Lactic acid

这篇文章于2022年发表在《Cell》,主要总结了细胞生长每个阶段（指数生长、稳定期和衰退期）的分解代谢和合成代谢的主要发现，重点关注主要代谢途径（糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环）和影响这些回路的生物分子家族（核苷酸、氨基酸、脂质和富含能量的代谢物）。此外，还比较了在不同实验环境中获得的结果（各种细胞系、克隆、培养基和培养策略，包括分批、补料分批和连续），以确定在生物反应器中培养过程中影响CHO细胞代谢组的常见趋势。1.指数生长期：高营养吸收使细胞生长      指数期的特征是细胞培养物中活细胞密度（VCD）急剧增加。这种生长是可能的，因为培养基中有营养物质，从中分解代谢产生能量，各种底物用于生物质生成。本节将介绍这两个步骤，图1总结了主要代谢趋势。第1步：碳源分解代谢为细胞产生能量，因为营养物质大量可用MFA研究表明，葡萄糖占总碳流入量的70%，而培养基中的丙酮酸在培养开始时作为额外的碳源，其中80%的葡萄糖在培养的第一天被消耗。同样，另一项研究得出结论，葡萄糖占进入碳的65%，其中10%来自谷氨酰胺，25%来自其他氨基酸。据报道，该研究的贡献也较低（40-50%），尽管这部分可以解释为葡萄糖消耗量会因不同的培养条件而变化，具体来说，在目前的情况下，培养体积。除了这些细微的差异之外，出版物总体上同意葡萄糖是生长的主要碳源这一事实。     细胞吸收的葡萄糖可以被磷酸化并供应到糖酵解途径以产生ATP或磷酸戊糖途径（PPP），这有助于氧化还原稳态和生物合成。大量研究报告称，在指数期，葡萄糖主要通过糖酵解被氧化，从而导致丙酮酸的形成。形成的丙酮酸的很大一部分转化为乳酸，乳酸被分泌并使培养基酸化，导致生长抑制，其余的用于供应TCA循环 .这种代谢状态以前被认为是Warburg效应，是消耗高水平葡萄糖的癌细胞的特征。根据葡萄糖的势能负荷，可以认为，从某种意义上说，碳通量被细胞“浪费”了，因为它不针对TCA，而是产生高乳酸水平。这降低了C的产生生物质生成所必需的前体。      据估计，75%的葡萄糖消耗用于贴壁和悬浮生长的CHO细胞培养物中的乳酸产生。然而，在灌流培养中，已测量到更平衡的比例，估计55%的丙酮酸产生乳酸，45%进入TCA循环 。相反，对分批/补料分批培养的MFA研究报告称，25-40%的胞质丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下转化为乳酸，这种效应在CHO WT细胞和产生蛋白质的CHO衍生物中都观察到，而50-60%的丙酮酸池被引导到TCA循环中。这些差异可能归因于不同的媒体构成。例如，已经表明培养基中提供的谷氨酰胺可以强烈影响葡萄糖和丙酮酸的代谢 。研究还表明，抗凋亡基因bcl2的过表达会影响丙酮酸进入TCA的比例，从而影响乳酸的形成。许多研究还分析了高生产者和低生产者克隆之间的差异。某些研究表明，（i）高生产者具有更高水平的细胞内NADH，表明与TCA循环和/或氧化磷酸化相结合的糖酵解水平更高，以及（ii）高生产细胞系和低生产细胞系之间在葡萄糖消耗和乳酸形成的时间存在一些差异，与低生产者相比，高生产者在培养中更早地消耗乳酸。另一项研究仅报告了微小的差异，这表明需要进一步研究来阐明生产力与葡萄糖代谢的早期阶段如何相关 。      在丙酮酸分支点，估计约75%的丙酮酸来自糖酵解，而25%来自苹果酸酶对苹果酸的转化，一小部分来自丝氨酸或半胱氨酸等氨基酸的降解。丙酮酸通量在转化为乙酰辅酶A后，总共90%会进入TCA，其余10%在被丙酮酸羧化酶转化为草酰乙酸后进入TCA循环。     在指数期后期，测得葡萄糖消耗和糖酵解活性减少了1/3，有利于乳酸摄取。有趣的是，通过向培养基中添加丙酮酸和氨基酸可以延长指数期 。     磷酸戊糖途径（PPP）代表了葡萄糖氧化的另一种途径，可再生 NADPH，这有助于细胞质中的氧化还原平衡，以及参与生物合成反应（特别是核苷酸生物合成）的C5糖。磷酸戊糖途径（PPP）活性已在指数期进行了表征，并且似乎它对总碳通量的贡献取决于实验模型。在灌注模式下，葡萄糖进入PPP的比例估计为20-40%，而在分批/分批补料条件下进行的研究报告称，葡萄糖对该途径的贡献非常低或可以忽略不计。这与一项关于补料分批培养的研究相矛盾，该研究报道80%的葡萄糖参与PPP通路，占该生长期胞质NADPH生成的大部分。因此，这些研究报告了糖酵解和PPP之间在葡萄糖利用方面的主要差异，这可能反映了培养基组成的变化，包括谷氨酰胺水平、补料分批培养中的培养基供应、重组蛋白生产中的特异性克隆或产量。      由葡萄糖或PPP中间体物质喂养的糖酵解氧化反应导致丙酮酸的产生，丙酮酸可以作为乙酰辅酶A进入TCA循环。如上所述，TCA循环通量在指数期很低，大部分丙酮酸用于产生乳酸。在初始细胞培养过程中，任何过量的葡萄糖都可能用于通过乳酸产生来维持能量，而不是用于TCA循环和氧化磷酸化。还有人假设，由于将柠檬酸盐转化为α-酮戊二酸（AKG）的能力降低，转化的CHO细胞系中的TCA周期可能受损。由于酶容量有限，苹果酸和草酰乙酸之间可能存在另一个瓶颈，这将导致苹果酸-天冬氨酸穿梭受限，因此在胞质溶胶中NAD再生。此外，草酰乙酸供应的这种限制阻止了线粒体丙酮酸掺入TCA循环，导致丙酮酸转化为细胞质中的乳酸。如前所述，尽管乳酸的产生量很大，但TCA是活跃的，主要碳源来自葡萄糖氧化成丙酮酸，其余来自谷氨酰胺和必需氨基酸。有趣的是，已经表明，TCA中间体（琥珀酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐和富马酸盐）的分泌代表了指数生长期和固定期期间大致相同的TCA循环通量水平，这可能表明TCA循环在整个细胞培养过程中以接近最大的酶能力运行。然而，这个结论是在使用1H-NMR，其灵敏度相对低于MS。也有人提出，培养规模会影响细胞的新陈代谢。在生产规模的生物反应器中生长的细胞可能更多地依赖于糖酵解来产生能量，而不是在实验室规模上生长的细胞合成更多的TCA循环中间体。      关于指数期的核苷酸和核苷，据文献报道，高达90%的ATP产生是由TCA循环产生的，并沿指数期呈下降趋势。虽然发现胞质溶胶和线粒体中的 ADP和AMP浓度相似，但胞质溶胶中的ATP浓度高于线粒体中的ATP浓度，这表明ATP从线粒体中转运出来可能使ATP的形成在热力学上有效 。在这个生长阶段，当比较高产者和低产者克隆时，稳态ATP浓度相当，但生产和消耗率与大肠杆菌和CHO细胞的生产力相关。在培养基中添加一磷酸腺苷（AMP）或鸟苷一磷酸（GMP）导致半胱天冬酶活性的诱导达到3倍，这是在所有测试的代谢物中观察到的最高水平，而添加胞苷一磷酸 （CMP）和尿苷一磷酸（UMP）则没有效果。这种促凋亡作用也见于对 CHO细胞和IEC-6肠上皮细胞的其他研究。这意味着，即使存在营养物质并且没有高水平的氨和乳酸，有毒代谢物也会导致细胞死亡。表1：指数生长期的氨基酸和氨基酸衍生物      已经研究了CHO细胞在指数生长期中氨基酸的消耗和产生（表 1），氨基酸相关代谢通量被描述为显著低于糖酵解和TCA循环通量。MFA研究报告了氨基酸对TCA循环补充的贡献百分比一致，谷氨酰胺是主要的碳源，并且已知它在培养基中的可用性与天冬酰胺或丝氨酸一起对CHO细胞的代谢有很大影响。研究发现，谷氨酰胺约占TCA循环总碳供应的40%。线粒体谷氨酸库起源于胞质谷氨酸转运到线粒体和谷氨酰胺转运到线粒体，然后水解成谷氨酸。谷氨酸被线粒体谷氨酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸，然后进入TCA循环。所有其他氨基酸贡献约10%，并在乙酰辅酶A、α-酮戊二酸或草酰乙酸分支点进入TCA循环。在诱导细胞和非诱导细胞中报道了非常相似的氨基酸分解代谢贡献。对于低产和高产者克隆，也观察到一致的结果，天冬酰胺和谷氨酰胺产生了约30%的柠檬酸盐库和50%的苹果酸和琥珀酸盐标记，这表明它们在ATP的产生和在生长的指数期补充TCA循环中起主要作用，而不是生物量产生。氨基酸与葡萄糖对进入碳通量的总贡献被认为在整个培养物中保持不变（占总碳的30%至50%），谷氨酰胺耗尽后其他氨基酸的摄取增加。另一个模型估计，35%的中央碳代谢由氨基酸分解代谢提供，其中谷氨酰胺占10%。更准确地说，形成的天冬氨酸的60%在指数生长过程中被转氨以产生草酰乙酸，在固定相中降至50%。丙氨酸用于指数期的氮解毒，相当于丙酮酸用量的6%。      平均而言，在指数增长过程中，消耗的必需氨基酸中有25%不用于生物质或IgG生产，而是产生TCA循环中间体。第二项研究支持了这一解释，其中谷氨酰胺在指数早期的摄取速率大大超过了生物质或抗体生产的生物合成需求，这反映了其在分解代谢能量生产中的用途。      一项比较用高浓度或低浓度谷氨酰胺补料的培养物的研究显示了这种代谢物的重要性，因为观察到通路通量的主要差异。这些变化对比生产率产生了很大影响，对于用低浓度谷氨酰胺补料的培养物，比生产率高出2倍，并显示了CHO细胞代谢对谷氨酰胺水平的敏感性。      氨基酸对TCA的补充会产生中间分子种类。在指数期结束时，当细胞密度高且乳酸浓度低时，这些中间体往往会积累，并且它们对细胞生长的抑制作用已得到证实，其中吲哚3-羧酸盐和异戊酸盐是最有效的（有关详细信息，请参见表1、表2和表3）。表2：稳定期的氨基酸和氨基酸衍生物     除了在补充TCA和蛋白质生物合成中的作用外，氨基酸还充当谷胱甘肽前体。因此，它们的代谢对细胞保护免受ROS引起的氧化应激有重大影响 。在这方面，谷胱甘肽是需要考虑的关键代谢物之一，因为其氧化 （GSSG）和还原（GSH）形式之间的平衡会影响细胞生长。两种形式在早期指数期都以1:5的比例以高浓度存在。然后，GSSG/GSH比率在指数期达到平衡。一致地，一些出版物报道了GSSG在指数生长期在培养基中的积累，然后在稳定期继续积累。已知GSSG是氧化应激和诱导细胞凋亡的标志物，这可能解释了它与caspase活性的相关性。也有报道称，细胞内 GSSG和GSH浓度降低。这与在培养基中观察到的GSSG积累一致，因为它被细胞排泄，细胞外GSSG可能是长时间培养中细胞死亡的原因。此外，有人认为，在指数期晚期观察到的GSH浓度降低以及NADPH浓度的降低触发了TCA循环通量峰值之前PPP活性的增加。支持这一假设的是，在培养过程中观察到PPP和TCA活性之间存在密切相关性。根据一项针对细胞中氧化还原状态的研究，也有人提出，细胞衰老不是导致谷胱甘肽代谢和 ROS管理增加的原因，而是高细胞密度的原因。表3：衰退期的氨基酸和氨基酸衍生物第 2 步：利用能源生产生物质      本节将重点介绍代谢组学研究广泛涵盖的脂质代谢。      一组研究测量了中链和长链脂肪酸的细胞内浓度增加，这与指数期细胞生长的需要一致。根据这一观察结果，在指数期，脂肪酸氧化对乙酰辅酶A线粒体库的贡献可以忽略不计，乙酰辅酶A主要针对细胞生长阶段的脂肪酸合成[23]。发现很大一部分柠檬酸盐被转运到胞质溶胶中，转化为草酰乙酸和乙酰辅酶A。一项MFA研究计算出，大约25%的柠檬酸盐合酶通量通过柠檬酸盐裂解酶引导到脂肪酸的生物合成。在这项研究中，TCA循环中间体主要促进脂质合成，并且氨基酸的含量可以忽略不计。一项对贴壁CHO细胞进行的研究表明，谷氨酰胺产生的乙酰辅酶A对脂肪酸的生物合成没有显著贡献，这表明葡萄糖等其他碳来源有贡献。作为构成细胞膜的甘油基磷脂的组成部分，甘油也被发现在细胞外积累，占糖酵解碳的5% 。在他们的评论中，Pereira 等人（2018年）指出，释放到培养基中的甘油会导致碳损失到细胞中。对于作者来说，甘油可以被视为NAD池再生中的储存化合物或氧化还原汇。其他研究表明，胆碱、磷酸胆碱、乙醇胺磷酸、胞苷-二磷酸-胆碱（CDP）和CDP-乙醇胺在指数期几乎耗尽，而细胞膜成分的其他前体物质则积累。Selvarasu等人认为，这可能反映了CHO细胞中膜脂质代谢调节不良，这可能会触发从指数期到固定期的转变。为了支持这一假设，据报道，细胞外磷酸胆碱和甘油-3-磷酸胆碱的增加，并与细胞内半胱天冬酶活性和细胞凋亡相关。对改变的代谢通量（包括甘油磷脂代谢途径）的彻底研究可能有助于设计提高细胞培养活力的策略。      与指数生长期不同，在细胞培养模型中可以得出一些碳通量共识，而平稳期和衰退期的特征是代谢变化似乎依赖于细胞培养模型。可参考补充表S1并将其结果与相关细胞培养模型中获得的结果进行比较。2. 稳定期：稳定生长和高重组蛋白产量2.1. 替代碳源分解代谢可实现能量产生和细胞维持总体趋势是，与指数相相比，大多数碳和氮源在固定相的消耗速率较低。因此，据报道，糖酵解活性降低5倍，同时谷氨酰胺分解和AKG产生也相应减少。稳定相还见证了乳酸代谢的重大转变，乳酸的代谢不是产生太多，而是被消耗掉，随着葡萄糖浓度的降低，能够补充TCA循环 。葡萄糖消耗会继续进行，即使以降低的速度消耗，直到完全耗尽。一份报告表明谷氨酰胺分解略有减少，而葡萄糖通量没有低于其初始速率的50%。在指数期晚期和固定期观察到葡萄糖消耗和糖酵解通量减少了三分之一。在产生抗体的GS-NS0小鼠骨髓瘤细胞中也观察到了这些关键特征。在这种细胞中，当人工停止增殖时，乳酸被更早消耗，这也与生产率的提高有关。有证据表明，葡萄糖在稳定期没有耗尽，但在下降期的进入阶段没有耗尽 。据报道，天冬酰胺和天冬氨酸的消耗发生在进入固定相时，远在葡萄糖耗尽之前。此外，丙酮酸被确定为一种限制生长的代谢物，这意味着它的消耗标志着从指数相到稳定相的转变。丙酮酸的耗竭在最近的一项研究中得到证实。      与指数期相比，固定期的PPP通量增加了5-6倍，相当于葡萄糖摄取率的30%，甚至可能更高。Sengupta等人假设，在固定相期间，细胞可能会经历更多的氧化应激，从而导致PPP的利用率更高，以产生用于还原反应的NADPH。一项关于大肠杆菌的研究支持了这一点，该研究表明，由于参与有氧电子传递的基因下调，细菌在固定期无法抵抗氧化应激。最近的一份报告显示，PPP的下调而不是其激活发生在CHO细胞的固定期，但这种关系尚未在CHO细胞中得到广泛研究，值得进一步研究。      大多数研究一致认为，琥珀酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐和富马酸盐在固定期在培养上清液中积累。在这个阶段，进入TCA循环的碳是由葡萄糖（50%）、谷氨酰胺（40%）和其他氨基酸（10%）提供的，这些氨基酸以乙酰辅酶A或厌氧底物的形式进入TCA循环，包括苹果酸、α-酮戊二酸或草酰乙酸。更重要的是，观察到丙酮酸利用从乳酸的产生和分泌到其转位到线粒体并在TCA循环中使用，达到其峰值活性。这种TCA循环激活可能继发于氧化应激加剧，导致NADH/NAD比率降低，随之而来的NADH池再生的反向调节。      除了报告固定相中TCA循环活性增加的出版物外，还报道了等效或降低的活性。例如，在固定期对贴壁CHO细胞进行MFA后得出结论，大部分丙酮酸被转移到TCA循环（而不是产生乳酸），而对TCA循环没有影响，TCA 循环的运行水平与指数期相似。在一项使用1H-NMR，其中琥珀酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐和富马酸盐的分泌被发现代表与指数期相同的TCA循环通量比例。这表明在这些模型中，TCA在整个培养时间内以接近最大的酶载量运行。在其他研究中，发现关键的厌氧酶谷氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的活性降低了2倍，从α-酮戊二酸到琥珀酰辅酶A的通量也降低到50% 。在其他研究中也观察到了这种降低的TCA循环活性，并得出结论，葡萄糖可能被重定向到其他代谢途径，以便在固定相中实现ATP生成和NADPH氧化，在此期间增殖受到限制，生产率增加（见下文）。      关于氨基酸，表3报告了生长稳定期的观察结果。根据许多研究，与指数期相比，稳定期的完全缺失可能明显降低，导致苹果酸酶通量降低3倍，而氨基酸向TCA循环的通量可以忽略不计。然而，另一项最近的研究估计，用于过敏的必需氨基酸的消耗量从指数期的25%增加到稳定期的35%，这表明氨基酸在整个培养过程中的能量产生中起着关键作用。这些相互矛盾的结果表明，跨培养阶段的细胞代谢可能依赖于模型和克隆。2.2. 利用能量生产重组蛋白CHO细胞在稳定期产生重组蛋白的增加，占进入碳通量的15%，而在指数早期仅为3%。     与指数生长期相反，约25%的丙酮酸形成是由于固定期的乳酸消耗所致，其他次要来源是苹果酸和丝氨酸以及从培养基中摄取的丙酮酸。测量到丙酮酸通过转化为乙酰辅酶A进入TCA循环在指数相和固定相中相似。相反，在稳定期中发现其通过丙酮酸羧化酶活性转化为草酰乙酸是检测不到的。      关于甘油磷脂，一项研究报道，指数生长和稳定期之间的转变以细胞内出现为标志，然后在甘油-3-磷酸和甘油培养基中积累，后者可能是由甘油-3-磷酸合成的。Carinhas等人估计，参与糖酵解的碳中有25%最终进入甘油。在从指数相过渡到固定相时观察到的甘油浓度激增被解释为反映了细胞增殖相关膜形成所需的脂质生物合成、膜脂质的周转以及用于蛋白质排泄的分泌囊泡。还观察到甘油磷酸胆碱的增加，甘油磷酸胆碱是磷脂酰胆碱降解的产物，磷脂酰胆碱是质膜的主要成分。这被解释为反映了细胞膜降解和细胞生长受限。令人惊讶的是，发现脂肪酸生物合成在固定期和指数期一样高，这表明除了细胞生长之外，还有另一个作用，作者没有阐明这一点。这与脂质合成可能反映膜脂质更新需求（参与囊泡运输的质膜和细胞内膜）的假设一致。3. 衰退期：培养基耗尽导致细胞死亡      相对较少的研究调查了细胞培养物衰落过程中的CHO代谢。发现最后阶段伴随着葡萄糖的耗尽，随之而来的糖酵解中间体减少。丙酮酸被耗尽，而乳酸在分批培养中保持相对稳定。在补料分批和HiPDOG（葡萄糖的高端pH递送）培养条件中，在下降阶段观察到乳酸利用率。在后一项研究中，即使细胞密度开始下降，PPP通量也保持不变。     关于TCA，Matuszczyk等人已经证明胞质丙酮酸会耗尽，而线粒体丙酮酸的浓度较高，这表明TCA循环活性很高。这与另一项研究一致，该研究报告称，TCA循环活性在下降期甚至高于早期指数期。相反，一项研究报告称，与其他培养阶段相比，TCA循环的代谢物显着减少，这被解释为是由于在该阶段为TCA提供燃料的葡萄糖碳骨架较少。这种差异可能是因为前者研究侧重于衰退的早期阶段，而后者侧重于衰退和中度疲惫的终末阶段。      关于核苷酸代谢，ATP 、ADP和AMP浓度随着培养时间的延长而降低，直到下降期，但它们在细胞质和线粒体区室中的分布不同。在此培养阶段，发现胞质溶胶中的ATP浓度高于线粒体中的ATP浓度，这与ADP和 AMP的情况不同，它们在两个区室中的浓度相似。      关于氨基酸，在氨基酸下降期的观察结果见表3。没有对下降期脂肪酸代谢的全面分析，但在这个阶段报道了中链和长链脂肪酸浓度的峰值。最后，关于细胞的氧化状态，观察到氧化谷胱甘肽的增加，导致ROS管理的GSSG/GSH比率不利。      除了需要进一步研究的衰退期对细胞代谢的全面了解外，还提出了几种策略来延长细胞悬液的生产阶段。例如，一项研究建议在含半乳糖的培养基中培养细胞，因为当葡萄糖耗尽时，细胞会被代谢，从而能够维持细胞活力。另一项研究建议添加抗凋亡剂以避免过度细胞死亡。4. 结论     对CHO细胞的所有代谢组学研究的比较揭示了细胞培养每个阶段的一般趋势，因为它们突出了从扩增到稳定，然后到最终活细胞密度下降的最重要转变。总体而言，生长的指数阶段对应于营养物质的高消耗状态，尤其是葡萄糖和谷氨酰胺。这实现了高合成代谢活性、平衡的氧化还原状态和可用于生物质生产的过量能量的形成，有利于细胞的强烈增殖。葡萄糖通过糖酵解的氧化程度很高，通过乳酸产生实现生物能量稳态和能量“储存”，这与丙酮酸介导的TCA循环的适度燃料形成鲜明对比，TCA循环反而由过敏性补充由于所有氨基酸的可用性。生长期的一个特征是mAb产量低，这使得后续固定相在重组蛋白的合成方面最有趣。这种减少的增殖使对生物合成的细胞能量的投资更高。固定相的特点是碳和氮源的消耗相对较低，糖酵解活性较低。相比之下，TCA循环通量在此阶段增加，乳酸消耗为乙酰辅酶 A 库提供。在这个阶段，氨基酸在TCA补充中的作用值得进一步研究。此外，与指数相相比，PPP在很大程度上被激活，从而产生还原当量，如NADPH和谷胱甘肽，它们在固定相中对抗氧化应激。培养物的最终下降以许多代谢物的耗尽和毒性产物的积累为标志。      重要的是，本综述还强调了各种研究结果之间的重要差异。这些差异可能是由来源于单个宿主的CHO细胞系的独特特征来解释的，这些细胞系是通过不同实验室的遗传漂变获得的。所用培养基和培养策略方面的差异也表明会导致遗传和表观遗传多样性，这可以解释当使用不同的过程生产同一克隆时出现的表型差异。众所周知，这种多样性对CHO培养物的代谢组学特征有重大影响。例如，对来自两个不同宿主的6个mAb产生细胞系的细胞培养上清液进行的主成分分析表明，代谢谱的变化高度依赖于细胞系的宿主谱系。在比较高产和低产克隆的代谢特征时，还发现了关键差异。在第一项研究中，Chong等确定了与高生产率相关的CHO细胞主要代谢途径（糖酵解、PPP和TCA循环）的7种代谢物。研究表明，这些代谢物的丰度改善了对氧化态的控制，从而增加了重组mAb的产量。此外，Dean等强调了高产者和低产者细胞系之间的几种代谢差异。低生产克隆在培养开始时消耗更多的葡萄糖，同时积累较少的乳酸。此外，在高产克隆中，超过50%的细胞内乳酸来源于细胞外丙酮酸，而在低产克隆中仅占30%。培养四天后，高产者能够消耗积累的乳酸，而低产者则不是这种情况。更重要的是，在高产者克隆中，TCA代谢物是从葡萄糖中补充的，这表明TCA循环的活性增加，这可能是高产量的标志。研究一致表明，重组蛋白的产生与TCA循环中葡萄糖的更有效利用相关。     特异性基因沉默或过表达也被证明会改变细胞代谢。例如，与对照细胞相比，bcl-2 抗凋亡基因的内源表达水平或苹果酸脱氢酶II的过表达导致乳酸积累减少和NADH丰度降低。      最后，本综述中引用的研究在培养基配方方面的多样性可能解释了所发现的一些差异。例如，与化学成分确定的杂交瘤培养基相比，使用化学成分确定的CHO培养基可以降低乳酸峰值浓度。研究还表明，在HiPDOG培养物中将葡萄糖浓度维持在几乎可以忽略不计的水平能够使乳酸、渗透压和氨维持在抑制水平以下。同样，培养基中谷氨酰胺（细胞的另一个主要碳源）的浓度对CHO代谢状态有重大影响。与在高谷氨酰胺培养基中生长的培养物相比，在低含量谷氨酰胺培养基中，糖酵解通量显著增加，而PPP降低2倍。在低谷氨酰胺培养基培养中，TCA循环使用丙酮酸而不是乳酸生产更为重要，Kirsch等人也观察到了这一点。其他研究也报道了这种培养条件下TCA通量的增加，包括在CHO-DHFR细胞中。      尽管如此，MS代谢组学和13C MFA对使用其他方法获得的结果进行分析，当用于提高我们对CHO细胞代谢的了解并确定主要趋势时，可能是一种有效的策略。未来的研究必须解决代谢变化与mAb产量之间的因果关系。这可以通过使用代谢组学以外的几种“组学”工具（如基因组学、表观基因组学、转录组学和蛋白质组学）将实验中获得的信息联系起来来实现。此外，单细胞“组学”的可用性增加可能会增加我们对单个细胞的了解，从而允许对可能的异质细胞群进行精细分析，最终改善克隆选择。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

声明：因水平有限，错误不可避免，或有些信息非最及时，欢迎留言指出。本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及）;本文不构成任何投资建议。口腔薄膜（oralthinfilms，OTF）是一种新型的药物传递方式，具有给药灵活高和患者用药顺应性高等优点。将药物负载于口溶膜中，服用后药物在口腔内崩解，药物通过口腔粘膜或胃肠道吸收，可使药物迅速起效，并可减轻或避免药物的首过效应，提高药物的生物利用度。口腔膜剂也没有常规口服制剂堵塞口腔或窒息的风险，提高了特殊患者例如儿童、老人、精神病患者和一些卧床患者的用药安全性，同时保留了传统口服固体制剂的优势，包装轻便易携带、剂量准确，并且给药无需饮水送服和二次容器，适合旅行和一些特殊情况下，如晕车时、过敏性病发作、咳嗽或哮喘时，放入口中可被唾液润湿而迅速崩解溶解起效;口腔膜剂可通过口腔豁膜或舌下组织快速吸收进入血液循环，避免了常规口服制剂的首过效应，提高了生物利用度，适用于需要快速起效的一些急症。膜剂可广泛应用于治疗多种疾病，如治疗疼痛、咳嗽/感冒、过敏性鼻炎、糖尿病等。由于膜剂特殊的单剂量包装，可有效隔绝空气和水分，具备良好的化学稳定性。在企业生产中，膜剂生产成本低，生产效率高，且辅料少。口膜分类口溶膜剂，又称为口腔溶解膜剂、口腔分散膜剂、口腔速溶薄膜剂、口腔速解溶膜，2020版《中国药典》对膜剂的定义为药物与适宜的成膜材料经加工制成的膜状制剂，供口服或粘膜使用。目前，药典已收载复方炔诺酮膜和克霉唑口腔药膜。由吸收途径，口腔薄膜剂可分为两类，一种为口腔粘膜，另一种为口腔分散膜。口腔粘膜薄膜可置于舌上、舌下或面颊内侧。通过粘膜粘附剂，它们可粘附在口腔内部，并通过粘膜（即舌下或脸颊）将药物缓慢释放到体循环中。所以，口腔粘膜薄膜的起效时间特别快，还可以减轻或避免药物的首过代谢或在胃酸环境中降解。口腔分散薄膜是非粘膜粘附性的，通常在与唾液接触后分解。具体可分为两种：“口腔崩解薄膜”和“口腔溶解膜”，这两种均会即刻在口中分解。口腔崩解膜一般载难溶性药物，在口腔中崩解，在胃肠道（GI）中溶解和吸收；口腔溶解膜通常是载水溶性药物，在口腔中崩解和溶解。口腔溶解膜中药物部分可在口腔吸收，但大部分还是在胃肠道中进行吸收。口膜优势及特点（1）降低/避免首过效应常规剂型药物主要是通过胃肠道进入体循环，在此过程中，药物易受胃酸、胆汁、消化酶及其他首过效应的影响而解离或降解，从而影响药物的起效时间、用药剂量或生物利用度。（2）提高患者用药顺应性口腔膜剂具有比其他给药方式更大的表面积，这使制剂的润湿、崩解和溶解更快，无需用水、咀嚼或吞咽即可服药，这对儿科、老年、吞咽障碍及精神病患者用药顺应性和舒适性具有极大优势。（3）剂量灵活可控与液体制剂相比，口溶膜剂能够提高给药剂量精度。每片膜都被赋予精准的药物剂量，以确保患者用药的安全性。通过分切，可获得可变的剂量，非常适合儿科用药。（4）延长产品生命周期从商业角度来看，口溶膜药物传递技术能为专利即将到期的制药公司提供延长药物生命周期的机会。将专利到期或即将到期的药物开发成OTF，可使它们获得额外的市场独占期。已上市品种1970年至今，口腔薄膜作为新型药物递送系统被广泛研究，随着载药能力和稳定性的提高，以及吞咽困难患者需求的持续增长，口腔薄膜给药方式受到了欢迎。目前，已有10余种OTF药物全球市场上市，尽管数量不多，但这些OTF可用于治疗广泛的疾病，如：偏头痛、精神分裂症、阿片类药物依赖、疼痛、恶心和呕吐等。膜剂的生产过程中耗能少、粉尘少、辅料少且成本低、生产效率高，能够替代部分传统制剂，可发挥高效速释的作用。近年来，口腔膜剂作为患者依从性好、方便携带、剂量精准的新剂型，引起越来越多的医药企业和研究机构的重视，而广泛见于各类处方和非处方药物中。口腔膜剂提高了给药的方便性和患者顺应性，尤其在有咀嚼和吞咽困难的儿童、老人和一些卧床患者中正在成为主流药品。统计显示，80%的患者相比于传统固体口服剂型更喜欢口服崩解剂型。目前口腔膜剂上市品种主要集中在北美市场，从2003年起，已有超过80多种产品在北美上市，如Novartis公司治疗儿童感冒的右美沙芬膜和苯海拉明膜，美国MonosolRx公司的昂丹司琼膜等。我国目前上市产品整理如下。表1.目前国内上市的口腔速溶膜信息汇总从目前的过评情况看口溶膜领域齐鲁制药布局品种最多已获批的品种多达5个，恒瑞和豪森同样有产品布局。口服制剂给药方式简便、剂量准确、易携带，在现代医学实践中有着最普遍、最广泛的应用。据不完全统计，在现有的主要药物中，口服制剂占比已经达到60%。但常用的口服制剂片剂、胶囊、丸剂会给部分特殊患者带来吞咽困难甚至窒息休克，而口腔膜剂可很好解决这类问题，提高患者顺应性。口腔膜剂的处方组成膜剂一般由活性药物成分、成膜剂、增塑剂、甜味剂、唾液刺激剂、表面活性剂和香精色素等组成。用于膜剂的所有辅料应是普遍认为安全的(即GRAS列出的)，并且应该被批准用于口服药物剂型，应充分考虑到辅料种类和量的不同，对膜的外观和性能的影响。成膜材料是膜剂处方中最主要最重要的成分，包括天然材料、合成类聚合物等。理想的成膜剂应具备以下特征:无毒、无刺激性、口感好、能保持长期稳定性、不改变处方中API和其他辅料的性质、有良好的润湿性和延展性、不会延长膜的溶化时间且具有最佳剥离强度和拉伸强度。增塑剂是口溶膜处方中的重要成分，它通过降低膜的玻璃转化温度，来增强膜的断裂和拉伸强度及提高拉伸率增加塑性和韧性。常用的增塑剂有:丙三醇、丙二醇、低分子量聚乙二醇等。若其用量不当也会导致膜的开裂和剥离，甚至一些增塑剂会影响药物的吸收速率。另外膜剂中辅料成分还可选择性地添加包括甜味剂、唾液刺激剂、表面活性剂以及着色剂等辅料。甜味剂在膜剂中起矫味作用回，有天然和人工合成2类，包括蔗糖、葡萄糖、糖精钠、阿斯巴甜等。常见的唾液刺激剂有柠檬酸、苹果酸、乳酸等，柠檬酸是其中效果最好、应用最广泛的一类。表面活性剂可提高药物的溶解性，能够使药物在口腔中快速被润湿和溶化，常用的表面活性剂有聚山梨酚、十二烷基硫酸钠和泊洛沙姆等。另外为了提高儿童患者用药的依从性，部分膜剂中添加极少量氧化铁、二氧化硅和氧化锌等着色剂或天然着色剂。口腔膜剂的制备工艺自口腔速溶膜应用开始以来，溶剂浇铸法便是最经典的制备方法。近年来，很多新技术也逐渐出现并发展成熟，包括热熔挤出法、静电纺丝法、和打印法等。这些新技术不仅可以改善溶剂浇铸法的局限性以提高口腔薄膜的性能，同时能制备多层的口腔薄膜以实现药物的缓释。（1）溶剂浇铸法(solventcasting)是制备膜剂较为普遍的方法，且适用于制备含有热敏API处方的口腔膜剂，即成膜材料、API和其他药用辅料溶解或分散于水中，高速搅拌混匀并除去气泡后，将得到豁稠的溶液铺于模具上或涂布成膜剂，干燥后起膜切割成目标规格并分装于指定包装中。API的稳定性及其与辅料、溶剂的相容性是影响该工艺的关键因素，针对不同的API可选择不同型号的成膜材料，或制成固体分散体等形式保证最终膜剂的稳定网。该工艺中水分的量会极大地影响薄膜的稳定性及其机械性能，应采用特殊的措施来制备和包装ODF以控制湿度的影响。图1.溶剂浇铸法制备过程示意图（2）热熔挤出法(Hot-meltExtrusion，HME)是制备含对热不敏感API和辅料的膜剂重要工艺。通过将药物、成膜剂及其他辅料加热并均化，直到它们熔融并混合后受挤压通过模具，压成所需的膜形状，最后将挤出的薄膜冷却，切割和包装成所需膜剂。该法制备过程中不需要溶剂，对难溶性药物的分散机制更好，与溶剂浇铸法相比膜有更好的含量均匀度，并且加入合适的增塑剂可降低膜的延展性，提高产品灵活性和抗伸长率。制备过程有良好的参数控制且达到最小的药物浪费。但该工艺对处方的要求较高，药物适用面较窄。图2.热熔挤出法制备过程示意图（3）静电纺丝法（Electrospinning）是制备纳米纤维（nanofibers）的常用技术。在电场作用下，聚合物溶液的液滴可以从球体向圆锥体转变，并可以进一步延展至纳米级别的纤维丝。随着静电纺丝法的潜力逐渐被挖掘，近年来被广泛应用于基于纳米纤维生产制造口腔薄膜，除了因比表面积大提高载药量外，还能有效地增强药物的溶解度和渗透性。基于纳米纤维制备的口腔薄膜，具有优良的机械强度和柔韧性，可实现对药物的控释。连续采用静电纺丝法，可以制备多层结构的纳米纤维薄膜，内层为含活性成分的聚合物材料，外层为纳米纤维。由于外层材料的疏水特性，多层纳米纤维薄膜表现出优良的缓释效果，这让静电纺丝法用于制备口腔薄膜具有广阔的应用前景。尽管静电纺丝法在某些方面有巨大的优势，但是在实际应用过程还是存在诸多弊端。例如，原辅料必须用有机溶剂溶解，为环保和溶剂残留留下了安全隐患。静电纺丝法涉及高度复杂和高成本的设备，制备过程步骤较多，严重制约其在制药和生物医学领域的产业化和商业化。图3.静电纺丝法制备过程示意图（4）打印法，打印技术是在计算机辅助设计（Computer-aideddesign，CAD）下，将打印材料一层层叠加起来，形成具有所需形态的产品。打印技术能完成连续一步制造，同时能实现多种制药剂量的个性化设计。因其特点，3D打印又被称为增材制造（additivemanufacture）。（5）静电喷雾沉积技术，静电喷雾沉积（Electrostaticspraydeposition，ESD）是一种干粉喷雾沉积技术，以静电喷枪将成膜粉末均匀喷在固定衬底上并形成均匀的沉积物，之后经高温将沉积物固化。未来趋势通过本文对于口腔膜剂的研发状况及市售药物的分析，主要得到了以下几点结论:①口腔膜剂与现有剂型相比，具有崩解快、溶解迅速、快速释药和生物利用度高等许多优点。②口腔膜剂适用于所有年龄患者尤其是儿童和老人以及特殊患者，具有传统口服制剂所无法达到的很高的患者依从性。尤其是儿童对传统口服制剂具有较强的排斥心理，导致许多医院面对儿童患者用药困难。③现今上市的口腔膜剂药物虽然品种不多，但作为新型制剂在患者人群中有着较好的声誉和很好的市场前景，对于该类药物的开发也一直处于热门状态。有研究表明该类药物在糖尿病、偏头痛、过敏免疫疗法、尼古丁依赖及止痛药物依赖上有很强的应用潜力。与传统剂型（如片剂、胶囊和糖浆）相比，OTF具有许多不可替代的优势，随着剂型的发展，将会有更多药物用于口腔薄膜给药。OTF给药途径适合吞咽困难的患者，如：儿童、老人和咽喉不适的人。值得注意的是，随着人口老龄化不断加剧，，对安全无障碍给药方式的需求会日益增加，市场直接推动OTF市场的增长。MarketResearchFuture预测，2018-2023年全球口腔薄膜市场将以10.50%的复合年增长率(CAGR)增加。另一位业内人士预测，包括OTF在内的所有新型药物输送系统的全球市场价值将在同一时间以2.9%的复合年增长率增长。随着越来越多的药物被开发或改为OTF剂型，现有技术限制的解决方案会随即出现。尽管限制是静态的——如：载药量。另一角度，这些并不是限制，而是优先满足特定患者群体的需求。儿童和老人是OTF药物的主要消费者，随着研究的深入，研究者们将扩大OTF的应用范围，使这种新型给药系统成为标准剂型。笔者认为口溶膜在剂型上虽有诸多优势具有剂量准确、携带方便、患者依从性良好等特点，在部分疾病及适应证人群治疗中，口溶膜能很好解决其他剂型所带来的不便，提高患者用药依从性。但是并不是所有药物都适合开发成为口溶膜。企业在立项时需谨慎。特别需要全面评估适应证和剂型特点，充分调研产品国内外上市情况，对于药审中心关注的剂型适用性及临床优势应予以充分说明，20年到22年是口溶膜开发最为火爆的几年，很多研发机构都立项了很多相关品种，但是从获批的情况看能杀出重围的也只有齐鲁、恒瑞、豪森这样的国内制药头部企业。近年来争夺比较激烈的是布瑞哌唑口溶膜，四川科伦身位稍稍领先，齐鲁同样虎视眈眈，且该品种目前已经有10家企业申报，呈现出“大乱斗”的局面。口溶膜要么不立项，一旦发现合适品种多家“打破头”的局面可能是未来的常态。参考文献：[1] Kathpalia H,Gupte A. An introduction to fast dissolving oral thin film drug delivery systems: a review[J]. Current Drug Delivery,2013,10(6):667-684.[2] 方亮.药剂学[M].第8版,北京:人民卫生出版社,2016.[3] Arwaiam,Mohamed A I,Maha A H, Optimization and evaluation of venlafaxine hydrochloride fast dissolving oral film[J]. Saudi Pharm J,2020,28(11):1374-1382.[4] Qin Z Y,Jia X W, et al. Fast dissolving oral films for drug delivery prepared from chitosan/pullulan electrospinning nanofibers[J]. Int J Biol Macromol,2019,137:224-231.[5] 魏婷,王丹丹,赵雅.口腔速溶膜剂改良药物剂型的研究方法[J].甘肃科技,2020,36(24):129-133.[6] Zhang M, Zhang T R, et al. Self-microemulsifying oral fast dissolving films of vitamin D3for infants: preparation and characterization[J]. Food Sci Nutr,2019,7(8):2577-2583.[7] 尚悦,赵炯,等.甲氧氯普胺口腔速溶膜剂的制备与体外评价[J].中国医药工业杂志,2019,50(11):1296-1303.[8] 王倩,苏峰,等.口腔速溶膜剂的研究进展[J].安徽医药,2017,21(3):399-403.[9] 陈小云,秦燕,等.他达拉非口腔速溶膜的临床前药动学研究[J].中国新药杂志,2019,28(17):2157-2162.[10]任连杰,刘娟,等.口腔膜剂的研发与评价[J].中国新药杂志,2017,42(19):3696-3702.[11]任连杰,刘娟,等.国内外口腔膜剂申报上市进展及其药学评价探讨[J].药品评价,2017,14(18):23-27.