈的偏向Th1的免疫反应和CTLs。Poly-I:C及其改良变体Poly-ICLC是最研究的合成dsRNA免疫刺激剂。体外研究表明，poly-I:C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞衍生的DCs成熟，导致分泌IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12，从而促进外源性抗原与CD8+ T细胞的交叉呈递，并触发偏向Th1的免疫反应。临床前和临床研究均表明，poly-I:C和poly-ICLC是增强抗体产生和CD8+ T细胞免疫反应的有前景的佐剂。在人类的一项测试显示，将poly-ICLC与靶向DC的疫苗结合使用，诱导了与活病毒疫苗相似的先天免疫反应，进一步强调了poly-I:C/poly-ICLC作为疫苗佐剂的有效性。此外，我们注意到poly-I:C和poly-ICLC在临床上用于肽疫苗、DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于各种癌症疫苗。将poly-I:C或poly-ICLC添加到癌症疫苗中，增强了疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤的消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I:C/poly-ICLC可能会有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用，除了其触发强大免疫反应的功能外。因此，应考虑合理的递送系统来保护它免受降解，并将更多的poly-I:C/poly-ICLC靶向到APCs，以确保尽可能低的剂量激活APCs并减少副作用。 GLA及其衍生物。葡萄糖基脂质A（GLA）是一种合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品。GLA可以通过激活APCs上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。为了增强GLA的免疫效果，通常将其制备成制剂使用。GLA通常被制备成葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF）、葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE）、葡萄糖基脂质A-脂质体（GLA-LS）和葡萄糖基脂质A-氢氧化铝（GLA-alum）。其中，GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。当Clegg等人使用GLA-SE作为H5N1亚单位疫苗的佐剂时，他们发现它诱导产生了抗原特异性Th1型CD4+ T细胞和更高滴度的Th1型抗体，并保护小鼠和雪貂免受H5N1病毒挑战。在非人灵长类动物中，GLA-SE作为流感疫苗佐剂使用时诱导产生更多的Th1型细胞因子，并诱导产生针对多种流感病毒变种的中和抗体，大大提高了疫苗的保护性免疫效果。除了改善疫苗的体液免疫反应外，在一项II期临床试验中，当使用GLA-SE作为H5N1流感疫苗的佐剂时，显示出剂量节省效应，这在大流行性流感情况下特别有益。在几项临床试验中，当GLA-SE作为TB疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，疫苗被发现诱导产生高滴度的抗原特异性抗体产生和CD4+ T细胞反应，在接种人群中展现出良好的安全性和免疫原性。此外，GLA-SE已在临床上作为疟疾疫苗、肿瘤疫苗、HIV疫苗、内脏利什曼病疫苗和血吸虫病疫苗的疫苗佐剂进行评估。这些临床试验似乎表明，GLA-SE是一种有效且安全的疫苗佐剂，有潜力成为下一代疫苗佐剂。GLA-AF是GLA家族中另一个研究得很好的产品。GLA-AF也已在临床前和临床测试中作为几种疫苗的佐剂候选进行了评估。 咪唑喹啉类。咪唑喹啉类能够激活TLR 7/8，导致NF-κB和IRF7激活，促进产生促炎细胞因子和I型干扰素，这将导致强烈的Th1细胞和CTLs产生。伊马克莫德（R837）、雷西莫德（R848）和3M-052（也称为特拉托利莫德）是作为佐剂在临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉类。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出强大的佐剂作用。与R848结合的病毒疫苗和肿瘤疫苗显示出更强的体液反应和CD8+ T细胞免疫反应。 3M-052是一种结构类似于R848的咪唑喹啉化合物。3M-052的18-C脂肪酸链赋予了化合物增强的疏水性，从而提高了免疫部位的生物利用度并降低了系统传播的可能性。此外，这种脂化使3M-052更容易纳入基于脂质的制剂中，如乳液或脂质体。用PLGA纳米颗粒或氢氧化铝包裹的3M-052配制的HIV疫苗已被证明能诱导高水平和持续的抗体反应和T细胞反应。基于氢氧化铝-3M-052佐剂的HIV疫苗已在人类I期临床试验中进行了研究。此外，3M-052也用于灭活SARS-CoV-2疫苗。印度III期临床试验的中期结果显示，该疫苗总体估计有效率为77.8%，表明该疫苗耐受性良好。COVAXIN目前已被世界卫生组织（WHO）批准紧急使用。 这些咪唑喹啉类作为疫苗佐剂的使用增强了免疫效果，但也存在一些不足。具体来说，它们经常从注射部位系统扩散，从而远离抗原，降低效果，并诱导系统性副作用。因此，这些咪唑喹啉需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、基于脂质的纳米颗粒或其他递送材料结合，以增强其免疫效果并减少副作用。 CpG ODNs。CpG ODNs是合成的单链DNA分子，作为TLR9激动剂已得到广泛研究。其中，最常用作疫苗佐剂的是CpG ODN 1018、CpG ODN 7909和IC31。它们可以导致TRF7的转录激活，进而导致细胞因子IL-12和I型干扰素的产生，最终诱导强烈的Th1型细胞反应和CTLs产生。CpG ODN 1018是在临床前和临床试验中研究最多的CpG ODN，并在前一节中有所描述。除了CpG ODN 1018，CpG ODN 7909是研究最多的CpG ODN。当CpG ODN 7909添加到HBV疫苗中时，CpG ODN 7909在健康人群中诱导出更显著和快速的HBsAg特异性体液反应。CpG ODN 7909还可以改善HIV阳性患者对疫苗的反应率，展示了与CpG ODN 7909配制的疫苗在提高免疫受损个体疫苗反应率方面的潜力。一项随机、双盲对照试验测试了CpG ODN 7909作为HBV疫苗（Engerix-B）佐剂的免疫刺激效果。试验结果表明，添加CpG ODN 7909实现了快速、更高和持续的血清保护，并增加了与单独Engerix-B相比的HBV特异性Th反应。除了与HBV的使用外，CpG ODN 7909(表1, NCT00889616)还用于疟疾疫苗。一项基于蛋白质的疟疾疫苗BSAM2的I期临床试验显示，添加CpG ODN 7909的剂量节省效应。这一特性在资源匮乏的环境中特别有价值。 IC31是TLR9的另一种激动剂，它包含CpG ODN和带正电的抗菌肽成分。它通过TLR9/MyD88依赖途径信号细胞和体液免疫反应。此外，IC31的两个组分之间通过离子和疏水相互作用形成的稳定复合物可以在注射部位形成抗原库，提供抗原的缓慢释放并延长抗原的生物可用性。IC31可以增加APCs的抗原呈递，并显著提高CpG ODN的免疫效果。基于小鼠的研究表明，IC31有助于诱导强大的抗原特异性CTLs和强烈的抗原特异性体液反应。IC31已作为各种亚单位疫苗的候选佐剂在临床前和临床试验中得到广泛评估。结果表明，IC31是一种有效的疫苗佐剂，具有临床转化的潜力。 环二核苷酸（CDNs）。CDNs能够靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导产生I型干扰素和促炎细胞因子。I型干扰素选择性刺激抗原交叉呈递并动员CD8+ T细胞。因此，CDNs产生强烈的Th1型细胞反应和CTLs反应。CDNs包括天然CDNs和合成CDNs。天然CDNs包括2',3'-cGAMP、3',3'-cGAMP、c-di-GMP和c-di-AMP，它们是细菌和哺乳动物的第二信使，具有强大的免疫调节功能。基于天然CDNs的佐剂已在多种疫苗中得到评估，并显示出有希望的结果。例如，当2',3'-cGAMP被包裹在肺表面活性剂模拟脂质体中时，它增强了H1N1流感疫苗诱导的体液和CD8+ T细胞反应，并在小鼠和雪貂中诱导了对异型病毒的长期交叉保护免疫反应。Junkins等人将3'3'-cGAMP包裹在酸敏感的乙醛缩聚右旋糖（Ace-DEX）聚合物颗粒中，并与流感疫苗一起给小鼠注射。测试结果表明，与常规氢氧化铝疫苗组相比，抗体滴度高出60至600倍，并且未观察到明显的毒性效应。Lin等人将c-di-GMP包裹在PLGA中，并将MERS疫苗抗原外部耦合形成纳米疫苗。这种疫苗不仅触发了有效的中和抗体和抗原特异性T细胞反应，而且还优先靶向引流淋巴结，产生局部免疫并减少系统反应。当Ebensen将c-di-AMP作为H5N1流感疫苗的粘膜佐剂时，发现它能有效诱导小鼠对H5N1流感的保护性免疫。c-di-AMP作为HPV疫苗佐剂的I期临床试验目前正在进行中。 由于天然CDNs的半衰期短和APCs的摄取效率低，一些具有化学修饰的合成CDNs应运而生，以增强其免疫效果，如ADU S100、MK-1454、BMS-986301、SB-11285、IMSA-101。然而，这些合成CDNs作为疫苗佐剂的具体应用实例尚无。值得注意的是，由于这些合成CDNs在临床前和临床试验中显示出显著增强机体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDNs作为疫苗佐剂的愿望很快就会实现。 此外，值得注意的是，随着纳米技术的出现，基于纳米颗粒的递送系统，如脂质体、乳液、类病毒颗粒（VLPs）和可生物降解聚合物，已受到显著关注。它们可以持续释放货物并改善货物的生物可用性。因此，使用纳米颗粒包裹CDNs被视为提高体内CDNs利用效率的策略。 代谢佐剂。近年来，一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现是新型疫苗佐剂。甲羟戊酸途径是各种细胞过程的核心代谢途径，包括胆固醇生物合成和蛋白质翻译后香叶基化。研究人员发现，亲脂性他汀类药物和合理设计的双膦酸盐可以通过靶向甲羟戊酸途径中的酶抑制下游代谢产物香叶基焦磷酸（GGPP）的形成。这一结果导致APCs中小型GTPases（例如Rab5）的香叶基化受阻，减缓了抗原从内体到溶酶体的运输并防止了抗原的快速降解。这延长了抗原保留时间，从而增强了抗原呈递。这些靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加抗体滴度和增强小鼠和猕猴的细胞免疫反应中显示出佐剂效果。 此外，最近的研究发现，雷帕霉素（mTOR）复合体，作为中心代谢调节因子，在调节免疫细胞中起着重要作用。首先，mTOR复合体可以调节浆细胞样DCs中I型干扰素的分泌。抑制mTOR复合体会严重减少产生的干扰素α。此外，mTOR复合体是效应T细胞扩增和生发中心B细胞反应产生的必需调节因子。除了mTOR，氨基酸传感器一般控制非压抑性2（GCN2）也在调节DCs等免疫细胞中发挥作用。研究表明，GCN2的激活导致DCs的自噬增强，从而增强了抗原呈递。这些结果表明，细胞代谢途径的酶或调节剂可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。 锰佐剂及其衍生物。最近，锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性。它们作为cGAS的激活剂，直接激活cGAS并诱导非规范的催化合成2'3'-cGAMP。通过这种方式，锰激活cGAS-STING先天免疫途径，诱导产生I型干扰素，增强抗原呈递和交叉呈递，促进抗体产生并增加CD8+ T细胞免疫反应的产生。据报道，Mn2+诱导的小鼠骨髓来源的DCs产生大量IFNβ和IFNα，并在体外实验中导致共刺激分子（例如CD80和CD86）和趋化因子（例如CCL2和CCL3）的显著上调。这表明Mn2+具有诱导DCs成熟和增强抗原呈递的佐剂活性。为了进一步验证其佐剂活性，研究人员将含有Mn2+的溶液与抗原一起注射到小鼠体内，发现它导致抗体滴度增加。为了防止Mn2+在溶液中聚集并失去佐剂活性，研究人员开发了一系列基于Mn2+的纳米佐剂来稳定Mn2+的佐剂活性。 例如，纳米级锰果冻（MnJ），它不仅具有作为免疫刺激剂激活cGAS-STING途径并诱导产生I型干扰素的能力，而且还作为递送系统携带抗原，从而产生强烈的体液和细胞反应。当通过鼻腔给药时，MnJ还作为粘膜佐剂诱导高水平的IgA抗体。王等人开发了另一种名为MnARK的锰佐剂。他们发现，即使在抗原剂量低5倍且注射次数减少的情况下，用含有MnARK佐剂的RBD疫苗接种的小鼠与用含有氢氧化铝佐剂的RBD疫苗接种的小鼠相比，显示出更大的中和假病毒（约270倍）和活冠状病毒（8倍）的感染能力。孙等人使用化学工程策略制造了一种基于Mn2+的纳米锰佐剂，称为nanoMn。以nanoMn为佐剂的冠状病毒疫苗在体内诱导了强烈的CD8+ T细胞免疫反应，并显示出良好的安全性。此外，一些其他基于Mn2+的纳米佐剂也显示出激活cGAS-STING途径和改善疫苗免疫反应的效果。这些结果表明，锰作为新型疫苗佐剂的开发具有巨大潜力。 许多具有不同特性的免疫刺激剂已在临床前和临床试验中得到评估。总体而言，靶向TLRs的免疫刺激剂在临床前和临床研究中仍然是最受欢迎的。另一方面，将多种PRRs激动剂结合起来，并将其配制成水包油乳液或使用其他递送系统进行装载，以增强其靶向APCs(NCT02126579, NCT01585350, NCT01008527, NCT02126579)的趋势日益增加。 4.2.正在调查的交付系统平台 近年来，随着工程材料科学的发展，基于工程材料的多种疫苗递送系统已经被开发出来。新型水包油纳米乳液、脂质纳米颗粒(LNPs)、聚合物纳米颗粒、类病毒颗粒(VLPs)、笼状蛋白纳米颗粒和无机纳米载体是一些重要的递送系统平台。不同类型的递送系统具有不同的机制和物理化学特性，相应地影响疫苗接种的效果。在这里，我们总结并描述了这些递送系统平台的机制、特性和应用。 新型水包油纳米乳液。Montanide ISA 51和Montanide ISA 720是两种在临床试验中测试的新型水包油乳液递送系统。Montanide ISA 51是用矿物油和甘露单油酸酯乳化的，而Montanide ISA 720是用非矿物油和甘露单油酸酯乳化的。此外，它们具有不同的油水比。这两种佐剂的作用机制是形成抗原库和缓慢释放抗原，以延长抗原的生物利用度。临床前和临床测试结果表明，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720佐剂增强了血清抗体的产生和细胞毒性T细胞(CTLs)的产生。目前，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720正在作为流感、疟疾、黑色素瘤和其他癌症疫苗的佐剂在临床试验中进行评估。此外，Montanide ISA 51在古巴获得了治疗性肺癌疫苗的许可。我们注意到，Montanide ISA 51和Montanide ISA 720通常用作乳化免疫刺激佐剂，以增强免疫刺激剂的效力。 脂质纳米颗粒(LNPs)。LNPs是一种多功能、非病毒性的纳米级脂质囊泡递送系统，由离子化脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的脂质组成。离子化脂质是LNPs的主要成分。磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，而聚乙二醇修饰有助于维持LNPs的稳定性。LNPs的作用机制主要包括(1)为抗原提供有效的货物保护并延长其生物利用度；(2)增加抗原的粒径以针对抗原呈递细胞(APCs)并促进其被APCs摄取；(3)通过膜融合促进抗原从内质网逃逸，从而引发CD8+ T细胞免疫反应。经过多年的研究，LNPs已被用于各种疫苗的递送，并显示出强烈增强体液和细胞免疫反应的能力。Alameh及其同事发现，LNPs通过诱导强大的T滤泡辅助细胞、生发中心B细胞、长寿命浆细胞和记忆B细胞的增殖，增强了对mRNA和蛋白质亚单位疫苗的体液免疫反应。Oberli及其同事在使用LNPs递送mRNA疫苗治疗B16F10黑色素瘤时，激活了CD8+ T细胞，导致肿瘤缩小并延长了小鼠的总体存活率。近年来，LNPs作为有前景的mRNA疫苗递送系统，在COVID-19疫苗、肿瘤疫苗、流感疫苗等的临床试验中得到了广泛测试。2020年，辉瑞的BNT162b2疫苗(商品名为Comirnaty)和Moderna的mRNA-1273疫苗(商品名为Spikevax)，这两种使用LNPs递送mRNA抗原的疫苗，获得了紧急上市许可。这两种mRNA疫苗在抗击COVID-19方面做出了重要贡献。 聚合物颗粒。聚合物颗粒通常分为天然聚合物和合成聚合物颗粒。它们通常通过缓慢释放抗原来发挥作用。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密复合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间保持与粘膜表面的接触，促使抗原持续刺激免疫细胞。这表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的一个有前景的递送系统。Sawaengsak等人通过将壳聚糖与三聚磷酸钠交联来封装灭活的流感病毒抗原，制备了一种纳米颗粒疫苗，并发现通过鼻内接种两剂这种疫苗的小鼠能够产生更多的抗原特异性抗体和IFNγ+ T细胞。这导致接种疫苗的小鼠100%抵御流感病毒攻击。最近，壳聚糖也被测试为Neocrown DNA疫苗的递送系统。鼻内免疫后，在小鼠体内检测到高水平的中和抗体，并且各种冠状病毒及其突变假病毒被有效中和。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活DNA感受器cGAS-STING途径诱导I型干扰素的产生，以促进CD8+ T细胞免疫。 合成聚合物颗粒通常具有比天然聚合物更高的可重复性和更可控的缓慢释放速率。PLGA，一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。在临床前研究中，Kim等人将疫苗成分(包括抗原和免疫刺激剂)封装在PLGA中，以增加DCs对抗原的摄取和呈递，这使得免疫刺激剂能够针对淋巴结中的DCs，而不是系统性传播。Koerner等人设计了一种封装抗原和dsRNA佐剂的PLGA颗粒。这种颗粒疫苗被发现显示出理想的释放曲线，增加了目标淋巴结的数量，并被DCs有效吞噬和呈递。最终产生了有效且持久的抗癌免疫反应。PLGA也被用来递送其他癌症疫苗和HBV疫苗，并增强它们的免疫治疗效果。目前，PLGA颗粒已作为癌症疫苗的递送系统在临床上进行了测试。值得注意的是，PLGA已被FDA批准用于药物递送。因此，我们相信基于PLGA的疫苗递送系统将在未来不久被批准用于人类。 类病毒颗粒(VLPs)。VLPs是由病毒衣壳蛋白的外套蛋白通过蛋白单体的自组装形成的具有固定形状的聚合物颗粒。VLPs的优异粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台。VLPs通常直径在20到100纳米之间，因此容易进入淋巴管并靶向淋巴结，由专门的APCs摄取。此外，由于它们高度重复和刚性的结构，VLPs可以在其表面展示多价抗原表位，因此可以广泛交联BCRs，从而刺激B细胞并诱导强烈且持久的抗体反应。目前，基于VLPs的疫苗已经成功并已经广泛上市，如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™，以及RTS, S VLP疫苗。VLPs不仅可以递送内源性病毒抗原，还可以递送通过化学偶联或基因融合修饰在VLPs上的异源抗原。例如，一种将HER2抗原表位附着在30纳米二十面体豇豆花叶病毒(CPMV)上的乳腺癌VLP疫苗，能够有效诱导抗原特异性反应和肿瘤保护。此外，肿瘤相关糖抗原MUC1可以共价连接到Qβ，这是一种自组装的二十面体壳VLP，直径为25纳米。这种MUC1 VLP疫苗诱导产生更高水平的特异性抗体，并延长了荷瘤小鼠的存活时间。几种基于VLPs的疫苗已成功进入临床试验，包括基孔肯雅疫苗、流感疫苗、Neocon疫苗、癌症、脑炎等疫苗。值得注意的是，由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCRs，即使在没有T辅助(Th)细胞的情况下，VLPs疫苗也能强烈激活B细胞。(表2) 笼状蛋白纳米颗粒。笼状蛋白纳米颗粒通常由一系列重复的图案组成，这些图案允许将抗原表位或抗原并入它们的亚单位结构中，使得这些并入的抗原表位或抗原在组装好的颗粒表面展示出来。与类病毒颗粒类似，笼状蛋白纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及适合淋巴结转运的最优尺寸。然而，与类病毒颗粒不同，笼状蛋白纳米颗粒是非病毒来源的。如热休克蛋白、蛋白金库和铁蛋白等笼状蛋白纳米颗粒已被广泛研究作为疫苗的递送平台。在上述蛋白纳米颗粒中，铁蛋白是最常应用的。铁蛋白是由24个亚单位自组装形成的具有八面体对称结构的蛋白，每个亚单位由四个α螺旋束组成。Kanekiyo等人通过将H1N1流感病毒的血凝素抗原与幽门螺杆菌来源的铁蛋白进行遗传融合，并将血凝素抗原插入铁蛋白亚单位并在其表面展示，构建了一种抗体滴度超过许可灭活疫苗10倍以上的纳米流感疫苗。这一设计的有希望的结果帮助开发了三种针对其他流感亚型的疫苗，这些疫苗现在正处于1期临床试验中。在上述三个1期临床试验中，NCT03186781试验已完成。结果显示，无论作为单独还是加强方案，流感疫苗H2HA-铁蛋白都是安全且耐受性良好的，并且可以产生广泛的中和抗体反应。最近，张和他的同事开发了一种基于铁蛋白的SARS-CoV-2纳米颗粒疫苗，该疫苗引发了有效的保护性免疫反应。此外，基于铁蛋白纳米颗粒的乙型肝炎疫苗可以递送乙型肝炎病毒抗原preS1到特定的抗原呈递细胞，激活强烈的免疫反应，并诱导高水平的持续抗体反应。此外，铁蛋白纳米颗粒可以有效递送肿瘤特异性抗原到淋巴结，导致特定的细胞毒性CD8+ T细胞反应和显著抑制肿瘤生长。值得注意的是，一种基于计算机设计的新型笼状蛋白纳米颗粒I53-50最近作为展示多价抗原的强大且多功能平台显示出令人兴奋的结果。基于I53-50的SARS-CoV-2疫苗展示了60个SARS-CoV-2刺突受体结合域在高度免疫原性图案中，产生了比对照疫苗高10倍的中和抗体滴度。同样，一种基于I53-50的纳米颗粒疫苗可以展示20个呼吸道合胞病毒DS-Cav1三聚体抗原，诱导的中和抗体反应比单独的DS-Cav1三聚体抗原高出约10倍。 无机纳米材料。金纳米颗粒是常用的无机纳米材料递送系统之一。由于金纳米颗粒的组成、尺寸、形态、疏水性、表面电荷、均质性和分布等物理化学特性可以通过材料合成和表面化学修饰精确调节以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米颗粒作为有前景的抗原递送系统被研究。金纳米颗粒通过(1)保护抗原免于降解和(2)形成合理粒径的纳米疫苗以促进直接将抗原运送到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。此外，Zhu等人报告称，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症体并促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。当金纳米颗粒用作SARS-CoV-2蛋白疫苗的佐剂时，也发现它们可以促进抗原特异性IgG的产生，但未能诱导足够的细胞免疫反应来对抗病毒感染。因此，为了扩大金纳米颗粒的使用，它们通常与其他免疫刺激剂联合使用或表面修饰，以增强它们的T细胞免疫反应。Xu等人制备了修饰有PEI的金纳米颗粒，发现这些纳米颗粒通过激活抗原呈递细胞显著促进了T细胞的增殖。Wang等人将重组流感病毒血凝素与金纳米颗粒偶联，然后将其与TLR5激动剂鞭毛蛋白偶联作为颗粒佐剂系统。用这种疫苗通过鼻内接种小鼠，发现它增加了抗原特异性IgA和IgG水平，并增加了细胞因子IFN-γ的分泌和CD8+ T细胞的激活。在临床上，使用金纳米颗粒作为佐剂的登革热和SARS-CoV-2疫苗正在测试中。 与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNs)也具有强大的装载能力和易于表面修饰的特点。修饰后的MSNs已被研究作为有效的疫苗递送系统。Lee等人通过将MSNs与氧化铁纳米颗粒组装，形成了具有超大介孔的空心MSNs。然后使用PEI进行表面修饰，使得修饰后的MSNs内部的空隙允许有效装载不同大小的各种模型蛋白，并能增强抗原呈递和交叉呈递。当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTLs的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，并提高了荷瘤小鼠的存活率。Li等人报告了一种以结核菌素纯化蛋白衍生物为佐剂的介孔二氧化硅/钙磷酸盐复合纳米颗粒的例子。结果表明，复合颗粒能够显著抑制肿瘤的生长。MSNs基材料也已在其他抗原的递送系统中进行了测试。值得注意的是，MSNs作为其他药物的载体已慢慢开始临床试验。由于MSNs在临床前研究中已显示出作为疫苗递送系统的效力，我们相信基于MSNs作为递送系统的疫苗也将在未来不久获得临床试验许可。 随着材料科学的发展，基于材料的递送系统迅速发展。现在可以通过递送系统保护疫苗成分并将其靶向到抗原呈递细胞或特定淋巴组织来增强疫苗接种的适应性免疫反应。然而，与免疫刺激剂相比，相对较少的递送系统进入了临床测试。这可能部分是由于递送系统的安全性问题尚未解决。因此，递送系统与宿主免疫细胞或器官之间的具体相互作用机制仍需要进一步研究以阐明其有效性和副作用，以便更好地平衡和控制两者之间的关系。 5.结论与展望 近年来，新型冠状病毒的出现和传播给全球公共卫生在疾病预防控制方面带来了巨大挑战，这再次凸显了疫苗开发的重要性。疫苗开发中不可忽视的一个话题是佐剂，因为它们能显著增强疫苗的适应性免疫反应。在综述的开头，我们总结了佐剂的作用机制，并对其进行了描述。根据作用机制，佐剂可分为免疫刺激剂和递送系统。免疫刺激剂通过靶向特定的模式识别受体(PRRs)激活抗原呈递细胞(APCs)，从而增强抗原呈递和共刺激信号，导致适应性免疫增强。递送系统通过延长抗原的生物利用度，将抗原靶向到APCs或淋巴结，增强APCs对抗原的摄取和呈递，从而增强适应性免疫反应。随后，本综述详细阐述了经典佐剂平台以及正在研究中的佐剂平台，希望为开发特定疫苗时合理选择佐剂提供信息。为了促进佐剂领域的更好发展，我们认为以下几点可能需要关注。 首先，选择正确的佐剂以协助抗原并改善免疫反应是新疫苗开发中的一个重要问题。然而，这个问题复杂且具有挑战性。这是因为免疫系统对给定疫苗和佐剂的反应高度依赖于具体情况，没有任何一种佐剂适用于所有情况下的抗原。结合本综述中对佐剂的描述，我们在此提出，在为新疫苗开发选择佐剂时，需要考虑以下因素。例如，给药途径（如肌肉内、粘膜、腹膜内）、所需免疫反应的类型（抗体偏向或CD8+ T细胞偏向，或两者兼有）、病原体类型、抗原类型（亚单位抗原或mRNA抗原）以及疾病阶段。此外，疫苗接种者的生物学特征也可能很重要，包括物种、种族、年龄、医疗史和遗传组成等。此外，佐剂的安全性和经济性也需要考虑。所有这些因素都可能影响疫苗佐剂的有效性。 此外，考虑到目前免疫刺激剂（主要是PRRs激动剂）和递送系统（尤其是纳米颗粒递送系统）的结合用于佐剂开发，以实现更高的免疫激活。在这里，需要仔细考虑一些问题。首先，通过我们对黄热病病毒疫苗的了解，我们知道同时激活多个先天受体比激活单个受体更有效。因此，非常需要阐明不同PRRs之间的信号交互作用，以更好地筛选更有效的PRRs组合。此外，鉴于抗原和PRR激动剂之间以及不同PRR激动剂之间的物理化学特性差异，递送系统需要更合理地设计，以足够灵活和兼容，同时递送多种疫苗成分。 最后，我们也想提及一点关于经典佐剂的问题。经典佐剂在历史使用中已显示出良好的生物安全性。此外，成熟的研发技术和完善的制造条件和设备为新疫苗的开发转化提供了相对容易的平台。然而，经典佐剂的缺点是它们的免疫刺激能力有限。鉴于此，迫切需要新佐剂来弥补经典佐剂的不足。然而，临床前开发和临床试验的成本和时间限制了新佐剂的转化。因此，我们认为，在促进新佐剂的开发和转化的同时，对经典佐剂进行一些性能优化和配方改进，如表面修饰、颗粒化，以及与其他提高其免疫效力的佐剂结合，可能是具有临床价值的研究课题。 在本综述中，我们系统总结了佐剂的作用机制，并根据其机制介绍和讨论了不同类型佐剂的特点和应用场景。我们期望这篇综述能为佐剂作用机制的进一步研究、现有佐剂的合理使用以及新佐剂的设计与开发提供参考价值。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：病毒样颗粒（VLPs）已成为生物学、医学甚至工程学中的关键工具。在最初用于解析病毒原子级结构之后，VLPs迅速被用于开发抗病毒疫苗，随后作为展示平台用于生成各种疫苗。最近，VLPs被用作纳米机器，将药物活性产品输送到体内的特定部位和特定细胞。在这里，我们专注于使用VLPs开发疫苗，其应用范围广泛，从针对病毒的经典疫苗到针对慢性炎症、疼痛、过敏和癌症的治疗性疫苗。在这篇综述中，我们穿越时间，从最新的实验性基于VLP的疫苗开发开始，以每年赚取数十亿美元的上市疫苗结束，为已经出现在地平线上的下一波预防性和治疗性疫苗铺平了道路。 1.病毒样颗粒（VLPs）的概念 病毒样颗粒（VLPs）是指由于表达编码病毒的衣壳、核心或包膜蛋白而自行组装成的颗粒，甚至是源自多层病毒的单层颗粒的制剂。由非病毒或人工蛋白形成的对称颗粒也可以被视为VLPs；在这种情况下，对称性指的是衣壳单元在几何上的组织方式。然而，这类VLPs不在本综述中讨论。此外，VLPs自行组装成模仿原始病毒的结构、大小和对称性的颗粒，但VLPs不能复制，因为它们缺乏基因组和复制酶。关于VLP结构、免疫原性和表达的详细描述，以及它们与疫苗接种的相关性，已在其他地方进行了综述。 乙型肝炎病毒的结构蛋白，主要是核心蛋白（HBc）和表面抗原（HBsAg），是最早在异源表达系统中表达的VLPs之一。这些努力促成了1986年首个针对HBV的重组人用疫苗的使用，该疫苗利用了表面抗原。接下来，引入了一种针对人乳头瘤病毒（HPV）的疫苗，该病毒会导致宫颈癌，使用的是L1结构蛋白。HPV疫苗在2006年和2007年上市。在此成功之后，2011年中国批准了一种针对戊型肝炎病毒（HEV）的疫苗。总的来说，使用VLPs作为传统疫苗平台具有几个优点，如表1所列。 当前的综述旨在通过首先描述一些基于VLP的疫苗在临床前开发和临床试验中的实例，最后描述目前市场上的基于VLP的疫苗，来讨论一些VLP疫苗开发的最新进展。 2.临床前开发 VLPs已广泛用作预防性或治疗性疫苗平台，用于多种疾病的预防。在本节中，我们旨在讨论一些VLP作为疫苗平台在以下疾病中成功诱导抗体和/或T细胞反应的临床前应用实例：传染病（讨论的实例：中东呼吸综合症、2019冠状病毒病（COVID-19）、流感、疟疾和获得性免疫缺陷综合症（AIDS）、炎症、过敏、疼痛、神经退行性疾病（阿尔茨海默病和帕金森病）和癌症）。 表1. 使用传统病毒样颗粒作为疫苗平台的优势 2.1.用于在预防性或治疗性方案中诱导抗体的基于VLP的疫苗 具有重复表面的颗粒可以最佳地刺激B细胞。20世纪70年代的研究发现，至少有12-16个表位间隔5-10纳米可以诱导最佳B细胞反应（例如，半抗原和人工聚合物），称为免疫子。随后人们意识到，典型的RNA病毒表现出多个免疫子的特征，因为它们通常直径为30纳米，有180个衣壳蛋白副本间隔约5纳米，如图1所示。使用这种颗粒的优势包括有效地交联B细胞受体，以及成功地被天然IgM抗体识别，导致经典补体途径的激活，引起抗原在滤泡树突状细胞（FDCs）上的沉积，增强生发中心（GC）的形成，并诱导持久和长寿命的浆细胞。因此，用全长抗原装饰并装载RNA的VLP被认为是激活B细胞和诱导长寿命B细胞反应的重要工具。此外，对于某些VLPs，特别是RNA病毒衍生的VLPs，可以装载RNA或CpGs（富含非甲基化CG基序的DNA寡核苷酸），分别在B细胞中激活TLR7/8或TLR9。这增强了IgG2a和IgA抗体反应，并增强了浆细胞形成和亲和力成熟。装载在VLPs中的RNA类型也很重要，细菌RNA是最有效的B细胞增强剂。下面，我们讨论了一些预防性和治疗性基于VLP的疫苗的例子，这些疫苗能有效地激发抗体反应，从而介导对疾病的保护。在目标抗原不能很好地诱导TH细胞反应的情况下（例如，自身分子或碳水化合物），针对VLPs的TH是必不可少的，因为它将介导分子间的相互作用，推动针对目标抗原的抗体反应。 图 1 当抗原以颗粒形式存在，并且表面表位每5-10纳米重复出现时，抗原处理得到促进。这种重复结构被免疫系统识别为病原体相关的结构模式（PASPs），这有助于B细胞的交联、天然IgM的结合、补体激活、高亲和力长寿命抗体的诱导以及生发中心的形成。使用 BioRender.com 创建。 2.1.1.传染病 冠状病毒病：冠状病毒是一类最近引起广泛关注的病毒，主要由于SARS-CoV-2引起的持续大流行。冠状病毒是一类具有单链正义RNA分子的RNA病毒，大约30 kB，编码包括四种结构蛋白在内的多种蛋白，如图2A所示：刺突（S）、膜（M）、核衣壳（N）和包膜（E）。人们已经做出了巨大努力，使用传统的VLP平台来开发针对这类病毒的疫苗。然而，除了一些针对SARS-CoV-2的候选疫苗目前正在I、II和III期临床试验中外，这些努力的大部分仍处于临床前阶段，如表2所总结。 图 2 A 一种典型的冠状病毒基于四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。B 通过基因融合将MERS-CoV的RBD（受体结合域）融合到优化的CuMVTT-VLPs中，开发马赛克VLP基础疫苗的策略，这些VLPs包含一个通用的TT表位和TLR7/8配体。使用 BioRender.com 创建。 表 2. 临床试验中的基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗列表。 中东呼吸综合症（MERS）：中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）在人类中引起严重的呼吸道疾病，并在十年前沙特阿拉伯首次注册大流行后，继续在全世界超过27个国家构成威胁。MERS的死亡率非常高，大约在40%的范围。MERS-CoV包含几种免疫原性蛋白，包括刺突（S）蛋白，该蛋白通过其受体二肽基肽酶4（Dpp4）介导病毒进入宿主细胞。因此，受体被用作疫苗开发中针对病毒的主要靶向剂。已经进行了临床前研究，使用不同的平台，包括VLPs，来开发针对MERS-CoV的疫苗。 我们最近优化了一种称为黄瓜花叶病毒样颗粒（CuMVTT）的植物源性VLP，通过遗传融合将破伤风毒素（TT）表位整合到其中，作为改进的疫苗平台。TT表位的整合被认为可以增强B细胞和TH细胞之间的相互作用，特别是在老年人中，这是由于存在预先存在的TT特异性记忆TH细胞。此外，CuMVTT-VLPs在表达过程中结合了来自大肠杆菌的RNA，作为TLR7/8激动剂。该平台在小鼠、猫、狗、兔子和马中被证明具有高度免疫原性。 使用这个新平台（CuMVTT），我们开发了一种基于MERS-CoV刺突蛋白的受体结合基序（RBM）与CuMVTT-VLPs遗传融合的可扩展疫苗（图2B）。所得的马赛克VLP基疫苗（mCuMVTT-MERS）在大肠杆菌中表达，允许自发包装TLR7/8配体。mCuMVTT-MERS诱导了高水平的特异性抗体，能够中和MERS-CoV/EMC/2012分离株，显示出转化为单峰驼和人类的有希望的潜力。Wang等人使用杆状病毒表达系统构建了MERS-CoV-VLP疫苗，并在恒河猴中进行了测试。开发的疫苗可以诱导特定的抗RBD滴度（ELISA）1:1280以及T细胞介导的免疫。研究表明MERS-CoV-VLPs具有出色的免疫原性，是很有前途的疫苗候选物。同一组还开发了一种表达MERS-CoV RBD的嵌合VLP基疫苗，利用犬细小病毒（CPV）的VP2结构蛋白。用嵌合疫苗免疫也在小鼠模型中诱导了RBD特异性的体液和细胞免疫。不幸的是，到目前为止，还没有基于VLP的疫苗进入临床试验。 严重急性呼吸综合症（COVID-19）：持续的COVID-19大流行已经压倒了全球的卫生系统。大约有三十种不同的疫苗已经获得不同国家的批准用于人类，大约有八十个候选疫苗正在进行临床开发，其中19个处于III期临床试验。然而，随着新的关注变体（VOCs）的不断出现，仍然需要开发有效、可扩展、负担得起和稳定的传统疫苗。 作为一个例子，我们通过将SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）化学偶联到我们免疫学优化的CuMVTT VLPs上，开发了COVID-19疫苗。我们利用了VLP表面最流行的修饰目标，其中包含可接近的赖氨酸残基（图3A）。展示的RBD识别病毒受体血管紧张素转换酶2（ACE2），确认了正确的构象结构，并产生了高度特异性的抗体反应，体外中和了SARS-CoV-2[29]和VOCs。类似的平台，CuMVTT-RBD，在小鼠模型中进行了鼻内给药测试。疫苗候选物引发了强烈的特异性系统性和粘膜IgG和IgA反应，有效中和了不同的VOCs。 图 3 以下技术的示意图。A 化学技术将表位结合到病毒样颗粒（VLPs）上主要基于修改VLP表面的化学基团。VLP表面的赖氨酸（Lys）残基（以红点显示）是最常用的修饰目标。表位应该被修改以包含一个自由的半胱氨酸（Cys），以适应所选择的化学结合方法。B 一种遗传融合技术，允许VLP衣壳蛋白和目标表位的共表达。遗传融合技术可能被认为是GMP翻译目的和扩大规模的更好选择[37]。使用 BioRender.com 创建。 为了转化目的，我们接下来设计了一种新的疫苗候选物，通过将SARS-CoV-2的RBM遗传嫁接到CuMVTT VLPs中，称为马赛克CuMVTT-RBM（图3B）。开发的疫苗可以大规模生产（1000升发酵罐运行>250万剂），在4°C下具有高稳定性，持续14个月，并且可以用于多次增强剂量。CuMVTT-RBM还在小鼠和兔子模型中诱导了高特异性抗RBD和抗刺突抗体滴度，对突变RBD和VOCs具有交叉反应性。由于高生产率和在4°C下易于储存，我们预计生产和运输成本将比当前基于RNA的疫苗低几个数量级。使用VLP AP205融合RBM也获得了类似的结果。此外，我们还产生了一个双马赛克颗粒，它诱导了针对S1中的RBM以及S2中的切割位点的中和抗体，这是第二个“次要”中和表位。 使用不同的技术，其他组也成功地使用VLPs开发了针对COVID-19的疫苗。例如，Tan等人设计并在小鼠模型中测试了RBD-SpyAP205疫苗，采用主要/增强方案。他们使用SpyTag/SpyCatcher技术在AP205-VLP平台上展示RBD。他们的结果显示，疫苗候选物可以引发中和抗体反应。 如上所述，SARS-CoV-2包含四种基本结构蛋白，可以在没有病毒基因组的哺乳动物细胞中组装成VLPs。Yilmaz等人描述了一种基于VLP的疫苗，表达六脯氨酸预融合稳定化的刺突（S-6p）以及SARS-CoV-2的N、M和E结构蛋白。该疫苗被吸收到明胶上，并与K型CpG ODN配方。使用HEK293细胞表达疫苗候选物，并产生了表达四种结构蛋白的囊泡VLPs。结果表明，在接种动物中有效产生了抗S、抗RBD和抗N IgG，并防止了肺病理。这种疫苗候选物目前正在进行II期临床试验；请参阅表2。 总的来说，基于重组蛋白的疫苗可以使用不同的宿主表达系统生产，如昆虫细胞、酵母、哺乳动物细胞和植物。最近，随着COVID-19大流行的发展，基于植物的疫苗开发在该领域变得更加被接受。最近发表的一项研究描述了基于植物的SARS-CoV-2疫苗的成功构建。作者将SARS-CoV-2的M、N和E基因克隆到双生病毒载体中，并在N. benthamiana植物中进行了瞬时表达。该过程产生了与原生SARS-CoV-2病毒粒子形状和大小相似的植物源性VLPs，但没有刺突蛋白。图4展示了使用烟草植物中的农杆菌渗透法的植物表达系统过程。作者指出，这样的VLPs将来可以作为携带S抗原的平台。 图 4 利用两个载体在烟草植物中进行共表达的农杆菌渗透法。使用 BioRender.com 创建。 Medicago公司也利用植物衍生的VLP生产方法开发了他们的SARS-CoV-2疫苗（CoVLPs疫苗；Covifenz）。CoVLPs是通过表达修改后的全长S蛋白产生的，该蛋白在植物细胞中表达后三聚体化，并移动到质膜中的脂质筏上，自发组装成从植物细胞表面“出芽”的VLPs。在猕猴中，这些VLPs在AS03佐剂存在的情况下诱导了强烈而持久的IgG反应，并增强了T细胞反应，从而保护灵长类动物免受病毒感染。CoVLPs目前正在进行晚期临床试验，并已在加拿大获得批准用于人类（表2）。 流感：流感病毒是一类属于Orthomyxoviridae科的包膜RNA病毒。病毒表面的糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是疫苗开发的主要靶点。HA由一个球形头部和一个茎组成。目前市场上的季节性流感疫苗针对HA的球形头部进行中和；然而，球形头部的快速抗原变异使得诱导的抗体的亲和力降低，这就需要每年或每两年开发新的疫苗。相反，HA的茎部更加保守；然而，由于球形头部的免疫优势和茎部的空间障碍，可能具有挑战性但并非不可能对茎部产生有效的免疫反应。针对NA，流感病毒的第二大蛋白，可以防止病毒进入宿主细胞，降低疾病严重程度，并抑制病毒复制。与HA和NA类似，M2蛋白是流感病毒的一个完整表面蛋白，M2的细胞外结构域在流感A中高度保守。基质蛋白（M）和核蛋白（NP）是病毒的主要内部蛋白。图5展示了流感病毒的结构和主要抗原。 图 5 一幅卡通插图，展示了流感病毒的主要抗原，包括：血凝素（HA）的球形头部和茎部，M1基质蛋白，M2离子通道，NA神经氨酸酶和核衣壳蛋白（NP）。使用 BioRender.Com 创建。 VLPs构成了一个有吸引力的、替代传统流感疫苗配方的疫苗平台，因为它们模仿了原生病毒但缺乏任何遗传物质。Buffin等人表明，使用哺乳动物细胞进行疫苗生产有许多优势，包括维持糖基化模式。他们开发了一种包含HA、基质（M1）和NA蛋白的VLP疫苗。表达的VLPs模仿了真正病毒的外表面，并显示出高度的免疫原性。 使用噬菌体Qβ，我们设计了一种针对HA球形结构域不同形式的VLP疫苗。球形结构域被化学偶联到VLP的表面。几乎所有疫苗候选物都在小鼠中诱导了保护性抗体，这些抗体也与变异株发生了交叉反应。有趣的是，HA球形结构域是在细菌中产生的，表明糖基化对诱导保护性抗体并非必需，因为小鼠中血凝抑制抗体的水平与经典疫苗获得的水平相似。接下来，这种疫苗在I期临床试验中进行了测试，结果显示这种完全由细菌生产的疫苗至少与经典病毒基础疫苗在人体中对抗体和T细胞的免疫原性一样。 另一种有趣的方法是在铁蛋白纳米颗粒上展示HA，这可以诱导针对H1N1流感病毒株的高水平广泛中和抗体。 由于HA蛋白非常多变且保守性差，基于保守结构的疫苗，如M2的细胞外结构域（eM2）或HA茎部，可能是HA和NA疫苗的一个有趣的替代品。事实上，早期通过遗传融合在HBcAg上展示eM2或通过化学偶联在Qβ上展示的实验，都能诱导能够保护免受多种流感A病毒株侵害的抗体。基于Qβ的M2e疫苗还测试了通过鼻内给药诱导保护性抗体的能力。使用这种途径的疫苗接种在小鼠的血清和肺部诱导了高水平的保护性IgG和IgA抗体。 与Qβ类似，源自噬菌体AP205的AP205-VLPs也通过遗传融合在N-末端展示M2蛋白，显示出高诱导特异性抗体的能力。在针对流感病毒的eM2基疫苗的背景下，有趣的是我们已经提供了证据，在小鼠流感模型中，携带原核RNA的VLPs，一种TLR7/8配体，并展示eM2比携带真核RNA的VLPs诱导了更好的保护性IgG亚类，突出了包装RNA的类型的重要性，并确认了抗-M2 IgG抗体的亚类对保护至关重要。 HA的茎部区域，比HA的球形结构域更保守，可能是另一个有吸引力的靶点。事实上，可以将茎部区域表达为适合化学偶联到VLPs的三聚体，并且当在HBcAg上展示时，它可以在小鼠中诱导强烈的IgG反应。此外，铁蛋白纳米颗粒上展示的HA茎部在小鼠中诱导了广泛的中和和保护性抗体。因此，针对流感病毒保守结构的基于VLP的疫苗候选物，HA或M2蛋白，可能是目前用于对抗季节性和未来流感大流行的流感疫苗的合适替代品。 作为诱导对流感亚型更广泛免疫覆盖的替代方法，已经开发了一种包含来自H5N1、H7N2和H9N2的3或4个全长HA蛋白的马赛克、多亚型VLP疫苗。多亚型VLP疫苗在雪貂中进行了鼻内测试，并显示出有效性和免疫原性。也有几种针对H9N2的基于VLP的疫苗被描述。 疟疾：WHO估计2020年大约有85个疟疾流行国家的241百万疟疾病例，与2019年的227百万病例相比。2016年至2020年间，苏丹的死亡病例增加了49%，报告的80%病例是由于恶性疟原虫（P. falciparum）。针对疟疾的疫苗可以分为三种方法：红细胞前期疫苗、血液期疫苗和阻断传播疫苗（TBV）。最先进的红细胞前期疫苗是RTS,S（MosquirixTM），一种基于VLP的疫苗，WHO在2021年10月推荐在高风险地区使用。RTS,S在下面的“市场上的基于VLP的疫苗”部分讨论。 Chan等人设计并开发了一种通过利用鸭HBV VLPs结合大Pfs230和Pfs25蛋白的阻断传播疫苗。该疫苗在与cGMP兼容的Hansenulla细胞系中表达。诱导的抗体能够识别配子体表面的原生蛋白，并在标准膜喂养测定中降低传播活性。同一组最近使用鸭HBV的小表面抗原（dS）在支架表面上更大一部分展示环孢子蛋白（CSP）。为了克服RTS,S的缺点，CSP只出现在疫苗表面的一小部分。Barillas Mury小组还专注于通过使用Spycatcher-SpyTag技术将Pfs47（一种在配子体表面表达的蛋白）结合到Acinetobacter噬菌体（AP205-VLPs）上，开发一种TBV。候选疫苗诱导了高抗体滴度，对Pfs47具有高亲和力，证实了其潜力。 炎症。病毒样颗粒（VLPs）已被广泛用于开发针对不同慢性炎症性疾病的治疗性疫苗。在这方面，已经在不同动物种类中为不同的临床前疫苗生成了概念验证。在昆虫叮咬过敏（IBH）中，马因蠓（Culicoides）叮咬引起的Ⅰ型/Ⅳ型过敏反应而遭受慢性过敏性皮肤炎，由嗜酸性粒细胞介导。白细胞介素-5（IL-5）被认为是嗜酸性粒细胞的关键刺激因子（图6）。 针对IL-5的单克隆抗体（mAbs）已成功用于治疗具有嗜酸性粒细胞成分的人类疾病，特别是嗜酸性粒细胞性哮喘。因此，可以预期通过疫苗降低IL-5水平会减少一般的嗜酸性粒细胞疾病，包括IBH中马皮肤的嗜酸性粒细胞浸润，扩展了早期在小鼠中的观察。为此，我们将马IL-5共价连接到我们的CuMVTT平台上，并在34匹冰岛马的安慰剂对照研究中测试了疫苗。疫苗未添加佐剂，未显示任何安全问题，但在89%的接种马中诱导了抗IL-5自身抗体，这转化为了临床改善。通过每年加强注射，有效性可以提高到100%，并在几个季节中保持，几乎完全消除了症状。这种方法可能被视为针对马的慢性炎症性疾病的突破性治疗，并有潜力在未来转化为人类。除了IL-5，IL-31在IBH以及人类、狗、猴子和小鼠的过敏性瘙痒中也起着重要作用（图6）。 图 6 IL-31 和 IL-5 是过敏性瘙痒的中心介质。通常，过敏原穿透皮肤，触发肥大细胞和辅助性 T 细胞 2 型（TH2）。IL-31 的分泌刺激周围感觉神经元，导致瘙痒。IL-5 是生成和激活嗜酸性粒细胞所需的主要细胞因子。使用 BioRender.com 创建。 与IL-5不同，IL-31主要促进瘙痒；然而，这种瘙痒导致慢性抓挠引起局部炎症，通常因感染而加剧。基于CuMVTT平台，生成并测试了一种IL-31马用疫苗。结果证明了疫苗的安全性，并揭示了方法的有效性，与安慰剂组相比，治疗组的临床评分显著降低。特应性皮炎是狗最常见的过敏性疾病，导致广泛抓挠和毛发脱落以及继发感染。在对屋尘螨敏感的狗中测试了展示在CuMVTT上的犬IL-31，这些狗在局部挑战过敏原后发展出典型的特应性皮炎症状。免疫的狗在免疫后显示出显著减少的瘙痒，这与诱导的特定抗体滴度相关。然而，在抗体滴度下降时注意到反应较弱，表明维持IgG滴度是未来改进的领域。进行的研究为狗特应性皮炎的有效治疗奠定了基础。还需要进行进一步的研究来增加和延长有效性，并且使用单克隆抗IL-31抗体的结果将指导针对人类IL-31的疫苗开发。除了IL-5，展示IL-13的VLPs也可能是广泛用于治疗特应性皮炎的另一种有趣的方式，并且应该与针对IL-4的VLPs一起更详细地探索。已经证明，针对促炎细胞因子IL-17A的mAbs对银屑病非常有效，银屑病影响全球1%至4%的人口。IL-17生物制剂的高成本限制了患者的获取。使用基于IL-17展示在Qβ或CMVTT上的疫苗针对小鼠的IL-17A，在心肌炎、类风湿性关节炎和多发性硬化症以及银屑病的临床前模型中证明是有效的。针对TNF-α的mAbs在一系列炎症性疾病中显示出疗效，如银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎。不幸的是，接受抗TNF-α治疗的患者可能在长期内产生抗药性，除了与治疗相关的高成本外。因此，开发针对TNF的疫苗可能是有吸引力的。已经描述了两种基于VLP的疫苗：一种疫苗基于HPV，使用生物素/链霉亲和素展示了TNF衍生肽，另一种基于全长TNF或在Qβ上使用SMPH化学和在TNF或肽中引入的自由Cys展示的TNF衍生肽。两种策略都诱导了能够中和TNF并消除胶原蛋白诱导的关节炎中的疾病的治疗性抗体。有趣的是，基于整个TNF连接到Qβ-VLPs的疫苗诱导的抗体能够中和跨膜和可溶性TNF。相比之下，基于TNF N-末端20个氨基酸（a.a.）的疫苗候选物（Qβ-C-TNF(4-23)）中和了可溶性TNF，但不是膜形式。尽管如此，两种疫苗都产生了能够保护小鼠免受类风湿性关节炎的特定抗体。相比之下，只有接种全长TNF（Qβ-C-TNF(1-156)）的小鼠显示出对单核细胞李斯特菌感染的增加敏感性以及潜伏的结核分枝杆菌的增强复活，而接受基于肽的疫苗的小鼠没有免疫受损。因此，仅针对可溶性TNF-α可能是一个有效的临床转化策略，可能克服机会性感染的风险。基于HPV和TNF衍生肽的疫苗与单独的融合肽相比，将抗TNF抗体水平提高了1000倍。如上所述，这种疫苗候选物还抑制了小鼠模型中胶原蛋白诱导的关节炎的发展。考虑到这些发现，进行了一项基于（Qβ-C-TNF(3-24)）的临床研究。研究显示了令人失望的结果；然而，基于小鼠TNF衍生肽的疫苗未能在人类中诱导TNF中和抗体（未发表）。 过敏。目前，特异性脱敏是治疗过敏的唯一可用方法。这种策略需要长期应用过敏原，并可能导致危及生命的过敏性休克。因此，能够通过几次注射缓解过敏症状的治疗性非反应原疫苗被认为是一种有吸引力的策略。对于治疗猫过敏，我们之前描述了一种治疗性疫苗，由主要猫过敏原（Fel d 1）与Qβ-VLPs偶联而成。单次注射能够诱导对1型过敏反应的保护。此外，过敏原诱导的系统性嗜碱细胞脱颗粒被特异性IgG抗体抑制，这一特性被FcγRIIb增强。将过敏原偶联到VLPs不仅可以增加过敏原特异性IgG反应，而且显著降低了过敏原引起过敏反应的能力，这是这种新的特异性免疫治疗方法的重要安全特性。在HBcAg上展示的过敏原也发现了类似的结果。为了快速转化，我们开发了一种替代策略，通过给猫接种疫苗来治疗人类的Fel d1过敏。使用基于CuMVTT的偶联疫苗，我们的结果表明在猫中具有耐受性，没有明显的毒性，疫苗还产生了强烈且持久的特异性IgG反应，具有高亲和力和中和能力。人类和猫预计将从这种治疗中受益，这将降低人类患哮喘的风险，并促进宠物主人与他们的猫的互动。Hirschberg等人研究了用屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，Der p1）致敏后以及用来自携带免疫优势表位Der p1的酵母逆转录转座子的p1蛋白的杂交Ty-VLPs疫苗接种后诱导的免疫反应。他们的结果表明，杂交疫苗取消了过敏原特异性IL-5的产生，并且这种效应是通过CD4+ T细胞介导的。在一项较早的研究中，当Der p 1衍生的肽与Qβ-VLPs化学偶联时，在人类中诱导了强烈的IgG反应。最近的证据表明，基于VLP的过敏原疫苗接种也可能对预防性干预具有吸引力。花生过敏是一种日益频繁的疾病，在美国尤其如此，目前尚无治疗方法。CuMVTT-VLPs被用来展示烤花生（Ara R）提取物或纯化的单一过敏原Ara h1或Ara h2，并通过化学偶联在花生过敏的小鼠模型中进行了测试。所有生成的疫苗的一剂或两剂可以保护对花生敏感的小鼠在用整个花生提取物挑战后的过敏反应。令人惊讶的是，所有三种疫苗候选物，即使是基于单一过敏原的，也能够提供对整个花生提取物的系统性和局部挑战的保护，并且所有疫苗都保护了在用复杂提取物口服挑战后胃肠道的嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润。这些结果表明，针对单一过敏原的疫苗接种可以提供对复杂过敏原混合物挑战的保护。抗体被确定为作用方式，因为纯化的IgG或甚至是单一的单克隆抗Ara h 2抗体的被动转移都能保护小鼠免受过敏反应。也研究了肥大细胞和嗜碱细胞上的FcγRIIb受体的作用，所获得的结果证明了这种抑制性受体在阻止对复杂提取物的过敏反应中的关键作用（图7）。简要地说，对单一过敏原的高水平特异性IgG抗体的诱导将导致免疫复合物的形成，这些复合物将结合FcγRIIb，从而抑制IgE介导的信号，这些信号也由其他过敏原触发。基于Ara h 2的疫苗的GMP材料已经生产出来，并且在美国已经获得了IND（表2）。疼痛。神经生长因子（NGF）对神经系统的早期发育至关重要，但在后期，它成为疼痛的重要介质。mAb tanezumab在几项人类研究中显示出有效性，目前正在注册中，还有许多其他mAbs正在开发中。因此，开发针对NGF的治疗性疫苗可能具有重大兴趣。事实上，我们已经展示了一种基于VLP的疫苗对NGF的强效效力，以控制类风湿性关节炎和骨关节炎中的疼痛。开发的疫苗是基于在CuMVTT VLPs上呈现小鼠NGF蛋白。然而，进一步的研究对于建立针对NGF的疫苗的安全性至关重要。 图7 一个卡通图示，展示了在花生过敏模型中抑制肥大细胞上FcγRIIb的机制。A 花生过敏原与结合在高亲和力Fcε RI上的IgE结合，导致肥大细胞脱颗粒和过敏反应。B 使用基于VLP的疫苗（CuMVTT-Arah2）进行免疫，诱导针对单一过敏原Ara h2的特异性IgG抗体，形成免疫复合物，该复合物结合到FcγRIIb上，抑制IgE介导的信号。通过BioRender.com创建。 2.1.2.神经退行性疾病 阿尔茨海默病：阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆的主要因素之一，这是一种随着年龄增长迅速增加的疾病。根据阿尔茨海默协会的数据，在美国，AD影响大约620万65岁以上的人，预计到2060年这个数字将增加到1380万。此外，目前的治疗费用，特别是护理援助，在2020年达到了美国的> 2500亿美元。针对淀粉样斑块的主动免疫是一种有前景的治疗策略。然而，目前还没有针对AD的批准的预防性或治疗性疫苗。在最初的突破性研究将针对AD的潜在疫苗置于聚光灯下之后，开发了一种基于Qβ和Aβ的N末端（CAD106）的VLP疫苗候选物。只选择了前6个氨基酸，因为在用原始疫苗候选物Aβ1-42配制的佐剂进行的临床研究中，诱导了自身特异性T细胞，这些细胞在高达10%的患者中诱发了脑膜炎性脑炎。临床前评估表明，在不使用佐剂的情况下用CAD106免疫可以在淀粉前体蛋白（APP）转基因小鼠中有效清除斑块，重现了使用佐剂配制的Aβ1-42获得的原始发现。此外，没有观察到Aβ特异性T细胞的迹象。随后在AD患者中的临床研究表明，清除斑块没有脑膜炎性脑炎或微出血的迹象。然而，目前没有明确的证据表明CAD106免疫的AD患者的性能有所改善。使用我们的免疫学优化的VLPs（CuMVTT-VLPs）以及Aβ1-6肽，我们建立了一种针对AD的疫苗。如前所述，CuMVTT包含一个TT表位，据提出由于对破伤风的预先存在的存储记忆TH细胞，可以增强老年人的反应。开发的疫苗可以用于预防性和治疗性环境。CuMVTT-Aβ1-6在年轻和老年小鼠中显示出高度的免疫原性，并且对破伤风的预免疫增强了对Aβ1-42的反应。实际上，在CuMVTT表面上展示Aβ1-6诱导的抗体表现出正确的特异性，因为免疫小鼠的血清可以像针对Aβ肽1-17的单克隆抗体一样有效地识别AD斑块在死后大脑切片上。最近的努力利用HBc为特定患者生产个性化的AD疫苗。研究人员通过将SpyCatcher插入截断的HBc的主要免疫优势区域（MIR）构建了一个平台，该平台可以组装成能够轻松结合不同SpyTag表位的均匀VLPs，例如Aβ（1-6），Aβ（1-15），cAβ（1-7）cEP1和cEP2来自β-淀粉样单体或寡聚体，以及来自tau蛋白的T294，pTau396-404和pTau422。一项研究的结果表明，HBc-S-pTau422在转基因小鼠中减轻了认知缺陷以及神经病变进展。对于替代的Qß-，HPV-和逆转录病毒颗粒-基础疫苗候选物也观察到了强大的免疫原性和良好的安全性。Aβ可能不是治疗AD的唯一靶标。事实上，Maphis等人报告了针对tauopathies的治疗性疫苗的开发，包括AD。在苏氨酸181处磷酸化的Tau肽被化学连接到Qβ-VLPs（pT181-Qβ）。该疫苗诱导了一种强大而持久的特定抗体反应，能够识别死后的人脑切片，并能够减少转基因小鼠的皮层和海马中的可溶性和不溶性pTau。因此，针对Aβ或Tau或两者的组合的疫苗可能是AD治疗或甚至预防发展的有希望的途径。 帕金森病：帕金森病被认为是第二常见的神经退行性疾病，与运动障碍、认知障碍和进行性残疾有关。该病影响60岁以上的1%的人。中和有毒的α-突触核蛋白（a-syn）寡聚体被提出在阻止寡聚体和聚集体在大脑中的传播以及细胞毒性方面发挥作用。Doucet等人提出了一种基于将针对α-syn C末端区域的短肽偶联到Qβ平台的主动疫苗策略。所获得的结果证明了疫苗在野生型小鼠和α-syn转基因小鼠中诱导高抗体滴度的能力，并识别了Lewy体。尽管诱导的抗体能够特异性地识别溶液中的寡聚α-syn，但疫苗未能在转基因小鼠模型中产生显著变化，与对照条件相比，对行为表型没有影响。缺乏临床前疗效是否是由于使用的特定小鼠模型尚不清楚，这些结果表明需要优化的临床前模型，这可能是一个具有挑战性的任务。癌症。已经在几种肿瘤中研究和使用了抗体，并已被证明是抗肿瘤免疫的重要参与者。抗肿瘤抗体的效应功能包括诱导凋亡、干扰肿瘤信号通路、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）或激活补体。尽管大多数抗肿瘤抗体以mAb的形式被动给药，但疫苗可能是主动诱导抗肿瘤抗体的有希望的替代方案。然而，大多数针对癌症的疫苗旨在诱导T细胞而不是抗体，下面描述的疫苗可能更准确地被描述为“利基候选物”。诱导抗体的癌症疫苗的突出例子是基于AP205的，它已经在临床前用作治疗性疫苗的平台，用于诱导癌症治疗的抗体。作者使用SpyTag/SpyCatcher技术，用人类表皮生长因子受体-2（HER-2）装饰VLPs，这是一个经典的mAb治疗靶标。使用这种策略，他们能够克服B细胞耐受性，并诱导强烈的抗HER2 IgG抗体，阻碍了表达HER-2的小鼠乳腺癌肿瘤的进展。此外，三阴性乳腺癌肿瘤中xCT蛋白的过度表达已被用作靶表位，并插入到MS2-VLPs中。该疫苗引发了强烈的特定抗IgG2a反应，阻碍了肿瘤生长并防止了在已建立的4T1小鼠模型中的转移。与人类乳头瘤病毒相关的癌症占所有恶性肿瘤类型的约4.5%，并且已被证明每年影响超过50万人。与HPV相关的癌症包括宫颈癌（99.7%）和阴道、肛门、阴茎、外阴和口咽的鳞状细胞癌。HPV的衣壳L1蛋白是一个高度免疫原性表位，针对已获得许可的预防性HPV疫苗（稍后在4中讨论）。结构L1蛋白可以自组装成VLPs，形态上类似于亲本原生病毒（图8）。小衣壳蛋白L2是HPV类型中高度保守的蛋白质，因此可以被认为是开发下一代泛HPV疫苗的合适靶标。然而，基于L2的疫苗已被证明比基于L1的疫苗诱导的中和抗体水平低。Schellenbacher等人构建了一种表达L1和L2蛋白的嵌合HPV疫苗（HPV16 L1-HPV16 L2（嵌合体17-36）），并且佐剂化的VLPs诱导了针对与HPV16不同的HPV类型的广泛谱系中和抗体。这些发现表明，这种嵌合疫苗可能对由高风险、低风险和beta HPV相关疾病引起的粘膜感染提供保护。关于RG1-VLP作为另一种使用L2作为疫苗候选物的尝试的临床研究即将开始。RG1-VLPs包含HPV16L2的保守氨基酸17-36，这些氨基酸紧密融合在HPV16L1-VLP的免疫优势表面环中。小动物模型的免疫实验已确认对医学上相关的高风险和低风险HPV类型具有交叉保护。AAVLP-HPV是另一种嵌合疫苗，旨在展示L2表位，来自HPV16和31，显示在腺相关病毒衍生的VLPs上。用这些VLPs在Montanide佐剂中配制的小鼠和兔子的免疫诱导了特定的抗体滴度，能够在伪病毒感染测定中中和几种HPV类型的感染。这种嵌合疫苗已成功完成I期临床试验（表2）。 图8 人乳头瘤病毒（HPV）的L1和L2衣壳蛋白 A. HPV的L1衣壳蛋白是一种高度免疫原性表位，能够组装成VLPs，例如（已获得许可的预防性基于HPV的疫苗：Cervarix®、Gardasil®和Gardasil9®）。B. 一种表达L1和L2两种衣壳蛋白的嵌合HPV疫苗。通过BioRender.Com创建 2.2.病毒样颗粒（VLPs）治疗性疫苗用于诱导治疗性方案中的保护性T细胞 带有T细胞表位的VLPs是有效的工具，可以诱导TH1以及细胞毒性T细胞淋巴细胞（CTLs），尽管VLPs不包含遗传物质。外源性抗原优先进入主要组织相容性类II（MHC-II）途径以启动CD4+ T细胞。然而，以前的研究表明，颗粒状的VLPs可以被APCs成功摄取并通过交叉呈现进入MHC-I途径。通过与抗原处理相关的转运蛋白（TAP）独立的内体途径或TAP依赖的内体至细胞质途径可以实现MHC-I的装载。将VLPs与APCs的刺激因子结合使用可以产生CTL和TH1反应。在小鼠中测试的所有TLR配体中，刺激TLR3、TLR7/8尤其是TLR9最为有效，而其他TLRs，如TLR2和TLR4，对刺激CTL反应的能力较弱。此外，装载有TLR配体的Qβ-VLPs，如RNA或CpGs，能够有效地诱导CTL和TH1反应，但如果装载了多聚谷氨酸或为空载则无法做到这一点。出乎意料的是，我们已经证明VLPs和TLR配体可以分开传递，无需物理连接，只要TLR配体以颗粒形式配制，就可以在体内产生CTL反应。形成沉积物的佐剂可能提供进一步增强诱导的T细胞反应的机会。 2.2.1.癌症 由人乳头瘤病毒（HPV）引起的癌症：预防性HPV疫苗旨在针对晚期蛋白L1和L2产生体液反应。因此，这样的疫苗在治疗环境中不会显示出疗效，因为在病毒感染的增殖细胞中没有检测到病毒衣壳蛋白。HPV治疗性疫苗的主要目标是消除癌前病变和持续的HPV感染。早期E蛋白（E6和E7）是转录因子，负责推动感染细胞的增殖。因此，这两种蛋白在肿瘤细胞中高度表达，使它们成为治疗性疫苗的理想靶标。在宫颈上皮内瘤变（CIN）自发消退中检测到基质中CD4+：CD8+比率的增加，CD4+ T细胞对E2蛋白的反应以及E6和E7特异性CD8+ T细胞的浸润。已经采取了几种不同的临床前方法来开发HPV治疗性疫苗，包括使用VLPs。一些研究设计了一种针对肿瘤蛋白E6和E7的基于T细胞的疫苗，其他研究开发了一种包含衣壳和肿瘤蛋白的嵌合疫苗。例如，Greenstone等人展示了HPV-VLPs通过生成包含主要衣壳蛋白L1加上整个非结构性E7或E2融合到小衣壳蛋白L2中的嵌合VLPs来诱导细胞介导的免疫的能力。HPV16 L1/L2-HPV16 E7嵌合VLPs保护了野生型和MHC-II缺陷小鼠（缺乏Th细胞）免受TC-1肿瘤挑战。另一项研究使用修饰后的兔出血病病毒VLP（RHDV-VLP）作为疫苗平台，装饰有E748-57肽。使用表达E6和E7抗原的TC-1细胞系在小鼠模型中测试了开发的疫苗。作者将疫苗与抗CTLA-4检查点抑制剂或用于Treg耗竭的抗CD25结合使用。结果表明肿瘤负担减少了50%，生存率显著提高。我们已经证明，展示或与E7蛋白混合的Qβ-VLPs可以诱导对肿瘤生长的保护并增强超过80%的接种小鼠的生存。另一项研究生成了一个将长E7蛋白片段结合到禽传染性肿瘤病病毒VLPs中的VLP-E7疫苗。在表达人类HLA-A2的人源化转基因小鼠中，在治疗环境中接种了TC1/A2癌细胞系，测试了VLP-E7疫苗。结果表明完全根除了已建立的肿瘤以及持久的免疫反应。 黑色素瘤：一些临床前实验已经探索了使用VLPs作为针对黑色素瘤的治疗性疫苗的疗效。装载A型CpGs的Qβ-VLPs（Qβ(G10)，也称为CMP-001）不包含任何肿瘤抗原，并且在肿瘤内注射后已测试了抗黑色素瘤反应。Sabree等人证明CMP-001诱导形成抗Qβ抗体，这些抗体使Qβ VLPs包被，随后被浆细胞样树突状细胞（pDCs）摄取，导致细胞因子分泌和抗肿瘤T细胞反应。CMP-001已在临床试验中使用，如表2所示。在最近发表的一篇论文中，Melhim等人表明，CMP-001单独或与pembrolizumab（PD-1抑制剂）联合用于晚期黑色素瘤患者是可耐受的，并且能够逆转抗PD1抗性治疗，具有持久且强烈的临床反应。使用化学偶联方法开发了Qβ(G10)MelanA疫苗，并在II-IV期黑色素瘤患者的I/II期研究中证明了潜在的疗效。超过60%的接受治疗的患者产生了特定的效应和记忆T细胞反应以及高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-2细胞因子产生。最近，我们已经将我们的努力转向开发针对患者肿瘤特异性表位的个性化VLPs疫苗，以实现有效的T细胞反应。鉴于针对单一抗原允许肿瘤细胞通过下调这单一抗原来复发，我们设计了一种在具有挑战性的移植小鼠黑色素瘤模型中的多靶标疫苗。我们的结果表明，针对生殖系和突变表位可以增强诱导的抗肿瘤反应。我们还测试了微晶（MCT）佐剂与CuMVTT-p33疫苗结合的沉积效应。结果表明MCT将反应极化为TH1并增强诱导的抗肿瘤反应。 乳腺癌：由于我们已经在黑色素瘤中展示了使用多靶标疫苗策略的增强疗效，我们已经将这些发现扩展到一个侵袭性转移性乳腺癌小鼠模型。为了进一步提高主动免疫疗法，我们设计了一种个性化的多靶标疫苗，使用Qβ-VLPs包装TLR9配体，通过整合基于质谱的免疫肽组学和全外显子测序，展示延长的新生抗原。与短新生抗原的疫苗接种相比，长新生抗原的疫苗接种更有效，并且抗肿瘤效应可以显著重新极化肿瘤微环境，减少肺转移并增强生存。 获得性免疫缺陷综合症（AIDS）。自从20世纪80年代作为获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的病原体被发现以来，HIV已成为全球主要的公共卫生问题。尽管抗病毒药物能够控制病毒，但迫切需要一种针对HIV的治疗性疫苗，以消除接受抗逆转录病毒治疗的患者中的长期持久性HIV。对HIV-1发病机制的了解表明，T细胞免疫在控制HIV感染的急性期中起着至关重要的作用，长期研究表明CD8+ CTL反应与HIV复制的控制和感染清除有关。1996年，Wolf等人构建并表达了一种嵌合HIV-1 VLP疫苗。将gp120的第3个可变区域（V3）或CD4结合域插入Pr55gag-VLPs中；这种插入没有干扰VLPs的组装能力。使用不同的途径和不同的嵌合Pr55gag/V3 VLPs对小鼠进行免疫，没有使用任何佐剂。结果表明对V3区域内已知表位有强烈的MHC-I (Dd) CTL反应。此外，已经证明Gag-VLP疫苗能够在处理的单核细胞来源的树突状细胞（DCs）中诱导干扰素α（IFN-α），APOBEC3G和APOBEC3F蛋白mRNA表达增加，这些蛋白已知是HIV-1的抑制剂。此外，包含HIV V3环的酵母衍生VLP已被证明可以被小鼠树突状细胞处理，与MHC类I相关呈递。 3.临床开发 目前有几种预防性和治疗性的基于VLP的疫苗处于临床开发阶段。我们在表2中列出了与上述讨论的疾病相关的临床试验。 4.市场上的VLP疫苗 4.1.人乳头瘤病毒疫苗 Gardasil®是首个获批作为针对人乳头瘤病毒（HPV）的预防性疫苗。Gardasil9®覆盖9种而非4种血清型，已经在美国取代了Gardasil®。Gardasil®、Gardasil9®和Cervarix®疫苗是L1-HPV表位的重组制造VLPs（表3）。然而，Gardasil9®包含比Gardasil®更大的总抗原负荷，以补偿不同共同配方VLPs的数量增加。Gardasil可预防4种HPV（6、11、16和18型），而Gardasil9®可预防另外5种（31、33、45、52和58型）。这些疫苗的设计目的是激发病毒中和抗体，以预防最初的HPV感染。这些上市疫苗已被证明能提供100%的预防宫颈癌前病变和生殖器疣的发展的保护效果，预计保护效果至少持续4.5年。HPV疫苗是安全的，局部不良反应如肿胀、疼痛和发红大多是轻度和短期可逆的。全身反应很少见，可能涉及恶心、发烧、头痛和疲劳。目前酵母或昆虫表达系统中的许可HPV疫苗的成本可能被认为是全球广泛实施的一个障碍。最近在大肠杆菌中表达低成本HPV疫苗的努力已成功。Cecolin®是一种针对HPV16和HPV18的双价L1-HPV疫苗，已成功在大肠杆菌中表达，并在小鼠、山羊和兔子中显示出高度免疫原性。2019年12月30日，Cecolin®正式获得国家药品监督管理局的批准，于2020年5月在中国上市。2021年10月，WHO为Cecolin®授予了预认证，使其成为首个获得WHO预认证的中国制造的HPV疫苗。 表3. 市场上目前批准的基于VLPs的HPV预防性疫苗列表 4.2.乙型肝炎病毒（HBV）疫苗 有几种针对可能危及生命的疾病乙型肝炎的HBV疫苗可供商业使用。HBV感染可能导致慢性感染，并使患有肝硬化和肝癌的人处于危险之中。现有的疫苗对HBV显示出98-100%的保护。 第一代HBV疫苗于1981年获得批准，基于Bulmberg的工作，他因发现澳大利亚抗原（现称为乙型肝炎表面抗原（HBsAg））而获得诺贝尔奖，该抗原在感染者的血清中。独特的疫苗是基于直接从人类携带者中获得HBsAg。然而，由于生物安全问题，这种血液来源的疫苗在1986年被改进的重组HBsAg版本所取代，使用重组DNA方法和在酵母细胞以及目前也在哺乳动物细胞中生产。第二代HBV重组疫苗最初是使用酵母系统生产的。现有的酵母衍生的HBV疫苗基于HBsAg单体自组装成VLPs。几项研究表明，纯化的酵母衍生的HBsAg呈现为∼22 nm VLPs 。形成的HBsAg VLPs中60-70%由HBsAg单体蛋白组成，其余由脂质组成。总的来说，形成的VLPs具有高度免疫原性，能够激发强大的中和抗体，并且是一种安全的疫苗，不含任何病毒基因组。使用单一抗原（HBsAg的小S抗原）进行疫苗接种有一些限制，包括实现血清保护所需的时间延长。30-40%的成年人在接种2剂疫苗后达到血清保护，但即使在接种第3剂后，也可能有10%的人无法达到这一点。最近FDA批准的第三代HBV疫苗PreHevBrio表达三种HBV表面抗原，S、pre-S1和pre-S2，并在哺乳动物细胞中生产。III期临床试验证实了疫苗在老年人和慢性病患者中的高免疫原性。研究得出结论，在第3剂后4周，疫苗在血清保护率上与单一抗原疫苗相比没有劣势。接种2或3剂后的血清保护率高于接种经典HBV疫苗（对照组）。超过90%的参与者在接种2剂后报告了快速诱导的保护性抗体轮廓；此外，观察到良好的安全性。表4总结了不同HBV疫苗的可用性，表5概述了第二代和第三代HBV疫苗之间的主要差异。 表4. 市场上一些基于VLPs的FDA批准的HBV疫苗 表5. 第二代与第三代乙型肝炎病毒（HBV）疫苗的比较 4.3.乙型肝炎病毒（HEV）疫苗 乙型肝炎病毒是印度、中国、肯尼亚、苏丹、尼泊尔和孟加拉国等国家超过50%的急性病毒性肝炎的罪魁祸首。据估计，全球每年约有3500万例病例发生，平均死亡率为0.2-4%，在孕妇中高达25%。HEV是一种无包膜病毒，大小为27-35纳米，分为四种不同的基因型，I、II、III和IV。I型和II型仅限于人类，而III型和IV型感染其他哺乳动物，然后可以将病毒传播给人类。尽管存在这种遗传多样性，但所有HEV都属于同一血清型。病毒的正义链RNA基因组包含三个开放阅读框，其中一个编码病毒衣壳蛋白，是中和抗体的主要靶标。HEV239（Hecolin®）于2012年在中国获得批准作为针对HEV的疫苗。该疫苗是由厦门万泰沧海生物技术有限公司（中国）开发的基于重组VLP的疫苗，编码基因来自ORF2 HEV基因型I菌株。在大肠杆菌表达系统中产生的重组蛋白由368-606个氨基酸组成（p239）4-5，经过复性并自组装成20-30纳米大小的VLPs。形成的VLPs在小鼠和恒河猴中具有高度免疫原性。Hecolin®在人类中显示出良好的安全性和100%的疗效。目前正在进行研究，以评估疫苗在高风险群体中的安全性和有效性，以评估潜在的全球使用，正如WHO推荐的那样。 4.4.疟疾疫苗 RTS,S/AS01（Mosquirix™）被认为是迄今为止针对疟疾红细胞前阶段的最先进疫苗。单价重组疫苗针对环孢子蛋白（CSP）蛋白的片段，这是P. falciparum包膜蛋白的主要成分。CSP蛋白片段被融合到HBsAg作为载体。在RTS,S中，R：代表19个中心串联重复，T：代表C末端的T表位，第一个S代表修饰的表面抗原，第二个S指的是未修饰的表面抗原，允许CSP在粒子表面的马赛克HBsAg颗粒上呈现。该结构组装成VLPs，并与AS01配制而成，AS01是一种有效的佐剂。RTS,S/AS01已在III期临床研究中进行了评估；然而，结果仅显示部分保护，并存在一些令人担忧的安全问题，特别是年轻女性可能增加的死亡率。RTS,S马赛克颗粒包含与CSP-HBsAg融合蛋白相比，有4倍摩尔过量的未修饰HBsAg亚单位。相比之下，下一代RTS,S/AS01疫苗（R21）仅包含CSP-HBsAg融合蛋白，R21因此在表面显示更多的CSP表位，并能在小鼠中诱导无菌保护。正在进行几项晚期临床试验，以测试下一代R21的安全性和有效性，并提高第一代RTS,S的疗效（表2）。2021年10月6日，WHO建议在撒哈拉以南非洲地区以及P. falciparum传播中等至高的地区广泛使用RTS,S/AS01疫苗。 5.结论 VLPs表现出高度免疫原性与卓越的安全性的独特组合，使它们成为疫苗设计的理想平台。自从首次描述基于VLP的HBV疫苗以来，该领域已取得显著进展，VLPs现在是许多上市疫苗的基础，如针对HPV和HEV的疫苗。关于使用VLPs作为展示平台的非常激动人心的新颖发展已经实现，不仅用于病原体衍生的抗原，如针对疟疾免疫的HBsAg上展示的CSP，还用于自身分子，如用于针对阿尔茨海默病的疫苗的Aβ或用于治疗伴侣动物和人类的慢性疾病的细胞因子。因此，我们预计未来几年将有几种新产品，包括针对人类和动物的产品，将进入市场。 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。