Nusinersen sodium

核酸治疗药物通过核苷酸的工程序列达到选择性调节基因表达之目的。常见的核酸药物包括反义寡核苷酸 （ASO）、适配体（aptamers）、短干扰 RNA （siRNA） 和microRNA （miRNA） 的药物。这些药物的作用机制不同于传统药物，其可以通过改变其序列、结构或化学修饰来精确控制，并且它们的灵活性允许根据疾病的特定需要定制药物。 ASO 技术起源于 1978 年的一项研究，使用15 或 20 个核苷酸的合成链直接补充 Rous 肉瘤病毒的短 RNA 序列。基于沃森-克里克碱基配对理论，提出了将靶 RNA 视为 ASO 受体的概念。此外，RNA 干扰 （RNAi） 于 1998年首次被描述为由双链 RNA （dsRNA） 启动的序列特异性基因沉默过程，引发了药物开发商对其抑制特定基因表达潜力的极大兴趣。2006 年，Andrew Fire 和Craig Mello 因发现 RNA 干扰 （RNAi） 而获得诺贝尔医学和生理学奖。递送系统的发展进一步拓宽了 RNAi 的潜在应用，特别是对罕见疾病和癌症的治疗。与传统的小分子和蛋白质药物相比，核酸药物具有得天独厚的优势。从根本上说，传统小分子药物和抗体药物的主要靶点是蛋白质，但只有 1.5% 的人类基因组可以编码蛋白质，其中 80% 是传统药物的不可成药靶点。与传统药物不同，核酸药物通过与相关核酸结合来调节靶点表达，这意味着核酸药物理论上适用于任何治疗靶点。此外，一旦知道靶基因的碱基序列，设计与靶基因结合的核酸药物就相对容易。最后，由于核苷酸合成过程简单，成本低，核酸药物的研发相当容易获得。第一个 siRNA 药物 patisiran 于 2018 年获得 FDA 批准，第二个siRNA 药物 givosiran 于 2019 年获得批准，siRNA 药物已进入快速开发阶段。小核酸药物发现到临床应用时间轴根据其分子机制，治疗相关核酸大致可分为八类：适配体、siRNA、miRNA、ASO、小激活 RNA （saRNA）、PIWI 相互作用 RNA （piRNA）、信使 RNA （mRNA） 和质粒 DNA （pDNA）。ASOs：ASO 是长度为 18-30 个核苷酸的短合成单链寡核苷酸，通过阻断 RNA 的功能来调节基因表达。已经确定了 ASO 发挥其功能的两种主要机制：RNase H1 依赖性切割和空间位阻。RNase H1依赖机制（RNA切割）通过结合目标RNA后（核/细胞质），RNase H1剪切靶RNA链（距离双链区5’端7-10nt）。RNase H1非依赖机制（空间调控）通过高亲和力结合产生空间位阻修饰基因表达而不降解RNA。ASO 还可以通过与前体mRNA 结合来改变蛋白质的生物学特性，结合pre-mRNA隐藏剪切信号。单链 ASO 对细胞内核酸酶降解不稳定，并且与靶 RNA 严格互补。这些特性表明，通过序列变异优化 ASO 特性的能力是有限的。因此，化学修饰的核苷酸或特异性序列被掺入，以增加 ASO 的结合亲和力和对核酸酶降解的抵抗力。核酸适配体（Aptamers）：适配子是具有独特三级结构的短单链核苷酸，通常为 20 至 100 个核苷酸的 DNA 或 RNA。其具有多种二级结构，如发夹、内环、凸起、假结和 G 四聚体，可以识别、结合并随后以阻断靶分子，就像抗体一样工作。与体内合成的抗体相比，适配体具有成本低、免疫原性低、合成时间短、特异性高等优点，适配子甚至可以设计为结合普通抗体无法识别的隐藏表位。通常，高亲和力适配体是使用称为配体系统进化的体外程序从随机文库中选择的。siRNAs：siRNA 是由 20-25 个碱基对组成的双链 RNA 分子，其中两个核苷酸悬垂在 3' 末端。每个分子都有一个 5' 磷酸基和一个 3' 羟基。siRNA 有两条链，一条是引导链（也叫反义链），可以引导核酸酶切割靶基因;另一个是 Passenger Strand（也称为 Sense Strand）。将双链 siRNA 引入细胞质后，Argonaute 2 蛋白 （AGO2） 清除乘客链，释放引导链，与 Dicer 和反式激活反应 RNA 结合蛋白 （TRBP） 形成 RNA 诱导沉默复合物 （RISC）。在引导链与特异性 mRNA 结合后，靶 mRNA 被切割，这一过程由 AGO2 介导，断裂的 mRNA 无法维持结构稳定性，随后降解，导致靶基因下调。miRNA：miRNA沉默基因表达的机制与 siRNA 相似。内源性 miRNA 从初级 miRNA （primiRNA） 发展到成熟 miRNA 需要几个步骤。首先，pri-miRNA 是从细胞核中带有 RNA 聚合酶 II 的 miRNA 基因转录而来的，DGCR8与Drosha切割生成pre-miRNA，EXP5转运pre-miRNA到细胞质→ Dicer切割为双链miRNA，引导链（miRNA）结合Argonaute形成miRISC复合体，通过3’-UTR种子序列结合mRNA，完全互补配对 → mRNA降解，不完全互补配对 → 空间位阻抑制翻译。piRNAs：piRNA 是一类单链小非编码 RNA （ncRNA），长度为 26-31 个核苷酸。piRNA 的概念于 2006 年 7 月提出。几个研究小组几乎同时报告说，一类新的 ncRNA 通常与 PIWI 蛋白结合，导致转座因子沉默，这与 siRNA 和 miRNA 的机制不同。piRNA 簇通过细胞核中的 RNA 聚合酶 II 转录为初级 piRNA （pri-piRNA），类似于 miRNA 的过程。单链 pri-piRNA 随后被转运到细胞质中的 Yb 小体，Zuc切割 → PIWI蛋白结合形成前体 → 3’端甲基化修饰 → 成熟复合体入核。成熟的 piRNA 还可以通过“乒乓”循环进行扩增。piRNA 调节基因表达的三种主要途径。piRNA 可与 PIWI 蛋白形成 piRNA 诱导的沉默复合物 （piRISC），导致细胞核中的转录基因沉默和细胞质中的转录后基因沉默。piRISC 还可以与蛋白质结合以促进与多种蛋白质的相互作用。piRNA 主要调节癌细胞的发生和进展，特别是在增殖、迁移、转移和凋亡方面。因此，靶向piRNA 提供了一种有前途的治疗策略。新兴研究表明，piRNA 可用于调节导致肿瘤发生的通路，为治疗干预提供了新的途径。saRNAs（小激活RNA）：saRNAs是由 21 个核苷酸组成的双链 RNA，其中 2 个核苷酸悬在 3' 端，可通过RNA 激活增加靶基因的表达。分子作用机制主要包括以下步骤：saRNA双链进入细胞质后与AGO2蛋白结合，在RNA解旋酶A（RHA）作用下解链；通过导入蛋白-8（importin-8）介导进入细胞核；引导链结合靶基因启动子区域，募集PAF1复合物形成RITA复合体；最终激活RNA聚合酶II启动转录并延长，促进靶蛋白表达。与 siRNA 和 miRNA 触发的基因下调相比，saRNA 诱导的基因表达激活持续时间更久。然而，需要更高浓度 （nM） 的 saRNA 才能达到治疗效果，而 siRNA 可以在相对较低的浓度 （pM–nM） 下起作用。与 mRNA 相比， saRNA 在大规模生产中具有优势，因为它们的核苷酸数量较低，从而大大降低了成本。较小的 saRNA 可能比较大的 mRNA 分子更易递送。此外，saRNA 利用内源细胞的基因调控机制来激活基因表达，可降低有害的过表达和免疫原性的风险。不同小核酸药物作用机制示意图核酸的修饰静脉注射到靶组织中的未修饰裸核酸可被 RNase 快速降解并从血液中清除，化学修饰对于产生有效的核酸药物至关重要.化学修饰的主要目标包括增加小核酸与靶序列的结合，增强核酸酶稳定性，优化药代动力学特性，和最小化副作用。核酸的结构修饰：核糖核苷酸的结构可以通过化学修饰核苷酸碱基、糖基团或核苷来改变。糖基修饰：2’端修饰 【2’-氟 (2’-F)，2’-O-甲基 (2’-OMe)2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-MOE)】；糖环结构改造【约束乙基(cEt)：LNA结构类似物（含额外甲基）， 特点：提升血清稳定性、降低脱靶效应；乙二醇核酸(GNA)：无环核酸类似物；锁定核酸(LNA/ BNA)：4’C-2’O亚甲基桥；三环DNA(tcDNA)：构象限制型类似物；解链核酸(UNA)：2’,3’开环RNA】。碱基修饰：【尿嘧啶替代，腺嘌呤替代，胞嘧啶甲基化，硝基吲哚替代】。主链修饰：【硫代磷酸酯 (PS) 改造，戊糖替代】。磷酸骨架修饰Backbone modifications：降低寡核苷酸药物的净负电荷以提升递送效率是常见策略。核心方法是对磷酸二酯键（PO键）的非桥连氧原子进行非离子化修饰。硫代磷酸酯（PS）（最常见）：化学性质类似PO键，但显著提升代谢稳定性。如：甲基膦酸酯（MP）、甲氧基丙基膦酸酯（MOP），二硫代磷酸酯（PS₂）、磷酸酰胺（PA），硒代磷酸酯（PSe）、**硼烷磷酸酯（BS）**等。此外，磷酸二酯键的3’-桥连氧原子可替换为碳（3’-甲叉膦酸酯）或氮（N3’-磷酸酰胺），甚至完全替换：C3’-酰胺修饰（3’-CH₂-CO-NH-5’）：通过预组织糖环构象增强生物活性；甲叉亚胺（MMI）（3’-CH₂N(CH₃)-O-5’）：无手性、可完全抵抗核酸酶；疏水性甲酰缩醛键（3’-O-CH₂-O-5’）：提升RNA双链稳定性，但削弱DNA双链；硫代甲酰缩醛键（3’-S-CH₂-O-5’）：同时提升稳定性及对靶RNA亲和力。核酸递送系统理想的递送系统应具有高载药效率和足够的安全性，保护核酸免受快速降解和特异性靶向。脂质纳米颗粒 （LBNP）：BNPs 是具有良好的生物相容性和可降解性的球形纳米颗粒，是目前最有前途的递送载体。LBNPs根据其组成可分为五类：脂质体、脂质纳米颗粒（LNP）、脂质纳米乳剂（LNE）、固体脂质纳米颗粒（SLN）和纳米结构脂质载体（NLC）生物肽：细胞穿透肽 （CPP） 和归巢肽由 5-30 个氨基酸组成，与生物分子和细胞相互作用以提高核酸递送效率。不同大小和结构特征的肽具有更有效载荷能力和生物相容性等优点，具有广泛的应用范围。此外，合理设计的肽可以克服一系列生物障碍，如内体逃逸、细胞内化以及与生物分子和细胞的相互作用，从而提高核酸递送效率。这些材料的侧链可以携带各种活性官能团，这些官能团可以通过化学修饰来增强药物递送系统。此外，肽还可以作为功能片段整合到药物递送系统中。多聚体：聚合物通过其固有的质子海绵行为静电结合带负电荷的核酸，提供保护并促进细胞摄取。聚合物的进一步化学修饰优化了转染效率、生物相容性、细胞选择性和体内分布，并降低了细胞毒性。一般来说，合成聚合物和天然聚合物是完全不同的。源自植物、动物和微生物等天然来源的聚合物具有生物相容性、机械性能、生物降解性和可再生性等优点，而合成聚合物更容易生成和改性，由于其结构和机械性能而已广泛应用。外泌体：外泌体（也称为细胞外囊泡）是纳米大小的囊泡，范围从 30 nm 到 150 nm，由各种蛋白质和 RNA 组成，周围环绕着脂质双层膜，结构类似于脂质体，天然外泌体来源于质膜的内吞作用，核酸装载有两种主要类型，主动装载和被动加载，前者包括机械挤出、超声处理、电穿孔和重复冻融循环和，后者包括直接孵育和外泌体转染。载有核酸的外泌体可以通过不同的摄取途径被细胞内吞，包括网格蛋白包被的 PIT 介导的内吞和微胞饮作用，吞噬细胞的外泌体摄取效率远高于非吞噬细胞。这些内吞途径可分为两种主要类型：直接膜融合（这是最可能的途径）和受体介导的内吞作用。然而，外泌体递送系统的发展面临许多困难。首先，天然外泌体可以在体内的任何地方迁移，不具有特定的器官靶向能力。源自肿瘤细胞的外泌体，尤其是具有扩增癌基因的肿瘤细胞，可以将该癌基因与核酸药物一起转移到靶细胞，进一步刺激肿瘤生长。偶联物：药物偶联物是一种集成的药物递送系统，由治疗剂和一种或多种载体通过可生物降解的连接剂组成。无机纳米颗粒：无机纳米颗粒主要包括金属、半导体和金属氧化物纳米颗粒，并表现出各种物理化学性质。无机纳米支架基于其独特的理化特性和结构能力提供了独特的磁性和光学特性。用于核酸递送的无机纳米颗粒已成为靶向治疗疾病的关键成分无载体递送虽然递送系统可以提高体外摄取效率，改变体内靶器官的积累，但设计精巧的小核酸药物，无需任何载体即可直接使用，在人体内表现出生物安全性高、副作用小、免疫原性低等特点。然而，在临床上广泛使用无载体小核酸之前，必须克服几个障碍，包括它们容易被核酸酶降解、缺乏特异性递送、稳定性差和体内命运不可预测。核酸治疗的临床转化研究（神经系统）大多数神经退行性疾病由功能获得性突变引发，因此反义寡核苷酸（ASOs）被广泛用于抑制突变蛋白的表达。在亨廷顿病（HD）研究中，鞘内注射针对人类HTT突变基因的2'-MOE-PS ASOs可有效减少毒性亨廷顿蛋白（mHTT）的蓄积，并延缓疾病进展。此外，等位基因特异性ASOs通过靶向HD相关单核苷酸多态性（SNPs）实现精准调控，展现出高效性与选择性。Wave Life Sciences开发的实验性ASO药物WVE-120101和WVE-120102，通过选择性靶向CAG重复序列相关的SNPs抑制突变HTT（mHTT），目前正处于Ib/IIa期临床试验阶段。脊髓性肌萎缩症（SMA）是儿童最常见的致死性遗传病之一，其核心病因是运动神经元存活基因2（SMN2）的功能缺陷。Nusinersen是一种经化学修饰（2'-MOE多糖骨架）的反义寡核苷酸（ASO）药物，通过调控SMN2前体mRNA的剪接过程，促进完整SMN蛋白的表达，从而补偿因基因缺陷导致的蛋白缺失。临床试验表明，鞘内注射Nusinersen安全性良好，可显著改善SMA患者的运动功能，尤其对1型SMA患儿的生存率（无事件生存期和总生存期）提升效果显著，对2型和3型患者也表现出一致的疗效。基于此，美国FDA已批准其用于儿科及成人SMA的治疗，成为首个针对该疾病的基因表达调控类药物，开启了脊髓性肌萎缩症精准治疗的新时代。siRNA药物通过化学修饰（如2’-F、LNA）或脂质纳米颗粒（LNP）封装显著提升稳定性。Patisiran（2018年首个获批的siRNA药物）通过静脉给药抑制肝脏中转甲状腺素蛋白（TTR）的合成，有效治疗遗传性淀粉样变性（hATTR），但其无法直接靶向神经系统。针对中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病），ALN-APP等药物通过脂溶性修饰或靶向递送系统（如C16脂肪酸链）增强脑部渗透性，部分疗法已进入临床试验阶段（如NCT05231785）。尽管静脉/皮下给药仍是主流，但突破血脑屏障的siRNA递送技术仍是未来治疗神经退行性疾病的关键突破口小核酸治疗的未来发展方向小核酸治疗目前的局限性和缺点：财务与时间限制：将小核酸药物从实验室推向临床的过程耗时极长。需要开展广泛研究、严格测试以及多阶段临床试验，以确保安全性和有效性。除时间投入外，高昂的研发成本是小核酸药物面临的主要壁垒。药物设计与生产的复杂性，叠加严格的监管要求，导致了巨大的财务负担。非预期免疫反应:小核酸药物主要通过与靶标mRNA结合在体内发挥作用。寡核苷酸通常与天然存在的寡核苷酸共享某些分子特征，这可能导致免疫毒性。文献表明，免疫原性反应的机制主要源于寡核苷酸药物与模式识别受体（如TLRs）的结合，从而激活固有免疫系统并引发免疫应答。此外，寡核苷酸的免疫调节效应主要受其序列影响，富含鸟嘌呤（G）和尿嘧啶（U）的序列更易与TLR7/8结合。部分化学修饰（如硫代磷酸酯修饰）会促进炎症反应，已知会诱发免疫原性反应。研究表明，硫代磷酸酯骨架修饰是导致血小板计数降低的主要原因之一，因其可特异性结合血小板糖蛋白VI，激活血小板并触发血小板-白细胞聚集体的形成。此外，纳米颗粒的毒性仍然是小核酸药物开发中的一个重要问题。例如，SiO2纳米颗粒已被证明会对各种人体器官产生毒性，包括肺上皮细胞、肝细胞、肠细胞以及肺和肾。尽管关于纳米材料毒性的研究在其程度和机制方面得出了混合结果，但由于其散装形式的安全性，一些先前被认为是生物相容性的材料显然可能具有毒性。纳米材料的尺寸、形状和表面化学性质以及聚集等因素会影响自由基的产生和由此产生的氧化应激。纳米颗粒毒理学仍然是一个新兴领域，大多数研究集中在急性毒性。了解这些材料的长期影响和长期暴露对于全面评估其体内毒理学至关重要。人工智能在小分子核酸药物发现中的应用:人工智能（AI）和基于机器学习的方法的出现导致引入新的快速算法进行药物探索，预测药物反应和有效的药物组合。近期，机器学习在预测化学修饰siRNA效力方面的应用潜力巨大，有望显著加速siRNA药物设计流程并降低成本。刘等人开发了基于多视图学习策略的Cm-siRPred算法，通过结合化学修饰设计与效力预测模块，系统优化siRNA的化学修饰方案。此外，已有研究构建了针对不同化学修饰模式的siRNA沉默活性预测模型，揭示了序列、修饰模式与沉默效率间的关联性。更重要的是，人工智能（AI）与机器学习（ML）的结合推动了医疗技术的快速发展。例如，徐等人通过深度学习与组合化学的协同作用，开发了AI引导的可电离脂质工程（AGILE）平台。该平台利用预训练神经网络学习小分子结构信息，并通过自监督方法区分脂质结构特征，最终筛选出具有高mRNA转染效率的新型脂质结构。许多研究人员试图引入统一和实用的算法来增加寡核苷酸结合成功的机会。近几十年来，某些设计软件程序旨在提高基于最常引用的算法的设计质量。通过仔细地改进它们的长度、组成和结合亲和力，研究人员可以增加特异性，确保核酸序列仅与所需靶结合。该过程涉及严格的测试和计算建模，以预测和消除潜在的脱靶相互作用。此外，预测算法的不断进步，特别是机器学习和人工智能，越来越多地被整合到生物信息学平台中，为临床应用前识别和评估OTE提供了强大的工具。这些工具允许模拟整个基因组的相互作用，从而能够选择具有最高精度和最低意外后果风险的序列。近日，一种名为AttSiOff的新方法被开发用于预测siRNA的抑制效应及脱靶效应。该方法整合了基于自注意力的siRNA抑制预测器、mRNA搜索模块和脱靶过滤器。预测器通过分析来自预训练RNA-FM模型的siRNA及局部mRNA序列，捕捉影响siRNA抑制的关键特征。针对五种siRNA药物及新靶点基因（AGT）的测试证实了AttSiOff的实用性与有效性。小核酸治疗正从“精准调控工具”向“全能型疗法”转型。其通过RNA介导的基因表达调控，实现了从遗传病矫正到癌症免疫治疗的跨越式突破。尽管在递送效率、免疫原性及长期安全性方面仍需深化研究，但AI、纳米技术及多学科协作的推动下，小核酸有望成为继抗生素、抗体药物后的第三代革命性疗法，最终实现“从疾病管理到病因根治”的医疗范式转变。小核酸药物的挑战与未来方向参考文献：Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, Yang L. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther2025, 10(1): 73.识别微信二维码，可添加药时空小编请注明：姓名+研究方向！