H1N1 seasonal influenza virus vaccine(Vaxart, Inc.)

摘要：病毒载体和病毒样颗粒(VLPs)疫苗是新型疫苗设计平台，用以克服传统疫苗的局限性。病毒载体疫苗高效且能快速激发保护作用。许多基于重组病毒载体的人类疫苗候选株，基于不同病毒科的病毒，如腺病毒科、逆转病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科和细小病毒科。此外，首个获批用于人类疫苗接种的病毒载体疫苗是日本脑炎病毒疫苗。此后，已有几种病毒载体获批用于针对拉沙热病毒、埃博拉病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、SARS-CoV-2病毒和疟疾的疫苗接种。VLPs是能模仿病毒颗粒的纳米颗粒，由结构蛋白的自组装形成，针对乙型和戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒以及疟疾的VLPs疫苗已商业化。正如COVID-19疫苗加速生产所证明的，这些新方法对于疫苗学以及针对病原体和新出现大流行威胁的快速响应是重要的工具。 1.引言 疫苗学的时代始于1789年，当时爱德华·詹纳开发了第一种针对天花的疫苗。从那时起，疫苗预防了数百万人死亡，并且在1978年甚至导致了这种疾病的根除。在19世纪，巴斯德开创了基于病原体灭活或减毒的疫苗发展。在20世纪下半叶，使用细胞培养来培养病毒，促进了几个灭活和减毒疫苗的发展。有关疫苗历史的综述， 在20世纪末分子生物学出现之前开发的常规疫苗包括灭活或减毒病原体、类毒素、基于蛋白的疫苗或细菌多糖。因此，它们的使用减少了如脊髓灰质炎、麻疹、破伤风和白喉等疾病的影响。尽管经过数十年的深入研究，针对某些人类病原体的有效疫苗尚未开发出来，例如，那些表现出高度遗传变异性（如人类免疫缺陷病毒[HIV]和丙型肝炎病毒）、导致持续或潜伏感染（如HIV、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒）或未能诱导无菌免疫的病原体。此外，传统疫苗存在几个缺点，如安全问题，包括减毒活病毒恢复毒力的风险、与活生物污染的可能性以及对免疫系统减弱人群的风险。同时，疫苗生产成本高昂且耗时，需要更高水平的生物安全和专业实验室。近几十年来，新的有希望的疫苗平台已经出现，这些平台得到了遗传工程、分子和细胞免疫学、结构生物学、生物信息学、计算生物学、纳米技术、合成生物学等领域进展的支持，如重组病毒载体、病毒样颗粒(VLPs)、mRNA、合成DNA和细菌载体疫苗。此外，疫苗设计新技术是疫苗学中的重要工具，用于克服传统技术的限制，并促进对新威胁（如新出现的病原体和大流行爆发）的快速和有效响应。在这篇综述中，我们旨在总结病毒工程的最新进展，这些进展导致了针对当前流行病病原体（如流感、埃博拉、艾滋病和COVID-19）的安全有效疫苗的开发，特别关注病毒载体和基于VLP的疫苗平台。 2.基于病毒载体的疫苗  重组病毒是经过基因改造并设计用作针对传染病和抗癌及基因疗法的疫苗。具体来说，20世纪90年代开始使用病毒载体进行基因疗法。从这一点开始，遗传工程、重组DNA技术以及发展反向遗传技术以恢复重组病毒，促进了基于载体的疫苗平台的发展。病毒载体是通过将外来抗原或转基因（如感兴趣的免疫原）通过重组DNA工程插入病毒遗传物质构建的。此外，病毒载体被特别修改以根除其固有的致病属性。然后使用新构建的病毒载体将抗原基因传递给宿主，在那里它被短暂地高度表达以引发强大的免疫反应。此外，构建了多价或多病原体疫苗，以同时从同一或不同病原体表达各种转基因。而且，在被动免疫中，重组病毒携带抗体转基因。 迄今为止，已经设计了两种主要类型的病毒载体：复制型和复制缺陷型载体。复制型载体扩增转基因并产生感染性后代，而非复制型载体传递单一的转基因副本而不复制，这提高了其安全性。复制型载体通过模仿自然感染产生强烈的免疫反应。复制缺陷型载体在外来启动子的控制下表达免疫原，产生较弱的疫苗反应，可能需要使用佐剂。复制型载体包括腺病毒、逆转录病毒、弹状病毒和副黏病毒载体，而复制缺陷型载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体（表2）。还有单周期病毒载体可用，它们通过一轮复制增加抗原表达并避免病毒后代的形成。已从腺病毒和弹状病毒开发出单周期载体。病毒载体疫苗通常极其有效，并通过诱导强烈的体液和细胞免疫反应（包括干扰素和炎症细胞因子的产生）提供快速保护。通常不需要使用额外的佐剂，这简化了疫苗的组成和配方过程。表1总结了基于病毒载体的疫苗的主要优点和缺点。有关载体疫苗免疫反应的综述。 许多基于病毒载体的疫苗已获准用于兽医用途，如犬瘟热病毒、猫白血病病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒和马立克病。例如，基于NDV的流感疫苗保护鸡免受高致病性禽流感的侵害，并在墨西哥和中国作为兽医疫苗使用。牛痘病毒是第一个作为针对乙型肝炎的疫苗载体开发的。2010年，针对黄病毒属日本脑炎病毒的第一种病毒载体疫苗ChimeriVax-JE(Imojev)获准用于人类。ChimeriVax-JE是一种利用黄热病黄病毒株17D构建的减毒活疫苗，通过用日本脑炎病毒的相应序列替换编码前膜和包膜蛋白的序列。这个载体在澳大利亚和亚洲商业化，单剂量可迅速引发免疫反应，具有良好的安全性。 尽管目前只有少数病毒载体疫苗获准用于人类（表3），但针对SARS-CoV-2的腺病毒载体疫苗的广泛使用已被证明是安全的。因此，目前正在进行许多使用重组病毒载体疫苗的临床试验。有关在欧洲进行的病毒载体疫苗临床试验的综述。 许多基于人类的重组疫苗候选株都是基于腺病毒科、逆转录病毒科、痘病毒科、副黏病毒科、弹状病毒科、黄病毒科、togavirus科和细小病毒科的病毒，其中腺病毒和逆转录病毒是最广泛使用的载体。然而，那些被选为设计疫苗的载体是根据要插入的基因的特性以及与预先存在的免疫力、病毒复制和遗传稳定性相关的安全问题来选择的。下面总结了被选为设计基于病毒的疫苗的五种主要类型的病毒载体（表2）。 3.用于开发疫苗的主要病毒载体  3.1.腺病毒载体 腺病毒（Ad）载体已被广泛用作基因治疗的工具，并且是最常见的疫苗平台之一。腺病毒科由非包膜的双链线性DNA病毒组成，长度范围从26到45 kb。基因组包含五个早期转录基因（E1A、E1B、E2、E3和E4）、四个中间转录单元（IX、IVa2、L4中间和E2晚期）、五个晚期单元（L1-L5）以及两端的两个倒置末端重复（ITR）序列。二十面体衣壳由三种主要蛋白质组成：纤维蛋白、五聚体和六聚体，后者是最丰富的蛋白质，含有主要的中和表位。存在100多种不同的人类腺病毒血清型，分为七个不同的物种（A-G）。最初，Ad5和Ad2是最广泛用于构建载体的血清型，因为它们最容易操作，生产和免疫原性都很高。然而，由于预先存在的免疫力，Ad5已被其他血清流行率较低的血清型所取代，如Ad6、Ad26和Ad35。此外，还开发了针对不同病原体和疾病的猴源腺病毒载体，包括流感、HIV、埃博拉、SARS-CoV-2和疟疾。 使用腺病毒载体的优点包括增加转基因转导能力、广泛的细胞嗜性、能够感染分裂和非分裂细胞以及抗原呈递细胞，以及它们不整合到宿主基因组中（表2）。此外，重组基因组在连续传代中表现出稳定的维持，这有助于快速和大规模生产，并产生高滴度稳定库存。如上所述，腺病毒载体的主要缺点是预先存在的免疫力和载体本身的免疫原性。这是因为腺病毒具有很强的免疫原性，能够引起针对Ad主要衣壳蛋白的高滴度中和抗体。 根据病毒基因组编辑，Ad载体被分类为第一代、第二代或第三代载体（图1a）。然而，第一代载体已从病毒复制基因E1B和E1A中移除。此外，通过同源重组插入外源基因以及E3基因的删除，使得转基因的大小从5增加到8 kb。E3产物的删除促进了免疫原性，因为它对于抑制宿主的免疫反应至关重要。在第二代Ad载体中，E4和E2区域的删除增加了转基因容量并减少了宿主细胞中的毒性。第三代Ad载体，称为无肠道载体或助手依赖载体，除了包装信号Ψ和对病毒包装至关重要的ITR序列外，大部分结构和功能基因都被删除（图1a）。这些载体可以容纳高达35 kb大小的转基因。助手依赖载体在保持免疫反应的同时提高了安全性。 图1. 不同基于病毒的载体示意图：(a) 腺病毒载体。在第一代载体中，腺病毒基因组的E1A、E1B和E3基因被删除；在第二代载体中，额外删除了E2和E4基因；在第三代载体或无肠载体中，除了包装信号Ψ和ITR序列外，大部分病毒基因被删除。(b) 慢病毒载体。包含转移载体质粒（带有慢病毒5'和3' LTRs，修改为自灭活和转基因）的第三代慢病毒载体；包含一个启动子和HIV env或VSG-G的假型慢病毒颗粒的包膜质粒；以及分别编码gag或pol和rev的两个包装质粒。(c) 副黏病毒载体。显示了NDV载体。使用T7启动子系统从克隆的DNA（cDNA）中恢复NDV。NDV，新城疫病毒；T7Pro，T7聚合酶启动子；T7ter，T7末端序列。ITR，反向末端重复；Ψ，包装信号；LTR*，自灭活长末端重复。使用BioRender.com创建。 Ad载体通常是复制缺陷型的。此外，通过删除IIIa衣壳水泥蛋白设计了单周期Ad载体；例如，用于针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗。使用动物模型进行的几项临床前研究导致了良好的免疫反应，使得单周期Ad载体用于人类疫苗的开发非常有希望。 使用Ad载体技术的疫苗已经为广泛的病原体开发（表3）。一些Ad载体疫苗仍在研究中，而针对埃博拉病毒和SARS-CoV-2的疫苗已经被商业化，正如我们将在以下部分讨论的。 3.2.逆转录病毒载体 在腺病毒之后，慢病毒是病毒载体设计中第二常用的载体。慢病毒，如HIV-1，属于逆转录病毒科，这是一类包膜的单链RNA病毒。进入宿主细胞后，RNA被逆转录成DNA并整合到染色体DNA中。基因组编码三个必需基因（gag、pol和env）以及几个调节和辅助基因，用于小型六蛋白（tat、rev、vif、vpr、vpu和 nef），这些基因对于病毒复制、感染和灭活宿主限制系统至关重要。gag基因编码结构蛋白，pol基因编码蛋白酶、这一组特有的逆转录酶和整合病毒DNA到宿主基因组所需的整合酶。env基因编码包膜（Env）糖蛋白，gp160，它经过蛋白水解裂解产生gp120和gp41跨膜糖蛋白。 慢病毒载体在免疫方面具有巨大潜力，因为它们最佳地转导树突细胞并有效刺激T和B淋巴细胞。临床前研究表明，慢病毒载体能够引发强烈且持久的体液和T细胞反应，为许多传染病提供有效保护。导致慢病毒载体广泛使用的其他优点包括它们增强的能力来携带大型转基因（<8 kb），它们整合到宿主基因组中，确保了高水平和持久的转基因表达，它们在分裂和非分裂细胞中的高转导效率，以及它们的低遗传毒性和免疫原性，包括低抗载体免疫。然而，慢病毒载体的广泛使用可能受到相对较高的生产成本和与大规模制造相关的技术挑战的阻碍。主要缺点源于它们的整合，这可能诱发肿瘤发生（表2），尽管基于慢病毒的基因疗法临床研究表明插入性突变的风险很低。此外，慢病毒的前病毒整合位点不是随机的，而是相对非特异性。对于HIV，位点整合的偏好包括活跃转录的基因，而不是启动子区域。尽管如此，通过突变病毒整合酶已经为疫苗生产了非整合慢病毒载体。 大多数慢病毒载体是从HIV产生的。第一代慢病毒载体是使用三质粒表达系统开发的，该系统包括携带gag和pol基因以及辅助和调节基因的包装质粒；包膜质粒；以及带有被慢病毒长末端重复序列(LTR)包围的转基因盒的转移质粒（图1b）。慢病毒载体的细胞嗜性可以通过伪型化来修改，从而增加病毒的嗜性。在伪型化载体中，病毒受体结合蛋白Env被异源包膜糖蛋白所取代，其中弹状病毒狂犬病病毒(VSV-G)的G蛋白是最常用的。缺乏对伪型化慢病毒载体的预先存在的免疫力，加上它们低促炎特性，使它们成为粘膜疫苗策略的合适候选者。第二代慢病毒载体通过从包装质粒中删除辅助毒力基因vif、vpr、vpu和nef而变得更安全。第三代慢病毒载体目前用于基因传递，也通过疫苗接种诱导强烈的免疫。在第三代载体中，病毒基因组被分离成三个不同的质粒（gag/pol、rev和env或VSV-G）。为了防止整个HIV基因组的转录，转基因被包含在一个额外的含有用于自我失活的慢病毒LTR序列的质粒中（图1b）。 慢病毒载体作为癌症疫苗的使用也在研究中，特别是用于黑色素瘤、淋巴瘤和前列腺癌。正如下一节将讨论的，已经设计了许多针对不同病原体的慢病毒载体，如流感病毒、西尼罗河病毒、HIV-1和SARS-CoV-2。 3.3.腺相关病毒载体 在腺病毒和慢病毒之后，腺相关病毒（AAVs）是第三广泛使用的病毒载体。AAVs是一种属于细小病毒科的非包膜单链DNA病毒。AAVs是依赖性病毒，因为它们需要辅助病毒，如腺病毒或单纯疱疹病毒，才能复制。大多数AAV载体已用于基因治疗。AAV载体可以感染分裂和非分裂细胞，并携带高达5 kb大小的转基因。AAV载体主要作为游离基因组存在，并以较低频率整合到第19号染色体。它们的优点包括缺乏致病性、广泛的嗜性、低免疫原性、易于生产，并能够建立长期的转基因表达。主要缺点是转基因的大小有限（表2）。构建AAV基载体时，病毒复制（rep）和结构（cap）基因被转基因表达盒（转基因以及启动子和调控元件）替换，该表达盒由AAV ITRs包围。几种基于AAV载体的疫苗候选物已被评估，它们编码针对病原体如尼帕病毒、登革热病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、HIV、埃博拉病毒（EBOV）、流感病毒和SARS-CoV-2的抗原。此外，还开发了许多基于AAV的载体，用于被动免疫策略，以传递中和抗体的基因。这种策略针对HIV、流感病毒和呼吸道合胞病毒（RSV）等几种病原体产生持续的抗体表达，对于这些病原体，疫苗尚未可用或效果较差。例如，已证明通过鼻腔给药AAV血清型9载体表达重组单克隆抗体palivizumab，可以有效保护小鼠模型免受RSV挑战。 3.4.弹状病毒载体 已开展了许多基于弹状病毒载体的疫苗候选物的临床前和临床研究，包括一些商业化的病毒载体疫苗（表3）。然而，与腺病毒、AAV和慢病毒载体相比，进行的研究数量较少。弹状病毒科由具有典型子弹形状的包膜病毒组成，它们具有非分段的负义单链RNA基因组。基因组编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和大聚合酶（L）。反向遗传技术的使用已使负义RNA病毒能够从克隆的DNA中恢复。1994年首次开发该系统，用于从cDNA中恢复狂犬病病毒。其基因组的模块化组织便于通过反向遗传学进行基因修饰，并提供比大多数更复杂的DNA和正义链RNA病毒更大的操控性。 使用弹状病毒载体的优点包括转基因大小（高达6 kb），这允许表达多价弹状病毒疫苗的多种抗原，细胞质复制，这降低了病毒整合到宿主基因组的可能性，低或不存在预先存在的免疫力，以及在组织培养中高滴度复制（表2）。基于弹状病毒的疫苗候选物主要使用狂犬病病毒和VSV。许多基于弹状病毒的载体是减毒的复制型，尽管也设计了单周期载体。此外，在基于VSV的伪型载体中，G蛋白（病毒神经毒性的主要贡献者）被另一种糖蛋白所取代。然而，复制缺陷的弹状病毒载体疫苗的免疫原性较低。 已开发了相当数量的重组狂犬病病毒，用作针对HIV、淋巴细胞性脑膜炎病毒、埃博拉和马尔堡病毒、拉沙热病毒、裂谷热病毒和SARS-CoV-2等多种病原体的疫苗载体。特别是，表达拉沙热病毒糖蛋白复合物的狂犬病病毒载体疫苗，是一种针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的灭活双重候选疫苗。这种载体在小鼠和豚鼠模型中诱导了针对拉沙热病毒和狂犬病病毒的持久体液反应，并提供了针对拉沙热病毒的有效保护。 与狂犬病病毒不同，VSV会在牛、马和猪中引起疾病，但不会在人类中引起。编码外源蛋白的重组VSV是针对HIV、EBOV、结核病和SARS-CoV-2等疫苗载体的优秀候选物。使用VSV载体进行的首次成功试验之一是使用基于VSV的载体编码流感病毒血凝素抗原对小鼠进行疫苗接种。还开发了针对致命的新兴副黏病毒亨德拉和尼帕病毒的基于弹状病毒的疫苗候选物。在许多情况下，受体结合G糖蛋白被免疫原所取代。如上所述，VSV的G糖蛋白也可以被纳入伪型慢病毒载体。 至少有两种基于重组VSV的疫苗已获准用于人类，即rVSV-ZEBOV和GamEvac-Combi，后者结合了表达EBOV包膜糖蛋白的重组VSV和Ad5（表3）。 3.5.副黏病毒载体 副黏病毒科由具有负义单链RNA基因组的包膜病毒组成。副黏病毒基因组的组织与弹状病毒相似，编码五种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、附着糖蛋白（HN/G）和大聚合酶（L）（图1c）。与弹状病毒类似，副黏病毒的模块化基因组便于通过反向遗传学进行操作。麻疹病毒（MV）于1995年首次恢复，NDV于1999年恢复。许多基于副黏病毒的疫苗载体基于MV、人副流感病毒3型（HPIV3）和NDV。 基于副黏病毒的载体提供了几个优点。它们不整合到目标细胞的基因组中，而是仅在细胞质中复制，没有DNA中间体。它们可以容纳6 kb的插入大小，提供高且稳定的异源基因表达，具有黏膜疫苗接种的潜力，制造简单且成本效益高。在NDV载体疫苗的情况下，它们基于卵清的性质使它们适合大规模生产（表2）。 由于使用减毒活麻疹病毒取得了巨大成功，因此很早就开始将其作为疫苗载体用于病毒载体疫苗学领域。不同的麻疹病毒基载体已在针对HIV、RSV、登革热、SARS-CoV、MERS-CoV、基孔肯雅、埃博拉和寨卡病毒、乙型肝炎、西尼罗河和SARS-CoV-2等广泛病原体和病毒的临床前和临床试验中使用。 天然无致病性的NDV株作为家禽业中活减毒疫苗的广泛使用。NDV载体疫苗也已开发用于兽医用途。此外，由于宿主范围有限且缺乏预先存在的免疫力，NDV基载体在人类中使用是安全的。已设计NDV载体来携带来自EBOV、流感病毒、HIV、SARS-CoV和尼帕病毒等的抗原。还描述了使用编码SARS-CoV-2 S蛋白的NDV载体（表3）。 基于HPIV3的载体疫苗已针对EBOV、RSV和SARS-CoV开发，包括针对儿童COVID-19疫苗的候选疫苗，但并未达到MV和NDV载体疫苗的程度。 4.病毒样颗粒  VLPs是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米颗粒，它们模仿病毒颗粒。VLPs不含遗传物质，因此是复制缺陷型和非感染性的。这显著提高了它们的安全性，与减毒活疫苗或重组病毒载体相比，因为不会像病毒载体疫苗那样合成更多的免疫原副本。VLPs可分为两类：非包膜和包膜。非包膜VLPs缺乏外部脂质包膜，而包膜VLPs具有来自宿主细胞的膜包膜，允许糖蛋白抗原被整合到脂质膜中。非包膜和包膜VLPs都可以是单层或多层，并由单个或多个蛋白质组装而成。一个简单的非包膜VLP的例子是HPV VLP疫苗，它由单层组成。流感VLPs是包膜VLPs的一个成熟例子。 病毒样颗粒（VLPs）携带它们自己的特定病毒表位或外来抗原（嵌合VLPs），这些表位安全地刺激体液和细胞免疫反应，并引发强大的免疫原性。VLPs通常表现出与它们起源的病毒的抗原相似性。它们以有组织且高度重复的方式呈现抗原，从而有效激发体液和细胞免疫反应，这归功于具有重复表面的颗粒对B细胞的最佳刺激。此外，VLPs具有激活T辅助细胞的能力，因为它们自然编码激活细胞免疫反应的T辅助细胞表位。通过将特定的病原体相关分子模式（PAMPs）如单链RNA或CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODNs）装入VLPs，可以进一步激活免疫系统。这一特性即使在较低剂量下也增强了VLPs的免疫原性。 来自35个病毒家族的100多种病毒蛋白，包括包膜和非包膜病毒，已被证明能够组装成VLPs。这解释了为什么使用VLPs提供了一个多功能的新兴平台，用于创建提供病毒载体替代方案的疫苗。由于设计的疫苗种类多样以及它们的临床应用，这项技术在近年来经历了显著增长。通常，较低剂量的抗原足以诱导与亚单位疫苗相似的保护反应。病毒蛋白自发组装成VLPs确保了快速高效的生产，允许VLPs经济地大规模生产（表2）。除了用于预防传染病和癌症的疫苗，VLPs还可以用作药物、染料或纳米材料的载体，用于纳米医学。 VLPs是通过将病毒结构基因分子克隆到表达载体中，然后在表达系统中表达这些基因而开发的。大约30%的VLPs是在细菌中生产的，尽管也使用不同的表达系统，如杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物。大肠杆菌表达系统以其易用性和成本效益而著称。然而，由于缺乏翻译后修饰（PTM）系统，它在生产非包膜VLP方面的效用有限。在酵母中的生产具有低成本的生产和维护成本，但引入PTMs（例如，糖基化、磷酸化）的能力有限。相反，杆状病毒-昆虫细胞和哺乳动物细胞系统具有引发更完整的PTM修饰的优势，有助于生产包括多蛋白VLP组装在内的包膜和非包膜VLPs。此外，植物表达系统已成为降低蛋白质生产成本的多功能和有前途的平台。有关设计、生产和开发基于VLP疫苗的不同方法的综述。 第一种基于VLP的疫苗，Recombivax HB，于1986年获得许可用于人类。这是一种在酵母中生产的乙型肝炎VLP疫苗，最早开发于1982年。从那时起，已有几种基于VLP的疫苗被商业化（表3）。Engerix-B是另一种针对乙型肝炎病毒的疫苗，也是在酵母中生产的。Gardasil和Gardasil9是另外两个在酵母中生产的商业化VLP疫苗，它们携带HPV的L1蛋白。最近的研究已经成功生产了携带Gag和p17以及p24蛋白的基于HIV的VLPs。最近批准的两种疟疾疫苗，RTS, S/AS01（Mosquirix）和R21/Matrix M，利用乙型肝炎表面抗原（HBsAg）VLP作为平台，在酵母中形成的VLP表面展示疟疾表位。 Hecolin是唯一能有效预防戊型肝炎的疫苗。它是第一种在细菌中生产的VLP疫苗，携带戊型肝炎病毒的p239截短衣壳蛋白。III期临床试验已证实Hecolin具有高度的免疫原性和效力，证明了它能够诱导显著的戊型肝炎病毒抗体滴度。此外，利用大肠杆菌表达系统有助于成本效益生产。Hecolin于2011年在中国获得监管批准。最近，它作为第三代乙型肝炎疫苗PreHevBio获得批准，该疫苗在哺乳动物细胞中生产。针对疟疾、流感、HPV和西尼罗河病毒的疫苗是其他在细菌中生产的VLP疫苗候选物。杆状病毒/昆虫细胞系统是VLP生产的优选系统，因为它有助于高表达具有许多PTMs的多蛋白VLPs。Cervarix是一种含有HPV 16和HPV 18的L1衣壳蛋白的HPV疫苗，就是这种情况。 针对SARS-CoV-2、流感A、EBOV、腺病毒-7、HPV、HIV-1、乙型肝炎、SARS-CoV、登革热、狂犬病、轮状病毒、诺如病毒和疟疾的不同基于VLP的疫苗最近已获批准或目前正在临床试验中测试（表3）。 5.针对主要传染病和病原体的病毒载体疫苗  在这一部分，我们将总结一些已获得许可用于预防主要疾病或正在几个临床试验中测试的新型疫苗载体。 5.1.埃博拉病毒疫苗 埃博拉是由丝状病毒EBOV引起的一种新兴疾病，已在西非和中非国家引起多次爆发，导致25%至90%的死亡率。迄今为止，可获得的获批埃博拉疫苗基于编码EBV的GP糖蛋白的病毒载体（表3）。Adv5-EBOV是2017年在中国获批的第一种EBV疫苗，基于Ad5载体。Ervebo或rVSV-ZEBOV疫苗是一种活减毒重组VSV基载体疫苗，其中VSV的G蛋白被EBOV扎伊尔物种的GP蛋白所取代。rVSV-ZEBOV是2019年获得FDA批准的第一种抗EBOV疫苗。临床前研究表明，Ervebo在小鼠和非人灵长类动物中对致命EBOV挑战提供保护，主要由抗GP抗体介导。最初由加拿大公共卫生机构开发的疫苗，作为单剂量1毫升剂量给药，并在2018年至2020年持续爆发期间给药超过200,000人。第三种EBOV疫苗是Zabdeno（Ad26.ZEBOV），一种腺病毒载体（Ad26）和Mvabea（MVA-BN-Filo）的两剂量组合，以及编码不同EBOV物种GP蛋白的改良牛痘病毒安卡拉（MVA）载体。GamEvac-Combi是一种异源载体疫苗，已获得紧急使用许可，结合了重组VSV和Ad5表达EBOV的包膜糖蛋白。 此外，许多埃博拉疫苗候选物正在临床前或临床试验中研究，包括使用副黏病毒载体、VSV和狂犬病病毒载体、巨细胞病毒载体和基于VLP的疫苗。 5.2.流感病毒疫苗 流感是由正黏液病毒科的病毒引起的疾病，影响全球15%的人口，每年导致多达645,000人死亡。感染人类的三个主要属是流感A、B和C。正黏液病毒具有负义、单链、分段的RNA基因组，由于遗传突变和基因组重组，经常导致新变种。这一特性使有效疫苗的生产变得复杂。存在于家禽和野生鸟类中的许多禽流感病毒对人类构成人畜共患威胁。除了病毒的不同季节性变种的出现，流感病毒是导致未来大流行的强有力候选者。流感A是开发重组疫苗的主要目标，病毒包膜的血凝素（HA）是主要的抗原靶点。此外，NA、M1、M2、NP和病毒RNA聚合酶复合物免疫原也可以包括在载体中。 基于不同病毒载体的流感A疫苗主要涉及阿尔法病毒、痘病毒和腺病毒，已进入临床试验阶段。此外，副黏病毒、腺相关病毒和疱疹病毒也被考虑用作疫苗载体。特别是，基于Ad5和Ad4腺病毒的疫苗，以及基于非人腺病毒载体（黑猩猩AdC7、AdC68和ChadOx1；牛BAdV-3；猪PAV-3）的疫苗，正在临床前和临床试验中研究。据报道，基于Ad5的疫苗在单剂量下对流感病毒产生了更强大和更有效的免疫反应。编码流感病毒NP和M1基因的ChAdOX载体已完成两个I期临床试验。VXA-A1.1是一种基于Ad5载体的流感疫苗，编码HA免疫原，并使用双链RNA作为佐剂进行给药。VXA-A1.1疫苗也已完成II期临床试验。 此外，基于MVA载体的几种疫苗已在动物模型和临床试验中进行了研究和测试。例如，表达流感A病毒NP和M1蛋白的MVA-NP + M1疫苗（VTP-100载体）在I/2a期临床试验中进行了测试，但未获成功。此外，委内瑞拉马脑炎病毒作为流感疫苗载体也进行了测试。慢病毒载体也被设计为流感病毒平台疫苗，并在临床前试验中进行了测试。具体来说，使用缺陷整合酶的慢病毒载体传递了流感病毒的HA和NP抗原。使用该载体免疫的小鼠对流感病毒表面蛋白持续产生功能性抗体，并引发能够中和病毒致病性的功能性T细胞反应。 最后，在I、II和III期的多个临床试验中测试了基于VLP的流感疫苗的有效性，包括流感B疫苗。一项III期试验评估了针对流感病毒的四价植物源性VLP疫苗。该疫苗的配方包括来自四种不同毒株的HA蛋白，并使用Nicotiana benthamiana作为生产平台。研究结果突出了这种植物源性VLP流感疫苗的免疫原性和安全性。表达HA和不同NA亚型的VLP衍生疫苗被认为是开发通用流感A疫苗的有前途的平台。 5.3.HIV-1疫苗 HIV在1980年代首次被确认，当时它造成了全球公共卫生威胁。该病毒属于逆转录病毒科，如前所述，包含具有单链RNA基因组的包膜病毒，在病毒生命周期中被逆转录为DNA。两种主要的HIV物种感染人类，即HIV-1和HIV-2。主要的抗原蛋白是病毒包膜糖蛋白，Env或gp160，它被蛋白水解激活成受体结合蛋白gp120和融合蛋白gp41。Env蛋白的两个主要特征赋予了它逃避中和抗体和非中和体液及细胞反应的机制。暴露的表位高度变异，具有高突变率，并且蛋白质具有高度的糖基化，使表位无法接触。因此，尽管进行了深入研究，至今仍未商业化有效的HIV疫苗。 为HIV疫苗接种设计了不同的病毒载体。HIV疫苗旨在刺激针对Env蛋白（刺激产生中和抗体）或Gag、Pol和Nef蛋白（刺激T细胞反应）的保守表位的体液和细胞免疫反应。此外，腺病毒载体已被广泛使用。例如，STEP和Phambili IIb期试验测试了编码HIV-1 B亚型gag、pol和nef基因的Ad5衍生疫苗。由于对这些载体的预先存在的免疫力，结果令人沮丧，导致设计了具有不同Ad血清型的载体，如Ad26、Ad35或黑猩猩腺病毒，这些载体已在几个临床试验中进行了测试。 除了腺病毒载体，还基于其他类型的载体设计了几种HIV疫苗，如慢病毒载体。THV01是一种第三代慢病毒疫苗，它是一个复制缺陷型和自失活载体，编码HIV Gag、Pol和Nef蛋白片段。I/II期临床试验表明，这种载体具有高度免疫原性。基于NDV副黏病毒的载体表达gp160 Env和p55 Gag蛋白已在临床前研究中进行了测试。编码env、gag和pol基因的canarypox ALVAC-HIV载体也在III期RV144试验中进行了测试。在这项研究中，病毒载体与增强剂和重组gp120蛋白疫苗结合使用。这次试验对HIV免疫产生了适度的结果。目前正在进行几项正在进行的有效性试验，以进一步阐明RV144试验的发现，包括对各种佐剂的有效性研究。 5.4.SARS-CoV-2疫苗 SARS-CoV-2是最近COVID-19大流行的病原体，是一种属于冠状病毒科的动物源性呼吸道病毒，具有包膜的正单链RNA。表面刺突S糖蛋白是设计针对SARS-CoV-2疫苗的主要靶标。这种蛋白对于病毒进入目标细胞至关重要，因为它在亚基S1和S2上分别具有受体结合和融合活性。 已迅速且成功地开发了针对SARS-CoV-2的安全有效疫苗。此外，目前正在开发大量使用不同平台的SARS-CoV-2疫苗，包括病毒载体和基于VLP的疫苗。 许多疫苗基于复制缺陷型腺病毒载体，编码不同版本的S蛋白或表位，如受体结合域（RBD）。迄今为止，已有四种腺病毒载体疫苗获得批准（表3）。Janssen（Johnson & Johnson）Ad26.COV2–S SARS-CoV-2疫苗是一种复制缺陷型Ad26载体，编码全长S蛋白的前融合构象，于2021年全球获批使用。Gam-COVID-Vac或Sputnik疫苗由基于Ad26载体的异源方案和Ad5增强剂组成，两者都编码全长S蛋白，于2021年春季在俄罗斯作为紧急疫苗获批。Oxford/AstraZeneca疫苗基于黑猩猩腺病毒载体（ChAdOx1 nCov-19），包含编码蛋白S的转基因。Convidecia疫苗基于Ad5（Ad5-nCov9），由中国的CanSino开发。 此外，目前正在进行大量临床前和临床试验。AdCOVID是一种基于Ad5载体的疫苗，表达S蛋白的RBD区域。这种载体可以在小鼠中有效引发粘膜免疫。第二代Ad载体hAd5-S-Fusion + N-ETDS编码刺突和N蛋白。该载体旨在免疫并保护可能的新出现的变种，目前正在进行I期临床试验。GRAd-COV2是第一代大猩猩腺病毒载体，编码在前融合构象中稳定的S蛋白，已在II期临床试验中进行了测试。 一种携带全长膜锚定的S蛋白的慢病毒载体已被证明，在通过鼻内接种后，能够在临床前动物模型中对SARS-CoV-2提供保护。基于新城疫病毒（NDV）的载体表达S蛋白，也已针对SARS-CoV-2设计并在I、II、III期临床试验中进行了测试。NDV-HXP-S载体含有一种增强免疫原性的S蛋白版本，该版本保持了刺突蛋白在稳定的前融合构象。这种疫苗可以在鸡蛋中以低成本高效生产。NDV-HXP-S既适用于活疫苗，也适用于灭活疫苗。I期临床试验表明，通过肌肉注射或鼻内途径给予NDV-HXP-S载体是安全且高度免疫原性的。在泰国，灭活的NDV-HXP-S疫苗已获得紧急使用授权。使用狂犬病病毒（VSV）作为疫苗载体也已针对SARS-CoV-2进行了使用，利用了为设计埃博拉疫苗而发展起来的成熟平台。这些载体表达S蛋白，无论是在其原始未修饰的非稳定构象中，还是在优化的前融合稳定构象中，以及核衣壳。大量的基于改良型安卡拉病病毒（MVA）的疫苗候选物已针对SARS-CoV-2设计并在临床前和临床试验中进行了测试。此外，来自不同病毒的病毒样颗粒（VLP）平台，如流感、新城疫病毒和莫洛尼鼠白血病病毒等，也被用于SARS-CoV-2疫苗的开发。基于VLP的SARS-CoV-2疫苗目前正在临床前和临床研究中，Novavax的NVX-Cov2373疫苗是唯一商业化的针对SARS-CoV-2的VLP疫苗。最近，加拿大批准了植物制造的SARS-CoV-2 VLP疫苗Covifenz。 6.结论性评论  病毒载体最初用于基因治疗，其中第一种疫苗是20世纪80年代开发的天花病毒载体疫苗。自那以后，许多病毒载体疫苗已被设计用于人类疫苗接种，并已成为解决传统疫苗限制的新平台。腺病毒载体在COVID-19疫苗接种中的广泛使用已证明这项技术既安全又有效。此外，病毒载体促进了对新病毒变种和新出现的病毒的新病毒载体的重新设计，并可用于大规模生产。 腺病毒载体是临床试验和批准疫苗中最常用的载体。由于Ad5血清流行率，其他较少见的人类和猴血清型被用作载体。然而，出于安全考虑，更倾向于使用复制缺陷型载体。此外，通常去除载体的病毒复制必需基因和防止宿主免疫反应的基因。这一领域的大量研究导致了第三代载体的设计，主要是腺病毒和慢病毒载体，从而增加了转基因的大小并提高了安全性。 一些病毒载体疫苗已获得人类疫苗接种的许可，然而，许多使用病毒载体疫苗候选物的临床前和临床试验仍在进行中。病毒载体疫苗已在单一试验中进行了测试，并对HIV免疫接种产生了适度的结果。因此，开发针对没有有效传统疫苗的病原体的疫苗，如HIV、丙型肝炎病毒和埃博拉病毒等，至关重要。 VLP是一种新兴的多功能疫苗平台，近年来已被显著用于生产几种商业化疫苗。从这个意义上说，VLP衍生的疫苗被提出作为对抗新出现的病毒和开发通用流感A疫苗的有希望的解决方案。 利用病毒载体和其他技术，如mRNA和蛋白质亚单位疫苗，迅速开发COVID-19疫苗进行全球疫苗接种，突显了这些技术的成功。这一成功强调了拥有基于先前研究的正确平台的重要性，并验证了病毒载体针对新出现的病毒和大流行爆发的有效性。 7.展望  病毒载体和VLP基础疫苗的巨大潜力推动了新疫苗的持续设计。大量针对重要病原体的疫苗，如流感、HIV、RSV、埃博拉病毒和SARS-CoV-2，目前正在开发中，有些处于临床前或临床试验阶段。然而，尽管在开发病毒载体和VLP基础疫苗方面取得了显著进展，但仍需解决许多挑战。具体来说，进一步的研究对于提高其安全性至关重要，解决与预先存在的免疫、可能整合到宿主细胞基因组以及产生致病表型相关的担忧。此外，开发针对主要人类病原体或疾病（如HIV、Epstein-Barr病毒、丙型肝炎病毒和结核病）的有效疫苗至关重要。努力还应集中在创建通用流感疫苗和发展新的载体以免疫针对新出现的变体上。此外，改进多价疫苗、克服扩大病毒载体在被动免疫中使用的挑战，以及推进病毒载体在预防性或治疗性癌症疫苗中的应用，是未来研究的关键领域。 为了推动人用及兽用疫苗行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展将于2024年8月16日-17日在苏州共同举办“第三届新型疫苗研发峰会”。诚邀全国相关领域专家、学者和企业家共享学术盛会。现将有关事宜通知如下。 名称：2024第三届新型疫苗研发峰会 时间：2024年8月16-17日（周五-周六） 地点：苏州（酒店定向通知） 主办单位：四叶草会展、生物制品圈 媒体支持：药时空、抗体圈、细胞基因研究圈 会议费用：点击二维码即可查询。 报名方式：扫描下方二维码→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，免交报名费，承担一定工作任务）！ 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