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01 科研翘楚与产业化明星的初心 立志克服疾病的科研翘楚 杨辉教授：现任辉大基因首席科学顾问 中科院上海药物所研究员、基因治疗中心（筹）主任、博士生导师。杨教授的科研生涯从中科院细胞所李劲松院士门下起步，随后在MIT的Whitehead研究所Rudolf Jaenisch实验室继续深造。2014年回国在中科院神经所建立实验室。在此期间，“如何解决人类疾病困扰”不仅贯穿了其整个科研生涯，也为其后续创业定下了基调。在科研生涯的初始，模式动物的基因改造与干细胞基因编辑是杨辉教授的课题主线，尤其是针对业界药物开发难度超高的CNS领域。这一系列研究为辉大基因未来CNS管线的布局奠定了坚实的基础。 然而创业并不是一蹴而就，杨教授的创业灵感来源于一次感人的经历：在神经所期间，他接触到一些唐氏综合症患儿的家庭对于疾病治愈的渴望，这让他深受触动。杨教授感叹到,“既然我们已经做了诸多CNS疾病的灵长类模型，也做了许多基因编辑工具的开发与使用，那为什么不自己成立一家可以真正将科研积累转化为临床患者能用上的药品，造福人类的公司呢？”彼时恰逢国内基因治疗行业的快速发展，加上夏尔巴投资的蔡大庆博士的支持，拥有底层创新技术的辉大基因由此诞生，致力于为全球患者带来希望。 不断创造奇迹的产业化明星 陆英明博士：现任辉大基因CEO及联合创始人 拥有30多年生物技术与制药行业经验，陆博士曾在全球多个知名公司担任要职，如复宏汉霖、Spark Therapeutics（被罗氏收购）、Biogen（血友病业务部门被赛诺菲收购）、拜耳、Avigen（被赛诺菲健赞收购）、Tularik（被安进收购）和武汉纽福斯等，并这些公司都在陆博士的领导与参与下取得了显著成就。 来中国之前，陆博士是Spark Therapeutics的临床研究和运营VP。他参与了第一个获得FDA批准上市的基因治疗产品Luxturna及辉瑞/Spark今年四月在美国上市的用于治疗B型血友病的基因治疗产品Beqvez的开发。2006年至2009年，曾作为美国FDA罕见病临床设计委员会的行业委员会成员，他接下了优化临床试验设计这一重任。陆博士至今领导了22个产品的获批，向各国监管机构提交超过250份监管文件。在担任复宏汉霖担任CMO期间，陆博士主导了五款生物药在中、美、欧三地的成功上市，开创了中国生物药企业的新篇章，也是复宏汉霖成功上市的重要条件。后来，作为武汉纽福斯CEO，他和团队一年内不仅成功为公司引进了超过1.2亿美元的资金，还领导团队完成眼科项目临床I/II/III期无缝设计的基因治疗试验IND，并获得了FDA和EMA的孤儿药资格认定，推动公司进入中国基因治疗第一梯队。基于对杨辉教授科研翘楚的信心与辉大出海战略的渴求，双方一拍即合，陆博士希望引领中国基因治疗迈向国际前沿做到First in Class，为罕见病及更广阔疾病领域的患者带来福音。 02 基因编辑疗法的背景及优势 基因治疗以其显著的优势成为医疗领域的革命性突破。相比现有的小核酸或抗体疗法（患者需要接受多次给药，甚至是终身服药），基因治疗能够通过基因的持续表达实现患者在一次给药后彻底终身痊愈。在基因治疗中，基因编辑技术因其更高的编辑效率及可适用的潜在适应症，优于传统的基因替换疗法。简单来说，基因编辑的核心在于对核酸序列的精准修改，当前最常见的基因编辑工具有三种，包括ZFN、TALEN和CRISPR。其中，CRISPR作为最新一代技术，其优势在于编辑效率高、成本低、易获取，且更容易标准化，具有非常广泛的应用场景。 CRISPR/Cas9已成为目前使用最广泛的基因编辑工具。尽管其编辑效率随着技术进步不断提高，但其无法避免的脱靶效应和双链断裂时潜在的遗传毒性，仍是药物开发中的关键挑战。此外，由于Cas9底层专利技术被海外研究机构及少数公司垄断，寻找性能更优、精度更高且具有自主知识产权的Cas酶，已成为基因治疗领域的共同目标。 03 基因编辑公司顶流的发展历程——辉大基因 的 3.1 因势利导，建立底层技术布局 与其他创新药公司成败往往取决于一两款药物管线的商业化不同，基因编辑领域的竞争更加激烈。专利壁垒与安全性考量使得拥有底层核心技术成为公司持续创新的关键。杨教授于2018年创立了辉大基因，刚起步时便专注于底层基因编辑工具的开发。他率领团队建立了HG-PRECISE®技术平台，从超过100TB的宏基因组数据库中识别并优化新的Cas蛋白，致力于开发适合体内递送的小尺寸、更高特异性和更低脱靶活性的紧凑型核酸酶，解决了如AAV载体等常见递送工具对核酸酶尺寸的限制。 依托HG-PRECISE®技术平台，辉大基因开发了一系列靶向活性更高、脱靶更低的核酸酶工具，包括RNA编辑的Cas13X/Y、DNA编辑的hfCas12Max®和Cas12f、以及更小尺寸的RNA单碱基编辑器和不依赖脱氨酶的DNA单碱基编辑器等。这些研究成果不仅得到了学术界的高度认可，发表在顶级国际期刊和学术会议上，更重要的是，辉大基因成功获得了国际专利授权。凭借这些原创技术，辉大有效解决了海外专利“卡脖子”问题的底层创新技术，为各种基因编辑应用场景提供了自主创新的工具技术。 3.2 四面开花，推进管线前进的魄力 随着2023年12月首个基于CRISPR的离体基因编辑疗法获批，CRISPR基因组编辑迎来了全新时代。基于原创基因编辑工具，辉大基因团队搭建了一系列CRISPR基因编辑疗法产品管线，聚焦于眼科及神经疾病领域，致力于通过“一次给药，终身治愈”的潜力，解决尚未被满足的重大临床需求。 辉大基因的首个RNA编辑疗法HG202，专注于治疗湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），已进入临床阶段。当前wAMD的标准疗法为抗VEGF抗体药物，虽然已有多种药物获批，但它们需要频繁的玻璃体注射，不仅增加了患者的安全风险，还带来了时间与经济负担，有诸多不便。更令人担忧的是，高达46%的wAMD患者会产生耐药性而导致治疗效果不佳。虽然数家国内外公司正在开发AAV载体介导的抗VEGF基因疗法，以减少射抗VEGF抗体的频率，但长期表达VEGF抗体可能抑制正常血管生成，且对于VEGF抗体耐药性或难治性AMD患者很难起作用。辉大基因的解决方案则通过CRISPR/Cas13靶向敲低VEGFA的mRNA，部分抑制VEGFA蛋白的表达。陆博士提到：“我们已在首个人体“SIGHT-I视”临床研究（NCT06031727）中完成了HG202的低和中剂量组给药，并顺利与FDA完成了pre-IND会议，美国IND已提交。” 辉大基因的另一个RNA编辑疗法是HG204，针对神经类罕见病MECP2复制综合征（MDS）。MDS是一种致命的神经发育疾病，导致男孩在25岁前出现严重的智力障碍、运动功能障碍、癫痫和过早逝。陆博士介绍，“HG204使用新型高保真Cas13Y靶向MECP2基因，将其包装在单个AAV载体中。小鼠实验表明，HG204可恢复MECP2转基因小鼠的运动功能、焦虑行为和社会障碍，且显著延长了转基因小鼠的寿命。该项目已获得FDA的孤儿药和儿科罕见病药物资格双认定，以及EMA的孤儿药认定。计划在今年底开展“HERO英雄”临床试验（NCT06615206）。” 在DNA编辑疗法方面，辉大基因进展最快的项目是HG302用于治疗杜氏肌肉营养不良症（DMD），是一种严重影响男孩的神经肌肉类罕见病，导致患者会因肌肉逐渐萎缩退化而丧失行走能力，直至死亡。Sarepta公司获批的基因疗法及目前大多数临床项目都是依赖AAV递送的截短抗肌萎缩蛋白（迷你蛋白）。FDA已明确指出这是一种并不齐全的蛋白，但其功能有限，且DMD作为全身性疾病，需要更高剂量的药物来有效治疗。不少DMD患者在临床试验中被注射了高剂量的AAV，例如2E14vg/kg甚至更高的剂量，已导致发生多例免疫原性带来的安全事件，包括出现了死亡案例。最近，Cure Rare Disease 公司使用携带cas9的双AAV载体的临床试验中，注射剂量1E14vg/kg导致首例患者死亡。为应对此问题，辉大基因采用了其原创高效hfCas12Max® DNA编辑器，显著降低了所需剂量至E13vg/kg甚至更低。临床前结果显示，HG302可恢复DMD小鼠模型中的抗肌萎缩蛋白表达及其运动功能，项目已获得FDA的孤儿药和儿科罕见病药物资格双认定，首个人体“MUSCLE肌肉”临床研究（NCT06594094）即将开展。 3.3 专利出海，不畏海外竞争的决心 CRISPR技术的专利壁垒极高，特别是与Cas9相关的底层专利已被海外研究机构及少数公司垄断。相比之下，较晚发现的核酸酶如Cas12、Cas13、IscB和TnpB等，其专利保护范围相对较小，仍留有一些技术突破的空间。然而，这些核酸酶的基因编辑活性相对较低，限制了其在基因治疗中的实际应用。 辉大基因自成立之初，便立志打破这种局限，创造新的行业范式----不仅要掌握核心底层专利技术，还要以全球市场为目标，积极出海。因此，辉大选择专注于非Cas9的基因编辑体系，通过技术手段开发并优化性能更优、真正拥有底层专利保护的核酸酶。辉大自主创新的HG-PRECISE®平台是其创新能力的有力证明。该平台不仅能够高效发现新型蛋白质并通过AI设计进行蛋白进化，原创的荧光报告系统还使其可以快速进行高通量蛋白性能验证。凭借这一平台，辉大基因在在短时间内以低成本开发了多种基因编辑工具，成为全球基因编辑公司中技术工具种类最丰富企业之一。 HG-PRECISE®平台中的明星产品是DNA编辑工具hfCas12Max®。凭借其高效的靶向编辑活性和极低的脱靶风险，hfCas12Max®在科学研究、作物育种和基因治疗等领域展现了巨大的应用潜力，并已获得美国和中国的专利授权。作为国内首个成功出海的基因编辑工具，辉大基因与Synthego签署了海外许可协议，用于hfCas12Max®的生产和商业化。Synthego目前正在与全球多家大型制药公司谈判相关许可协议。陆博士激动地提到，“虽然目前具体进展保密，但我们对Synthego的进展感到非常振奋。” 除了基因编辑工具，辉大在递送系统方面也取得了重大创新。腺相关病毒（AAV）作为常用的病毒载体，虽然能够持续表达基因，但这可能会增加脱靶的风险。相比之下，脂质纳米体颗粒（LNP）作为非病毒类的常用载体可实现瞬时表达，但其递送主要靶向肝组织，其他非肝组织的递送系统开发尚在探索中。辉大基因创新方案是原创的RNA重组腺相关病毒（RAAV）递送系统，通过改造AAV载体，使其能够递送单链RNA至靶细胞中，实现瞬时表达，既保持了AAV的靶向多样性，又具备LNP类似的瞬时表达效果，降低了安全性风险。杨教授介绍道：“我们从五年前就开始开发这个体系，经过多年的系统改造和优化，我们的RAAV系统体在递送效率、工艺流程、产量和质检等方面几乎与AAV相当，同时实现了和LNP相似效果的瞬时表达，并获得美国专利局授权。” 目前，辉大在全球拥有35个专利家族、91项有效申请和17项已授权专利。正如陆博士所说：“我们植根于中国，着眼全球。辉大的临床管线为国际临床试验，编辑工具和递送系统也都具备全球知识产权保护，这为我们的国际BD合作奠定了坚实基础。” 3.4 合作共赢，深度立体考量商业化 “当前基因编辑疗法的高昂成本，使其仅依赖国内的支付体系，难以支撑商业化运营。因此，打造独属知识产权并走向国际市场至关重要。”陆博士强调。基于原创技术和产品，辉大基因积极拓展海内外的BD合作机会。在今年6月的美国BIO会议上，辉大与多家跨国药企和海外Biotech公司进行了深入的一对一合作洽谈。除了对辉大的产品管线表现出浓厚兴趣外，许多公司还对辉大的HG-PRECISE®技术平台、基因编辑工具hfCas12Max®和瞬时表达的RAAV递送载体充满期待。杨教授透露，“辉大在基因编辑疗法产品管线的差异化布局，主要集中在Cas9尚未取得突破的领域，充分利用我们自有的高效编辑工具和递送技术的优势，并通过这些产品验证我们的技术平台能力。” 陆博士进一步指出：“许多跨国药企和海外biotech都在关注我们的临床进度，甚至包括一些海外竞争对手，也表达了合作意愿。我相信，辉大的首代基因编辑药物将通过单个AAV递送是第一代基因编辑药物，聚焦于罕见的致命或致残、无药可救的疾病；而我们的第二代基因编辑药物则将以RAAV递送为基础，有望治疗更为广泛的疾病，如阿尔茨海默症和帕金森病等，希望引领全球基因编辑药物的发展。” 3.5 美好愿景，铸就精诚合作的团队 一家生物技术公司的成长往往经历三个主要阶段：公司设立、产品开发和产品商业化。辉大基因自成立六年来，已经迈入了充满希望的产品开发阶段，并逐步在全球舞台崭露头角。 作为1990年代就投身基因治疗领域的行业先驱，陆博士一直希望通过自身丰富的经验，将中国的新型基因编辑产品推向全球，为人类健康贡献力量。在担任辉大CEO之前，陆博士受邀加入了辉大的科学顾问委员会（SAB）。在SAB期间，陆博士对杨辉教授及其团队的创造力、创新基因编辑工具留下了深刻印象。双方在共同愿景的引领下，陆博士正式接任CEO，全力推动公司快速成长，发展出核心竞争力——多样化的基因编辑工具、创新的基因编辑疗法管线以及全球化的知识产权布局。 “我们不追随前人的足迹，而是开辟自己的道路（we don’t follow footsteps; we create the path）。这才是辉大想做的事情。”陆博士如是说。 04 基因治疗，尤其是基因编辑商面临的挑战 尽管基因疗法作为新兴疗法的代表在近年来发展迅速，但距离成功商业化仍有很长一段路要走。从成本角度来看，虽然基因疗法不像当前的细胞治疗需要为每位患者单独生产，但GMP级别的病毒载体和基因编辑元件等的生产成本依然高于传统大分子药物。 在监管政策方面，由于基因疗法会改变患者基因组的科学本质，监管机构对其安全性尤为关注。随着更多新兴疗法涌现，临床开发指南也在不断演进，以适应产业的创新需求。对此，陆博士指出：“基因与细胞治疗行业必须找到可扩展生产规模、降低成本的可行路径，同时在开发过程中实现成本效益的平衡。在监管机构的支持下，通过灵活的临床试验设计，尤其是II期和III期试验中，我们有望加速基因治疗药物通过有条件批准程序（CAP）进入市场，并在未来的上市后监控其安全性。” 在这背景下，陆博士相信：“中国在基因治疗产品的审批速度上不会落后于美国和欧盟。” 随着中国监管机构逐步完善新兴疗法政策，特别是对基因编辑技术的重视，中国有望在全球基因治疗领域中占据重要地位，推动国内创新药物加速进入国际市场。 05 基因疗法的未来，从罕见病到常见病 未来，从罕见病 2017年，首个基于AAV载体的基因疗法Luxturna获得美国FDA批准上市，用于治疗罕见眼病先天性黑矇。2023年底，首个用于治疗镰状细胞病的CRISPR离体基因编辑疗法Casgevy也成功在欧洲和美国获得上市批准。除此以外，治疗DMD的Elevidys、治疗血友病的Hemgenix、Roctavian和Baqvez等基因疗法也相继在美国获批上市。基因治疗领域中还出现了诸多高额的商业合作，例如拜耳以高达40亿美元收购的AskBio，其基因疗法管线涵盖了庞贝病、血友病、充血性心力衰竭和帕金森病等多种疾病。目前，全球正在进行超过2700项基因治疗临床试验，旨在将基因疗法从罕见病逐步扩展到更广泛的常见病患者人群。 总而言之，基因疗法，尤其是基因编辑疗法，作为一种新兴的治疗手段，具有显著的优势和广阔的应用前景。尽管目前成熟度尚低，面临着安全性、监管、商业化等多重挑战，但总有先行者一往无前，勇于探索，秉持科学精神和脚踏实地的新药开发原则，勇敢迎接基因疗法的“春天”。

摘要：重组腺相关病毒（AAVs）已经成为有前途的基因传递载体，导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了三种基于AAV的基因疗法，欧洲药品管理局（EMA）也批准了一种。尽管AAV是多项临床试验中治疗性基因转移的领先平台，但宿主对AAV载体和转基因的免疫反应阻碍了它们的广泛应用。多种因素，包括载体设计、剂量和给药途径，共同影响了AAVs的整体免疫原性。对AAV衣壳和转基因的免疫反应涉及最初的先天感知。随后，先天免疫反应触发适应性免疫反应，以引起针对AAV载体的强烈和特定的反应。AAV基因疗法的临床试验和临床前研究提供了有关与AAV相关的免疫介导毒性的重要信息，但研究表明，临床前模型未能准确预测基因传递在人类中的结果。本综述讨论了先天和适应性免疫反应对AAVs的贡献，强调了挑战和潜在策略，以减轻这些反应，从而增强AAV基因疗法的治疗潜力。 1.引言 近年来，使用重组腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗取得了令人鼓舞的成果。除了美国食品药品监督管理局（FDA）批准的三种AAV基因治疗产品Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX，分别用于治疗Leber先天性黑蒙、脊髓性肌肉萎缩症（SMA）和血友病B型，欧洲药品管理局（EMA）最近还批准了一种AAV5-因子8载体（Roctavian）用于治疗血友病A型患者。目前，正在进行大量的AAV基因治疗临床试验，针对多种疾病，包括血友病、神经退行性疾病和肌营养不良症。然而，阻碍这些试验临床成功的一个因素是AAV的免疫原性，这在该领域仍然是一个未解决的挑战。 已经鉴定并分类了13种不同的AAV野生型血清型和100多种衣壳变体。AAV最初在1965年作为腺病毒（Ad）制剂中的污染物被发现，是自然存在于多种脊椎动物物种中，包括人类和非人灵长类（NHPs）的细小病毒，但从未与任何已知疾病相关联。AAV迅速成为体内基因传递的首选载体，并携带一个由反向末端重复序列（ITRs）包围的转基因表达盒，而不是病毒蛋白编码序列。这些ITRs源自野生型AAV2，是复制和包装所需的唯一顺式作用序列，但它们是非编码区域。AAV作为染色体外DNA存在，能够在非复制细胞中实现稳定转基因表达。尽管AAV的免疫原性较弱，但在AAV基因治疗临床试验中观察到的免疫反应限制了其治疗应用。由于AAV载体不包含任何表达的病毒基因组，因此在基因转移过程中引入的唯一外来抗原来源是病毒衣壳和转基因盒。然而，宿主对AAV载体和传递的转基因的免疫反应影响了有效和稳定的转基因表达。 已经做出了重大的研究努力来评估与AAVs相关的免疫介导毒性。免疫系统的主要作用是识别自身与非自身，以保护免受病原体侵害。包括补体系统在内的先天免疫反应可以被AAV衣壳和AAV基因组以及其他宿主特异性因素触发。随后的激活信号有助于招募抗原呈递细胞（APCs）、T细胞和B细胞，这些细胞负责介导适应性免疫。许多报告已经剖析了适应性免疫反应对AAVs的作用。由于AAV在人类中的广泛传播，许多人群中普遍存在针对AAV衣壳的预先存在的中和抗体（NAbs）。这些抗体可以阻止AAV转导目标细胞。此外，还可能针对传递的转基因产生抗体，这可能中和可溶性转基因产品并干扰成功的基因治疗。此外，针对衣壳的细胞介导的细胞毒性T细胞反应影响转基因表达，并导致转导细胞的清除，阻碍治疗效果。近年来，接受高系统剂量AAV治疗的SMA1、杜氏肌营养不良症（DMD）和X连锁肌管性肌病（XLMTM）患者经历了不同程度的不良反应。这些结果在很大程度上可以归因于对载体的先天和适应性免疫反应。因此，了解免疫系统对AAV的反应对于提高AAV基因治疗的安全性和治疗效果至关重要。 AAV载体激活宿主免疫反应取决于多种因素，包括给药途径和剂量，宿主细胞和体液遇到载体的部位，载体组分以及转基因产品。直接注射到视网膜下空间，如第一个FDA批准的AAV载体的途径，导致较少暴露于血浆蛋白、循环抗体、血细胞和组织驻留的吞噬细胞。注射到其他部位，如中枢神经系统（CNS），可能在一定程度上限制了血清抗体在目标细胞进入之前的暴露。相比之下，AAV的静脉注射使载体广泛暴露于血细胞、血浆蛋白，包括抗体，以及广泛的组织驻留细胞，如肝脏内的Kupfer细胞。最大限度地发挥潜在的载体-抗体相互作用导致降低基因治疗的有效性或安全性。几乎所有衣壳类型和给药途径，广泛生物分布的AAV载体基因组到肝脏，取决于所给剂量。因此，虽然直接注射途径可能在很大程度上绕过了预先形成的抗体，但对载体组分的新的免疫反应可能仍然很强。最后，某些宿主反应仅在非常高剂量的静脉AAV中观察到，这表明这些宿主反应的阈值效应。这表明在评估AAV基因治疗的免疫反应时，需要考虑多种因素，而不仅仅是AAV载体的组成部分。 在这篇综述中，我们提供了针对AAV衣壳和转基因的先天和适应性免疫反应的概述，并讨论了规避这一主要障碍的策略，以发展成功的基于AAV的治疗性基因传递平台。 2.对腺相关病毒（AAVs）的免疫反应 免疫反应可以分为先天和适应性免疫反应。在以下部分中，我们简要概述了AAVs刺激的先天和适应性免疫途径，并讨论了AAV感染响应中激活的机制，这些机制导致转基因表达的抑制（图1）。 图1 AAV基因治疗中的免疫反应。AAV衣壳或引入的转基因可以被先天免疫系统识别，导致细胞因子产生、先天免疫细胞激活、补体激活，并为适应性免疫反应做好准备。在MHC I分子上的衣壳肽段或传递的转基因呈递导致CD8+ T细胞激活和转基因表达的清除。在MHC II上的抗原呈递激活CD4+ T细胞，这导致细胞因子的产生，并进一步诱导体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。Treg的激活导致细胞和体液免疫反应的抑制以及转基因表达的长期维持。AAV：腺相关病毒，APCs：抗原呈递细胞，FoxP3：叉头框蛋白3，GzmB：颗粒酶B，IFNγ：干扰素γ，MHC：主要组织相容性复合体，NAbs：中和抗体，PFN：穿孔素，rAAV：重组腺相关病毒，TCR：T细胞受体，TLR9：Toll样受体9，TNFα：肿瘤坏死因子α，Tregs：调节性T细胞。 2.1.对AAV的先天免疫反应 暴露于病原体时，先天免疫系统以一种非特异性方式被触发，并随后刺激激活更特异性的适应性免疫反应。在本综述中，我们简要讨论了感知AAV载体元素的关键参与者，这些元素导致先天免疫信号级联的激活。 2.1.1.病原体相关分子模式和模式识别受体 具有独特病原体相关分子模式（PAMPs）的外来病原体被高度表达在先天免疫细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）上的模式识别受体（PRRs）识别。PRRs已被分类为不同的家族，即Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLRs）和DNA传感器。相应的PRRs识别PAMPs主要激活信号通路，如通过适配蛋白如MyD88激活NF-κB。这些信号级联诱导主要组织相容性复合体（MHC）基因表达和促炎细胞因子或Ⅰ型和Ⅲ型干扰素（IFN）的分泌。分泌的IFNs和细胞因子反过来介导表达限制病毒复制的基因，并刺激适应性和记忆免疫反应。适应性抗衣壳体液和细胞毒性免疫反应已被证明在体内受到限制，通过抑制先天免疫激活途径。 TLR介导的信号，触发先天免疫和随后激活适应性免疫反应，是重要的AAV感知机制。TLRs主要表达在免疫细胞上，如DCs和巨噬细胞，以及一些非免疫细胞，如上皮细胞和成纤维细胞。细胞表面TLRs识别病原体的膜成分，如脂蛋白和脂质，细胞内TLRs识别病原体衍生的核酸。研究表明，细胞内TLR9有助于对转基因和衣壳的免疫反应。除了ITRs，插入的转基因、启动子序列和载体表达的RNA可能包含TLRs识别的炎症信号。存在于Kupfer细胞或DCs中的内体TLR9，特别结合双链DNA（dsDNA）载体基因组中的未甲基化CpG二核苷酸。研究表明，密码子优化，一种提高转基因表达的技术，可能增加AAV载体中的CpG基序。TLR9的参与有利于激活AAV特异性细胞毒性CD8+ T细胞反应，由于MHC I上抗原呈递的增加。由IFN诱导的免疫反应导致AAV在小鼠中传递的转基因表达的丧失。此外，TLR9/MyD88途径不仅对激活AAV衣壳的CD8+ T细胞反应至关重要，而且对肝脏和肌肉定向的转基因。研究表明，空AAV衣壳本身也可以触发先天免疫反应，可能通过非实质肝细胞表面的TLR2介导。或者，一些研究报告称，抗AAV衣壳免疫球蛋白（Ig）G2抗体的产生不依赖于任何特定的TLR，而是依赖于B细胞中固有的MyD88信号。此外，其他研究表明，自互补AAV（scAAV）载体与单链AAVs（ssAAVs）相比，表现出对转基因的增加的先天免疫反应，可能由于TLR9/MyD88信号级联的增强激活。 细胞质DNA传感器，如环状GMP-AMP合成酶（cGAS），被AAV基因组激活。AAV转导可能导致细胞将其线粒体DNA释放到细胞质中，从而激活细胞质DNA传感器。另一种可能性是，AAV衣壳的蛋白酶体降解在进入后导致基因组暴露，然后可能被DNA传感器感知。最近的研究指出dsRNA传感器在先天感知AAVs中的作用。ITRs的内在启动子活性可以在细胞质中产生dsRNA中间体，这可能刺激黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和视黄酸诱导基因（RIG）传感器。在AAV转导人肝细胞后，一些人类受试者观察到MDA5和RIG-1的上调，触发IFN-β的产生。在灵长类视网膜中AAV转导后，也观察到高水平的MDA5和RIG-1。需要进一步的研究来阐明dsRNA形成在AAV转导细胞中启动适应性免疫反应中的作用。 2.1.2.AAV与补体系统 补体系统由多种可溶性和膜结合蛋白组成，是无细胞先天免疫系统的一部分。它可以通过三种不同的途径被激活——经典途径、凝集素途径和替代途径。经典途径与抗体结合到抗原靶标上协同工作，而替代途径是通过外来大分子与循环补体成分的相互作用而被激活，因此不需要预先形成的抗体。这三条途径汇聚在补体成分C3转化酶上，它将C3蛋白裂解为功能性亚基C3a和C3b，最终形成终端膜攻击复合体。 AAV介导的补体激活成为了许多近期研究的焦点。一项研究表明AAV衣壳与C3相互作用，导致巨噬细胞中AAV2的摄取增加，并随后上调了如IL-8、IL-1β和巨噬细胞炎症蛋白等细胞因子。缺乏补体蛋白CR1/2或C3的小鼠对AAV没有表现出强烈的体液免疫反应，这表明补体系统在产生AAV特异性抗体中发挥作用。 在DMD和SMA1的临床试验中，接受静脉AAV剂量>1×10^14病毒基因组(vg)/kg的患者表现出补体激活和血栓性微血管病(TMA)的症状。此外，最近在一份新闻稿中报告，两名接受5×10^13 vg/kg AAV-LK03的甲基丙二酸血症(MMA)患者在最近出现了TMA。这些患者中替代补体途径的激活似乎导致血小板激活并与白细胞和内皮细胞结合，从而触发消耗性血小板减少症、微血管性贫血和播散性血管内凝血，这由D-二聚体和纤维蛋白裂解产物的升高证明。在一些患者中，这些机制可以发展成一系列不同程度的症状，如呕吐、急性肝衰竭和心脏及肾脏损伤（非典型溶血性尿毒症综合征[aHUS]）在AAV给药后（NCT03362502和NCT03368742）。这种综合征通常在输注后5-10天发展。Eculizumab的治疗已在AAV接受者中用于TMA综合征，以中断TMA级联。然而，这些试验的结果尚属初步，需要进一步调查。 2.2.适应性免疫反应 除了启动对AAV的初级免疫反应外，先天免疫还为适应性反应做好准备。适应性免疫反应诱导抗原特异性反应，同时创建免疫记忆。适应性免疫由两个主要机制组成：通过B细胞和抗体的体液免疫，以及通过细胞毒性CD8+ T细胞的细胞免疫。CD4+辅助T细胞在体液和细胞免疫中都是关键的中介，通过激活B细胞和细胞毒性T细胞。 在初次接触AAV后，先天免疫细胞通过PRRs的表达和细胞因子的释放被广泛激活。在长期接触AAV后，如DCs的APCs通过转导或吞噬作用摄取AAV颗粒，并向B或T细胞激活呈现处理过的抗原。B细胞识别可溶性或呈现的抗原并产生抗体。T细胞的激活涉及辅助CD4+细胞，它们进一步诱导炎症反应和激活CD8+细胞毒性T细胞，导致去除AAV感染的细胞。在炎症信号解决后，调节性T细胞抑制免疫反应以恢复稳态。以下部分将强调适应性免疫反应在AAV基因治疗中的作用。 2.2.1.体液免疫反应 体液免疫是通过产生针对特定抗原的抗体来介导的。抗体通过多种机制发挥作用：NAbs阻止病原体进入细胞，覆盖在病原体表面的抗体将它们标记为吞噬作用，或抗体结合导致经典补体途径激活的开始。 体液免疫反应，特别是NAbs的产生，对AAV成功基因传递构成了最有效的障碍之一。AAV转导后，APCs向CD4+辅助T细胞呈现抗原，这导致B细胞成熟、扩增、类别转换，并增加针对AAV衣壳的抗体产生。 在人类中，抗AAV NAbs（以其损害AAV感染或病理学的能力为特征）通过自然接触野生型AAVs形成。根据AAV衣壳变体的不同，2-60%的人类血清含有限制AAV基因治疗应用的抗体。其中，抗AAV2和AAV1 NAbs是AAV衣壳变体中最常见的NAbs。然而，抗AAV NAbs通常在多个衣壳变体之间高度交叉反应，可能由于AAV衣壳变体之间的高度同源性。一些研究表明，在AAV给药后，产生的抗体对其他未给药的AAV衣壳变体也具有交叉反应性。对AAV NAbs的表征显示IgG1是NAbs中的主要亚类，其次是IgG2和IgM。接受AAV基因治疗的患者也会发展出特异性抗体，防止AAV的后续再剂量。在一项研究中，NHP中AAV8的再给药没有导致转基因表达增加，但观察到抗AAV抗体水平增加。然而，目前的治疗方法表明，由于载体稀释或丢失，可能需要在新生儿、儿童和成年退行性疾病患者中重复给药AAV。 结合抗体（BAbs）参与免疫细胞的招募和触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。一项研究报告称，在体外存在BAbs的情况下增加了衣壳内化。此外，与接受NAbs免疫的小鼠相比，接受BAbs免疫的小鼠显示出更有效的肝脏转导。BAbs在AAV免疫反应中的作用目前正在进一步调查中，可能会突出BAbs可能的作用以及重新考虑筛选技术的必要性。 大多数系统性（静脉内）AAV基因治疗的临床试验已经排除了针对使用的血清型的显著抗衣壳抗体的患者。例如，BioMarin AAV5-FVIII载体（Roctavian）的关键试验排除了可检测到抗AAV5 NAbs滴度和抗AAV5总结合抗体（TAb）滴度的患者。目前测量抗衣壳抗体的检测包括TAb检测和NAb检测，但NAb检测和TAb检测都难以标准化。NAb检测是基于细胞的或基于小鼠的，因此昂贵、耗时，并有低估TAb滴度的风险。由于TAb检测筛选出针对AAV衣壳的所有抗体，包括中和和非中和的，所得的滴度更为保守和安全。此外，FDA和EMA已经批准了不同的衣壳血清型，每种产品都需要开发不同的抗AAV抗体检测。例如，AAV9的伴随诊断检测不适用于AAV1、AAV2或AAV5。最近的一项研究建立了基于Meso Scale Discovery（MSD）的检测，用于定量BAbs和NAbs，允许快速和定量评估AAV特异性抗体。 除了体液免疫反应外，T细胞介导的反应在限制AAV基因治疗中也起着重要作用，如下一节所强调的。 2.2.2.衣壳特异性T细胞反应 T细胞反应由多种T细胞亚群介导。效应CD4+ T细胞通过细胞因子产生诱导炎症和免疫激活。而细胞毒性CD8+ T细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素和炎症细胞因子介导感染细胞的靶向杀伤。此外，Tregs通过与免疫细胞的直接相互作用或产生免疫抑制细胞因子，防止超免疫激活，并将免疫反应恢复到稳态。 在动物研究中，由AAV引起的细胞介导的免疫反应导致转基因表达丧失并不普遍观察到。启动T细胞反应需要通过APCs进行抗原呈递。内源性或细胞内抗原在MHC I上呈递，而外源性或细胞外抗原在MHC II上呈递。在某些APCs中，交叉呈递允许通常在MHC II上展示的外源性抗原在MHC I上呈递。研究表明，浆细胞样DCs、常规DCs和CD4+ T细胞之间的合作导致AAV颗粒在MHC I上的交叉呈递，随后激活CD8+ T细胞。细胞介导的免疫反应首次在血友病临床试验中观察到，其中AAV2表达人类凝血因子9（hFIX）的肝脏传递导致肝脏转氨酶升高和转基因表达丧失。后续研究证实了衣壳特异性CD8+ T细胞的存在。衣壳特异性CD8+ T细胞的扩增可能清除AAV转导的细胞，导致转基因表达丧失和靶器官炎症。此外，APCs在MHC II上呈递衣壳肽段，导致CD4+ T细胞激活。CD4+ T细胞的激活导致细胞因子的产生，进一步激活体液或细胞介导的免疫反应，并创造免疫记忆。在随后的研究中，接受高剂量AAV8-hFIX的人类受试者观察到衣壳特异性T细胞反应，导致肝脏酶升高和hFIX表达下降。类固醇治疗降低了肝脏酶并部分恢复了hFIX表达。此外，中等剂量的AAV给药导致可检测到循环的衣壳特异性T细胞，但没有观察到转氨酶升高和转基因表达丧失。进一步的研究表明，衣壳特异性免疫反应是剂量依赖性的，低剂量的AAV载体给药更有可能引起可由类固醇管理的轻度炎症。额外的表征显示衣壳特异性CD8+ T细胞在体外通过MHC I上的衣壳肽段交叉呈递后消除人类肝细胞。 与其他试验观察到的T细胞免疫反应不同，特别是在肌肉导向的试验中，并没有清除转基因表达。包括在大多数肌肉传递试验中使用非分泌性转基因，以及反应性T细胞的凋亡等因素，使得分析这些结果变得复杂。在α1-抗胰蛋白酶（AAT）缺乏症和Glybera研究中，除了CD8+ T细胞外，还报道了CD4+叉头框P3+（FoxP3）T细胞的浸润。同样，在DMD临床试验中限制或未观察到衣壳特异性T细胞反应。由于Tregs具有抑制免疫反应的能力，因此在局部肌肉导向的AAV基因治疗中诱导免疫耐受和转基因的长期表达归因于Tregs。尽管如此，肢带型肌营养不良的AAV基因治疗导致了衣壳特异性T细胞反应。 需要额外的研究来进一步表征T细胞免疫反应以及Tregs在诱导免疫耐受中的作用，这需要合适的动物模型。一些研究已经集中在模仿在动物中观察到的人类免疫反应。向AAV衣壳引入卵清蛋白免疫优势表位并未能触发特定的杀伤。然而，将扩增和激活的衣壳特异性T细胞转移到小鼠体内，导致转基因表达减少和转导细胞的丧失。此外，用表达VP1衣壳蛋白的AAV或腺病毒免疫小鼠，导致衣壳特异性T细胞的诱导。另一项研究利用嵌合抗原受体（CAR）技术创建衣壳特异性T细胞。AAV-CAR T细胞在体外对多种AAV衣壳变体有反应，并在体内减少了转基因表达。然而，AAV的趋向性和免疫反应在人类和小鼠中并不相同。需要进一步的研究来创建能够准确模拟人类AAV特异性T细胞反应的动物模型。 除了在引入AAV后观察到的细胞介导反应外，免疫记忆在第一次接触AAV后形成，无论是通过AAV基因治疗还是暴露于野生型AAV。这种记忆反应的激活不需要先天免疫反应。与体液免疫类似，衣壳特异性T细胞反应在年幼儿童中较少见，可能在婴儿期在感染野生型AAV后产生。研究表明，在二次AAV暴露后，衣壳特异性记忆T细胞会产生细胞因子并获得细胞毒性表型。一些研究对健康人类受试者的T细胞反应进行了表征，并报告了10-100%的人类受试者具有针对多种AAV血清型的功能性循环衣壳特异性T细胞。进一步分析证实，大多数AAV特异性CD8+和/或CD4+ T细胞属于中央记忆亚群。尽管AAV特异性免疫反应对基因治疗和再剂量研究至关重要，但传递的转基因可以引起免疫反应。下一节将讨论针对转基因的免疫反应。 3.针对转基因的免疫反应 传递的转基因产品通常包含外来抗原，因此它们可能诱导体液或细胞免疫反应，中和分泌性转基因并清除转导细胞。在暴露于AAV传递的转基因后，APCs通过转导或吞噬作用获得蛋白质产物，并在MHC I或MHC II分子上呈现处理过的抗原，分别导致细胞或体液免疫反应。针对转基因的免疫反应持续到转导细胞被清除，或由Tregs或T细胞耗竭抑制免疫反应。然而，与腺病毒和慢病毒载体相比，由于AAV对APCs的转导效率较低，AAVs诱导针对转基因的免疫反应的风险较低。在这篇综述中，我们总结并讨论了转基因免疫反应的复杂性。 迄今为止，AAV基因治疗中针对转基因的免疫反应主要在肌肉导向的临床试验中报告。在一项研究中，AAV的肌肉传递在一些患者中导致了针对转基因的抗体形成，这在NHP研究中已被预测。此外，研究表明，在没有残留蛋白表达或大片段缺失的基因转移的人类受试者中，针对转基因的免疫反应风险更高，而在具有错义突变的受试者中，基因传递更易被耐受。一些临床试验通过简单地不招募有更高风险发展反应的患者来控制针对转基因的免疫反应。在大多数肝脏导向的临床试验中，排除了有蛋白替代疗法免疫反应史或空突变的人类受试者。然而，在庞贝病临床试验中，AAV被肌肉注射，观察到缺乏功能性酶表达或非常低水平的患者出现免疫反应，类似于蛋白替代疗法中观察到的情况。在一项肌肉传递AAV的AAT临床试验中，只有在一个具有常见非病理性多态性和较不常见的HLA-单倍型的人类受试者中观察到转基因免疫反应。此外，当在肌肉传递hFIX中包括具有错义突变的患者时，未观察到转基因免疫反应。最近的一篇摘要表明，包括在转基因蛋白中存在的N-末端表位的基因组缺失的DMD患者，对转基因免疫反应的风险更高。这些观察表明，残留蛋白表达水平和患者基因型在影响针对转基因的免疫反应方面发挥了更关键的作用。此外，在临床环境中，眼部和鞘内AAV基因传递显示出有限的与转基因相关的免疫反应，可能是由于它们的分隔和减少的抗原呈递。AAV衣壳变体是另一个促进针对传递转基因的免疫反应的因素。在APCs中转导效率较低的衣壳可能具有较低的风险诱导针对转基因的免疫反应。 总结来说，针对转基因的免疫反应主要在没有残留蛋白表达的患者中观察到；因此，临床研究更倾向于选择具有错义突变的受试者或在蛋白替代疗法中没有反应的受试者。然而，这种方法排除了需求最迫切的目标人群。为了满足这一未满足的需求，已经采用了几种策略，将在第5.3节中描述。 4.监管批准后的AAV载体免疫反应 临床试验在标准化条件下进行，涉及的小规模、同质人群与批准后的患者选择和治疗条件不同。因此，可能会观察到安全性概况和反应的差异。迄今为止，已有三种基于AAV的药物（Luxturna、Zolgensma和HEMGENIX）获得FDA批准，为许可后研究提供了更大的数据集。在这一部分，我们简要讨论与Luxturna和Zolgensma相关的整体安全性概况和免疫反应。 4.1.Luxturna Luxturna（voretigene neparvovec）是FDA批准的第一种用于治疗双等位基因视网膜色素上皮特异性65千道尔顿（RPE65）突变相关视网膜营养不良的眼部AAV基因治疗。通过单次AAV基因传递，将RPE65基因的功能性拷贝直接传递到视网膜细胞，恢复患者的视力。无论是对AAV2衣壳还是转基因，都没有观察到有害的免疫反应。报道了Luxturna的轻微免疫反应，并通过Luxturna的视网膜下传递前后的系统性皮质类固醇治疗得到了控制。同样，在用AAV2-ND4（玻璃体内注射）治疗的Leber遗传性视神经病变（LHON）患者中，体液和细胞免疫反应有限。Luxturna和LHON患者观察到的轻微免疫反应可以归因于局部注射到含有高浓度免疫调节神经肽和细胞因子的分隔环境中。 4.2.Zolgensma Zolgensma（onasemnogene abeparvovec）是FDA批准的第一种基于AAV的基因替代疗法，用于治疗SMA。Zolgensma由一个自互补的、复制缺陷的AAV9组成，编码功能性SMN蛋白，通过单次静脉注射以1.1×10^14 vg/kg体重的剂量给药。 Zolgensma能够实现临床相关的治疗结果，并在减少SMA患者的过早死亡方面取得了有希望的结果。来自临床试验和市场后监测的数据显示，存在诸如肝毒性、血小板减少、TMA、心脏事件和神经节病等安全风险。在SMA许可后，报告了肝转氨酶的暂时升高，这些通过强的松治疗得到了解决。所有SMA患者都接受了预防剂量的强的松，但激素治疗的剂量和持续时间是可变的。当转氨酶水平低于正常上限的两倍时，才开始逐渐减少剂量。表现出急性肝衰竭的患者接受了暂时的高皮质类固醇剂量。对于接受长期激素治疗的患者，建议咨询内分泌学家以评估肾上腺功能不足。 肝毒性可能归因于衣壳特异性的细胞介导免疫反应。在急性疾病的情况下，即使经过长期皮质类固醇治疗，也可能考虑使用氢化可的松进行应激剂量。迄今为止，强的松已被证明在SMA临床试验和许可后经验中有效地恢复了肝转氨酶水平。然而，尽管接受了类固醇治疗，仍有SMA患者出现急性肝毒性的证据。诺华最近报告了两名儿童SMA患者因急性肝衰竭死亡。这些患者的肝功能严重受损，并迅速发展为肝性脑病和多器官衰竭。死亡发生在Zolgensma治疗后6-7周，开始逐渐减少强的松后。 除了肝毒性，其他不良反应包括短暂的血小板减少症。在一个患者中，观察到血小板减少症和多器官衰竭的晚期发作，但机制仍然不明。在接受Zolgensma治疗的1400多名患者中，FDA报告了9例TMA病例。EMA报告了在接受Zolgensma治疗的800名患者中有5例TMA病例。在基因治疗后第12天被诊断为TMA的一名患者，由于多种因素，面临致命结果。有趣的是，报告了该患者补体激活的生物标志物可溶性C5b9复合物（sC5b9）的水平增加。患者逐渐恶化，症状符合非典型溶血性尿毒症（aHUS）。根据儿童aHUS的治疗建议，患者接受了依库珠单抗治疗，这是一种单克隆抗体，已知可抑制补体因子C5的裂解。依库珠单抗注射导致EsC5b9 C3水平恢复正常，C3减少，C4正常，血小板计数轻微增加，表明1个月后TMA恢复。然而，在第40天，由于表皮葡萄球菌感染的发生，TMA复发，患者不幸心脏骤停。另一项研究报告称，在Zolgensma治疗1周后，也有三名患者发展为TMA，这表明了免疫介导的病因。其他因素，如并发细菌感染和最近的疫苗暴露，也促成了TMA。在两个病例中报告了通过替代途径激活补体系统，接受依库珠单抗治疗的一名患者没有显示出显著的临床改善。需要进一步调查，以评估依库珠单抗在由AAV基因治疗引起的TMA中的有效性。值得注意的是，其他基于AAV9的基因治疗在DMD和Danon病中也报告了伴有补体激活的TMA。未来的研究需要阐明补介导因素在SMA患者TMA中的作用。 最近的一项研究报告了一名接受Zolgensma治疗的SMA患者出现血嗜性淋巴组织细胞增多症（HLH）。连续3天使用高剂量的甲泼尼龙，随后几天逐渐减量，导致临床改善。因此，需要仔细监测炎症标志物，以避免因HLH导致的致命性。 5.少AAV基因治疗中免疫反应的策略 在这一部分，我们讨论可能的策略，以规避针对AAV衣壳和转基因的有害免疫反应，从而实现成功的转基因传递和表达（表1）。 表1 AAV基因治疗中的免疫反应及可能的调节策略 5.1.减少针对AAV的先天免疫反应的策略 正在积极开发免疫调节技术，以减少AAV载体的免疫原性，并允许安全和重复的干预。尽管在大多数试验中施用的皮质类固醇有助于调节免疫介导的毒性并实现长期转基因表达，但有些病例需要更复杂的类固醇方案和额外的方法，以潜在地减少载体和转基因的免疫原性。 5.1.1.克服Toll样受体激活和DNA感应 TLR激活在触发针对AAV载体的先天免疫反应中起着关键作用。规避TLR激活的策略旨在减轻这些反应。TLR9缺陷的小鼠显示出高水平的转基因表达，这一观察促使几个小组修改转基因序列，以干扰TLR9介导的识别。通过耗尽AAV基因组中的CpG二核苷酸来阻止TLR9信号，已被证明可以增强AAV介导的基因表达。耗尽CpG二核苷酸在免疫原性AAVrh32.33.33载体中显示出稳定的转基因表达，并减少了效应T细胞（Tef）的浸润。此外，CpG缺失在血友病B小鼠的肌肉注射中导致显著减少的CD8+ T细胞浸润，但没有影响抗体水平。ITR区域也含有高CpG含量，因此一项研究产生了功能性无CpG ITR。然而，由于ITR在包装中的关键作用，载体产量减少了约三倍。在另一项研究中，已报告在AAV基因组中加入TLR9抑制（TLR9i）DNA序列可以减少小鼠和猪的免疫反应。TLR9i由多个TTAGGG副本组成，也可以阻断DNA传感器，如cGAS。此外，抗疟药羟氯喹（HCQ）可能作为TLR9抑制剂。在小鼠和人体组织中，HCQ在AAV传递前1小时给药增强了转导效率。其他修改包括工程化表达盒，以便从3′ ITR阻断转录。因此，不会生成dsRNA，并且可以避免源自与细胞质dsDNA和dsRNA结合的先天免疫反应。在AAV表达盒中引入设计用于dsRNA传感器或其下游信号通路的短发夹RNA，可能用于规避dsRNA介导的先天免疫反应。采取多学科方法阻断TLR9激活和DNA感应，以规避先天免疫反应，可能会改善临床反应。 5.1.2.逃避补体系统激活 限制补体激活可能防止炎症反应和随后的组织损伤。Apellis Pharmaceuticals提出了使用一种名为APL-9的聚乙二醇化合成环状肽，它抑制补体激活的所有三条途径，以防止对AAV的补体激活。在I期测试中，静脉注射单剂量的APL-9能够限制补体激活，持续时间长达12小时。没有报告严重的不良事件，APL-9治疗能够完全抑制AH50溶血活性。在最近的一项研究中，APL-9减少了APCs上的CD86水平，AAV摄取和细胞因子/趋化因子分泌，以响应体外的AAV。由于在IgG耗尽的血清中确认了经典途径的参与，减少AAVs与抗体之间相互作用的治疗可能在防止补体激活方面有效。正在测试大量的补体抑制剂，从小分子抑制剂、siRNAs、适体、反义寡核苷酸、抑制肽、药理学药物到阻断抗体等，以抑制补体激活。依库珠单抗是一种针对补体超激活的单克隆抗体，通过抑制C5和MAC形成发挥作用。依库珠单抗已成功用于限制SMA和DMD AAV基因治疗中的补体激活(NCT03362502, NCT03368742, NCT03381729, NCT02122952)。未来需要进行进一步的研究，以抑制AAVs通过补体系统激活。 5.1.3.减少抗原呈递细胞中的转基因表达 正在开发限制免疫细胞激活的策略。例如，TLR9抑制性寡核苷酸恢复了由scAAV给药触发的增加的巨噬细胞浸润。限制泛素化并逃避蛋白酶体介导降解的蛋白酶体抑制剂可以减少MHC I分子上衣壳肽片段的呈递。通过阻断其他细胞的不需要表达，实现目标组织和细胞特异性表达的microRNA(miRNA)介导的去靶向是另一种策略。这种方法可以减少先天免疫细胞的抗原呈递，并随后阻断对AAV传递的转基因的适应性免疫反应。下面讨论了限制对AAV衣壳和转基因的适应性免疫反应的其他方法。 5.2.减轻对AAV衣壳的适应性免疫反应 AAV基因传递后的适应性免疫反应限制了转基因表达，并产生了抑制AAV重复剂量的免疫记忆。因此，正在采用几种策略来限制适应性衣壳特异性免疫反应。在以下部分中，讨论了克服针对AAV衣壳的体液和T细胞介导的免疫反应的策略。 5.2.1.克服体液免疫反应的策略 AAV基因治疗受到NAbs形成的阻碍，因此采用了多种策略来克服体液免疫反应。需要系统给药AAV的患者尤其处于NAbs的更大劣势。一种方法是剂量受试者缺乏对AAV的预先存在的免疫力，这在年轻患者中更为常见，但在青少年和成人中则相当少。 由于NAbs的高流行率，已经采用了几种策略来抑制或消融基因治疗受试者的体液免疫反应。抑制体液免疫的主要方法是使用免疫抑制药物（IS）。一种广泛适用的策略是使用B细胞耗竭单克隆抗体。研究表明，使用利妥昔单抗，一种抗CD20抗体，进行B细胞耗竭后，NAb滴度降低的有希望的结果。利妥昔单抗与雷帕霉素，mTOR抑制剂，或与雷帕霉素和皮质类固醇的组合，在临床试验中成功诱导耐受并防止抗体形成。贝利木单抗，一种抗B细胞激活因子(BAFF)的抗体，是另一种B细胞耗竭抗体，在控制自身免疫疾病方面显示出有希望的结果。此外，使用ibrutinib，一种B细胞抑制剂，在小鼠模型中减少了针对AAV的初级抗体反应。然而，全身性IS可能增加感染风险，并且对于完全缓解高滴度NAbs无效。除了传统的IS，AAV载体和合成疫苗封装雷帕霉素(SV[rapa])的联合给药，ImmTOR，是另一种有希望的方法。ImmTOR治疗导致抑制AAV特异性抗体形成，并减少了B和T细胞的激活。最近的一篇摘要显示，ImmTOR与贝利木单抗联合给药减少了抗AAV IgM抗体，提供了更持久的抗AAV IgG抗体抑制，并允许在小鼠中多次重新给药AAV8载体。当ImmTOR与ibrutinib组合时，观察到减少的效果。然而，将ImmTOR与空AAV8联合给药给健康人体受试者只延迟了NAbs的形成。 多种方法专注于直接逃避NAbs。一种方法利用细菌衍生的抗体降解酶。另一种方法是血浆置换，它用于减少循环抗体，但可能无法完全根除NAbs或需要多个周期。此外，血浆置换去除总抗体含量，因此增加了传染病的风险。为了克服这个障碍，一项研究使用AAV特定的血浆置换柱从NHP的血浆中耗尽抗AAV NAbs，而不影响总IgG水平。另一项研究表明，AAV9颗粒结合到Sepharose珠子上在大鼠中选择性地耗尽抗AAV抗体。这种方法的治疗窗口有限，因为血浆置换不去除产生抗体的细胞。在另一项研究中，使用盐水冲洗或带气囊导管隔离目标组织与系统循环。这种策略相对侵入性，并且可能不适用于所有目标组织和AAV的系统给药。此外，在这项研究中，使用了NAbs低的NHP，这种方法在NAbs高的动物中的有效性需要进一步评估。建议使用最小暴露于NAbs的途径。在一项血友病临床试验中，与系统给药途径相比，AAV的肌肉传递对预先存在的NAbs不太敏感。此外，在动物模型中，直接将AAV传递到CNS被良好耐受。然而，改变给药途径可能会潜在地减弱转导效率并改变AAV载体的生物分布。 其他方法专注于AAV衣壳以调节体液免疫反应。一种方法是使用诱饵空衣壳吸收循环NAbs。空衣壳的添加通常不是有效的，可能会加剧AAV的免疫毒性并降低转导效率。此外，除了携带转基因的衣壳外，还生产大量空衣壳，这给过程增加了额外的复杂性和相关成本。 衣壳工程是另一种方法，用于生成具有所需趋向性和降低免疫原性的重组AAV。在NAb识别位点的修改可以提高转导效率。或者，通过定向进化产生的衣壳可以逃避NAb感应。与自然变体相比，由AAV2、AAV8和AAV9变体的残基组成的工程化AAV-DJ变体已被证明在存在人类静脉注射IgG的情况下转导肝细胞。此外，从人源化小鼠模型中分离的AAV3b对NAb识别不敏感，并且在人类肝细胞中具有更高的转导效率。尽管如此，与使用当前可用且研究充分的衣壳相比，工程化AAV衣壳是耗时的、劳动密集的，并且需要识别NAb识别位点。为了避免工程化AAV衣壳的复杂性，建议对AAV衣壳进行化学修饰，包括聚乙二醇化和聚合物封装。然而，这些化学修饰可能会潜在地降低转导效率，降低产量，改变AAV载体的生物分布，并导致抗聚合物抗体的形成。除了化学修饰的衣壳外，多项研究表明，外泌体封装的AAV可以在预先存在的免疫存在下转导目标细胞，诱导耐受性，并赋予AAV改变的趋向性。然而，用外泌体封装AAV可能进一步复杂化生产过程并引入核酸或蛋白质污染。 通常，AAV基因治疗的单一治疗可能不够。除了AAV基因治疗后的免疫反应外，暴露于野生型AAV导致预先存在的免疫力，阻碍了AAV再剂量。多项研究表明，CD28/B7和CD40/CD40L阻断导致炎症反应的缓解并允许载体再给药。在这个策略中，CTLA4融合蛋白与B7的相互作用比CD28具有更高的亲和力，导致免疫反应的下调。这种方法与一种抗CD40配体抗体结合使用，阻断了B细胞的刺激信号。尽管结果有希望，但CD28/B7和CD40/CD40L阻断广泛抑制NAbs并需要进一步调查。此外，血浆置换、衣壳诱饵和更换衣壳变体的缓解策略不是有效的。此外，免疫抑制和使用抗体降解酶不针对AAV特异性免疫反应。需要进一步研究开发更具体和有效的方法。更换衣壳变体是另一种允许AAV再剂量的选择，但受到AAV衣壳的不同趋向性、NAbs的交叉反应性和开发不同产品的复杂性的限制。逃避允许基因治疗的体液免疫反应仍然难以捉摸。包括给药途径、所需剂量和目标组织在内的几个变量在选择适当策略中起着关键作用。此外，使用除B细胞耗竭之外的其他策略，如针对IL-1β和IL-6的抗体、etanercept（TNFα抑制剂）或anakinra（IL-1R阻断剂）可能有助于调节AAV基因治疗中的体液免疫反应。使用一种或多种策略可能允许在否则不符合条件患者中进行AAV基因治疗。 5.2.2 克服细胞介导免疫反应的策略 与可以预测的患者体液免疫反应不同，患者对AAV的细胞介导反应在临床试验中差异很大。自从在血友病临床试验中首次观察到以来，通过免疫抑制方案广泛抑制了衣壳特异性T细胞反应。在AAV临床试验中使用的IS治疗包括类固醇、单克隆抗体和蛋白酶体抑制剂。类固醇通常用于临床试验，以通过影响T细胞受体信号减少T细胞激活和细胞因子产生。此外，它们增加抗炎细胞因子的产生和Treg增殖。类固醇通过抑制血管生成、白细胞迁移到炎症部位以及改变免疫细胞死亡和迁移来抑制炎症反应。如前所述，糖皮质激素被用于所有人类受试者中，以抑制Zolgensma试验中的衣壳特异性T细胞反应，然而在类固醇逐渐减少期间，两名患者死于急性肝衰竭。多项临床研究表明，使用类固醇未能防止转基因逐渐丧失。因此，一些研究专注于使用免疫抑制剂药物组合和优化治疗时机。环孢素和他克莫司下调IL-2转录，从而抑制T细胞增殖和激活。他克莫司的日常给药允许NHP中AAV传递的转基因持续表达。麦考酚酸莫非特（MMF）优先耗尽T和B淋巴细胞中的鸟苷核苷酸，并抑制它们的增殖。环孢素和MMF的组合在Glybera临床试验中使用，但未能抑制所有人类受试者的免疫反应。后续研究表明，在AAV剂量之前开始免疫抑制和额外的皮质类固醇治疗是有益的。体外研究表明他克莫司和环孢素抑制Treg增殖。一项研究表明，他克莫司治疗损害了肾脏和肝脏移植患者的Treg功能，而雷帕霉素对Treg有有益的效应。因此，雷帕霉素与利妥昔单抗或强的松的组合已在AAV临床试验中频繁用于诱导耐受。此外，环孢素和非耗尽性CD4受体抗体诱导Tregs并允许在小鼠中重新剂量。建议使用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米。体外和临床前动物研究表明，硼替佐米的给药可以防止内化的AAV降解，减少衣壳呈递，并增加通过增强AAV的核转移来提高转导效率。尽管应用广泛，系统性免疫抑制可能会导致Treg抑制和多种不良效应，包括肠道并发症、肌肉疼痛和头痛，这使得其他策略受到关注。 在AAV运输过程中，AAV衣壳表面的酪氨酸残基可以被磷酸化并随后泛素化，这导致衣壳降解并呈现在转导细胞表面。因此，建议突变表面酪氨酸，这导致AAV衣壳的呈递减少，T细胞毒性降低，并需要治疗剂量。多项研究减少了AAV的治疗剂量，并使用了转基因的超活性变体。并非每个转基因都有超活性版本，并且可能并不总是导致减少的T细胞反应。 除了前面讨论的策略外，降低给药剂量和去除空衣壳已被提出。这种方法试图减少AAV衣壳对抗原呈递的可用性。然而，降低AAV剂量可能会降低转导效率，并导致NAbs中和AAV。 Tregs的浸润和肌肉导向AAV基因治疗试验中转基因的长期表达强调了Treg在诱导免疫耐受中的作用。因此，Treg诱导表位，Tregitope，被纳入AAV衣壳结构，成功扩大了Treg并抑制了CD8 T细胞。除了工程化AAV衣壳，ImmTOR颗粒在衣壳特异性T细胞和体液免疫反应方面显示出有希望的结果。然而，这些新策略需要进一步的功效和安全性调查，因为它们是非抗原特异性治疗。 为了诱导局部和特异性耐受，另一项研究结合了Tregs抑制免疫反应的能力以及CAR的抗原特异性。在这项研究中，使用了AAV特异性CAR Tregs和多克隆Tregs，尽管存在衣壳特异性T细胞反应，但允许转基因表达。 在临床上，衣壳特异性T细胞反应主要通过使用类固醇来控制。免疫抑制增加了感染风险，并且在需要高剂量AAV时效果较差。因此，开发一种新的抗原特异性策略似乎是不可避免的。 5.3.减轻转基因免疫反应 为了避免针对传递转基因的免疫反应，已提出几种方法，包括限制目标人群、免疫抑制、使用组织特异性启动子、miR技术以及免疫细胞疗法。 短期使用环磷酰胺治疗，这是一种烷基化剂，可减少促炎细胞因子的产生，在小鼠和犬模型中成功实现了基因表达。此外，在犬研究中，使用环孢素、抗胸腺细胞球蛋白和MMF的短暂免疫抑制预防了免疫反应并实现了转基因表达。除了系统性免疫抑制外，临床前研究指出了组织特异性启动子在减少针对传递转基因的免疫反应中的作用。当转基因由普遍性启动子驱动时，与肌肉特异性启动子相比，观察到较低水平的转基因表达和强烈的体液和细胞免疫反应。此外，使用肌肉特异性启动子在犬模型中实现了转基因的稳定表达，而没有免疫反应。此外，NHP的一项研究报告称，肝脏导向的表达可能有助于限制抗转基因抗体，诱导耐受，并允许重新使用不同衣壳变体的再剂量。 其他研究利用Tregs来抑制与转基因相关的免疫反应。一项研究使用多克隆Tregs来抑制蛋白替代疗法中因子8和9的免疫反应。然而，Tregs的低频率和潜在的非特异性免疫抑制限制了多克隆Tregs的应用。因此，多项研究产生了转基因特异性CAR Tregs，在抑制转基因诱导的免疫反应方面显示出有希望的结果。TRuC Tregs是通过将抗人凝血因子VIII (hFVIII) 的单链可变片段与T细胞受体融合而开发的。这项研究表明，与FVIII-CAR Treg相比，F8-TRuC Treg具有更优越的抑制功能。B细胞抗体受体（BAR）是通过将因子8抗原和T细胞刺激信号域结合而产生的。BAR T细胞在体外和体内成功消除了FVIII反应性B细胞。随后，通过将Tregs与BAR构建物共转导而创建的BAR Tregs，在抑制转基因特异性B细胞方面显示出有希望的结果。尽管免疫细胞疗法在抑制转基因免疫反应方面取得了有希望的结果，但其临床安全性和有效性需要进一步调查。 目前，临床研究中招募了可能具有较低转基因免疫反应风险的受试者。利用新开发的方法使我们能够包括更多的代表性研究对象。 6.结论 关于患者对AAV基因治疗的免疫反应仍有许多未知之处。然而，基于正在进行的临床试验和治疗数千而非少数患者的许可后数据，不断积累的证据。为了进一步了解AAV基因治疗的免疫反应的发展，需要对入选受试者进行进一步的免疫监测，包括监测血清因子的策略、外周血免疫细胞的表征以及组织分析。然而，缺乏免疫测定的标准协议以及无法收集相关样本导致研究间的变异性，并进一步复杂化了研究结果的解释。开发标准协议以监测AAV临床试验中的受试者将有利于该领域的更好比较。然而，当前试验中存在的剂量、给药途径和使用多种衣壳血清型的变异性可能进一步使比较和解释AAV基因治疗的免疫反应更加复杂。 在大多数试验中，系统性免疫抑制被广泛施用以调节AAV基因治疗临床试验中的免疫反应，尽管有一些显著的不良效应。然而，免疫抑制方案、剂量和时机也都非常多变，并且该领域没有共识。适当的动物模型来测试当前或新药物并不容易获得，这使得标准化协议变得困难。应用新开发的战略可能比广泛、非特异性的免疫调节更有针对性，可能有助于改善结果并减少并发症。 自1995年第一次AAV临床试验以来，已经观察到有关AAV安全性和免疫反应的显著临床数据，然而免疫反应仍然是成功AAV基因治疗的障碍。克服免疫反应的新兴策略将使AAV基因治疗的全部潜力对数千人的生活产生积极影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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