XAV-939

β-连环蛋白(CTNNB1,β-Catenin)是一种致癌转录因子，驱动许多不同类型的人类癌症的发病机制，包括肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌。CTNNB1作为E-cadherin和α-catenin的大蛋白复合物的一部分调节细胞间的粘附。CTNNB1也是一种转录因子，可被上游Wnt信号通路激活，该信号通路调节参与细胞增殖、存活、上皮-间质转化、迁移和转移的基因。CTNNB1受泛素-蛋白酶体系统的高度调控，其中E3泛素连接酶β-TrCP1在被GSK3α和GSK3β磷酸化后识别CTNNB1的N端。 CTNNB1突变常见于多种癌症，通常位于E3连接酶识别的N端片段，阻止CTNNB1的泛素化和降解，从而增强CTNNB1的致癌转录活性。在Wnt通路中也发现了突变，包括APC和轴蛋白，这些突变可增强CTNNB1的水平和活性。针对Wnt通路的癌症治疗已经做了很多努力，PKF115-584和CGP04090破坏CTNNB1和TCF之间的相互作用。然而，这些化合物的抑制机制尚不清楚，这些化合物含有与泛测定干扰化合物(苦痛)相关的功能基团，如醌或紫黄素ICG-001通过与CBP的结合破坏CTNNB1与CBP之间的结合，并且在微摩尔效应下不是特别有效抑制剂，如IWR-1和XAV939，稳定轴蛋白和CK1激活剂pryivinium，以增强破坏复合物的活性，但这些化合物并不直接与CTNNB1相互作用。此外，虽然Wnt通路抑制剂很有前景，但在许多人类肿瘤中发现的Wnt通路中的许多突变可能使这些间接作用的化合物无效直接作用的CTNNB1抑制剂或降解剂作为潜在的癌症治疗药物是优选的，但由于CTNNB1的结构灵活性、内在无序性和缺乏可配体热点，直接靶向致癌转录因子(如CTNNB1)仍然具有挑战性。来自加州大学伯克利分校的Daniel Nomura教授团队通过筛选共价分子库和蛋白质细胞组学得到的直接与CTNNB1结合作用的化合物NF764。 为了鉴定CTNNB1的共价降解物，作者在HEK293细胞中筛选了2100个由丙烯酰胺和氯乙酰胺组成的半胱氨酸反应性共价配体文库，确定在与蛋白酶体抑制剂硼替佐米或Cullin E3连接酶NEDDylation抑制剂MLN4924预孵育后CTNNB1损失衰减的化合物(图S1)。作者发现EN83是唯一表现出剂量响应性CTNNB1损失的靶标，该损失通过蛋白酶体或NEDDylation抑制而显著减轻，这表明EN83通过泛素-蛋白酶体介导的机制作为CTNNB1降解剂(图1b-d) 作者通过Western blotting进一步证实了HEK293T细胞中蛋白酶体介导的CTNNB1缺失(图1e,f)。EN83以剂量依赖的方式显著抑制CTNNB1转录活性，证明细胞中WNT通路的功能性抑制(图1g)。作者观察到，与CTNNB1降解相比，EN83在细胞中对CTNNB1转录活性的抑制作用更高，这表明EN83可能在较低浓度下与CTNNB1结合以抑制CTNNB1活性，而CTNNB1的降解需要更高的结合或浓度。CTNNB1在由CTNNB1驱动的结直肠癌细胞中的表达，包括HT29、COLO和SW480癌细胞系(图1)。 接下来，作者试图确定EN83是否直接与CTNNB1共价结合。作者发现EN83剂量响应性地取代半胱氨酸反应性荧光探针用凝胶基ABPP标记纯人源CTNNB1蛋白，表明EN83通过靶向CTNNB1上的半胱氨酸直接作用于CTNNB1纯蛋白(图2a)。作者进一步对CTNNB1纯蛋白与EN83孵育后的胰蛋白酶进行串联质谱分析(MS/MS)，发现四种半胱氨酸被EN83修饰C439、C466、C520和C619(图2b)。为了进一步证实EN83与CTNNB1的直接共价结合，作者合成了EN83的炔功能化类似物NF686，并通过NF686对纯CTNNB1蛋白进行了直接共价剂量响应探针标记(图2c,d)。作者进一步证明了共价是必要的，因为EN83的非反应性类似物NF602不显示与CTNNB1结合，并且通过HiBiT或Western blotting检测不会改变CTNNB1水平(图2e-h)。研究结果表明EN83直接与CTNNB1结合。 接下来，作者想确认EN83在细胞中与CTNNB1结合。作者首先在细胞中使用炔探针NF686来证明CTNNB1可以在不富集GAPDH等不相关靶标的情况下从细胞中富集(图3a)。作者使用先前建立的方法进行了基于质谱的ABPP或同位素去硫代生物素-ABPP (isoDTB-ABPP)，以绘制EN83在细胞中整个蛋白质组范围内的半胱氨酸反应性。这些结果表明，EN83与C619的作用大于50%。 在作者的isoDTB-ABPP实验中，作者没有检测到EN83参与的其他三种半胱氨酸，可能是因为这些半胱氨酸不是基于碘乙酰胺反应性的探针的目标，或者这些肽可能不能很好地通过基于MS的方法从复杂的蛋白质组中电离。因此，作者无法确定其他三种半胱氨酸的参与，但作者的数据显示C619在CTNNB1中有显著的参与。然而，半胱氨酸化学蛋白质组学分析还揭示了许多其他靶点被EN83-308显著参与CTNNB1的直接共价靶向导致其降解，作者仍然对EN83能否通过很感兴趣，并将该化合物视为“探路者探针”，以确定CTNNB1配位性的途径，随后可通过药物化学的努力进行优化。EN83细胞处理的细胞热移实验显示CTNNB1在细胞中具有明显的热不稳定性。这些结果进一步证明了EN83直接作用于CTNNB1，也表明CTNNB1的降解可能是通过直接共价靶向CTNNB1引起的，导致CTNNB1折叠不稳定，随后泛素化和降解(图3c,d)。 接下来，作者试图确认EN83在CTNNB1中靶向的半胱氨酸是否有助于其降解。作者在细胞中表达了flag标记的野生型、C439S、C466S、C520S或C619S突变型CTNNB1，结果表明，C466、C520或C619的丝氨酸突变(而不是C439)显著减弱了细胞中CTNNB1的降解(图4a,b)。与这三种半胱氨酸在CTNNB1降解中的作用一致，C466、C520和C619突变为丝氨酸导致FLAG-CTNNB1减少完全衰减(图4c,d)。这些结果表明，直接靶向CTNNB1中鉴定的四种半胱氨酸中的三种会导致CTNNB1的降解，并且CTNNB1的下调不是通过间接机制或通过EN83的许多脱靶之一。 为了提高EN83对CTNNB1的活性并探索其构效关系，作者合成了几种EN83的类似物。EN83是两种对映体的外消旋混合物。作者首先用手性色谱法分离单个对映体，以确定是否有一个特定的对映体更有效。EN83的两种对映体通过HiBiT和蛋白酶体介导的CTNNB1降解显示出相当的CTNNB1水平降低，并且显示出相同的CTNNB1结合，表明两种对映体之间没有差异。 作者还寻求替代氯乙酰胺半胱氨酸反应弹头，优化其代谢特性。不幸的是，在许多口服共价药物(如BTK抑制剂ibrutinib或KRAS G12C抑制剂sotorasib)中发现的丙烯酰胺(NF601)替代11损害了与CTNNB1的结合，并且在HiBiT或Western blotting检测方法中均未显示CTNNB1减少。 作者发现，用三氟甲基部分NF740和NF741取代甲氧基基团，可以耐受凝胶基ABPP与CTNNB1结合，并以剂量反应方式降低HEK293细胞中CTNNB1 HiBiT水平。 作者发现用含NF764的氧苯基丁烯酰胺战斗部替换氯乙酰胺战斗部可以改善CTNNB1的结合(图5a,b)。分析纯CTNNB1蛋白的NF764修饰位点发现，只有C619被NF764内聚，而C439、C466和C520没有被NF764内聚。NF764的半胱氨酸化学蛋白质组学分析显示，CTNNB1 C619在HT29结直肠癌细胞中以3.7的比例显著参与，表明在10nM处参与73%。引人注目的是，NF764有效降解CTNNB1, 50%的降解浓度(DC50)为3.5nM, Dmax。81%的HT29细胞(图5e,f)。CTNNB1蛋白水平的丧失仍然依赖于蛋白酶体(图5g)。因此，虽然这些变化可能是由于NF764的脱靶效应，但蛋白质水平的许多变化可能是通过靶机制发生的。 作者进一步发现几个CTNNB1靶基因的mRNA水平显著下调，包括MYC、S100A6、AXIN2和CCND1。因此，作者证明NF764是一种更有效和选择性的CTNNB1结合剂和降解剂。 为了进一步验证NF764仅通过靶向C619而不是通过靶向三种半胱氨酸作用的EN83来降解CTNNB1，作者证明了与表达FLAG-CTNNB1野生型蛋白的细胞相比，表达HEK293T的FLAGCTNNB1 C619S突变的细胞对NF764介导的CTNNB1损失具有完全的抗性，并且表达C466S/C520S/C619S三重突变的细胞对NF764介导的CTNNB1损失具有完全的抗性。除了单个C619S突变外，细胞没有表现出任何额外的响应(图6a,b)。NF764的细胞热移分析也显示，HT29细胞中CTNNB1的不稳定性更为明显，NF764处理后，熔化温度从62℃上升到55℃，变化7℃(图6c,d)。因此，虽然作者的化合物可能仍然有脱靶，但作者证明NF764对CTNNB1的降解是通过C619对CTNNB1的直接共价靶向介导的。因此，作者将NF764指定为一种先导化合物，该化合物揭示了一种新的可配体半胱氨酸C619，可以用于降解CTNNB1。 在这项研究中，作者发现了一种CTNNB1的降解物，它通过C466、C520、C619或仅C619对CTNNB1的直接共价靶向作用，以蛋白酶体依赖的方式破坏和降解CTNNB1。作者推测，在本研究中观察到的降解模式可能不同于传统的靶向蛋白降解模式，如靶向嵌合体(PROTACs)和分子胶降解剂的蛋白水解，而是通过CTNNB1的热力学不稳定发生，直接共价结合导致不稳定介导的CTNNB1降解。许多转录因子由于缺乏用于小分子结合的定义明确的结合口袋，并且许多转录因子具有大片段的非结构化或无序区域，因此常常无法通过传统的药物发现努力。无论是通过抑制、激活、不稳定还是降解，共价配体都可以进入高动态和内在无序的蛋白质(如转录因子)的动态和瞬时状态或罕见但动态可达的状态，以独特的方式调节其功能。虽然难以证明，但作者推测转录因子内部这些内在无序的区域可能采用一种瞬时结合口袋，可以被共价配体分子识别，形成不可逆的键。鉴于这些无序转录因子可能已经是热力学不稳定的，作者假设它可能不需要显著的结合能来进一步破坏这些动态区域的稳定，从而导致它们的展开并最终泛素化和降解这些靶标。 与之前描述的CTNNB1抑制剂相比，CTNNB1抑制剂要么间接作用于Wnt通路的其他组分，要么潜在地直接作用于CTNNB1，但不能有效地或以未知的机制或选择性调节其功能，作者提出了一种高效的CTNNB1降解剂，它通过一种独特的机制共价靶向一种新的可配体C619来破坏和降解CTNNB1。总的来说，作者的研究证明了使用共价化学蛋白质组学策略来识别独特的配体位点和共价配体的实用价值，这些配体可以直接靶向经典的难以处理的靶标类，如转录因子，最终降解CTNNB1等靶标，用于潜在的未来癌症治疗应用。 参考文献 Covalent Degrader of the Oncogenic Transcription Factor β-Catenin. J Am Chem Soc. 2024， doi: 10.1021/jacs.4c05174. 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

机器学习（ML）和人工智能（AI）方法在药物发现领域的广泛应用引起了极大关注。自2015年以来，在生命科学和化学领域，基于AI的研究论文数量呈指数增长。这些方法涉及生物活性的预测、从序列数据生成3D蛋白质结构、计算各种ADME/Tox属性以及提供复杂目标分子的合成途径。然而，虽然这些技术取得了显著进展，但对于非计算机专业用户来说，它们通常缺乏直观的界面，因此难以掌握。为解决这一挑战，AIDDISON作为一款由人工智能驱动的药物发现平台应运而生。该平台通过充分整合计算辅助药物设计（CADD）工具和AI技术，实现了对新颖分子的虚拟筛选和生成（图1）。通过各种来源，如公共数据库、虚拟化学集合和生成模型，AIDDISON可以识别或生成数千个可行的分子起点。通过基于性质的过滤，选择最有成功概率的分子进行进一步研究，通过对接和形状对比来评估其生物活性。最终，有潜在活性的分子设计可送入SYNTHIA逆合成软件评估其可合成性和所需试剂。AIDDISON的目标是使科学家能够更迅速、更高效地进行药物发现。其平台的开发仍在积极进行，未来版本将引入更多功能。同时，AIDDISON注重信息安全，遵循ISO 27001标准，为数字产品提供最高级别的信息安全认证。图1 AIDDISON的工作流程AIDDISON功能介绍AIDDISON的搜索功能涵盖了多个方面，包括2D相似性搜索、2D药效团搜索、De Novo设计（生成模型）和基于形状的搜索。1.2D相似性搜索：利用FPSim2，通过对结构特征（ECFP）编码成分子指纹进行比较，快速在大量化合物中找到与目标分子相似的结构。结果从包括Sigma-Aldrich目录、PubChem、ChEMBL和ZINC等多个数据库中返回，保证了结果的标准化。2.2D药效团搜索：2D药效团搜索通过比较BioSolveIT的Feature Trees（FTrees）计算与目标分子的相似性。这是一种非常高效且有效的工具，用于进行支架跳跃和基于配体的筛选，适用于庞大的虚拟化学空间。3.De Novo设计（生成模型）：基于生成式AI模型，使用REINVENT 2.0从目标分子生成具有期望化学性质的虚拟分子。强化学习奖励函数包括药物相似性（QED）和与目标结构的相似性，同时还评估可合成性。用户可通过自定义模型扩展评分组件，最佳分数的分子返回供进一步分析。4.基于形状的搜索：基于Cresset's Flare，通过3D叠合评估新颖分子的结合亲和性。使用形状和基于性质的集团对比模式，与已知活性的参考分子进行叠合和评分（例如图2）。可通过Gallery View可视化3D结构对齐结果。图2 基于形状的叠合对比5.分子对接：AIDDISON采用基于Flare Docking工作流程的分子对接方法（图3）。用户可以通过PDB的API或上传PDB格式的蛋白质结构，选择口袋的方式包括算法、手动指定或基于结晶结合的配体周围的口袋。利用Flare Docking工作流程，系统自动添加氢原子和电荷，为待对接分子生成多个低能构象。通过LF RankScore评估，选取最优位构，该能量函数专为实现与已报告的晶体配体相似的构象而调整。对接结果在Gallery View中可视化，展示新分子在口袋内的位置，并显示蛋白质的溶剂可及表面和参考配体。计算评估通过Table View进行，用户可按VSScore和Flare软件的“结合自由能”等多种计算量排序，辅助选择具有最佳性能的候选物。图3 分子对接工作流程结果的可视化AIDDISON案例分析Tankyrase抑制剂存在许多具有不同支架的强效分子。作者以已知的Tankyrase抑制剂XAV-939为目标，通过de novo设计鉴定了几种可能会证明有用的不同支架。选择了喹唑啉-4(3H)-酮支架来举例说明这个过程。使用二维相似性和药效团搜索来识别一组类似的结构，构建了一个结构活性关系（SAR）。工作流程在图4中得到了说明，其中由SYNTHIA软件提供了逆合成路径。所有分子均使用XAV-939结合到Tankyrase 2的晶体结构进行对接。有趣的是，通过de novo设计还发现了来自ChEMBL的已知Tankyrase抑制剂——黄酮类化合物（表1）。最终，使用de novo设计（基于Bemis–Murcko和拓扑支架）和2D药效团搜索（三个虚拟化学空间）得到了14k个化合物。图4  tankyrase 抑制剂设计流程表1 从目标结构 XAV-939 开始的 De Novo 设计中鉴定出 ChEMBL 中已知的 Tankyase 抑制剂类（黄酮）总结AIDDISON是一款安全、基于Web的SaaS药物发现引擎，融合了AI/ML和CADD工具的强大功能。它为计算机操作水平较低的用户提供了便利，使其能够快速利用基于配体和结构的设计工具，识别具有良好预测ADMET概况且可合成的新型潜在活性分子。参考文献及软件应用AIDDISON平台已商业化，并对公众开放（https://www.sigmaaldrich.com/US/en/services/software-and-digital-platforms/aiddison-ai-powered-drug-discovery）。该平台集合了了rdkit部分功能，REINVENT模型以及第三方软件软件，如BioSolveIT的FTrees算法、Cresset的Flare和pyFlare等。Rusinko A, Rezaei M, Friedrich L, Buchstaller HP, Kuhn D, Ghogare A. AIDDISON: Empowering Drug Discovery with AI/ML and CADD Tools in a Secure, Web-Based SaaS Platform. J Chem Inf Model. 2024 Jan 8;64(1):3-8. doi: 10.1021/acs.jcim.3c01016. Epub 2023 Dec 22. PMID: 38134123.版权信息本文系AIDD Pro接受的外部投稿，文中所述观点仅代表作者本人观点，不代表AIDD Pro平台，如您发现发布内容有任何版权侵扰或者其他信息错误解读，请及时联系AIDD Pro (请添加微信号sixiali_fox59)进行删改处理。本文为原创内容，未经授权禁止转载，授权后转载亦需注明出处。有问题可发邮件至sixiali@stonewise.cn关注我，更多资讯早知道↓↓↓