BEAM-201

作者 | 赵宝龙、华坚、张长风来源 | 中国医药导刊摘  要以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的免疫细胞治疗产品为多种癌症的治疗策略带来了突破性改变，但实体瘤疗效以及异体使用等问题仍阻碍细胞治疗领域的进一步发展。基因编辑技术可以通过改造免疫细胞的生物学功能来克服上述技术瓶颈。其中，规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）技术由于具备成本低、准确度高等特点而成为目前最常用的基因编辑工 具。因此，CRISPR也被认为是开发下一代细胞治疗产品的关键。然而，作为一种新兴技术，CRISPR会在细胞产品中诱导非预期的基因改变，并对临床应用带来潜在风险，而行业内对此类风险的了解仍非常有限。本研究结合细胞治疗领域的最新研究情况， 概述CRISPR技术在细胞治疗产品中的研究进展，总结2016—2024年全球开展的基于CRISPR技术的细胞产品的临床试验情况， 重点描述临床研究类型、基因编辑靶点、适应证种类等要素，并基于国内外政策法规与临床实践情况，分析CRISPR技术相关细胞 产品的基因风险以及评估策略，以期为该类产品的临床开发和监管政策制定提供借鉴。关 键 词CRISPR；基因编辑；细胞治疗；药品监管；监管挑战以嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）和T细胞受体T细胞（TCR-T）为代表的细胞治疗技术在最近10年中迎来了爆发，而基因编辑（genome editing）技术一直伴随着细胞治疗行业的发展［1，2］。这两种技术结 合后的产品被称为基因编辑细胞治疗（genome edited cell therapy）。基因编辑细胞治疗这一名称中的“基因编辑”特指以规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic  repeats， CRISPR）等技术对T细胞功能进行改造，以区别于使用逆转录病毒或非病毒载体使T细胞表达CAR蛋白的基因修饰过程［3］。目前，细胞治疗行业正面临着实体瘤效果不佳和无法异体使用两大挑战，越来越多的研究者尝试将基因编辑技术与CAR-T等细胞产品相结合以解决这两个问题［4］。因此，基因编辑细胞治疗成为下一代细胞治疗发展方向之一。 本研究结合细胞治疗领域的最新研究情况，重点探讨基于CRISPR技术的基因编辑细胞产品的技术发展、临床应用以及监管挑战，以期为该类产品的临床开发和监管政策制定提供借鉴。01基因编辑细胞治疗技术发展概况基因编辑细胞治疗的研发策略分为3类：第1类是通过基因编辑来改善T细胞的抗肿瘤作用。 Fraietta等［5］研究发现，1例接受CD19 CAR-T细胞回输的癌症患者所回输的CAR-T细胞中的甲基胞嘧啶加双氧酶（TET2）基因被意外破坏，导致CAR-T细胞获得了更强的扩增和体内存留能力，并最终诱导了癌症的完全缓解。由此，使用基因编辑工具破坏TET2成为行业内重点关注的改善CAR-T临床疗效的策略之一［6］。与TET2类似的其他基因编辑靶点还有促进T细胞记忆功能的FOXO1、对抗耗竭的Reg⁃nase-1、以及免疫检查点如程序死亡蛋白1型（PD-1） 等［7］。第2类是通过基因编辑消除T细胞的移植物抗宿主（graft versus host， GvH）以及排异作用，从而实现T细胞产品的异体使用。这类产品通常是通过基因编辑工具破坏T细胞受体（T cell receptor， TCR）α链、 β链和人白细胞抗原（human leukocyte antigen， HLA） 1 型、2型等，具体包括敲除TRAC、β2M、RFXANK、 CIITA等基因，以及插入β2M-HLA-E和β2M-HLA-G 等基因［8］。第3类则是通过基因编辑赋予T细胞某种与抗肿瘤不直接相关的生物学新特性，如敲除CD52 使T细胞可以耐受特定抗体药、敲除CD5以避免 CAR-T的自相残杀、敲除干扰素γ来降低细胞因子风 暴等不良事件的发生概率、以及敲除CD33使CAR-T 可以与自体造血干细胞移植联用［9-11］。 基因编辑细胞治疗产品常用的基因编辑工具包括锌指核酸内切酶（ZFN）、转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）、CRISPR等［4］。其中，CRISPR被称为第3代基因编辑技术。目前，最常见的是CRISPR/Cas9系统，由CRISPR序列和Cas9核酸内切酶两部分构成。CRISPR/Cas9的工作原理：首先由向导RNA （guide RNA， gRNA）与Cas9蛋白相结合形成复合物，之后在gRNA的引导下，Cas9蛋白对特定DNA序列予以切割，引发DNA双链断裂（DNA double strand break， DSB），断裂处的DNA片段就有可能出现基因敲除、插入等作用，从而实现对指定位点的基因编辑［12］。CRISPR在其发展过程中衍生出多个版本，在应用范围和精准程度方面各有特点。目前进入临床应用阶段的有CRISPR/Cas系统和碱基编辑（base editing）两种。其中，CRISPR/Cas系统是最成熟的CRISPR技术。部分版本，如CRISPR/Cas13d，可以一次实现多至10个基因位点的多靶向基因敲除［4］。碱基编辑是使用Cas切口酶（Cas9 nickase，Cas核酸酶的异构体）代替Cas核酸酶，从而实现单碱基对的修改［13］。目前可实现A：T→G：C以及C：G→T：A这两种碱基编辑。由于不需要诱导DNA双链断裂，该技术能降低染色体易位风险和p53相关细胞毒性。此外，还有Prime editor等多种新版CRPSIR技术在临床前研发阶段之中［14］。02基于CRISPR的基因编辑细胞治疗的临床应用基因编辑细胞治疗的临床试验数量在近几年快速增多。CRISPR由于具有成本低、操作便捷、准确度高等特点，比ZFN和TALEN有更大的竞争优势。 2014年，Tebas等［15］研究发现，使用ZFN破坏艾滋病患者的CD4+ T细胞中的CCR5基因可用于艾滋病的治疗。2015年，法国公司Cellectis使用基于TALEN技术的通用型CD19 CAR-T产品成功救治1名患白血病的1岁女婴蕾拉，让通用型CAR-T技术正式进入公众视野［8］。2016年，宾夕法尼亚大学向美国FDA递交了全球首个基于CRISPR技术的基因编辑细胞治疗产品的新药临床试验（IND）申请，其产品为通过 CRISPR/Cas9敲除TCR以及PD-1的靶向NY-ESO-1的TCR-T，并于随后完成了3例癌症患者的治疗，证实了基于CRISPR的基因编辑细胞产品的临床安全性与可行性［16］。此后，CRISPR快速取代ZFN和TALEN，成为基因编辑细胞治疗领域的主流技术之一［17，18］。 通过对药智数据库收录的相关数据采用 “CRISPR”作为关键词，本研究检索了2016年1月至2024年11月基于CRISPR的细胞产品在全球开展的临床试验数据情况（见表1）。由于本研究仅针对基于CRISPR的细胞产品，所以非细胞类基因治疗（如采用CRISPR治疗镰刀型细胞贫血或β地中海贫血） 的临床开展情况并未被纳入。表1 基因编辑细胞产品相关临床试验检索结果显示，2016~2024年，基于CRISPR的基因编辑细胞治疗相关临床试验的全球登记数量总计37项，包括2016年（1项）、2017年（5项）、2018年 （3项）、2019年（3项）、2020年（9项）、2021年（3项）、 2022年（6项）、2023年（4项）、截至2024年11月7日 （3项）。①相关临床试验场地方面，以美国和中国的数量最多，分别包括美国19项（占比约51.4%）、中国12项（占比约32.4%）。除此之外，其他地区如加拿大、欧盟国家共6项（共计占比约16.2%）。②临床试验分期方面，以I期临床试验为主，包括I期18项（占比约48.6%）、I/II期12项（占比约32.4%）、II期1项（占比约2.7%），不适用（not applicable）6 项。 ③研究类型方面，干预性研究35项（占比约94.6%）、 观察性研究2项，均为接受基因编辑细胞治疗的患者的长期随访。④基因编辑细胞治疗技术涉及疾病领域的种类较为集中，主要围绕肿瘤领域展开。其中，血液及淋巴疾病相关的试验数量22项（占比约59. 5%），主要为白血病、淋巴瘤等血液系统肿瘤。⑤血液瘤相关靶点中，CD19靶点10项，占比远超其他血液瘤靶点，而BCMA虽与CD19同为已上市细胞产品的靶点，但仅有2项临床。实体瘤临床试验15项（占比约40.5%），包括肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等多种实体瘤，涉及靶点较多，占比也较为平均，如NYESO-1，间皮素（mesothelin），CD70、CLL-1等，以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）等非靶向型细胞产品。⑥此外，为强化细胞产品临床疗效而使用CRISPR敲除PD-1的临床试验11项（占比约29.7%），远超同类靶点如CISH、CTLA-4、Regnase-1、TGFBR2。使用CRISPR敲除TCR（主要为TRAC）的临床试验15项（ 占比约40. 5%）。敲除HLA（主要为B2M）的临床试验10项 （占比约27.0%）。对TCR和HLA敲除的绝大多数为异体回输的细胞产品，但也有少量自体细胞产品（如NCT03399448）选择敲除TCR以减少外源和内源TCR发生错配的概率。所有临床试验中，使用CRISPR编辑基因数量为1~2个的共计27项（占比约72.9%）， 仅有少数临床试验有3个或3个以上的多基因编辑。对现有临床试验进行检索的结果显示，基于CRISPR的基因编辑细胞产品在临床上应用是安全且可行的，并在某些方面展现出对自体细胞产品的优势。但是，对比已有上千项临床试验开展的自体CAR-T和TCR-T类细胞产品，基于CRISPR的基因编辑细胞产品的临床数量并不多［17］。从靶点和疾病领域可以看到，最主要的临床应用领域仍然是细胞治疗最先取得突破的血液肿瘤领域，靶点则为CD19这一最常见、最成熟的靶点。CRISPR技术的主要作用是在已有细胞治疗产品的基础上通过敲除PD-1来获得更强的临床疗效，或敲除TCR及HLA以实现异体回输，均属于对已有细胞疗法的改良升级［19］。另一方面，虽然CRISPR技术已经出现包括碱基编辑在内的多种衍生版本，并且已有相关产品获得美国FDA或我国药品监管部门的新药临床研究申请（IND）批准，但进入临床应用的绝大多数产品仍然是基于经典的CRISPR/Cas9体系的单基因或双基因编辑［20］。 综上所述，目前基于CRISPR的基因编辑细胞产品虽然呼声较多，但临床应用仍未全面铺开。这除了技术本身的原因以外，还因为新兴技术从实验室研究阶段到大范围开展临床试验本就需要时间，此类技术尚在推进过程中［12］。考虑到此类产品在科研及非临床研究中展现出的技术潜力和行业认可，接下来的3~5年内，基于CRISPR的基因编辑细胞治疗产品可能将进入临床研究实质阶段，在技术类型、靶点分布、临床数量、适应证种类方面均可能将会不断增长。03基于CRISPR的基因编辑细胞治疗的监管挑战基于CRISPR的基因编辑细胞产品大量进入临床研究阶段后，必将对监管部门提出新的挑战。在监管方面，美国FDA已经发布了2个相关指导原则， 即2024年1月正式颁布的《Human Gene Therapy  Products Incorporating Human Genome Editing》以及《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor T cell Products》。我国监管机构在《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》与《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》中均有部分段落涉及基因编辑细胞产品，但尚无对该类产品的针对性的、全面的政策指引［21-24］。 基因编辑细胞产品作为细胞产品的一个新兴亚种，其在风险管理和监管要求上体现出与CAR-T等传统细胞产品所不同的特点，也对监管提出了新挑战。在临床应用方面，基于CRISPR的基因编辑细胞产品主要在基因编辑效率、脱靶、多基因编辑的风险叠加等方面展现出临床风险。3.1基因编辑效率在基因编辑效率方面，CRISPR的在靶（on target）编辑效率已经较ZFN或TALEN有所提高，但因技术原理限制，其总体编辑效率仍无法达到临床要求。CRISPR技术的原理是通过gRNA在指定的DNA位点诱导双链DNA断裂，然后断裂位点就有可能通过非同源末端连接通路（nonhomologous end joining pathway，NHEJ）完成基因编辑。但NHEJ本身是概率发生，所以理论上CRISPR无论敲除或插入都不可能达到100%的编辑效率［25］。现有的临床前及临床数据也印证了这一观点。Stadtmauer等［16］报道的全球首个CRISPR/Cas9基因编辑细胞产品的临床试验中，3个靶基因TRAC、TRBC和PDCD1的敲除效率分别是45%、15%和20%。通过优化gRNA序列设计、改良敲除工艺、选择优质供者细胞等方式可以提高基因编辑效率，在较为理想的情况下能达到89. 4%~92. 5%［26，27］。这种编辑效率如果是敲除PD-1等抗肿瘤效能相关基因的话尚且可以接受，但对于TCRα/β链或CD33等安全性相关的基因则无法有效消除潜在的临床风险。以TCRα/β链为例，基因敲除的目的是消除细胞产品异体使用时的GvH风险，但这需要足够高的敲除效率才能保证临床安全性。根据美国FDA的指导原则，异体使用细胞产品中TCRα/β+细胞的接受范围是<1~7×104/kg患者体重。按照成人平均体重及目前常见的细胞治疗临床使用剂量换算，可接受限度是<1%，也就是敲除效率应>99%［21，22］，这是目前CRISPR技术达不到的。针对这一问题的常见补救性措施是，在基因敲除后增加磁珠阴选或者流式分选等纯化步骤，以进一步降低TCRα/β+细胞的含量［28］。但这并未消除TCRα/β+细胞含量偏高的问题，只是将问题从基因敲除转移到了磁珠阴选，要求阴选后TCRα/β+细胞<0.5%~1%， 这对磁珠阴选的效率和工艺稳定性也是重大挑战。此外，增加纯化步骤会让本已复杂的CRISPR类细胞产品的生产工艺变得更为复杂，并且还会引入诸如无菌管理、磁珠等工艺相关杂质残留的问题［29］。 3.2脱靶基于CRISPR的基因编辑细胞产品的另一个监管挑战是脱靶（off-target）。CRISPR的脱靶具体可分为结构性基因重排、异倍体、脱靶突变等多种类型， 均与潜在的临床重大风险相关［30，31］。无论美国FDA还是我国监管机构都对CRISPR的脱靶问题非常关注，但实践中最大的挑战是缺乏对CRISPR脱靶情况可靠、有效的检测手段［25，32］。目前，常用的脱靶检测手段主要有计算机预测、传统方法、新型测序，共计3类。其中，计算机预测是大部分CRISPR类产品都会采用的脱靶风险控制手段，但只能提供理论可能性而非事实证据，因此无法满足监管要求［33］。脱靶检测的传统方法包括荧光原位杂交（fluorescence in  situ hybridization， FISH）、核型分析，以及一系列基于PCR的检测方法。这些检测方法相对成熟，但缺点也很明显，包括只能检测预先指定的有限序列范围、检测对象必须是活细胞、流程繁琐且成本高昂等［25］。针对CRISPR这类新兴基因编辑技术，多种新型测序方法也被陆续开发出来，包括GUIDE-seq、DISCOVER seq、SITE-seq等。这些新型测序方法各有特色，但共同的优点是可以对细胞产品进行全基因组层面的高精度扫描，发现传统方法遗漏的突变位点，因此可以提供更全面客观的脱靶检测［29，34］。但是，新型测序方法也具有自己的劣势。如GUIDE-seq检测需要使用双链寡脱氧核苷酸作为“标签”来标记脱靶位点，不能像传统方法那样用于指定批次细胞产品（如某一特定患者回输的批次）的检测［25］。此外，这些测序方法出现的时间短，产生的数据量大，缺乏明确的结果判定标准，因此容易对结果进行挑选或者做出带有主观偏向性的数据解读，从而掩盖脱靶风险。目前， 比较可行的策略是将传统方法和新型测序结合使用，两类方法优缺点互补，但可能不可避免地会带来工作量增加和成本上升。 3.3多基因编辑的风险叠加现有的CRISPR技术可同时完成10个位点的基因编辑，而多基因编辑对比于单基因编辑所带来的是临床风险的指数倍叠加［35］。单基因编辑的临床风险总体可控。常见的第2代CAR-T类细胞治疗产品采用慢病毒或逆转录病毒导入CAR基因就是一种单基因编辑。虽然美国FDA要求已上市的CAR-T类产品在说明书中增加因CAR基因导入而发生继发肿瘤的黑框警告，但进一步的调查研究显示，继发肿瘤的发生率并不高。如对接受慢病毒转导CAR-T的420人进行最长10年的随访，7人（1.7%）发生继发肿瘤， 而接受逆转录病毒转导CAR-T的340人中13人（3. 8%）发生继发肿瘤，整体发生率和仅接受标准化疗的同类患者持平［36-38］。但这一结论并不适用于多基因编辑的细胞产品。①多基因编辑中的每个被编辑基因都带来独立的脱靶可能性，增加了脱靶出现在原癌基因等高风险区域的风险。②多个被编辑基因各自具有的生理功能有可能出现相互作用，从而对细胞产品产生难以预料的影响。Wang 等［39］研究发现，15例患者接受基因编辑的间皮素CAR-T回输后，同时敲除TCR和PD-1会导致CAR-T在人体内的维持性下降，而这是细胞产品设计时未曾预料到的。此外，还应注意到，大部分细胞产品是有可能长期存留于患者体内的，因此存在潜在的长期安全性风险。如CRISPR的脱靶突变是随机或半随机的，可能导致回输时细胞产品中T细胞克隆突变的多样性增高，任一特定克隆都很难占据压倒性比例。但是，当基因编辑细胞产品回输进入人体后，人体内环境会对这些突变克隆进行筛选，那些在扩增和体内维持性能方面得到强化的突变克隆（也是更高概率发生成瘤或不受控制过度扩增的克隆）会有更高的概率留存下来，从而在数月甚至数年之后出现寡克隆富集的情况，即所谓“随机突变，定向筛选”［40，41］，导致临床上出现此类风险的概率比理论预计的更高。此外，TCR会通过克隆竞争（clonal competition）机制来抑制T细胞肿瘤的形成，所以敲除TCR的T细胞产品本身就比正常T细胞更容易转化为T细胞肿瘤［4］。目前，对多基因编辑叠加产生的风险还缺乏有效的检测或评估手段。较为常用的是细胞功能性实验，如细胞体外扩增实验、软琼脂和裸鼠成瘤实验等［29］。美国Beam公司开发的四敲除异体通用CAR-T产品Beam-201就在IND申请过程中被FDA要求追加细胞因子非依赖性扩增实验（cytokine independent growth assay）［20］。也有研究发现，采用全基因组CRISPR筛选联合单细胞RNA测序来进行评估，对比传统方法能展现出一定优势，但这种方法还处于开发阶段，尚不具备大规模推广的条件［42］。而长期安全性风险的应对手段主要依赖随访。目前开展的临床试验研究中，采用3个及3个以上的多基因编辑技术的细胞产品数量并不多。不过，随着领域的发展和技术的进步，越来越多的多基因编辑细胞产品必然会逐渐出现在人们的视野中。04结  语以CAR-T和TCR-T为代表的细胞治疗产品为肿瘤等多种重大恶性疾病带来新的治疗策略，而基于CRISPR的基因编辑细胞产品则有希望解决细胞产品所面临的实体瘤治疗和异体通用使用这两大难题。但是，CRISPR等基因编辑技术会带来复杂的基因层面变化与潜在临床风险，这对临床应用和监管都提出了挑战。而为了应对这一挑战，学术界、产业界与监管机构需要保持深入的合作交流，来促进细胞治疗领域的有序发展。作者简介赵宝龙上海医药集团生物治疗技术有限公司（注册部 高级经理）在细胞治疗领域工作十余年，曾担任多家大型制药公司注册事务管理人员。在药厂厂房建设、实验室建设、质量控制、体系搭建、确认与验证、技术转移、注册与申报、实验室日常运营等方面具有丰富的实践经验，参与过多家公司多个细胞治疗产品的技术开发，临床申报和注册申报，均获得了临床批件和/或生产批件，对国内外法规有丰富的实战经验，数次参加与CDE等药政监管部门沟通交流会。文献：赵宝龙，华坚，张长风. 基于CRISPR的细胞产品的临床应用及监管挑战［J］. 中国医药导刊，2025，27（1）：101-108.声明：本文仅代表作者个人观点，不代表任何组织及本公众号立场，如有不当之处，敬请指正。如需转载，请注明作者及来源：蒲公英Biopharma。拓展阅读浅谈PIC/S GMP质量体系建立的几点关注探索CAR-T细胞制备失败的风险因素