Blebbistatin

这大概就是因祸得福吧。 来源 | 医脉通 作者 | 王玉伟 01 我，35岁男性，一名普通的公司职员。万万没想到，因为我自己的外伤住院，竟然查出了我和父亲的心脏病！ 那天下着大雾，我执意骑着摩托车外出。 我的头盔面屏有些脏，导致视线更加模糊不清，所以我撞到了路边的树上；但也幸亏我戴着头盔，所以头部没有受伤。 只是胳膊没那么幸运，右肱骨骨折、多处皮肤浅表擦伤。没有生命危险，就是不幸中的万幸了。 因为外伤，我不得不住院治疗，还得接受手术。 术前查心电图，我被告知有“心脏病”！ 什么，心脏病？我身体一向健康，没有高血压、糖尿病，不抽烟、不饮酒，父母身体也健康，我从来没想到自己年纪轻轻就得了心脏病！ 这让我想到了10年前，入职体检时查过心电图，印象中没什么问题；再说，要是有问题，体检也过不了。之后单位每年发体检单，员工自愿参与，又不是强迫体检，我就没找那个麻烦。 至于心脏超声，好像还真的从来没查过。现在回想起来，自己真是疏忽大意了。 02 你问我术前心电图长啥样，那我就拿给各位看看。 入院心电图：窦性心律，左室面高电压（SV1+RV5=5.37mv），伴有ST-T改变（图1）。 图1 入院心电图 外科医生说，这“ST-T改变”是心肌缺血的表现，得让心内科医生会诊。 心内科医生说，心电图有问题，但是根本问题不是“ST-T改变”，而是“左室高电压”。 啥意思？心内科医生给我进行了解释，直接把我聊懵了。 左心室高电压通常意味着左心室肥厚，心电图的一般诊断标准为SV1+RV5＞4.0mV（男性）或3.5mV（女性），另有RaVL+SV3＞2.8mV（男性）或2.0mV（女性）等标准。 ST-T改变是左心室肥厚常见的继发性改变，其原因为心室除极时间延长，心室尚未除极结束，较早除极部位的心室肌便开始复极，导致最大QRS向量与ST-T向量方向相反，这与原发性ST-T改变有时不易区分，从而干扰诊断。 一般来说，在R波振幅增高的导联上，ST段轻度下降，T波倒置、双向或低平的程度较浅，提示ST-T改变为继发性的。如果ST段下降≥0.15mV，T波倒置较深，两肢对称，QT间期延长，提示ST-T改变为原发性的。 虽然原理听不懂，但我明白了要查心脏超声。这时，我的父亲已经赶来了医院，陪同我去做检查。 我的伤主要在胳膊，走路并不受影响，但父亲执意让我坐轮椅、他推我去检查。父亲已经60多岁，让我内心很不是滋味。 03 超声科医生问我：“你这是心肌病啊，家里有遗传病吗？” “没……没有啊。”我回头看了一眼陪我来检查的父亲。 “你这室间隔厚度26mm（图2），正常厚度的上限是11mm，你这厚出了一倍有余，左室后壁厚度11mm。左心室心腔狭小，室间隔非对称性肥厚，并排除高血压、主动脉瓣狭窄和先天性主动脉瓣下隔膜等引起的左心室壁增厚等疾病，可以诊断为‘肥厚型心肌病’。” “另外，左室流出道最大血流速度2.7m/s，计算主动脉峰值压力差（LVOTG）为29mmHg，只要静息状态下LVOTG≥30 mmHg就得诊断‘梗阻性肥厚型心肌病’，趁现在快点治疗吧。” 图2 心脏超声见室间隔肥厚 我父亲比我还惶恐，连忙问医生：“这很严重吗？您刚才问遗传病，是不是说这个病还能遗传？” “目前诊断肥厚型心肌病高度依赖心脏超声，每年总能检出几十例，即便我不是心内科医生，也会有所了解，这个疾病真跟遗传有些关系。” 父亲连忙问医生；“那请您给我也查一查吧！” 超声科医生点点头，示意父亲躺下。结果真是，同样诊断“肥厚型心肌病”，只不过没有梗阻。 回病房的路上，气氛压抑到了极点，我回头望向父亲，他已经是老泪纵横。 我低声叫了一声“爸”，他哽咽着说道：“儿啊，是我害了你啊！” 04 我再次通过会诊见到了心内科医生，他向我讲述了肥厚型心肌病的相关知识。 肥厚型心肌病，简称HCM，是青少年和运动员猝死的主要原因之一，我国患病率约为80/10万。 其发病原因如下： 1.绝大部分HCM呈常染色体显性遗传，约60%的成年HCM患者可检测到明确的致病基因突变，目前已经发现27个致病基因于HCM相关。 2.5%-10%的HCM由其他遗传性或非遗传性疾病引起，包括先天性代谢疾病（糖原贮积病、肉碱代谢疾病、溶酶体贮积病），神经肌肉疾病（如Friedreich共济失调），线粒体疾病，畸形综合征，系统性淀粉样变等。 3.25%-30%的HCM患者原因不明。 HCM的临床症状变异性大，有些患者可长期无症状，有些患者首发症状就是猝死，这与左心室流出道梗阻、心功能受损、心律失常相关。 有症状患者中，90%的可出现劳力性呼吸困难，25%-30%的有胸痛不适，22.5%的可发生心房颤动，15%-25%的至少发生过一次晕厥，另有20%的有先兆晕厥。 但并不是所有的患者都有症状，还有的患者在症状到来时并不在意，导致疾病“静悄悄到来”，突然被发现，甚至直接导致猝死！ 目前治疗大多针对有症状的梗阻性心肌病，从而改善患者症状，其中药物治疗是HCM治疗的重要选择。 β受体阻滞剂是HCM治疗的一线药物，即便是非梗阻性HCM患者也可在β受体阻滞剂的治疗中获益，如无法耐受β受体阻滞剂，可使用维拉帕米或地尔硫卓。但对LVOTG大于100 mmHg、严重心衰或窦性心动过缓的患者，维拉帕米应慎用。如使用β受体阻滞剂、维拉帕米后症状仍不能控制，可使用丙吡胺治疗。 哌克昔林、曲美他嗪、雷诺嗪、伊拉克嗪、Parvalbumin、Blebbistatin、马伐卡坦作为新的药物治疗方案，也在不同进度的研究试验中。 对于部分HCM患者虽然使用最大量药物仍有明显临床症状，可选室间隔心肌切除术、经皮室间隔心肌消融术、导管射频消融等手术治疗，每种手术方式各有利弊。 另外，HCM与基因突变相关，如能找到明确的致病基因突变，基因治疗有可成为HCM患者的一种可行性治疗选择。 05 最后，医生告诉我，只要确诊HCM，无论年龄、性别、种族、是否存在左心室流出道梗阻、是否有经皮室间隔心肌消融术或者室间隔心肌切除术治疗史、是否植入ICD，都不能参加剧烈的竞技运动。 如果没有症状，可参加低强度运动和娱乐活动。 如果病情稳定，也要定期复查，内容包括每12-24个月复查心脏超声、12导联心电图，如每2~3年进行1次运动负荷检查，每5年进行1次心脏磁共振成像检查。 从此，我们父子二人，都与心电图、心脏超声绑定在了一起，希望在无症状是发现疾病能够得到及时的治疗，这大概就是因祸得福吧。 外科手术效果良好，看到喊着爸爸跑来的儿子，我一定也要带他去查心脏超声！ 参考文献： [1] 国家心血管病中心心肌病专科联盟,中国医疗保健国际交流促进会心血管病精准医学分会“中国成人肥厚型心肌病诊断与治疗指南2023”专家组.中国成人肥厚型心肌病诊断与治疗指南2023[J].中国循环杂志,2023,38(1):1-33. [2] 戴贺,陶琴,程维礼,等.肥厚型心肌病的治疗进展[J].中国心血管杂志,2023,28(3):292-296. 责编｜米子 封面图来源｜视觉中国 HIV感染者因检验结果互认被拒诊？官方回应：已通知信息屏蔽！网友辣评：医生的命不是命？ 患儿死亡，医院赔偿53万余元后，家属又选择报了警……历时6年法院判决！丨医眼看法 医脉通是专业的在线医生平台，“感知世界医学脉搏，助力中国临床决策”是平台的使命。医脉通旗下拥有「临床指南」「用药参考」「医学文献王」「医知源」「e研通」「e脉播」等系列产品，全面满足医学工作者临床决策、获取新知及提升科研效率等方面的需求。 ☟戳这里，更有料！

深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769类器官技术类器官从最初的“游离的海绵细胞可以自组织再生整个生物体”到最终发展成为类器官组织，正逐步迈向临床应用，表 1 汇总了类器官的发展历程，其发展的重要意义及对应事件。类器官的生成与工程生物材料和类器官培养方法息息相关，该文将从工程生物材料和类器官培养方法两方面对类器官的形成进行阐述。1.1工程生物材料细胞黏附配体、基质几何形状和力学性能是影响细胞增殖、分化和成熟的主要参数，为开发先进可靠的类器官，工程生物材料优化了基质的生物、化学和物理特性，使得大多数用于细胞培养的工程基质和水凝胶具有机械弹性。用于 3D 细胞培养和类器官的工程生物材料按照其几何结构分类可以分为纤维基质、大孔基质和高度交联的水凝胶。纤维基质 ( 如脱细胞细胞外基质和水凝胶 ) 含有纤维蛋白，其孔隙与细胞的天然体积大小相近；高度交联水凝胶 ( 如聚乙二醇和海藻酸盐 )的孔网目尺寸小于细胞尺度，在无其他形式的材料重塑或降解情况下，小网目尺寸可能会抑制细胞的增殖和分化，因此大孔基质材料应运而生。大孔基质的孔隙比天然细胞大，如微带交联成水凝胶大孔支架 ( 形成的大孔约300 μm) 可使得人类脂肪来源干细胞扩散到 2D 和 3D 培养物中，而在具有小大孔 ( 约 100 μm) 的支架中细胞可与多个微带发生更直接的细胞间相互作用。CHRISNANDY 等报道的一系列合成水凝胶为促进精细的体外形态发生提供了有前途的多功能基质，它们通过可逆氢键介导的动态重排促进广泛的类器官形态发生，这些应激松弛的可调基质通过增加对称性破坏和潘氏细胞形成依赖于 yes 关联蛋白1(YAP1)来促进肠干细胞上皮细胞中的有效隐窝出芽。GJOREVSKI 等报道了微加工阵列能够均匀产生隐窝绒毛状上皮，即通过水凝胶力学和水凝胶微纳加工的原位光图案化，从外在控制肠道干细胞的自组织过程，这是完全由“随机”自组织驱动的、基于干细胞的指导器官发生方法，该研究也验证了组织的当前形状可以帮助模式化和指定组织的发育过程，从而确定组织的未来形状，该研究的类器官培养物可用于回答现有类器官和动物模型无法解决的问题，并且促使类器官技术转化为实际应用。1.2类器官培养方法体外建立三维类器官的常规方法有如下几种：① 3D 简单培养：在培养皿中的脱细胞细胞外基质 ( 如小鼠肉瘤、胶原蛋白等 ) 上生成类器官，尽管已被广泛应用，但存在缺乏营养物质和气体交换以及废物清除、缺乏类器官的可重复性和均匀性等问题，使其不适用于大型药物筛选或高通量评估。②利用旋转生物反应器从胚状体中产生类器官：这种方法常用于视网膜和脑类器官的生成。胚状体是多能干细胞的体外分化模型。生物反应器是指用于在体外增强细胞和组织 3D 培养的任何设备，虽然生物反应器能提高营养供给，但通常受到类器官大小的限制。CAI 等基于智能声流体的微型生物反应器培养人脑类器官，所用的微型生物反应器由 3 个组件组成，通过声螺旋相涡旋方法实现非接触式旋转的转子；用于实时跟踪旋转动作的摄像头；基于强化学习的控制器，用于旋转操作的闭环调节。在模拟和实验环境中，该微型生物反应器可以实现孔板中转子的自动旋转，可以出色地控制转子的旋转模式、方向和速度，而不受转子质量、液体体积和工作温度波动的影响，并且在长期培养过程中稳定地保持类器官的旋转速度、增强类器官的神经分化和均匀性，这种生物反应器在自动化、鲁棒性和准确性方面具有更优越的性能，凸显了新型智能系统在微流控实验中的潜力。③气液界面法：该方法中细胞的顶层暴露在空气中，细胞的基底表面与液体介质 ( 即类器官中的培养基 ) 接触，主要用于生成肾脏和肠道类器官。④“新型”类器官技术：随着新技术的发展，Tracewell小室、微流控芯片等多方面技术对类器官技术进行了改造，“新型”类器官技术已应用于建立类器官，例如：微流控生物反应器由一个或多个入口、一系列小通道和腔室以及一个或多个出口组成，可以改善营养物质的输送和交换，允许阵列生产大小可控的培养区域，从而产生更均匀的类器官和球状体；在微流体装置中设置传感器和执行器，以实现精确的监测和控制，调节关键参数 ( 包括细胞 - 细胞和细胞 - 脱细胞细胞外基质相互作用、流体流动交换、组织模式和电刺激 ) 以较大程度减少批次间差异，增加组织相似性；通常使用微加工技术 ( 例如基于光刻的成型 )进行定制设计，具有从毫米到微米级的小型建筑特征，为培养器械的几何形状提供广泛的可能性，为高度专业化的应用提供了有前途的动态平台。SALMON 等使用 3D 打印微流控芯片设计神经血管类器官，开发基于人类多能干细胞来产生以空间决定的与血管细胞相互作用的类器官，这种基于 3D 打印的平台旨在与任何类器官系统兼容，是一种简单且极具成本效益的类器官血管化方法。该平台为理解和操纵组织特异性类器官与脉管系统的共同开发开辟了新途径。WRIGHT 等报道了使用原代人肠道类器官建立 96- 孔 transwell 系统以捕获多个定量通路读数，通过对候选疗法进行定量评估，表征并确认了正常人肠道分化模式和屏障功能，使用各种定量读数确定了肿瘤坏死因子 α(IBD 的核心驱动因素 ) 通路拮抗剂以剂量依赖性方式挽救了肿瘤坏死因子 α 引起的损伤，表明该系统适用于屏障调节因子的定量评估，适合提供关键功能数据以支持转化靶点和药物发现工作。类器官临床应用方向及预期发展与受益类器官已在药效评价研究 ( 临床前模型 )、传染病研究、肿瘤研究及精准治疗、再生医学等领域得到应用。2.1药效评价研究 ( 临床前模型 )类器官技术具有成本低、时间短、生理相关度更高等优势，在体外培养体系中长期保持生理及遗传信息稳定下广泛扩增获得的类器官将更接近于临床实践情形，类器官模型可以增加筛选出具有更大生理和临床相关性药物的成功率，加速确定对患者最有益的药物，加速药物的临床应用。肠道类器官：由于小肠上皮细胞含有大量的药物代谢酶和外源加工蛋白，小肠在人体进行药物和外源物质的代谢、消化、营养吸收等过程中起极其重要的作用。EVANS 等首先提出肠内培养的概念，将肠道类器官定义为体外生长的小肠绒毛、黏膜固有层和完整的隐窝结构肠道类器官是体外研究肠道干细胞和肠上皮细胞的较好工具，其特点是由多种肠细胞组成、中空腔花瓣状结构、能稳定低温保存和复苏、能够长期自我更新。SATO 等 基于前人对肠道干细胞生长微环境的研究，分离肠道隐窝，培养 LGR5 基因表达的肠道干细胞，成熟后按比例 (1 ∶ 5) 进行传代培养，发现在连续传代培养 > 1.5年中依然可保持基因型及生理功能的稳定。因此，肠道类器官模型在疾病建模研究中可用于探索传染病和癌症发生的确切机制，肠道类器官模型也可用于疾病发生机制研究，如营养物质对肠道健康干预机制、幽门螺旋杆菌感染发病机制、GII.4 型人诺如病毒在人肠道组织中的增殖和转录机制；肠道类器官模型也可作为系统来识别生物活性微生物产品，评估它对宿主上皮的潜在作用；对于基因缺陷疾病，肠道类器官模型可用于基因组编辑技术集成的研究、细胞的治疗和药物输送工具。肾脏类器官：肾的功能单位由肾小球和肾小管组成。“转运扩增肾元祖细胞”可在发育过程中产生哺乳动物肾脏的所有肾元，但由于它们数量有限、体外扩增能力差、难以在人体中获得，减缓了肾脏发育和疾病的基础研究和转化研究。LI 等研究发现，在适当 3D 培养条件下可通过干细胞体外培养产生肾脏类器官，例如支持小鼠和人类胎儿肾元祖细胞、人类诱导多能干细胞的肾元祖细胞的长期扩增，所获得的扩大肾元祖细胞在体外和体内都保持了基因组稳定性、分子同质性和肾形成潜力。另外，据此培养方式获得的非肾细胞具有基因靶向性，可以形成类肾素器官，植入体内后与宿主循环系统功能结合，通过过滤产生尿样代谢物。总之，这些发现为研究人类肾脏发生、肾脏疾病建模和诊断以及药物发现提供了技术平台。肝脏和胆囊类器官：肝脏是细胞组成复杂、生理功能丰富、结构精密、相关疾病高发的器官，既是外源毒性物质作用靶器官也是最重要的解毒器官，肝脏类器官可应用于疾病模型、药物筛选和肝脏再生等诸多应用场景。2013 年，TAKEBE 等模拟肝脏发育早期的细胞谱系制备类似人肝芽组织的 3D 聚合物，主要是通过将肝细胞、人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞共培养，将获得的肝类器官移植入小鼠体内后具有良好的血管生成功能，虽然这些体外培养的肝芽组织缺乏胆管结构，该研究在 2013年仍被《Science》评为十大突破之一。SHINOZAWA 等建立了一个基于人肝类器官 (HLO) 的筛选模型，即开发一种可重复的方法，从具有可重复胆汁转运功能的多能干细胞系可储存前肠祖细胞中产生人肝类器官，通过组织学和超微结构评估微观解剖结构，并且测试存活率、胆汁淤积和线粒体毒性，预测238种市售药物对肝的毒性(特异性 88.9%，敏感性 88.7%)，获得了基于人肝类器官的药物诱导性肝损伤检测被转化为基于 384 孔的高速实时成像平台。胆管组织包括肝内胆管和肝外胆管，是一个复杂的三维网络系统。胆囊颈部和底部都存在具有前体 / 干细胞特性的胆管上皮细胞群。陈智闻等通过分离人来源胆囊组织上皮细胞，运用 3D 培养体系将细胞嵌入基质胶中进行 3D 培养并加入增强其繁殖能力的小分子 (CHIR-99021 和 blebbistatin)，所获得的胆囊类器官有胆管类上皮细胞特征。人胆囊类器官培养体系的建立为胆管疾病的治疗与建模提供了新思路。胆管细胞类器官已被建立用于研究正常的胆管细胞生物学和原发性硬化性胆管炎，并且测试类器官在体外形成胆管和胆囊组织的潜力。类器官培养系统已发展成为肝脏和胆道研究的前沿技术，如在胃肠道类器官建立的基础上，从富含亮氨酸的小鼠重复蛋白 G 蛋白偶联受体 5 阳性肝祖细胞产生肝胆类器官培养物；从肝细胞和胆管细胞开发 3D 肝胆类器官培养物，以模拟人类和动物的肝胆健康和疾病。目前，肝细胞类器官已被用于研究阿拉吉勒综合征、脂肪肝疾病、威尔逊病、乙型肝炎病毒感染和囊性纤维化。肺类器官：人体气道上皮是吸入空气污染物的主要毒性靶区，肺是病原体感染和损伤的重要靶器官。病原体包括细菌 ( 铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、结核分歧杆菌等 )、病毒 ( 流感病毒、人副流感病毒、呼吸道合胞病毒及新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 等 )、真菌、支原体、衣原体以及寄生虫等。肺类器官可源于祖细胞或干细胞等，成熟的肺上皮干细胞可直接进行体外培养，为肺生理、病理，尤其是感染性肺系病的防治研究提供有效研究工具。利用上皮基底细胞中表达的 YP450 代谢酶制成的肺类器官，为体外吸入毒理学研究的理想模型，基于该细胞的肺类器官气管结构的出现，是肺类器官构建成功的重要标志。商业化肺 3D 组织模型网 EpiAirwayTM 包含基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞，由正常人气管 / 支气管上皮细胞培养形成的、高度分化的假复层上皮组织模型，该产品具有良好的均一性和重复性。EpiAirwayTM 与人肺组织高度相似，能模拟人类真实的肺部结构及功能，在预测中 / 低毒性呼吸道刺激物的毒性效应时优于动物测试。脑类器官：人脑的复杂性极高，采用体内原位模型进行研究耗时长、成本高昂且成功率低；采用动物模型研究人类大脑功能不能准确再现脑肿瘤微环境，脑类器官能高度模拟脑原位组织的生理结构和功能，可研究肿瘤组织在脑内的特性，被广泛用于恶性肿瘤的研究。2016 年，HUBERT 等开发了直接从胶质母细胞瘤标本中衍生的肿瘤类器官培养系统，该方法将肿瘤细胞混悬在基质胶中培养并保持稳定和存活。这些类器官再现了体内肿瘤的低氧梯度和肿瘤干细胞的异质性、不同的分子特性，这也允许了肿瘤细胞层次结构的研究。类器官和胎儿组织之间显著的转录相似性为大脑类器官作为人类皮质发育模型提供了依据。EIRAKU 等建立了神经外胚层类器官，这些类器官中的神经元表现出新生皮质脑组织的特性，在神经上皮细胞受到刺激后可表现出特定的脑区功能特性，重现了早期皮质发生过程中的时空调控。2015 年，KIRWAN 等构建了模拟体内皮质网络发育和功能的人大脑皮质神经网络，可用于人类前脑神经网络生理学机制的研究。心脏类器官：心脏是外源化学物毒性的重要靶器官之一，全球范围内多发的心血管疾病是导致死亡的主要原因，体外药物诱导心脏毒性试验是药物发现和临床应用的关键步骤，而心血管疾病的研究主要局限于传统的二维细胞和动物模型。人类心脏类器官是复杂的多细胞聚集物，由于心脏类器官的血管化和结构复杂性，人类心脏类器官最近才被开发，其研究进展也相对较少。心脏类器官的 3D 类器官细胞来源于原代组织或重编程分化细胞类型 ( 人类多能干细胞、胚胎干细胞 ) 或人诱导多能干细胞的成体干细胞。自组织型心脏类器官和工程心脏组织类器官、心脏微组织等可用于疾病模型的构建和疾病机制研究 ( 如先天性心脏病、缺血性心肌病、遗传性心脏病、心律失常 )、心脏毒性监测、药物筛选与评价、再生医学与移植等。TAKEDA 等开发了一种通过在细胞表面涂覆细胞外基质成分在短时间内构建 3D 人工组织的方法，将 3D 人工心脏组织用于药物心脏毒性体外测试，通过纤维连接蛋白和明胶纳米膜包覆单颗人诱导性多能干细胞来源心肌细胞衍生生成诱导性多能干细胞来源心肌细胞 3D 心脏组织，组织学上该 3D 心脏组织显示肌细胞和细胞外基质蛋白 ( 如纤维连接蛋白、Ⅰ / Ⅲ型胶原和层粘连蛋白 ) 中有肌节结构，在体外表现出对阿霉素敏感的细胞毒性和对人类 hERG 相关基因通道阻断剂 / 异丙肾上腺素的响应灵敏性，hERG 型钾通道阻滞剂 E-4031 和异丙肾上腺素呈剂量依赖的方式诱导钙瞬变和细胞收缩力显著变化，表明其在药物诱导的心脏毒性试验或药物筛选系统中可用于发现药物。尽管类器官存在批次间的可见性和异质性、无法概括天然器官的高保真度、成熟度和功能有限等局限性，人类心脏类器官在这些领域仍极具潜力。皮肤类器官：皮肤为人体的第一道屏障，对人体起到物理保护、免疫防御、体温调节、分泌排泄等多种重要作用，也是最易损伤的器官，烧伤是最常见的皮肤损伤，因此创面的愈合和修复研究也愈加受到重视。合适的动物模型是皮肤刺激评价、创面愈合机制和评价药物治疗创面修复效果的基础，但存在实验周期长、成本高、实验结果外推至人类不确定等缺点，并且在毒理学测试方面需要评估的化合物数量庞大，因此其他方法正被大力推动来取代动物实验，如基于细胞的体外方法、高通量方法、创新技术 (基于诱导多能干细胞和类器官的方法，器官型共培养系统和微流控“多器官”芯片 )。LIU 等构建了一个含有毛细血管网络的无支架双层组织工程皮肤，通过将真皮成纤维细胞与真皮微血管内皮细胞以 2∶1 的比例共培养，成纤维细胞与内皮细胞相互作用形成纤维层，共培养 20 d 后可观察到毛细血管样结构，然后将上皮细胞播种在纤维片上以组装双层组织，苏木精 - 伊红染色显示 7d 后组织工程皮肤表皮呈层状，免疫染色显示上皮促进了毛细血管样结构的形成，透射电镜分析显示毛细血管样结构为典型的微血管。2009年3月，欧盟提出停止化妆品安全性评价的动物实验，并已根据欧盟新化妆品法规 EC 1223/2009 将 3D 皮肤模型用于化妆品安全性评价，皮肤模型有 EpiskinTM 模型和 Epikutis® 3D表皮模型。EpiSkin™ 模型是一个完全分化的三维皮肤模型，包括重建的表皮和功能角质层，该模型是通过在胶原底物上培养成人非转化人角质形成细胞而获得的具有 3D 结构的人表皮模型，具有功能角质层的表皮。EpiSkin™ 按照质量参考标准 ISO 9001 生产，获得的表皮组织具有可追溯性和可重复性，每个生产批次的组织在放行前都对细胞活力、屏障功能和形态进行了质量控制，已被广泛应用于皮肤腐蚀性体外实验。Epikutis® 体外重组 3D 表皮模型为国内第一款用于皮肤测试的模型，已被应用于化学品皮肤刺激检测、纳米材料透皮行为、皮肤毒性研究的模型 。生殖系统类器官：类器官在男性生殖系统(如睾丸)和女性生殖系统 ( 如子宫和卵巢 ) 中也建立了应用 。对于男性生殖系统，BAERT 等 的研究结果表明，无论是否有生物支架的支持，原代人睾丸细胞都能够自组织成人类睾丸类器官，即多细胞组织替代物。尽管缺乏睾丸特有的形状，但这些微型组织窝藏着精原细胞、生态位细胞，并且保留了特定的功能。人类睾丸类器官可能有助于开发仿生睾丸模型，这将对研究和开发不孕不育的临床治疗以及与药物发现和毒理学相关的筛选产生巨大影响。对于女性生殖系统，子宫内膜 / 黏膜在整个月经周期和怀孕期间经历动态变化，尽管子宫内膜作为植入部位的营养支持很重要，但没有长期培养系统可以在体外重现子宫内膜功能，来自子宫内膜和蜕膜的单细胞可以产生功能齐全的类器官。TURCO 等建立了人类成体干细胞衍生类器官培养物的条件，以生成正常和蜕膜化人子宫内膜的三维培养物，这些类器官长期扩增、遗传稳定，并且在用生殖激素治疗后进行区分，转录分析证实类器官与原发组织有很大的相似性。子宫内膜类器官暴露于妊娠信号后可发展出早期妊娠的特征。恶性子宫内膜类器官为研究子宫内膜异位症和子宫内膜癌等常见疾病以及早期妊娠生理学提供了基础。2.2传染病研究 严重急性呼吸系统综合征等病毒以及细菌、寄生虫和真菌每年在全世界造成超过 1 000 万人死亡，死因包括下呼吸道感染、腹泻病、肺结核、艾滋病毒 /艾滋病、疟疾、热带疾病 ( 恰加斯病和血吸虫病等 )，再加上耐药细菌 ( 如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ) 带来的额外威胁，需要对传染病保持警惕。知晓传染性病原体的疾病发展的潜在机制可更好地设计预防措施，例如：腹泻病仍是世界上最大的健康问题之一，利用肠道类器官模拟肠道感染，既能研究宿主 - 病原体的相互作用又能寻找治疗靶点。人肠道类器官可通过在三维培养中扩增分离的患者来源肠上皮干细胞来产生。近年来，人肠道类肠道越来越多地被用作研究宿主 - 病原体相互作用的疾病模型，特别是在缺乏强大细胞系统 ( 如轮状病毒和诺如病毒 ) 的病毒感染情况下。人肠道类肠道在细胞外基质支架中以 11D 形式生长，并且在培养中长期保持体内生理学的各个方面，与传统转化的肠上皮细胞系相比具有多种优势：仅包含未转化的人类细胞、包含多种细胞类型、维持肠道区域特异性培养的差异、可分化为位于绒毛或隐窝区域的细胞群、维持宿主的遗传特性等，已成功用于培养人轮状病毒和诺如病毒感染模型 。另外，中国科学家采用类器官研究病毒对人体的致病机制，为病毒致病机制研究和药物开发提供了新模型。2.3 肿瘤研究及精准治疗肿瘤的发生发展是多阶段、多步骤、多因素的复杂过程，类器官模型能够在体外稳定保存母体肿瘤的遗传、蛋白质组学、形态学和药型特征的能力，同时还可提供前所未有的基因组和操作环境，使用与原始肿瘤具有相似特征的个性化肿瘤模型可能会更准确地预测患者的药物反应，如对放化疗、靶向药物、免疫细胞治疗等有效性的反应。尽管最近在类器官方案方面进行了创新，但由于包括癌症组织来源和后续加工、培养基配方与动物源性三维基质在内的几个方面未标准化，目前的癌症类器官培养技术本质上是不受控制和不可重复的。鉴于癌症类器官有可能准确概括与患者特异性癌症相关的肿瘤内和肿瘤间生物学异质性，可实现肿瘤精准个体化治疗，建立可重复的平台以加速可转化为患者应用是必要的 。另外，建立肿瘤类器官样本库有利于进行肿瘤分子学背景与肿瘤生物学行为 ( 如临床病理学特征、药物反应或耐药关系等 ) 模式分析。肝胆癌类器官已从冷冻和新鲜的人体组织中建立，并且用作药物测试平台和癌症样本的生物样本库。而且，基于 CRISPR 的基因修饰和暴露于传染因子的类器官已经用于生产致癌的类器官模型，这种患者特异性肿瘤的器官型模型正在彻底改变人们对癌症异质性及对个性化医疗的理解。2.4 再生医学再生医学是利用干细胞、生物相容性和生化因子在体外环境中构建与体内组织相似的生物组织的科学，用于研究疾病的机制和诊断过程以及可能的治疗方法，此外还用于开发体外生命支持系统或替换体内受损器官或修复损伤 。类器官自诞生以来应用于再生和器官移植的尝试从未中断过，如用于骨 / 软骨修复、外耳修复、皮肤置换、炎症性肠病的肠道类器官、肺器官、唾液类器官、肝脏类器官、胆道类器官、胰腺类器官、心脏类器官和泪腺类器官等 。全世界每年骨折、骨缺损和软骨损伤的患者数量庞大，打印骨生物已成为替代丢失或受损骨组织的可行替代方案 ，生物打印生产与天然组织结构相似的复杂 3D 支架也非常适合软骨组织工程。TARAFDER 等通过微波烧结和激光 / 金属打印开发了机械坚固的 3D 磷酸三钙支架，使用人成骨细胞和 SD 大鼠股骨缺损进行体外和体内研究，通过微波烧结 3D 打印控制孔径较传统烧结可提高抗压强度、增加细胞密度且具有优异的生物相容性和成骨性能，掺入锶(Sr2+)和镁 (Mg2+) 的磷酸三钙支架较纯磷酸三钙支架在骨形成、矿化、多尺度孔隙度以及骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白水平方面均增加。在软骨再生研究方面，LEE 等 使用基于挤出的生物打印机，使用层层组装打印生产具有人类胫骨髁解剖形状的聚己内酯和羟基磷灰石的复合材料，得到的复合支架尺寸为 20 mm×15 mm×15 mm，具有关节再生和关节炎治疗的潜力。使用相同的工艺，LEE 等在没有细胞移植的情况下使用聚己内酯 - 羟基磷灰石聚合物再生兔滑膜关节的整个关节表面，以取代骨骼成熟兔的肱骨髁，并且注入转化生长因子 β3 的生物支架显示出全组织覆盖、更均匀的软骨细胞分布、更大的基质密度和关节软骨厚度。总之，与现有的再生疗法相比，基于类器官的再生医学具有以下优势：更易保护细胞；易获得，大多数组织可通过微创手术 ( 如活检 ) 轻松收集；获得程序简单，捐赠者无任何负担；可长期大规模繁殖；可分化成构成靶组织的特定细胞，再生治疗效果可最大限度提高；移植具有安全性；直接移植到病变部位，移动和分布到其他器官的风险较低；可最大限度地降低免疫排斥风险；移植程序安全且患者友好。尽管尚未应用于人类，类器官良好的治疗效果使其在再生医学中的应用备受期待。2.5免疫类器官免疫细胞的浓度在上皮细胞中最高(血液和淋巴器官除外 )，免疫细胞在上皮细胞中直接与上皮细胞相互作用，是人体与病原体感染环境的第一个接触点，上皮细胞与免疫细胞密切合作以维护体内平衡并对感染快速反应，不仅是预防和控制致病性感染的先决条件，也在防止过度免疫激活方面很重要。上皮类器官培养也可以整合到芯片上的器官平台中，从而建立更复杂的培养系统，也可以被操纵来反转它们的极性融合形成更接近原器官或原组织的管状结构。BOUFFI 等报道了一种新一代复杂的包括功能性免疫系统的肠道类器官，以帮助人类研究胃肠道疾病，这种类器官不仅能支持迁移的免疫组织，而且也能继续改善肠道自身的发育，并且具有识别外来抗原的能力。VOTANOPOULOS 等将从黑色素瘤患者获得的黑色素瘤和淋巴结生物样本转移到实验室，用生理盐水、抗生素和红细胞裂解缓冲液洗涤后，将生物样本解离并掺入基于细胞外基质的水凝胶系统中，生物制成三维混合黑色素瘤 / 淋巴结类器官。保持肿瘤异质性产生免疫增强的患者肿瘤类器官，平均免疫治疗 7 d，即类器官组织与纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、伊匹木单抗和达拉非尼 / 曲美替尼平行筛选 72 h，测定记录相对药物疗效，在 85% 的患者中，肿瘤类器官对免疫治疗的反应与标本临床反应相似证明了开发 3D 混合免疫增强肿瘤 / 淋巴结类器官允许个体患者的免疫系统和肿瘤细胞保持活力，用于研究个性化免疫治疗反应。国内类器官器械类产品上市申报情况概述目前国内类器官器械产品暂无上市申报情形，但有类器官相关辅助产品提交创新医疗器械特别审查程序并获得审批，如：胶原蛋白软骨再生载体 / 胶原基软骨修复基质。胶原蛋白软骨再生载体 / 胶原基软骨修复基质一般由注射针、预灌封注射器以及预装在预灌封注射器中的胶原蛋白材料组成，仅含载体不含活体细胞。保留天然结构的胶原具有良好的温敏特性和自组装能力，于低温条件下与骨髓间充质干细胞混合后注入软骨缺损部位，通过温度变化形成凝胶并固定于缺损处；胶原基软骨诱导性基质为干细胞提供良好的黏附、增殖与分化的微环境，诱导其成软骨分化并有正常的功能表达，最终实现软骨的再生修复。该产品将自体骨髓浓缩物与动物源软骨修复基质相结合，应用于关节软骨缺损修复，预期用于无系统性感染的成年患者，与自体骨髓间充质干细胞复合，用于治疗由创伤、退变导致的局灶性膝关节软骨缺损患者。国际监管部门关于 3D 打印类器官的应用研究4.1动物实验替代研究2016 年 FDA 通过的《21 世纪医药法案》法律法规，授权了开发旨在促进新药研发的药物开发工具，包括生物标志物、临床结果评估、动物模型；2017 年 FDA 推出预测毒理学路线图，强调FDA 减少动物实验使用的目标，推进类器官技术作为新的替代方法以及非临床研究工具，从而努力取代、减少、改善对动物实验的依赖。3D 打印类器官可以评估化妆品及食品中重金属对神经系统的毒性，利用微生理系统评估药物的预期效果，具体如下：①微生理系统：使用微型细胞培养平台，通过将细胞暴露于对其功能或病理生理重要的微环境，对人类或动物来源特定组织或器官的功能特征进行体外建模健康状况模拟。微生理系统设计可能旨在为培养的细胞提供和支持物理 ( 例如，温度、pH 值和氧气 )/ 生 化 / 电 气 / 机 械 ( 例 如， 流 动 或 拉伸 )/ 结构 / 形态条件，并概括一组定义健康的特定属性或患病器官或组织功能。微生理系统平台可能包括单一培养物、多种细胞类型的共培养物、来自组织 / 器官的外植体的维护和 / 或包含类器官细胞形成。②器官芯片：是微生理系统的一个子集，由一个微型生理环境组成，设计用于产生和 / 或分析能够模拟指定 /目标器官水平反应的功能组织单元，可用于评估疾病检测或疫苗效力的可靠性、敏感性、特异性、体外替代体的可重复性。4.2预测药物临床试验研究在对 14 家大型制药公司的调查发现，生产一种商业产品需要 24 种候选药物，而超过 45% 的失败发生在药物开发的 3 个临床阶段，表明药物开发过程中需要更好的临床前测试系统。药品评价和研究中心 (Center for Drug Evaluation and Research，CDER)正在评估通过在临床前药物测试的早期检测药物效果，用以推进药物开发和评估。在药物评估的临床阶段之前，检测药物毒性的能力受到如下因素限制：临床前测试中使用的动物模型与临床试验中人类受试者之间的生理差异、药物对患者的影响与实验室检测中观察到的差异。目前，CDER 评估重点主要集中在以下领域：开发用于改进药物对人体影响的临床前预测系统，测量药物对肝脏生理学影响的肝脏微生理系统，与其他器官系统相互连接的预测系统，成熟度增强的微工程单干细胞衍生心肌细胞，心脏细胞的功能性研究系统。上述方法也可能在临床试验有限或不可行的情况下使用，例如应对突发公共卫生事件的医学对策和评估治疗罕见疾病的疗法。4.3化妆品安全性评价替代研究自 2009 年 3 月欧盟禁止动物实验用于化妆品安全性评价，EpiskinTM 模型和Epikutis® 3D 表皮模型已被开发使用。EpiskinTM 模型可用于皮肤腐蚀性体外实验。EpiAirwayTM 是一个商品化的肺3D组织模型网在测试预测强吸入毒性化学物质和预测中/低毒性呼吸道刺激物的毒性效应。但欧盟尚未开展类器官在其他领域的研究应用，也尚未有相关指南推出。类器官研究的监管现状及监管风险5.1FDA关于类器官研究的监管现状2016 年 FDA 通过的《21 世纪医药法案》法律法规，授权开发旨在促进新药研发的药物开发工具及启动新药创新科学和技术方法试点计划，2017 年推出预测毒理学路线图推进类器官技术作为新的替代方法作为非临床研究工具 。5.2欧盟关于类器官研究的监管现状欧盟于 1997 年制定了《用体外模型替代动物研究》的文件，2010 年制定《保护用于科学目的动物的法律》(Directive 2010 /63/EU，现行版本为 2019 年修订版 )，以消除不同欧盟成员国在保护用于科学研究的动物方面的法律、法规和行政规定之间的差异 。2018 年出台的《非基因毒性杂质鉴定反思文件 ( 草案 )》提到对杂质的安全性评估可针对性地使用体外方法 (2D、3D 细胞系统和微生理系统 )。2023 年1月，欧盟发布的《非临床领域 3 年综合工作计划，包含 2023 年优先事项》制定了与类器官相关的具体监管行动，包括：起草“定义用于制药领域特定使用环境的器官芯片技术的监管接受标准的反思文件”；创建全球监管机构集群，为新方法学 (3R，例如器官芯片 ) 制定监管接受标准，并且协调欧盟和全球监管机构之间的观点和监管接受标准；专注于对特定重点微生理系统后续研讨会监管机构接受的方法确认。5.3中国关于类器官研究的监管现状3D 打印类器官研究涉及干细胞的提取、保存、应用，细胞治疗是Ⅲ类医疗技术。目前对于基因和细胞治疗产品，中国采用“双轨制”的框架进行监管，但人源类器官研究有其特殊性、复杂性和敏感性，因此除了评估其风险受益，伦理原则是否平衡与适度也需进行评估。目前，国家卫生健康委和国家药品监督管理局联合承担医疗机构开展干细胞临床研究的监管职责，中国相继推出和实施《干细胞临床研究管理办法 ( 试行 )》《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》《国家限制类技术目录和临床应用管理规范》，并且 2020 年和 2021 年分别起草《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则》和《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则》并公开征求意见。目前国家监管部门遵照上述临床管理原则及以《中华人民共和国药品管理法》为法律依据等开展专项监督检查，未来建议组织专业委员会制定相应的政策措施，优化法律和法规框架，细化相关规则和标准，逐步完善临床相关的监管体系并综合考虑伦理原则，为中国类器官产业创造更加良好的政策环境。5.4类器官研究的风险客观风险：新技术本身存在一定的客观风险，类器官作为药效评价研究 ( 临床前模型 )、传染病研究、肿瘤研究及精准治疗、再生医学方面一种新的研究方法，短期和远期是否安全有效、如何转化为临床应用都需要经过时间和实践的检验，仅有目前理论依据或探索研究可能存在风险和隐患。主观风险：类器官在应用阶段技术的推广、掌握过程都存在质量风险，中国人口众多，医务人员和研究机构人员数量庞大且水平参差不齐，易发生新技术的误用、滥用和谬用。伦理风险：类器官临床应用在缩短生物医学创新周期的同时，与人体组织相关的伦理问题，如道德地位、知情同意商业化和利益共享等随之而来，中国应在法律和监管政策下健全科技伦理治理，强化伦理底线意识，提倡公众参与治理，遵循伦理原则：人的福祉、尊重、负责、透明、公众参与和利益共享。生物安全风险：类器官涉及遗传物质、微生物改造或利用等生物技术的研究和应用，国际环境复杂且形势严峻，易存在危及公众健康、损害遗传资源和生物资源、破坏生态系统和生物多样性等危害。医疗管理风险：现有医疗管理体系对任何新技术使用所需的流程设置、人员安排、设施配套和建立应急措施都需进行调整，如何科学完善的管理、充分利用医疗资源、保证医疗安全都将会产生医疗管理风险。类器官用于监管工具的挑战与展望目前类器官模型已在毒理学评价中应用，但在其他靶器官毒理学研究中的应用极为有限。利用类器官模型进行毒理学评价，需要满足可获得高产量类器官模型、可测量毒性终点和高通量测试体系等方面的需求。现阶段相关研究还存在较多问题，具体如下：①尚未构建类器官应用方法学体系及其标准化工作。类器官培养过程暂无成熟的方法，也无标准化的程序，简单扩散过程在细胞大小和体积增加时不能为核心部分提供足够的氧气和营养，并且限制细胞代谢废物的排出，这导致制备的类器官通常缺乏基底、组织驻留免疫细胞和血管，限制了类器官的发育和成熟。②受试物的暴露途径、剂量和毒代动力学特征与体内相关性较难确认。由于类器官模型中的细胞呈 3D 生长和组织模式，并且采用的是特殊材料和器件体系，如何确定体外受试物暴露浓度、暴露途径、剂量和毒代动力学与体内的相关性，使得建立类器官毒理学模型具有困难。③剂量-效应关系评定。在动物 / 人体内产生毒性效应所需剂量，尚无法根据类器官毒理学研究结果利用体外体内外推法、计算毒理学模型直接估测。总   结 类器官组织可以打破传统细胞和动物模型的局限性，规避临床研究中存在的伦理问题，与源器官具有高度相似，与人类系统的生理和病理具有更加相似的表现且遗传稳定，在当前研究中具有极大的优势。随着类器官及相关技术的不断优化，类器官产品可在不久的将来在相关研究中发挥出更大潜能。随着该领域近年来迅速扩大，类器官在药效评价研究 ( 临床前模型 )、传染病研究、肿瘤研究及精准治疗、再生医学、免疫类器官领域已得到应用。在国内，类器官相关产品如胶原蛋白软骨再生载体 / 胶原基软骨修复基质已获得批准上市。许多类器官的可能性仍然只是在原理验证水平上显示，尚未得到广泛应用，但与其相关的再生医学产品已有突破性进展。类器官产品的功能与来源组织或器官高度相似，具有自我更新和组装能力，随着类器官监管政策的推进，预期在多领域具有广阔的应用前景。文章来源：《中国组织工程研究》作者：程玮璐 王泽华 张译丹 刘英慧END深度聚焦类器官与3D培养论坛，OTC2024论坛合作详询：王晨 180 1628 8769戳“阅读原文”立即领取限量免费参会名额！