L-Arginine hydrochloride/L-Lysine hydrochloride

几十年来，人们对癌症和心脏病等常见疾病进行了大量研究，这些疾病的治疗方法因此得到了极大的推进。然而，有许多疾病只影响少数人。这些疾病常常不受关注，相关研究也很少。其中包括很多罕见的遗传性疾病，例如DOOR综合征，这种疾病在加拿大和中东较为常见。“对于一些遗传性的罕见病，目前尚无治愈方法。然而，基因治疗是一种可能的解决方案，我们现在正在使用基因治疗测试各种策略。”挪威科技大学临床和分子医学系教授Magnar Bjørås说道。他在挪威科技大学和奥斯陆大学医院建立了一个研究团队，对罕见遗传性疾病进行基础研究，长期目标是寻找新的疗法。 脑细胞的患病结局  DOOR综合征是一种目前尚无药物或治疗方法的罕见疾病。这是一种涉及多种异常的先天性疾病。DOOR是该疾病主要特征的缩写：听力受损、甲基发育异常（指甲短小或缺失）、骨发育异常（手足短小）以及发育迟缓和智力障碍（以前称为智力低下）。DOOR综合征是遗传性的，是由OXR1（氧化抵抗基因1）基因中缺乏一种特定蛋白质引起的。“由于缺乏这种蛋白质，脑细胞无法正常发育。结局就是脑细胞要么功能失调，要么死亡。”Magnar Bjørås说道。为了探究是否有方法避免这种情况发生，Bjørås团队在他们实验室培养的微型大脑中进行了测试。 从皮肤细胞到微型器官  自2018年以来，Bjørås团队一直致力于培育微型大脑、微型肺和微型眼睛等微型器官。科学家们利用这些微型器官来测试药物和基因疗法的疗效。为了培养用于DOOR综合征研究的大脑，研究团队需要获得DOOR患者自身的细胞。加拿大和中东已经登记了许多DOOR综合征病例，研究团队正在进行的研究是基于挪威DOOR综合征患者的皮肤细胞开展的。“在实验室里，我们已将皮肤细胞转化为胚胎细胞。我们逆转了皮肤细胞的发育，使它们回到胎儿阶段，变得像人类最早形成的细胞一样，然后我们使用这些干细胞来制造微型大脑。”Bjørås说。研究人员在实验室中利用皮肤细胞制造出微型大脑科学家们利用DOOR综合征患者的皮肤细胞，在微型大脑中重现了这种疾病。接着他们可以使用微型大脑来测试疾病的治疗方法。开发微型大脑的过程需要几个月，时间和经济成本都较为高昂。 激发缺失的蛋白质  这项工作让科学家们深入了解了患者患病的原因，从而为治疗策略提供了新思路。基因疗法是一种潜在的治疗方法，可以使脑细胞开始生成缺失的蛋白质。“作为已发表内容的后续研究，我们现在正在测试基于病毒的基因疗法。”Bjørås说：“我们在实验室创造了一种无害的病毒，然后将健康的OXR1基因放入该病毒的基因组中，该基因能够产生DOOR综合征患者脑细胞所缺乏的蛋白质。”在这一过程中，病毒被用作向脑细胞传递蛋白质生成信息的信使。 疾病逆转成为可能  然后，研究人员将这种病毒注射到DOOR患者细胞培养出的微型大脑中。“病毒被吸收到大脑和脑细胞中，细胞便可以生成缺失的蛋白质。如果这种蛋白质能够过量生成，它就有助于阻止疾病，甚至可以逆转疾病。为了治疗DOOR综合征，患者需要在很早的阶段就开始进行基因治疗，可能是疾病的第一个症状出现后就开始治疗，”Bjørås表示道。过去20年以来，基因治疗研究取得了长足的发展。2007年，科学界只开展了一项基因治疗临床试验。如今，已经有数千项涉及基因治疗的临床试验在进行之中。有望治疗其他疾病  该研究不仅为DOOR综合征患者的治疗提供了新的知识和思路，也为其他疾病的治疗开启了全新的可能。“令人特别感兴趣的是，让DOOR综合征患者生成自身缺乏的OXR1蛋白的这种基因治疗方法还具有治疗其他疾病潜力，”Bjørås。OXR1蛋白可以减少炎症，炎症是大多数大脑退行性疾病的特征，例如儿童痴呆症、阿尔茨海默症、肌萎缩侧索硬化症和帕金森症。 大脑研究进行时  微型大脑已被用来研究大脑发育，科学家们创造了大脑的不同部分来控制不同的功能，如记忆、学习、运动技能、体液平衡、激素平衡和温度控制。人类模型首次验证了OXR1在大脑空间和时间发育过程中能够促进蛋白质甲基化。蛋白质甲基化是控制基因表达的几个重要化学过程之一。该研究为与患者OXR1缺乏相关的病理特征提供了新的见解。参考文献：Lin, X., et al. (2023). A loss-of-function mutation in human Oxidation Resistance 1 disrupts the spatial–temporal regulation of histone arginine methylation in neurodevelopment. Genome Biology. doi.org/10.1186/s13059-023-03037-1.责编|探索君排版|探索君End往期精选围观科学家称，每25人中就有1人携带“短寿”基因热文维生素B12在细胞重编程与组织再生中发挥关键作用！热文肝癌概率与种族相关？研究发现墨西哥裔美国人后代肝癌患病风险更高热文1型糖尿病潜在新疗法：抑制β细胞的Atf6基因激活热文一项最新发现或可用于阿尔茨海默病药物开发点击“阅读原文”，了解更多~

2005年，科学家首次发现细菌和古细菌体内存在一种系统，可以在病毒入侵时剪切下一段病毒的DNA拼接至自己的CRISPR序列中。等病毒再次入侵时，细菌就可以凭借之前留存的病毒DNA识别出病毒，并利用体内的DNA剪切酶Cas切除入侵病毒的DNA阻止其复制。这一套系统高效而精准，根据该发现，科学家们开发了CRISPR/Cas技术，只要将想要进行编辑的DNA拼接至CRISPR序列，就能借由该系统完成对特定基因的敲除。上一期，我们详细介绍了基因编辑中应用最广泛的CRISPR/Cas9技术，本期，我们将继续解读临床应用最火的三种CRISPR基因编辑技术：CRISPR/Cas9、CRISPR /Base editers（BEs）、CRISPR /Prime editers（PEs）。01CRISPR/Cas9 system全球首款CRISPR/Cas9基因编辑药物Casgevy刚获批CRISPR/Cas9系统是第一个被改造后用于人体细胞基因修饰的编辑器。Cas9蛋白细分有很多种（如表1）。其中源自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的spCas9应用最为广泛，本文所述Cas9均为spCas9。表1  CRISPR/Cas9 蛋白及其宿主、sgRNA大小、PAM序列、目标分子及切割位点[2]Cas9有6个结构域（如图1），分别为：① 结合gRNA的REC I（Recognition lobe）区域、② 结合靶序列后激活切割活性的精氨酸富集桥式螺旋区域（Arginine-rich bridge helix）、③ 特异性识别并结合PAM序列的PAM结合区域（PAM interaction）、④⑤ 负责切割靶序列的HNH和RuvC区域、以及⑥ REC II区域。REC II的功能目前尚不清楚。TracrRNA和crRNA经融合形成一条单链sgRNA，sgRNA的3’端形成特定的茎环结构并与Cas9 REC I 结合，此时Cas9被激活并通过与PAM序列（5’NGG3’）结合来搜寻靶序列，gRNA 5’端20bp片段通过碱基互补配对与靶序列结合，HNH和RuvC在PAM上游3bp处切割DNA双链，形成DSBs（double strand breaks）。在细胞内，DSBs主要通过非同源重组（non- homologous end -joining repair, NHEJ）进行修复，造成基因功能丧失；另一部分DSBs通过同源重组（homology-directed repair, HDR）进行基因修复。图1 CRISPR/Cas9 机制示意图[2]目前，基因编辑有两种策略：一种是先收集患者的细胞，在体外进行基因修饰后重新输注到患者体内，称为ex vivo策略；另一种是将试剂直接递送到患者体内，在体内完成基因编辑，叫做in vivo策略。全球首款CRISPR/Cas9基因编辑药物Casgevy2023年11月16日，全球首款CRISPR/Cas9基因编辑药物Casgevy在英国批准上市，用于治疗12岁及以上输血依赖性地中海贫血（TDT）或伴有复发性血管闭塞危象（VOC）的镰状细胞病（SCD）患者。Casgevy是由CRISPR Therapeutics和Vertex共同推出的一款自体、ex vivo CRISPR/Cas9基因编辑药物，该疗法需要先提取患者自身的造血干细胞，再通过电转的方式将CRISPR/Cas9系统递送到造血干细胞，靶向BCL11A红细胞系特异性增强子并且特异性沉默BCL11A基因，重新激活胎儿血红蛋白（HbF）的生成并表达高水平的HbF，从而缓解TDT患者的输血需求，减少SCD患者的疼痛和血管闭塞性危象。另外，CRISPR Therapeutics还有四款CRISPR/Cas9 based CART药物处于临床研究阶段，分别是CTX110，CTX112，CTX130，CTX13。NTLA-2001将于2023年底启动全球3期临床研究Intellia Therapeutics是2020年诺贝尔奖得主Jennifer Doudna 参与创立的公司，该公司目前有两款基于CRISPR/Cas9的in vivo临床候选药物NTLA2001和NTLA2002。NTLA2001用于治疗遗传性甲状腺转运蛋白淀粉样病变相关的多发性神经病或心肌病。通过静脉输注将包裹Cas9 mRNA和sgRNA的LNP（lipid nano-particle）递送到体内，LNP特异性靶向高表达低密度脂蛋白受体LDLR的肝脏细胞，从而降低肝脏甲状腺转运蛋白（TTR）的表达水平。NTLA-2001旨在通过在单次给药后推动血清TTR 蛋白水平持续下降并维持较低水平，提供了阻止和逆转疾病的可能性。如图2，在接受 0.3 mg/kg 或更高剂量（n=62）的所有患者中，第28天的中位血清 TTR 降低 91%，中位绝对残留血清 TTR浓度为17μg/ml，在所有临床测试中NTLA-2001 总体耐受性良好，大多数不良事件的严重程度为轻度。Intellia公司宣布NTLA-2001将于2023年底启动全球3期临床研究，拟用于治疗转甲状腺素蛋白介导（ATTR）淀粉样变性心肌病。NTLA-2001是首个获准进入后期临床开发阶段的在研体内CRISPR基因编辑疗法。图2 注射NTLA2001后血清TTR下降水平（Intellia Therapeutics）NTLA2002被EMA授予治疗HAE优先药物审批资格2023年10月，欧洲药品监督管理局（EMA）授予NTLA2002用于治疗HAE优先药物审批资格。NTLA2002目前处于临床I/II期阶段，其体内递送机制与NTLA2001相似。NTLA2002通过编辑激肽释放酶（Kallikrein）B1基因从而永久降低血清中激肽释放酶活性，用于治疗遗传性血管性水肿。Intellia计划最早于2024年第三季度，启动包括美国患者在内的全球关键性III期临床研究。关于CRISPR/Cas9系统临床应用，目前已披露临床候选药物见下表（表2）。表2  CRISPR/Cas9 based临床候选药物信息02CRISPR /Base editers（BEs）基因编辑的未来之星、单碱基精准替换单碱基编辑器BEs被誉为基因编辑未来之星，它利用CRISPR定位功能，在不产生DNA双链断裂的情况下实现单碱基的精确替换。BEs凭借更加安全、高效、精准的优点，在遗传疾病治疗领拥有广泛的临床应用。dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变，因此，dCas9只保留由gRNA引导进入基因组的能力。David R. Liu团队将dCas9与胞嘧啶脱氨酶进行融合，当dCas9在sgRNA的引导下特异性的打开靶点DNA双链时，胞嘧啶脱氨酶会将该处的胞嘧啶C脱氨化形成尿嘧啶U，U在DNA复制过程中被识别成T，由此完成碱基C to T的转化（如图3），这种系统就是初代Cytosine base editors (CBEs)。然而，初代CBEs 的C to T转化效率非常低，于是科学家们将尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合到CBEs的羧基端，再将dCas9替换成Cas9(D10A) nickase(nCas9)，完成CBEs里程碑式的升级。升级后的CBEs在肝细胞中C to T的转化效率可以达到74.9%。腺嘌呤A脱氨后形成肌酐I，I在DNA合成中被识别为鸟嘌呤G。David R. Liu将腺嘌呤脱氨酶融合到nCas9的氨基端，得到另一种单碱基编辑器Adenine base editors (ABEs)。 图3 Base editors 机理示意图[4]VERVE-101（1期临床）VERVE-101是一款由Verve Therapeuticsg公司推出的靶向PCSK9基因的ABE，用于治疗杂合体家族性高胆固醇血症。目前，VERVE-101处于临床1期阶段，这也是in vivo单碱基编辑疗法首次在美国获批进行临床试验。此外，Verve Therapeutics还有两款碱基编辑疗法VERVE-102和VERVE-201处于IND-Enabling阶段。BEAM-101（1/2期临床）BEAM-101是Beam Therapeutics公司在研的一种单碱基编辑疗法，它以基因组中的单个碱基为靶点，模仿遗传性胎儿血红蛋白持续存在（HPFH）综合征个体的单核苷酸多态性，以缓解镰刀状细胞贫血症的遗传突变导致的不良影响。该疗法在2021年11月获得了FDA的IND批准，目前正在进行治疗镰刀细胞贫血病和β地中海贫血的1/2期临床试验。BEAM-201（1/2期临床）BEAM-201是Beam Therapeutics公司推出的一款多碱基编辑试验药物，它是针对CD7靶点设计的四重碱基编辑CAR-T细胞疗法，用于治疗急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）或CD7阳性的急性髓系白血病（CD7+ AML），目前该产品处于临床1/2期。Beam Therapeutics致力于通过其专有的单碱基编辑技术来创建一类新型的精密的基因编辑药物，该公司旗下还有两款产品BEAM-302和BEAM-301处于IND-Enabling阶段（如图4）。 图4. Beam Therapeutics公司产品管线（Beam Therapeutics）03CRISPR /Prime editers（PEs）可完成12种碱基→碱基的转换先导编辑器PEs是David R. Liu团队继BEs之后研发的又一款精准基因编辑技术，BEs只能完成C to T，A to G，G to A和T to C四种碱基的转变，而PEs可以完成全部12种碱基to碱基的转换。PEs由nCas9-RT融合蛋白和pegRNA两部分组成（如图5）。nCas9-RT由切口酶nCas9(H840A) 和鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)融合而成，pegRNA由sgRNA、携带目的序列的逆转录模板和引物结合位点（primer binding site, PBS）组成。nCas9在pegRNA的引导下切割非靶向链并产生缺口，暴露出3’羟基基团，这促使3’端的序列与PBS结合并引导逆转录酶按照逆转录模板合成DNA，随后在细胞错配修复机制的作用下，目的基因被成功整合到宿主基因组。 图5 Prime editors 机理示意图[7]Prime medicine是David R. Liu创办的一家以Prime editing为主的公司，目前该公司布局了18条相关的产品管线。10月27日，Prime Medicine公布了最新临床前数据，在非人灵长类动物（NHP）中，静脉注射Prime Editor后，高达83%的肝细胞（高达50%的全肝）的p.L348fs突变被精确编辑，编辑效率远高于预期阈值，且未观察到安全问题。在人源化1b型糖原贮积病GSD1b小鼠模型中观察到高达56%的全肝编辑，体外分析未检测到脱靶编辑。目前，虽然PEs领域还没有产品进入临床，但是研究者们在多种哺乳动物模型中进行了POC(如表3)，这为即将到来的多项临床研究打下了基础。表3  Key examples of preclinical gene and cell therapy applications of prime editing[7]写在最后在三种CRISPR编辑技术中，临床研究最火热的当属Cas9系统，利用NHEJ机制在DNA双链断裂处产生indels，可以高效的完成多种致病基因的敲除。但是，Cas9系统在靶向目标DNA的时候，容易发生基因脱靶，跑到基因组其它位置切割DNA，从而引发功能基因敲除或者染色体易位。In vivo的脱靶现象除了基因脱靶以外，还包括组织脱靶，组织脱靶与递送载体(如LNP、AAV、eVLP等)的组织偏好性密切相关。这两种脱靶现象也是阻碍in vivo 的CRISPR/Cas9产品从临床走向市场的最大障碍。从机理来看，PEs更像是BEs的“高阶版本”，但是，PEs存在一个普遍的问题，就是编辑效率较低，针对这一点，目前仍需要大量的研究来进行优化。对比BEs和PEs两种编辑技术，发现当靶点区域存在单个目标核苷酸时，或者旁观者编辑被需要时，BEs通常比PEs更高效。但当存在多个目标核苷酸并且不需要旁观者效应时，或者当靶序列处的PAM不可用时，PEs比BEs更有优势。 主要参考文献 [1]中国国家药监局药品审评中心（CDE）官网.Retrieved Nov15，2023, From https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/4b5255eb0a84820cef4ca3e8b6bbe20c[2] V. Edwin Hillary1 · S. Antony Ceasar1. A Review on the Mechanism and Applications of CRISPR/Cas9/Cas12/Cas13/Cas14 Proteins Utilized for Genome Engineering. Molecular Biotechnology (2023) 65:311–325[3] Madigan, V., Zhang, F. & Dahlman, J.E. Drug delivery systems for CRISPR-based genome editors. Nat Rev Drug Discov (2023). https://doi-org.libproxy1.nus.edu.sg/10.1038/s41573-023-00762-x[4] Yanhui Liang1,2,3,*, Fangbing Chen1,2,3,4,*, Kepin Wang1,2,3,4, Liangxue Lai. Base editors: development and applications in biomedicine. Frontiers of Medicine 2023;17,359-387.[5] Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA withoutdouble-stranded DNA cleavage. Nature 2016; 533(7603):420–42411[6] Rees HA, Liu DR. Base editing: precision chemistry on thegenome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 2018;19(12): 770–78810[7] Zhihan Zhao ,1,2 Peng Shang ,1,2 Prarthana Mohanraju ,1,2,* and Niels Geijsen 1,2,* Prime editing: advances and therapeutic applications. Trends in Biotechnology, August 2023, Vol. 41, No. 8识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。