Paclitaxel-hyaluronic acid conjugate(Fidia Farmaceutici SpA)

摘要：自信使核糖核酸（mRNA）作为疫苗制剂首次在临床研究中成功应用以来，经过近30年的发展，mRNA治疗技术领域取得了许多进展。本文揭示了mRNA疫苗独特的优点，包括产生无毒、有效免疫反应的能力以及可快速设计和规模化扩增的潜力。这些优点使mRNA疫苗成为2019冠状病毒病（COVID-19）大流行期间的优势候选疫苗。事实上，最早获得监管机构加速授权的两种COVID-19疫苗是核苷修饰的mRNA疫苗，它们对症状性严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的感染显示出90%以上的保护效力，并在关键的III期临床试验中表现出较好的安全性。利用mRNA疫苗开展全球疫苗接种活动的实际证据支持了临床试验证据，并进一步表明这种技术可以安全有效地用于抗击COVID-19。这一前所未有的成功也强调了该种新药类别更广泛的应用潜力，不仅可用于其他传染病，也可用于其他适应症，如癌症和遗传疾病。本文简要介绍了核苷修饰和未修饰mRNA、环状RNA和自扩增RNA这四种mRNA疫苗平台的发展历史和现状，并对COVID-19 mRNA疫苗近年来的研究进展和现状进行了综述。我们还讨论了这些技术目前和预期的挑战。这对未来的研究方向和临床应用是很重要的。引言疫苗是预防、控制和/或根除传染病的重要工具，是全球公共卫生规划的基本组成部分。有效的2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗的研发和批准是当前大流行期间的一个重要里程碑。为抗击由一种此前未知的病原体——严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 （SARS-CoV-2）引起的疾病，大量疫苗研发项目同时启动。根据世界卫生组织的疫苗跟踪报告，截至2022年1月14日，有333种候选疫苗正在研发中，其中139种已进入临床阶段。mRNA技术的快速发展和高效的免疫反应使其跻身新冠病毒疫苗竞争的前列。主要原因是该技术需要的是已知序列的病毒基因组，而不是活病毒，而且设计仅需几天时间。此外，无细胞疫苗的规模化生产相对简单，因此为快速应对流行病和大流行提供了一种先进的工具。在此论文撰写时，已经进入临床的COVID-19疫苗中，23个（17%）是基于mRNA的疫苗。此外，最早获得欧洲药品管理局（EMA）有条件上市许可（CMA）或美国食品药品管理局（FDA）紧急使用许可（EUA）的两种疫苗分别是BioNTech/Pfizer和Moderna公司的核苷修饰mRNA疫苗，其在Ⅲ期临床试验中对症状性SARS-CoV-2感染的保护效率超过90%，超出了预期。在此综述中，我们总结了mRNA疫苗的临床前和临床数据，这些疫苗分为四种mRNA疫苗平台：非复制线性核苷修饰和未修饰mRNA、环状RNA（circRNA）和自扩增RNA（saRNA）。此外，我们还讨论了可能阻碍未来疫苗研发计划的潜在挑战。新冠mRNA疫苗发展之路与研发相对缓慢和费力的传统疫苗相比，基于mRNA的疫苗具有快速设计和快速规模化扩增的特点，同时具有高效力和低成本的优点。尽管mRNA疫苗已经在其他疾病（如癌症）的临床试验中进行了研究，但其深远的潜力直到COVID-19大流行时才被认识到——mRNA疫苗是首批进入临床试验并加速获得监管部门批准的疫苗。如果没有过去30年的广泛研究和技术进步，这一成就是不可能实现的。本节重点介绍最终促成COVID-19 mRNA疫苗发展和批准的一些最重要的突破。随着mRNA的发现，该领域的研究激增，并产生了多项科学突破，最终导致了RNA疫苗的发展。此前，由于细胞对裸mRNA的摄取极少，使得mRNA特性的检测受到阻碍。然而，保护性脂质制剂的发展使后续的mRNA研究工作变得不那么复杂了。保护性脂质制剂在1978年的一项研究中首次成功使用。这项研究将兔网织红细胞9S mRNA引入小鼠淋巴细胞，导致球蛋白合成。同年，在人细胞中也诱导了脂质体mRNA转运后的蛋白表达。后来，转染的有效性进一步提高，合成的阳离子脂质融合入脂质体，用于mRNA的递送。脱氧核糖核酸（DNA）依赖性RNA聚合酶的鉴定是利用DNA模板进行体外mRNA转录（IVT）的关键步骤。IVT于1984年首次发表，它能使从模板中选择的功能mRNA的转录达到所需的量。直到1993年，mRNA才首次被用作疫苗，在临床前试验中使用脂质运送的方式诱导出针对编码的致病抗原的特异性免疫反应。又过了20年，对抗传染病的mRNA疫苗在Ⅰ期临床试验，即概念验证阶段中被研究。由于脂质体在临床应用中具有潜在的毒性，因此首个小干扰RNA -脂质纳米颗粒（LNP）治疗药物和mRNA COVID-19疫苗的成功获批仅源于它们使用电离化含脂LNP进行递送，其在静脉注射（i.v.）后肝细胞或肌肉注射（i.m.）后肌肉细胞中的传递效率明显更高。此外，最近发现LNPs具有强大的佐剂功能，这进一步证明了其在疫苗应用中的有益作用。在mRNA作为一种药物的研发过程中，缺乏稳定性以及天然免疫激活是多年来的重要问题。含尿苷的mRNA能刺激天然免疫应答，并在用作疫苗时具有确定的佐剂功能。然而，将修饰过的核苷加入mRNA可以显著提高mRNA的生物稳定性和翻译能力，同时降低天然免疫应答。进一步提高mRNA质量可以利用纤维素、高效液相色谱（HPLC）、快速蛋白液相色谱（FPLC）、低聚物（dT）纯化或正切流动过滤（TFF）来纯化IVT mRNA。由于现有mRNA疫苗的细节尚未披露，因此只能进行推测。与LNP结合，修饰mRNA是目前独立mRNA疫苗平台的基础。由于能产生最佳的免疫应答，该平台被证明是最成功的mRNA疫苗平台。其最佳免疫应答源自LNP佐剂功能和修饰mRNA之间的平衡，从而提高有效性和安全性。尽管mRNA-LNP平台提供了多种优势，但仍有改进的空间，我们可能会看到这项技术的进一步迭代。最近，基于小鼠模型数据的临床结果预测的局限性被发现。该局限性来自于mRNA脂质体刺激toll样受体（TLR）7/8，从而诱导系统性炎症的下游效应。据报道，人类分泌促炎白细胞介素（IL）-1b，而小鼠通过诱导上调IL-1受体拮抗剂来控制炎症。这一领域的另一个挑战是脂质成分本身可能激活免疫应答，而免疫应答可能因成分和制剂的类型而不同。一项比较LNP和脂质体的研究发现，二者的差异来自于细胞因子诱导，表明LNP制剂的可电离脂质可能是导致差异的原因。考虑到这一点，未来对mRNA应用后免疫下游效应的研究需要谨慎，这可能会影响mRNA的安全性，并且需要根据疾病仔细选择mRNA制剂的类型和组成。除了线性mRNA，其他mRNA疫苗平台也受到了关注。circRNA最早于1976年被发现，后来在人类细胞中被检测到。虽然最初认为它不是翻译模板，但后来的报告反驳了这一假设，引发了进一步的研究。与线性RNA相比，由于缺乏防止降解的末端，circRNA的生物稳定性增强，因此circRNA可能是一个有前途的研究方向。另一种降低剂量水平的方法是使用能够自我放大的mRNA平台。随后的病毒生物学研究利用在抗原编码序列旁插入一个RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）序列，导致兴趣抗原在细胞质中扩增。随着兴趣抗原的细胞内RNA复制，saRNA可以实现低mRNA剂量下的高抗原产量。mRNA疫苗的免疫机制及SARS-CoV-2抗原的筛选用mRNA疫苗免疫需要抗原编码的mRNA转录形成LNPs，并运送到抗原呈递细胞（APCs）（图1）。LNP-mRNA被内吞，并通过内体逃逸到细胞质而释放。在被转染细胞（包括肌肉细胞和APCs）的细胞质中，兴趣抗原作为膜结合抗原提呈，导致B细胞、CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞应答的激活（图1）。生发中心B细胞及CD4+ T滤泡辅助细胞（Tfh）的调节对高亲和力中和抗体滴度和持久的B细胞应答至关重要。Tfh细胞识别APC表面的抗原，帮助激活B细胞，从而产生高亲和力的病毒中和抗体。最近，研究发现LNP- mRNA疫苗的LNP成分具有佐剂活性，这取决于其可电离的脂质成分和IL-6细胞因子的诱导。这种LNP驱动的佐剂活性导致了强烈的Tfh细胞反应和体液免疫，从而增强了mRNA疫苗的有效性。Tfh细胞进一步帮助激活CD8+细胞毒性T细胞，特异性识别并清除病毒感染的细胞（图1）。事实上，在人体内接种SARS-CoV-2 LNP-mRNA后，会引发一种持久的抗原特异性生发中心B细胞反应以及血液和引流淋巴结中的质粒反应，导致强烈而持久的体液免疫。图1 用mRNA疫苗免疫对抗COVID-19mRNA疫苗免疫需要抗原编码的mRNA转录物。线性非复制mRNA由一个编码抗原的序列（如SARS-CoV-2的S蛋白）组成，其两侧是5'和3' utr，5'端有帽状结构，3' 端有poly（A）尾。根据IVT过程中使用的未修饰或修饰核苷，产生未修饰或修饰的mRNA。saRNA由相同的序列团组成，但还包含：（1）编码4个非结构蛋白（nsP1-4）的序列，它们形成一个复制酶，负责saRNA的扩增（2）病毒源的亚基因组启动子（黑色箭头），可启动抗原的转录。用于疫苗的circRNA由包含抗原序列的共价闭合单链RNA和允许抗原翻译起始的IRES组成。抗原编码mRNA形成LNPs，内吞，并通过内体小泡逃逸到细胞质而释放。S蛋白由APCs（红色圆圈）的翻译机制产生，被蛋白酶体（粉色圆圈）降解，并呈递至MHC I（粉色圆圈）上，导致对SARS-CoV-2的特异性CD8+细胞毒性T细胞反应。抗原也可以锚定在APC的膜上，并直接被BCRs识别，导致B细胞反应；然而，这种途径及其对抗体生产的贡献目前仍有争议。最后，抗原蛋白可以从细胞输出，被内吞回相同或另一个APC，被内吞蛋白酶降解，并呈递至MHC II结构上，导致CD4+辅助T细胞应答。CD4+辅助T细胞进一步帮助（1）激活产生SARS-CoV-2中和抗体的B细胞，（2）激活可能特异性识别和消除病毒感染细胞的CD8+细胞毒性T细胞。APC，抗原呈递细胞；BCR，B细胞受体；circRNA，环状RNA；IRES，内部核糖体进入位点；IVT，体外翻译；LNP，脂质纳米颗粒；MHC，主要组织相容性复合体；mRNA，信使核糖核酸；saRNA，自扩增核糖核酸；SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2；S蛋白，纤突蛋白；TCR，T细胞受体；UTR，非翻译区。SARS-CoV-2的整个表面刺突（S）糖蛋白或S蛋白的受体结合域是病毒进入宿主细胞的关键，代表着新冠肺炎疫苗开发中选择最广泛和最合适的抗原靶点。全长S蛋白和RBD本身都具有免疫原性，并在被免疫系统识别后诱导强大的保护性中和抗体反应。免疫反应可通过引入两个连续的脯氨酸残基（2P）来改善，已知这两个残基将全长S蛋白保留在预融合构象中。S蛋白被宿主细胞蛋白酶Furin切割成支持进入细胞的亚基（S1和S2）。有趣的是，切割完成的S1亚基的C末端基序可以与神经肽-1（NRP-1）结合，从而对T细胞记忆产生负面影响。因此，在疫苗开发过程中，S蛋白的Furin蛋白酶切割位点的修饰功能丧失或缺失可能是有益的。病毒抗原编码的信使核糖核酸疫苗的效力受到编码序列密码子优化的影响，但不仅与稳定性和可译性有关。最近的一项研究表明，来自SARS-CoV-2感染过程中框外开放阅读框翻译的隐蔽表位在密码子优化过程中可能被修改或丢失，导致免疫原性反应增强或减弱。核苷修饰的mRNA疫苗在COVID-19大流行的早期阶段正在研究许多候选疫苗，包括核苷修饰的LNP-mRNA疫苗，这些疫苗率先进入临床试验并获得EUA、CMA以及后来的全面监管批准。目前，共有8种候选核苷基因修饰的LNPmRNA疫苗处于临床试验中，所有这些疫苗都具有一个关键特征，即能够用1-甲基伪尿苷（M1J）取代信使核糖核酸中的所有尿氨酸（表1）。核苷修饰的mRNA疫苗和LNP特征已在其他地方进行了广泛的总结。在这里，我们重点介绍已披露的mRNA结构特征的主要差异（图2）。BioNTech/Pfizer的modRNA平台RNA序列（用于BNT162b2）由人α-珠蛋白5’非翻译区（UTR）、氨基末端分裂增强子（AES）和mtRNR13’UTR基序和由A30LA70组成的Poly（A）尾部组成（连接铰链[L]：GCAUAUGACU），而由Moderna（mRNA-1273、mRNA-1273.211、mRNA-1273.351）、武田（Tak-919）和朱拉隆功大学（ChulaCov19）开发的序列尚未完全公开。BNT162b2使用三核苷酸Cap1类似物（（m27，3’-O）Gppp（M2’-O）APG）（TriLink）进行共转录加帽，而Moderna使用酶法加帽来获得其临床前mRNA12733。所有八种核苷修饰的mRNAs都是使用来自Acuitas、Modernna和Genevant的三种类型的LNP中的一种来形成的，这三种LNP由四种成分组成：可电离脂质、结构脂质、隐形脂质和胆固醇。图2 广泛使用的COVID-19 mRNA疫苗：成分比较 BNT162b2（BioNTech/Pfizer）和mRNA-1273（Moderna）由1-甲基假尿苷修饰的全长尖峰mRNA组成，具有脯氨酸取代即富含GC、密码子优化的特点，并由标准mRNA成分组成：帽、5’UTR、编码序列、3’UTR和poly（A）尾。BNT162b2与（（m27，3’-O）Gppp（M2’-O）APG）Cap1共转录加帽，并具有人类α-珠蛋白5’UTR、AES和mtRNR1 3’UTR基序、两个终止密码子和由A30LA70mRNA-1273组成的poly（A）尾91,92。mRNA-1273是酶加帽的，具有未公开的5’UTR和基于人类β-珠蛋白基因的3’UTR、三个终止密码子和未公开长度的poly（A）尾。在这两种情况下，mRNA都是使用由可电离脂质、结构脂质、隐形脂质和胆固醇组成的LNP制成的。两种mRNA疫苗的LNP都含有DSPC和胆固醇。BNT162b2和mRNA-1273LNP配方的独特之处在于使用ALC-0315和SM-102可电离脂质以及ALC-0159和PEG2000-DMG，分别是基于PEG的隐形脂质。脂质以特定的摩尔比整合到LNP中。除了mRNA和LNP成分外，唯一的成分是盐（分别用于BNT162b2和mRNA-1273的PBS和Tris缓冲液）和10%蔗糖用作两种mRNA疫苗的冷冻保护剂。ALC-0159,2-[（聚乙二醇）-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺；DSPC，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱；K，赖氨酸；mRNA，信使核糖核酸；LNP，脂质纳米颗粒；P，脯氨酸；PEG2000-DMG，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-甲氧基聚乙二醇；UTR，未翻译区；V，缬氨酸；AES，氨基末端分裂增强子；mtRNR1，线粒体编码的12SrRNA；ALC-3015,（（4-羟基丁基）氮杂二基）双（己烷-6,1-二基）双；SM-102,9-十七烷基8-{（2-羟乙基）[6-氧代-6-（十一烷氧基）己基]氨基}辛酸酯。图是使用BioRender.com创建的。核苷修饰的mRNA疫苗的设计和临床前测试基于多年的研究；因此，在COVID-19大流行开始时，它们已经做好了快速调整和应用于SARS-CoV-2的准备。然而，需要重大创新的瓶颈之一是制造、工艺开发和放大方法，以满足大规模临床试验和随后的全球营销的供应需求。制造过程的细节是生产核苷修饰mRNA疫苗的公司专有的，没有在文献中披露。Figure3概述了这种制造和放大的基本步骤：IVT、mRNA纯化、配制过程以及填充和完成的下游步骤。此过程中的关键步骤之一是mRNA纯化，它可以去除双链RNA（dsRNA）污染物。通过识别内体中的TLR3或视黄酸诱导基因I、黑色素瘤分化相关蛋白5和细胞质中的炎性体，dsRNA会过度激活先天免疫并导致不良事件的概率取决于数量。用于大规模生产的BNT162b2和mRNA-1273的确切纯化过程尚未公开。HPLC是实验室环境中mRNA纯化的黄金标准；然而，在扩大规模时会遇到挑战，因此只能推测必须在mRNA疫苗纯度和规模扩大的制造工艺之间进行某些调整，以允许生产足够的疫苗以满足大流行期间的全球需求。另一种可能性是IVT水平的创新（例如，通过使用工程RNA聚合酶和特定反应条件），这可能导致IVT反应过程中dsRNA形成的显着减少，从而通过标准工业纯化方法实现出色的纯度。最近，一种热稳定的RNA聚合酶被用于mRNAIVT并防止dsRNA的形成，无需纯化步骤即可降低对此类mRNA的免疫反应。2021年，Moderna提供了其T7RNA聚合酶的详细信息，该酶能够最大限度地减少dsRNA形成；然而，它在mRNA-1273疫苗生产中的潜在用途目前尚未公开披露，只能推测。临床试验中应用的核苷修饰的抗新冠肺炎LNP mRNA的剂量范围为10至250 mg RNA（表1）。为预防新冠肺炎，FDA于2020年12月11日授予BNT162b2 30 mg剂量的EUA，并于2020年11月18日不久授予mRNA-1273 EUA，用于18岁及以上的个人，剂量为100 mg。2021年8月23日和2022年1月31日，FDA分别批准了16岁及以上个体的BNT162b2和18岁及以上的个体的mRNA-1273。表1中所述的所有核苷修饰的LNP mRNA均以预增强（p-b）方案进行IM给药，BNT162b2和ChulaCov19的间隔为3周，mRNA-1273和TAK-919的间隔为4周。图3 核苷修饰mRNA疫苗的制造和放大核苷修饰的mRNA疫苗生产的第一步包括IVT反应在特定条件下进行的该反应基于混合线性化质粒模板、噬菌体RNA聚合酶、核苷三磷酸盐（包括m1J）和Cap1结构（当使用共转录封端过程时）。IVT反应可以在不同的规模下进行，通常随后是DNA酶I消化，这允许DNA模板耗尽。mRNA的纯化是一个允许消耗不需要的IVT反应副产物和其他杂质的过程。通过不同类型的色谱（如HPLC或TFF技术）在IVT反应期间形成的dsRNA的耗竭意味着mRNA疫苗引发的由系统先天免疫系统反应引起的不良事件保持在最低水平。纯化的mRNA在适当的缓冲液中稀释，然后用脂质组分配制，脂质组分通过微混合技术溶解在乙醇中。下游工艺包括进一步纯化、缓冲液交换和填充和完成前的无菌过滤。在需求高的情况下，如在大流行期间，原材料的可用性对于持续大规模生产至关重要。该过程由LNP、mRNA和LNP mRNA水平的大量质量评估严格控制。高效液相色谱法；LNP，脂质纳米颗粒；1-甲基假尿苷；信使核糖核酸；RNA聚合酶；TFF，切向流过滤。图是用BioRender.com创建的。在临床前研究中，一次体内注射BNT162b1或BNT162b2足以引发高滴度的抑制性抗体应答以及CD4+辅助性和CD8+细胞毒性T细胞应答。给恒河猴注射两次BNT162b2，导致SARS-CoV-2中和抗体滴度比恢复期人血清高8.2至18.2倍。BNT162b1和BNT162b2的I/II期试验的安全性和免疫原性数据支持基于较温和的全身反应和针对不同SARS-CoV-2病毒变体中保守表位的强适应性体液和多特异性细胞免疫应答，选择BNT162b2进行II/III期试验。在BNT162b2 II/III期试验中，共有43548名16岁或16岁以上的参与者，两剂BNT162b2证实了良好的安全性和95%的疫苗有效性（预防新冠肺炎）。在12至15岁的儿童中，两次30 mg剂量的BNT162b2显示出良好的安全性，并导致100%的疫苗有效性。最近，作为在5至11岁儿童中检测BNT162b2的临床试验（NCT04816643）的一部分，发现两种10 mg剂量的BNT162b2可提高90.7%的疫苗效力（预防新冠肺炎）。由于LNP mRNA疫苗的效力随着时间的推移而降低，并且出现了高度传染性的SARS-CoV-2变体，如delta（B.1.617.2）和omi-cron（B.2.1.529），正在检查加强接种的效果。以色列一项针对60岁以上人群的研究表明，在完成p-b初级方案后至少5个月给予BNT162b2单一增强剂，重症报告减少95%，确诊新冠肺炎病例的比率显著降低。最近，多个试验研究了针对德尔塔（B.1.617.2）和奥密克戎（B.2.1.529）变体的疫苗诱导免疫。在所有情况下，与delta（B.1.617.2）相比，尤其是与野生型变体相比，第二剂基于mRNA的疫苗后，奥密克戎的中和抗体滴度（B.2.1.529）显著降低，而第三剂显著提高了抗体中和滴度。这表明，mRNA疫苗的加强剂量的应用可能会防止这些高传染性变体，并支持目前正在全球推广的加强疫苗剂量。2021 9月22日，美国食品和药物管理局（FDA）通过EUA获得了BNT162b2的增强剂量，用于R65岁或R18岁的重度COVID19高危人群。目前，在特定人群（包括6个月至4岁的儿童、孕妇、免疫功能低下的个人和癌症患者）中使用授权疫苗的临床试验正在进行中（表2）。mRNA-1273经历了类似于BNT162b2的临床开发过程，3在关键的临床II/III期试验中证明，对于18岁的儿童，其具有良好的安全性和94.1%的疫苗有效性（预防新冠肺炎疾病，包括严重疾病）。在对p-b疫苗接种后单次加强剂量的中期分析中，Moderna测试了mRNA-1273和多种变体修饰形式，发现了高安全性和耐受性，以及针对关键变体和感兴趣变体的中和滴度增加SARS-CoV-2，包括β（b.1.351），γ（p.1），δ（b.1.617.2）和omicron（b.1.1.529）。在12至17岁的儿童中，mRNA-1273显示出95%的疫苗有效性，并具有可接受的安全性。2021年10月20日，美国食品和药物管理局获得了单次增强剂量的mRNA-1273，同时目前正在招募针对特定人群的多项临床试验（表2）。虽然最初的临床试验包括健康志愿者，但一个重要的方面是孕妇的安全性和有效性，他们没有包括在内。最近对10861名孕妇进行的一项观察性研究表明，BNT162b2在预防新冠肺炎方面有96%的有效性。在一个有131人的较小患者队列中，对怀孕或哺乳期妇女的BNT162b2和mRNA-1273进行了研究，两种疫苗都能产生强大的体液免疫，孕妇和非孕妇在接种后的反应原性方面没有显著差异。重要的是，在婴儿脐带血和接种疫苗的孕妇的母乳中发现了针对SARS-CoV-2的功能性中和抗体，这表明对新生儿有保护作用。2022年1月，欧洲药物管理局的新冠肺炎工作组完成了对孕妇多项研究的详细审查，包括约65000例妊娠。根据研究结果，鼓励在怀孕期间使用基于mRNA的新冠肺炎疫苗，因为未发现孕妇及其未出生婴儿发生妊娠并发症的风险增加，并且与非孕妇相比，有效性没有降低。未修饰mRNA疫苗mRNA构建体（包括编码序列）的优化可以调节免疫原性，而无需掺入修饰的核苷。通过密码子优化替换尿苷可以实现尿苷的消耗以减少反作用免疫反应，但这必须与转移RNA丰度平衡。目前，还没有上市的未修饰mRNA疫苗，但正在临床试验中研究候选疫苗（表3）。未修饰的信使核糖核酸疫苗信使核糖核酸结构的优化，包括编码序列，可以在不掺入修饰核苷的情况下调节免疫原性。通过密码子优化替换尿苷，来去除尿苷以减少适得其反的免疫反应，但这必须与转译核糖核酸的丰度相平衡。现阶段，还没有已上市的未修饰信使核糖核酸疫苗，但已有候选疫苗已在进行临床试验评估。由Cure-Vac 使用RNActive信使核糖核酸开发平台选出有着良好安全性的CvnCoV 候选疫苗，其剂量可达12mg，但在临床IIb/III 阶段，间隔 4 周施打第二剂 12mg，在 39,680 名参与者中，所有年龄组的任何严重程度计分之COVID-19的预防效果仅48%，最终导致其退出监管审批程序。针对COVID-19的未经修饰的信使核糖核酸疫苗仍有些固有局限性待克服。这些限制是基于由于细胞内检测和I型干扰素(IFN)产生而导致的未修饰信使核糖核酸 的内在免疫原性，而 I 型干扰素(IFN)反过来又导致转译抑制、CD8+ 细胞活化减少和抑制T辅助细胞产生。这些改变可能导致减弱的特异性免疫反应。然而，CureVac进一步改造了信使核糖核酸的UTRs，并在临床前测试中显示出优异的免疫学特征。随后，CureVac计划与葛兰素史克合作在临床项目中研究第二代候选疫苗。由 Translate Bio和赛诺菲开发的MRT5500在I/II期试验，其中不同剂量（15、45或135 mg）以3周的间隔施打第二剂，没有安全性或耐受性问题。有趣的是，MRT5500 候选疫苗是使用具有丧失修饰功能的弗林蛋白酶切割的全长棘蛋白位点（RRAR682-685GSAS）-编码序列。然而，开发人员却决定不进行候选疫苗的临床 III 期试验。BioNTech/辉瑞公司开始在三种不同的信使核糖核酸疫苗平台上开发COVID-19疫苗，其中一种是利用未修饰的信使核糖核酸。BNT162a2是一种由未修饰线性信使核糖核酸编码的全长棘蛋白，但没有被选择用于后期临床试验。而由云南沃森、苏州艾博与中国人民解放军军事科学院合作研发的ArCoV候选疫苗已注册进入后期临床评估。其研究的产品为受体结合域编码的脂质纳米颗粒-信使核糖核酸，以15 mg剂量施打第二剂。开发人员强调热稳定性，因为他们的疫苗可以在室温下储存至少1周，并且在临床前研究中得到了证实。由Providence Therapeutics开发的PTX-COVID19-B随着临床前测试和成功的 I 期试验后已进入II期临床试验，显示了在血清阴性个体中内高达100 mg的剂量是具有可耐受的安全性，并诱导了很高的中和抗体水平。2022年1月，开始将PTX-COVID19-B与授权的BNT162b2 COVID-19疫苗进行临床试验比较。由第一三共开发的DS5670在日本人群体中进行四种不同剂量的测试，最高达100 mg，并着重于I/II期临床试验中的年龄特异性免疫原性反应。最近，该公司披露，在不同年龄组中未观察到相关的安全问题，并具有适当的免疫原性反应。在I期临床试验中，斯微生物与上海东方医院合作并正在测试他们的SW-0123候选疫苗。有着天然全长棘蛋白编码的信使核糖核酸并非为融合稳定的形式，是需要配制成核状结构的脂多聚复合物(LPP)，其在临床前研究结果显示对树突状细胞具有高度选择性。EyeGene开发了一种使用阳离子脂质体的专有配方，以避免使用聚乙二醇并促进生产过程中的冷冻干燥。他们的候选药物计划于2021年底在韩国进行I/IIa期试验。此外，许多处于临床前阶段的开发项目用意在于使用未修改的线性信使核糖核酸 平台创建有效的 COVID-19 疫苗，包括德国马克斯-普朗克研究所(德国)、塞尔库克大学(土耳其)、康希诺(中国)与Precision Nanosystems合作、BIOCAD(俄罗斯)、RNAimmune(美国)、Greenlight Biosciences(美国)、IDIBAPS(西班牙)、Cell Tech Pharmed(伊朗)、ReNAP(伊朗)与Globe Biotech(孟加拉)。特别是，由eTheRNA开发的独特配方使其候选疫苗适用于鼻内给药，这可证明通过激活粘膜免疫对SARS-CoV-2疫苗接种是具有优势。上海蓝鹊生物医药、复旦大学和上海交通大学联合开发三种疫苗药品，除了棘蛋白外，还包括一种编码膜(M)和包膜(N)蛋白的蛋白，這三种蛋白會產生類病毒顆粒，与其他信使核糖核酸候选疫苗相比是标的不同的抗原。环状信使核糖核酸circRNA环状信使核糖核酸（也称为endless RNA）可以在真核生物执行转译，其结构为环形封闭，与线性相比更可以抵挡核酸外切酶避免降解。尽管有这些潜在的好处，但目前也只有一种环状信使核糖核酸的COVID-19候选疫苗正在开发，其生产是利用第一组核酶自催化策略。但截至2022年1月31日，尚未进入临床试验。此环状信使核糖核酸的受体结合域抗原编码序列被包裹在脂质纳米颗粒中，并与信号肽序列融合，确保抗原分泌产生并提高结合能力。为了驱驶转译，将未公开的内部核糖体进入位点(IRES)设计于抗原编码序列的前面。在临床前研究中，将候选疫苗以肌肉注射至小鼠体内，在相隔2周的增强方案中以两种不同的剂量（10和50mg）施打，以剂量依赖性方式引发高浓度，有着TH1辅助细胞反应的中和抗体。saRNA疫苗与其他信使核糖核酸 疫苗平台类似，saRNA 有助于快速候选药物设计和开发，以及可做到无细胞的分子合成。此外，由于其自我复制的性质，其中编码的复制酶可以让抗原编码核糖核酸的有多个拷贝，与非复制性信使核糖核酸相比，可以用更低的剂量达到相同的转译水平。saRNA 疫苗本质上是自带佐剂的功能，其中是因为复制酶活性让双股信使核糖核酸和复制子中间体在转录过中像是模拟病毒感染。这引发了更广泛的免疫反应，也被认为是最有潜力通过单剂量接种的药物。许多临床试验正在评估saRNA 疫苗对 COVID-19的安全性和有效性(表四)。目前领先与公开的候选疫苗是设计由委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV) 衍生复制酶，其中一个信使核糖核酸分子是带有抗原编码序列主要为全长棘蛋白。大多数临床试验都使用主要增强免疫方案或将单剂量与主要增强免疫方案进行比较。只有一个候选疫苗 EXG5003 正在接受单剂量给药的测试。此平台的其中一个障碍来自于saRNA的分子较大，它包含源自复制活动所必需的甲病毒基因组中的非结构蛋白编码序列。RNA 的长度极大地影响了递送的稳定性和难易程度。然而，目前还没有一个saRNA COVID-19候选疫苗是使用先前有成功将尺寸缩小的方法。经过前临床的体内实验证实了saRNA候选疫苗有效对抗COVID-19，伦敦帝国理工学院将脂质纳米颗粒-nCoVsaRNA 纳入 I/II 期临床试验。0.1-10 mg 的剂量都显示出剂量依赖性免疫反应；然而，大部分试验参与者没有血清转化，这些人在纳入 SARS-CoV-2 感染时均为血清阴性，因此，临床的开发进程就此停止。saRNA的自带佐剂作用部分与 I 型和 III 型 IFN 的激活有关，有可能引起负反馈循环并抑制转译。尽管剂量较低，使用 saRNA 疫苗会导致更高的反应原性。为了避免这种情况，一个未公开重新设计的抑制IFN生产的saRNA候选者，在COVAC-Uganda临床一期试验(LNP-nCOV saRNA-02)中被研究，用来评估在SARS-CoV-2抗体血清阴性和抗体血清阳性个体中的免疫反应。但是不直 接测试对COVID-19的效力。BNT162c2作为第一批进入临床阶段的疫苗候选株，由BioNTech开发和测试，然而，这种形式的疫苗没有被选去做进一步的临床研究调查。Arcturus Therapeutics与杜克-新加坡国立大学医学院合作，使用他们的STARR mRNA saRNA平台对三种候选药物(ARCT-021，ARCT-154，ARCT-165)进行研究。该公司的第一种候选药物ARCT-021在临床I/II期试验中被测试，采用单剂量给药法，p-b剂量范围为在1-10 mg。目前，单剂量治疗方案正在II期试验中被研究。ARCT-154已开始在越南进行I/II/III期试验，使用改良的抗原编码序列，重点针对最近的alpha (B.1.1.7)、beta (B.1.351)、gamma (P.1)和delta (B.1.617.2)病毒变异。为了解决saRNA加强应用的问题，在所有美国和新加坡接种及未接种个体的I/II期临床试验中对三种候选药物进行直接比较。第一批24名参与者的结果已经公布，在BNT162b2免疫接种5个月后，5 mg的ARCT-154或ARCT-165加强针注射剂量会显著增加对omicron变种(B.1.1.529)的中和抗体反应164在临床实验中，所有被测试的saRNA候选株针对肌肉注射的应用进行了设计，除了EXG-5003 (Elixirgen Therapeutics)外，它是为了皮内给药而配制的，使其仅在注射部位以温度敏感的方式有效，在SENAI Cimatec、Gennova Biopharmaceuticals、HDT Biotech和Quratis的广泛合作中，另一种候选者，HDT301(也称为repRNA-CoV2S或HGCO19)正在进行I/II期试验。在临床前，p-b方案已被证明比单剂量给药能诱导更强的T细胞反应，然而，在正在进行的临床试验中，单剂量方案也正在测试。来自印度一期试验的数据表明，Gennova’s COVID-19 RNA疫苗候选株HGCO19具有可接受的安全性和耐受性。近期，另一个关于促进不同疫苗形式潜在增长的重要的问题已经浮现出来，特别是针对两种不同产品采取不同的管理方式。在临床前，对一种异源的包含saRNA的腺病毒载体(ChAdOx1 nCoV-19/AZD1222)疫苗疗法进行了测试。结果表明，与p-b同源疫苗方案相比，增强了抗原特异性抗体反应，并具有更高的中和效果。类似的，Gritstone Bio公司也有一种saRNA候选疫苗(SAM-SARS-CoV-2)，该疫苗正在进行I期临床试验，研究对象是此前接种过腺病毒载体疫苗的个体。169SAM-SARSCoV-2被设计用于诱导对S蛋白和核蛋白、膜蛋白和开放阅读框3的免疫反应，这可能会增强相关变异的效果。还有其他几种候选疫苗即将在不久的将来进入临床试验，例如由根特大学的Ziphius 疫苗公司开发的疫苗，以及由Amyris(美国)与传染病研究所合作开发的疫苗，已经获得有希望的临床前数据，对临床开发计划做出了解释。结论和展望COVID-19大流行导致了历史上最快的疫苗开发速度，尽管mRNA的治疗潜力之前被研究了数十年，但仍未能够作为一种上市的医疗手段，与传统疫苗方法相比，利用其独特特性的时机现在已经成熟。在这篇综述中，我们旨在概述已获批的COVID19 mRNA疫苗和候选疫苗，以及它们在这一快速发展的领域中的不同分子生物学方法。如果有一个合适的目标抗原序列，mRNA疫苗技术可以快速进行设计和生产，因为它不涉及病原体，也不需要通过特定的细胞培养过程或发酵来生产疫苗。相比之下，这些挑战使传统疫苗的研究、开发和生产工艺更加复杂和漫长。首先获得加速批准并满足所需安全性和有效性标准的两种COVID-19疫苗是mRNA疫苗。8,81,82从临床效力和安全性数据来看，LNPs中核苷修饰的mRNA相比未修饰的mRNA，似乎是更好的选择，这也被临床效力和安全数据所证实。而相似剂量水平的未修饰mRNA和saRNA疫苗候选株在临床一期被测试，在使用比核苷修饰mRNA疫苗更低剂量的情况下，未修饰的mRNA疫苗在临床测试阶段可持续到更晚阶段，截至本文撰写时，由于没有一个未修饰的mRNA和saRNA候选株进入审批阶段，可以推测这是由于产品未修饰核苷造成的内在不良反应造成的。circRNA代表了一个好的概念，但似乎在继续开发它们作为候选药物之前，进一步的改进是必要的。circRNA平台理论上可以替代尿苷；然而，据我们所知，IRES元素与修饰核苷结合的功能尚未被证实。与传统技术相比，基于LNP-mRNA的灵活设性的疫苗设计与生产的可扩展性，在原始毒株疫苗设计效力低的情况下，允许针对其他新型SARS-CoV-2变种的做出快速反应。如今，不同的方法正在研究中，它们使用mRNA平台，旨在产生变种的特异性反应，包括对新毒株或异源疫苗的改良、调整编码序列。2022年1月，BioNTech和辉瑞公司宣布，一项新的临床试验已经在健康成人中开始测试omicron(B.1.1.529) mRNA疫苗特异性，Moderna开始了一项II期研究，以测试他们的omicron变体特异性疫苗候选毒株(mRNA-1273.529)mRNA疫苗在COVID-19疫苗竞赛中的成功表明了该技术在未来各种各样应用方面的潜力，包括其它传染病、癌症治疗、和蛋白质替代疗法，这反映在目前开发人员的管线中。然而，必须考虑到，除了第一批mRNA疫苗的成功之外，还必须提供这种技术未来用途广泛的证据。在非炎症环境治疗中的深入的免疫原性数据仍然缺失。同样也会预计，世界将不得不应对更频繁的新的大流行，就COVID-19而言，可能会出现令人担忧的新型病毒变体，并在人群中表现出来。在这里，在适应新的序列甚至其他疾病时，mRNA技术可以证明其在设计速度、放大和成本效率方面的优势。由于快速的疫苗推广，以色列拥有了大量关于COVID-19疫苗有效性的真实数据。据以色列报告称，在接种疫苗后，中和抗体滴度下降了初始滴度的10%以下，这引起了关于高度相似mRNA疫苗额外增加剂量的关注，以及是否可能造成宿主耐受，尤其在如果疫苗一年或每个季度注射几次的情况下。虽然已经报道了omicron (B.1.1.529)变体的免疫逃逸，但来自以色列的183数据表明，初次接种两剂后进行加强免疫，SARS-CoV-2感染率明显降低，最终，世界将同时需要多种适应性强的疫苗技术来满足供应需求。在mRNA疫苗用于其他疾病方面，已经建立了在实验性自身免疫性脑脊髓炎(多发性硬化症的小鼠模型)治疗中诱导抗原特异性耐受的治疗性mRNA疫苗的基本原理。mRNA技术的一些未来应用包括个性化癌症疫苗，协同刺激配体受体，细胞因子，免疫调节剂，mRNA编码的抗体，以及嵌合抗原受体(CARs)，并在其他地方进行了广泛的综述。尽管目前对mRNA技术的大肆宣传，许多研究人员已经在寻求改善mRNA组成的新方法，并扩展到他们的应用领域。mRNA治疗的给药途径主要局限于肌肉注射和静脉注射;但是，针对不同的注射方式，已经取得了令人鼓舞的结果。它看起来有益于空气传播病毒到达呼吸道上皮后产生肺部驻留记忆T细胞。除了不同适应症外，COVID-19候选株通过鼻内递送正在被研究。针对肠道使用，一种有趣的方法是使用含有纳米核酸配方的微注射胶囊，这种胶囊能够输送到胃上皮细胞。此外，诺如病毒和SARS-CoV-2序列已经被结合来产生一种口服saRNA疫苗。重组鼠巨细胞病毒被成功用于小鼠体内，作为对抗流感和SARS-CoV-2.193的载体疫苗。其他人则在研究以DNA为基础的疫苗来对抗癌症的耐药性。以腺病毒为基础的药物传递是一种传递核酸的选择；然而，由于宿主诱导产生抗腺病毒抗体，重复给药可能不能诱导或大大降低期待的免疫反应。新的mRNA疫苗还必须克服几个挑战，以满足世界市场的需求。进一步开发一种可调节的配方平台，从而降低甚至不产生不良影响，这是至关重要的，特别是在选择脂类、它们的电荷和生物降解性方面。持续生产的障碍可能是必要试剂的可用性和可扩展性。此外，低收入国家应能公平地获得这些新疫苗，这将有助于应对这一大流行病。BioNTech和辉瑞公司根据一个国家的收入水平设计了一个三步价格体系，其中最低的价格是非营利性的价格，由高收入国家(如美国或欧盟)的较高价格提供资金。同样，Moderna表示，他们的目标是“为所有人口提供有效和负担得起的疫苗和治疗”综上所述，基于mRNA的治疗方法在其通用性和适应性方面具有关键优势，这不仅可能产生有前景的治疗方法，也可能通往其他适应症，如癌症，因此，对该技术的进一步研究和投资是有必要的。鉴于这项技术迄今为止的成功，人们对它的期望很高，回报可能也很高。原文来源：COVID-19 mRNA vaccines: Platforms and current developments