Inotersen sodium

摘要:罕见病因其数量庞大和总体患病率而对社会发展造成重大影响。它们的异质性、多样性和特性为临床管理和治疗带来了巨大的挑战。在这篇综述中，我们讨论了基因治疗在罕见病临床应用方面的最新进展，重点关注了多种病毒和非病毒策略。我们将讨论腺相关病毒（AAV）载体的使用，特别是在Luxturna中，该药物已获准用于治疗视网膜上皮中的RPE65缺陷。Imlygic，一种单纯疱疹病毒载体，已获准用于治疗难治性转移性黑色素瘤，将是针对罕见癌症开发的溶瘤病毒载体的一个例子。Yescarta和Kymriah将展示逆转录病毒和慢病毒载体在自体体外生产嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）中的应用，这些细胞已获准用于治疗难治性白血病和淋巴瘤。类似的逆转录病毒和慢病毒技术可以应用于自体造血干细胞，如Strimvelis和Zynteglo，分别是腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷（ADA-SCID）和β-地中海贫血的获准治疗方法。我们将通过Onpattro和Tegsedi，这两种针对家族性转甲状腺素（TTR）淀粉样变性的RNA干扰药物，以及Spinraza，一种用于脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的剪接切换治疗，来突出反义寡核苷酸技术。通过Zolgensma，一种AAV血清型9载体，和Spinraza，我们可以对AAV和寡核苷酸疗法在SMA中的有效性进行初步比较。通过这些市场上的基因疗法和基因细胞疗法的例子，我们将讨论这些新技术在以前难以治疗的罕见病中的不断扩展的应用。 1.引言 这篇综述概述了目前用于治疗罕见病（RDs）的基因治疗策略。深入分析或全面概述RD领域超出了我们讨论的范围，但其他综述可供参考。尽管对RDs的定义各不相同，但决定性因素是低发病率，通常<0.05%。目前有近10,000种RDs，累积影响全球超过5%的人口，约4亿人，因此对全球健康造成了沉重的负担。它们的表型谱系极其多样化，从轻微的，例如遗传性巨舌症，到严重的，例如亨廷顿病舞蹈症或腺苷脱氨酸—重症联合免疫缺陷（ADA-SCID）。大约80%的RDs涉及遗传变异，并且通常对于每种疾病，存在多个不同的致病突变，这对疾病管理有着重要的影响。RDs还包括一些传染病，如巴贝西虫病，一种蜱传感染。RDs的医疗成本很高；它们可能是慢性的，通常具有毁灭性的后果，并且缺乏有效的治疗方法，通常转化为广泛而昂贵的症状管理，包括住院治疗。未确诊的RDs加剧了问题。没有确定潜在原因，管理患者症状是低效和无效的，恶化了结果并增加了医疗资源消耗。在发达国家，RDs占患者人口5%–7%的总直接医疗支出的约10%。疾病治疗的研究与开发无论患者数量如何都是昂贵和漫长的。对于有数百万患者基础的常见病，它们提供价值，并且可以由患者自己直接或间接资助。对于患者基础通常从几千到几十万，但可能低至一个患者的RDs来说，情况并非如此。RDs的治疗开发可能在商业上不可行，但RDs带来的痛苦和高昂的医疗成本，使得政府介入是值得的。例如，孤儿药指定状态在激励制药公司和促进创新方面发挥了重要作用。作为一组，RDs的性质在很大程度上排除了小分子治疗药物；异常或缺失基因的功能不易被其他分子替代。例如，伊马替尼用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）是例外。生物治疗药物如蛋白质补充可以提供解决方案，但往往无法完全恢复稳态平衡，只提供部分症状缓解。此外，一种生物制剂的开发从先前制剂的工作受益有限，它们的适用性并不普遍。血友病A，只影响一种蛋白质，并且可以用重组因子VIII有效治疗。对于47XXY（偶尔也是48XXYY）克林费尔特综合症，一种先天性X和Y染色体复制，这严重影响了全局基因表达模式。它的纠正超出了当前技术能力，只留下症状管理作为唯一的选择。相比之下，基于核酸的疗法非常适合治疗RDs，因为（i）核酸有效载荷是可互换的，因此平台和传递开发可以惠及许多不同的疾病领域；以及（ii）内部稳态平衡更有效地恢复，无论是永久性的还是暂时性的，这取决于使用的技术，以提供更大的保护，防止疾病造成的损害。简而言之，基因治疗承诺更有效的治疗方法和更高效的治疗发现过程。在这里，我们讨论了RDs的基因治疗的当前临床开发和实践。我们几乎只关注那些已经获得监管批准并正在用于受影响人群的治疗，将它们与传统治疗进行对比，并展示了它们的平台更广泛的适用性。 最初设想通过纠正有缺陷的基因来缓解或治愈疾病，基因治疗已经发展到包括几种治疗干预（图1）。遗传缺陷可以通过消除、减少或增加一个或多个蛋白质的表达，或通过创造具有改变功能的新型蛋白质（功能获得）来引起疾病。这些缺陷的规模从点突变到多核苷酸缺失或插入、基因拷贝数变异和核型变化差异很大。当前技术将基因治疗限制在单个基因缺陷上，但最近的进展有潜力纠正更大规模的异常。为了便于我们研究这个主题，我们将成功的基因治疗临床应用的讨论分为以下几类： 体内直接修改体细胞DNA。 在重新植入之前修改分化体细胞中的DNA。 在重新植入之前修改干细胞中的DNA。 使用核酸技术操纵转录后RNA处理和翻译。 图1 基因疗法领域的扩展。最初，基因疗法被设想为组织内细胞遗传信息的原位修改。该领域已经发展超越了这一点，涵盖了更多核酸技术方面，特别是寡核苷酸技术，该技术旨在修改基因表达，而不必改变细胞的遗传信息。在体外修改患者的细胞，然后在重新植入之前进行，已被证明是一种成功的临床策略。尽管最近的技术进步现在已经使得线粒体和生殖细胞或胚胎细胞基因疗法成为可能，但由于安全和伦理问题，这些方法尚未被使用。 2.体内体细胞DNA的直接修改 2.1.体细胞和有丝分裂后组织中的基因补充：Luxturna AAV基因补充治疗LCA2 基因功能性拷贝的缺失是高度分化组织（例如肺或眼睛）功能失调的常见原因，这导致RDs。这些情况适合于将功能性基因拷贝直接添加到目标组织的细胞中。这就是基因补充：将含有感兴趣基因的DNA传递到细胞核中，并确保其表达和持久性（见图2）。病毒可以被设计成强大的基因补充平台。基本前提是创建一个定制的病毒基因组，将感兴趣的基因替换病毒基因，并人工将其包装成病毒颗粒。这些病毒颗粒可以转导细胞并传递目标基因，但不能复制或引起疾病。作为例子，我们将看看病毒载体技术在遗传性视网膜病变中的最近成功临床应用。 图2 常见的基因补充策略。(A) 一个感兴趣的基因（GoI）可以被整合到染色体断裂中，这可能会破坏一个现有的基因，因为插入点可能是随机的。包括整合性病毒载体（RV，逆转录病毒载体；LV，慢病毒载体）和转座子的例子。(B) 新遗传物质作为染色体外元素的持续存在。腺相关病毒（AAV）、腺病毒（Ad）和缺乏整合能力的慢病毒载体（IDLVs）是常见的例子。没有基质附着区域和指导复制的序列，染色体外元素会通过细胞分裂而被稀释掉。(C) 同源依赖修复（HDR）涉及宿主序列的有针对性的替换。这是最安全的方法，但也是最难利用的。 视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白（RPE65）是视觉周期中11-顺式视黄醛再生的关键酶（见图3）。没有RPE65，11-顺式视黄醛就会耗尽，使光感受器无法工作，而代谢途径中的其他中间体积累到可能的有毒水平。RPE65突变导致一系列遗传性视网膜病变，这些病变导致出生时或非常早期儿童期就失明。最常见的表型是Leber先天性黑蒙和视网膜色素变性，但根据RPE65遗传缺陷，也可能有其他更罕见的表型。目前，除了基因疗法之外，无法实现患者眼中的RPE65功能的替代，并且是吸引基因疗法的目标（见图3）。密集的研究和开发努力最终导致了Voretigene neparvovec的开发，这是一种腺相关病毒（AAV）RPE65基因替代平台。2017年，它被美国食品药品监督管理局（FDA）批准，商品名为Luxturna，用于治疗2型Leber先天性黑蒙（LCA2）。 图3 杆细胞中的视觉循环。视觉信号是由视蛋白蛋白在11-顺式视黄醛（RAL）的帮助下产生的，它吸收光，变为全反式视黄醛，并在此过程中激活视蛋白。全反式视黄醛不再对光敏感，需要转换回11-顺式RAL。这种转换不是由杆细胞本身进行的，而是由支持性的视网膜色素上皮（RPE）完成的。全反式RAL从视蛋白中释放出来，由于它能够穿透细胞膜，它在特殊的载体蛋白（视盘间视黄醇结合蛋白，IRBP）的帮助下被运输到RPE，在RPE中一系列专门的酶催化这一转换。11-顺式视黄醛产物被运输回杆细胞。RPE酶的代谢缺陷阻碍了11-顺式视黄醛的转换，并导致各种中间体如视黄醇（ROL）酯的积累，这些中间体可能达到有毒水平。通过血液从外部供应11-顺式视黄醛和清除中间体并不足以维持视力。 腺相关病毒是一种非致病性共生细小病毒，其生物学特性使其适合作为基因疗法平台（见图4）。它不能自发地退出潜伏阶段并开始其溶解周期，除非被另一种病毒感染。自然AAV基因组能够在染色体19上的特定位点进行优先位点特异性整合，但也可以作为细胞核中的染色体外元素（作为染色体外元素）长期维持。人类有12种不同的自然AAV变体（称为血清型），每种都有独特的衣壳类型，控制它们的嗜性，即它可以感染的细胞类型。这些变体共同赋予AAV非常广泛的嗜性，可以通过使用非人类和基因工程变体进一步扩展。 图4 腺相关病毒（AAV）的生命周期。AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后破坏内体，逃到细胞质中。衣壳解体，同时将病毒基因组传递给核孔，促进核进入。在细胞核内，AAV基因组是单链的，利用反向末端重复序列（ITRs）变成双链。如果没有伴随的辅助病毒，AAV会进入休眠状态，倾向于以一种需要AAVS1基因组序列的位点特异性方式整合到19号染色体上的MBS85位点。辅助病毒的再次感染重新激活了AAV，允许它复制其基因组并表达其溶解阶段蛋白。辅助病毒使细胞裂解有助于AAV逃离细胞。 通过用称为反向末端重复序列（ITRs）的病毒序列包围一个能够产生感兴趣转录本的转基因表达盒来创建AAV载体。ITRs允许病毒结构蛋白将转基因盒包装成病毒颗粒。这些工程化病毒颗粒通常通过在细胞中表达ITR-转基因盒来生产，这些细胞也被用来表达病毒结构基因，来自表达载体而不是病毒骨架。提供结构基因的转录，只有ITR-转基因作为基因组，允许包装ITR-转基因，而不包括病毒颗粒中的任何结构基因，因此在过程中产生活病毒的风险要低得多。通过移除结构基因，AAV载体可以转导以传递转基因，但不能复制并创造新的病毒颗粒。通常，在包装过程中不提供AAV基因组位点特异性整合所需的基因，并且载体中不存在。因此，AAV载体缺乏位点特异性整合的能力，依赖于染色体外维持，大大减少了它们的潜在遗传毒性。染色体外维持的缺点是在复制细胞中病毒基因组的快速丢失，限制了AAV用于体细胞有丝分裂后细胞的效用。AAV载体的一个重要限制是包装能力。AAV包装的大小限制大约为5kbp，这是病毒载体系统可以提供的低端（即慢病毒载体可以携带8kb插入物，高容量腺病毒载体可以包括37kb）。考虑到需要包括的所有元素（例如启动子、增强子、调控域），这是一个重要的限制。这种大小限制对于使用自互补策略的第二代AAV载体尤其突出，但我们将与5.3节中的自互补AAV载体的例子一起讨论。AAV载体系统的一个关键优势是血清型转换，以改变载体嗜性。血清型转换涉及使用最有效的AAV变体的衣壳来转导目标细胞群体包装载体。 直到最近，LCA2既无法治愈也无法治疗。Luxturna的批准为LCA2以及其他许多以前无法治愈的视网膜病变带来了新的希望。Luxturna是一种基于AAV2的重组、非整合载体，旨在传递RPE65基因（见图5）。在临床试验中，Luxturna通过玻璃体下注射到双眼，间隔6-18天。接受Luxturna治疗的患者在治疗后1年显示出视力的显著和持久改善。视野和感知光线的能力也有了显著提高。值得注意的是，早期1期和2期试验的患者保留了这种改善3年或更长时间。这样的变化可以对受影响人的生活质量产生巨大影响，使他们从近乎失明到部分视力。 图5 Luxturna载体设计和治疗方案。Luxturna是通过将RPE65的表达盒包装进AAV2衣壳中生产的。从转染相关质粒的细胞中收集RPE65载体病毒，进行纯化，然后将高滴度的载体制剂直接注射到视网膜下空间。载体将向外扩散，并将基因插入视网膜色素上皮的大区域，创建一个新的11-顺式视黄醛来源。11-顺式视黄醛循环的跨细胞特性允许效果更广泛地传播到整个视网膜。该盒设计包含具有所有三个外显子和两个内含子的基因组RPE65序列。通过将鸡β-肌动蛋白启动子与巨细胞病毒（CMV）增强子连接，创建人工启动子/增强子对，并使用人工聚腺苷酸序列，确保了高效高水平的表达。该盒由AAV2 ITR序列所环绕。 Luxturna的成功为先天性视网膜病变和其他遗传性眼病验证了一种全新的治疗途径。实际上，RPE65突变只占遗传性视网膜病变的一小部分。Luxturna激发了针对眼睛的基因治疗产品的临床开发的爆炸性增长。结果应该在2020年代中后期开始显现。 2.2.固体肿瘤的基因治疗：Imlygic和HSV基因补充治疗黑色素瘤 癌症是一种遗传病，其极端的异质性使其成为RD领域的一个虚拟微观世界。总的来说，癌症很常见，但由于有这么多不同类型的癌症，个别类型可能是罕见的。高度可变的发病机制和对常规治疗的抵抗力意味着个性化医疗非常具有挑战性，但也是一项关键的优先事项。基因治疗提供了一个有吸引力的建议：利用特定癌症内的特定缺陷，创建选择性对那种癌症有毒的工程病毒载体。然后，该技术可以很容易地重新用于针对其他癌症类型。 黑色素瘤是英国第五种最常见的癌症，发病率约为每10万人25例。50它非常具有侵略性，原位黑色素瘤迅速发展为转移性疾病，此时存活率急剧下降。50Talimogene laherparepvec（Imlygic）是一种许可的单纯疱疹病毒-1（HSV1）基因治疗黑色素瘤的治疗方法。单纯疱疹病毒的生命周期见图6。单纯疱疹病毒依赖于关键的毒力因子，这些因子扰乱干扰素I途径和抗原呈递以逃避免疫并引起疾病（见图6）。 图6 单纯疱疹病毒的生命周期。单纯疱疹病毒通过其包膜与细胞膜的受体介导融合进入细胞。病毒基因组被注入到细胞核中，在那里它循环化以便于同时进行复制（通过滚环机制）和病毒基因转录。线性病毒基因组副本被运送到细胞质中，并与新合成的衣壳蛋白相互作用。完整的病毒颗粒在内质网（ER）内的囊泡中被内化，由插入到ER膜中的病毒包膜蛋白引导。带包膜的病毒在ER内被运输到内体，最终通过胞吐作用释放出来。 两种病毒蛋白在阻断宿主对病毒的反应中很重要。ICP47阻止病毒颗粒肽被装载到MHC I类分子上，阻碍细胞毒性T细胞的识别。ICP34.5阻止蛋白激酶R（PKR），破坏了干扰素途径对病毒的反应。 在癌症中，特别是黑色素瘤中，相同的过程通常存在缺陷。Imlygic缺乏这些毒力因子，削弱了它感染正常细胞的能力，但使癌细胞极易受到攻击（见图7）。两个额外的修改增强了Imlygic的抗癌效力：病毒在复制期间表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），并且无法进行溶原性，立即激活致命的溶解周期（见图7）。 图7 Talimogene laherparepvec（Imlygic）的总体设计。单纯疱疹病毒基因组有两个长反向重复序列（末端和内部，TRL和IRL）和两个短反向重复序列（IRS和TRS）。它还有一个长独特片段（UL）和短独特片段（US）。在Imlygic中，裂解周期基因的启动子被改变以立即激活，阻止溶原状态，ICP34.5被GM-CSF替换，ICP47被删除。Imlygic只能在癌细胞中有效复制，癌细胞中的干扰素途径和抗原呈递受损。复制裂解癌细胞并产生GM-CSF，增强对肿瘤的免疫破坏。 Imlygic在针对III-IV期黑色素瘤的临床试验中表现良好，这些黑色素瘤对手术无效。它增加了实现持久疾病缓解的患者比例，在60个月时将无病生存率提高了50%。尽管Imlygic对晚期IV期黑色素瘤无效，但它将IIIB/B和IIIB-IVM1的总体生存率提高了一倍以上。值得注意的是，几乎所有实现完全缓解的患者在接受5年随访时仍然无病。此外，发现Imlygic与检查点抑制剂显示出显著的协同作用。 3.在重新植入前对分化的体细胞DNA进行修改 3.1.体外基因疗法的优势和挑战 体外基因疗法是在体外对细胞进行遗传修饰，然后进行移植。这些细胞可能是分化的体细胞或干细胞/祖细胞。这种体外方法的主要优点包括选择性地针对感兴趣的细胞群体，避免免疫防御，以及在基因修饰细胞重新植入之前实施质量控制系统。在本节中，我们将重点关注保留足够复制能力以允许提取、体外修改和重新植入的分化体细胞。 3.2.体外基因疗法的逆转录病毒载体：嵌合抗原受体（CAR）T细胞 逆转录病毒是包膜的单链RNA病毒，其生命周期涉及将它们的RNA基因组转换为双链DNA，并稳定地整合到宿主基因组中。它们的RNA含量的外壳被来自宿主细胞质膜的脂质双层包围，包含包膜蛋白，一种跨膜宿主细胞入侵因子。γ-逆转录病毒66和慢病毒最常用作病毒载体。图8显示了逆转录病毒/慢病毒生命周期的简要总结。逆转录病毒使用称为长末端重复序列(LTRs)的特殊序列来指导它们的基因组包装到病毒颗粒中。LTRs包含促进病毒生命周期中几个步骤的信号，并作为强大的启动子。逆转录病毒载体是通过提供病毒结构蛋白的转录来制造的，从而直接将转基因插入宿主基因组。尽管整合是普遍的，但并不随机，已有整合模式的报道。例如，HIV偏好活跃的转录单元，但在基因上整合的频率相似。尽管整合的普遍性可能存在问题，但它也确保了有效载荷将被插入活跃的染色质区域。慢病毒与其他逆转录病毒相比提供了额外的优势。它们可以跨越完整的核膜转位它们的基因组，并且不需要等待细胞分裂才能访问宿主基因组进行整合。慢病毒载体因此可以转导静止细胞。 图8 逆转录病毒生命周期。逆转录病毒和慢病毒通过其包膜与细胞膜的受体介导融合进入细胞。在细胞质中，病毒衣壳解体，基因组RNA（gRNA）通过逆转录酶（RT）转化为双链（dsDNA）基因组。dsDNA基因组要么通过病毒蛋白通过核孔运输（慢病毒），要么在细胞分裂时进入细胞核（γ-逆转录病毒）。在细胞核中，发生循环化和染色体外持久性或直接整合到宿主染色体中。整合的dsDNA产生病毒转录本和gRNA基因组。病毒颗粒在细胞质中组装。插入到质膜中的包膜蛋白引导组装的核衣壳从细胞中出芽并获取病毒膜包膜。 急性淋巴细胞性白血病(ALL)是一种影响儿童的淋巴细胞祖细胞的恶性肿瘤。它与关键癌基因（如PAX5和TCF3）的一系列染色体易位相关，在某些情况下，还有功能的增益突变，如BCR-ABL1（费城易位）和ETV6-RUNX1重排。ALL的发病率估计为每百万10-20例。与许多其他遗传性癌症不同，ALL在生命中早期发展，使其成为最常见的儿童癌症之一。B细胞前体恶性肿瘤占ALL的大部分。 化疗的进步和对ALL中突变破坏的信号网络的理解，已经导致了相对有效的化疗方案的发展，但不幸的是，当患者在治疗后复发或更糟糕的是，最初的反应很差时，预后通常很差。 非霍奇金淋巴瘤(NHL)是影响头颈部淋巴组织的更常见的淋巴组织来源的癌症之一。它包括一个高度异质的恶性肿瘤群体，在欧盟的发病率大约为每10,000人中有1人。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)占NHL发病率的四分之一到三分之一，且极具侵略性。已经鉴定出NHL的家族形式。像ALL一样，通常有有效的治疗选择可供NHL使用，但难治性DLBCL的预后非常差。 开发针对CD19的人工T细胞受体(TCRs)，这是大多数B细胞淋巴瘤中强烈表达的B细胞前体的表面标记物，是一项革命性的进展（见图9）。这些嵌合受体是通过将TCR的信号装置与来自共刺激分子的部分以及针对目标蛋白的结合位点（在这种情况下是CD19）连接在一起而构建的。抗CD19 CARs将T细胞人为地靶向到B细胞。CAR信号步骤与实际TCR信号不同，根据使用的共刺激分子的类型而变化，形成的免疫突触是非典型的。尽管如此，产生的信号足以模拟T细胞受体信号，使修饰的T细胞能够攻击和摧毁表达CD19的目标，同时绕过人类白细胞抗原(HLA)限制。 图9 嵌合抗原受体（CAR）设计。人工T细胞受体（TCR）以模块化方式制造，由以下部分组成：TCR的CD3ζ信号域、跨膜和铰链区域，以及需要用于TCR信号传导的受体（如CD8、CD28和4-1BB（CD137））的共刺激域，以及针对目标蛋白的单链可变片段（scFv）。这创建了一个受体，能够在scFv目标结合时产生完整的TCR信号。CAR被认为是通过二聚化或多聚化激活的，允许一个CAR分子的信号域与另一个CAR分子的共刺激域交叉相互作用。这推动了CAR的激活，创建了一个CD3信号，并激活了其他辅助受体，特别是IL2受体。 自体CD19-CAR T细胞在治疗难治性NHL和ALL方面表现出了高效性。最早两个为此目的批准的产品是tisagenlecleucel（Kymriah）和axicabtagene ciloleucel（Yescarta）。Kymriah是使用4-1BB共刺激域以及CD8alpha跨膜和铰链区域的CD19-CAR工程T细胞制剂。从自体血液分离的CD3阳性细胞（CD4和CD8 T细胞）通过慢病毒载体转导，携带由Elongation Factor-1启动子驱动的CD19-CAR转基因。经过筛选和扩增后，CAR-T细胞被重新输回经过淋巴细胞耗竭治疗的患者体内。Yescarta的制备方式类似，但它使用CD28跨膜/铰链区域和共刺激域代替CD8alpha/4-1BB。该载体是逆转录病毒，由小鼠干细胞病毒（MSCV）启动子驱动。Kymriah被许可用于治疗难治性ALL和NHL/DLBCL，而Yescarta仅被许可用于难治性NHL/DLBCL。它们都有助于推动超过50%的显著缓解率，而传统治疗在很大程度上是无效的。它们还可能有严重的副作用。细胞因子释放综合征是一种可能危及生命的并发症，能够通过IEC（免疫效应细胞）相关神经系统综合征或ICANS损害包括神经系统在内的几个主要器官。第二种独特的并发症是可预测的β细胞消融和血免疫球蛋白水平的崩溃。这可能会使患者易于感染，必须进行管理以降低风险。 CAR-T技术在血液癌症中的成功引领了对可能应用于实体瘤的大量研究，这是一个更具挑战性的环境。现在，癌症的基因疗法应用约占正在开发中的基因疗法治疗的一半。 4.在重新植入前对干细胞DNA进行修改 一种替代的体外方法针对的是干细胞/祖细胞，这些细胞是器官自然维持的基础。这种策略特别适合于血液遗传缺陷的纠正，它建立在骨髓移植的临床经验之上。为了说明这种方法的有效性，我们将看看两种临床批准的治疗，针对影响血细胞的遗传疾病，Strimvelis用于ADA-SCID和Zynteglo用于β-地中海贫血。 4.1.重症联合免疫缺陷：Strimvelis HSC基因疗法 重症联合免疫缺陷是一组遗传性疾病，导致T淋巴细胞功能完全或几乎完全受损，与其他免疫细胞类型的原发性或继发性功能障碍相结合。SCID谱系非常罕见，大约每60,000例活产中有1例。T淋巴细胞的复杂性解释了SCID的广泛遗传异质性。目前已知有16个致病基因和20多种独立的缺陷。最常见的突变在X连锁IL2受体组分中（SCID-X1）。 腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷是另一种常见形式，也是最具破坏性的。腺苷脱氨酸酶对于调节嘌呤核苷酸平衡的嘌呤救捞途径至关重要。ADA活性在防止腺嘌呤核苷酸积累方面很重要。缺乏ADA会导致dNTP池的显著失衡，损害DNA聚合酶的功能。在快速或持续增殖的细胞中，结果是基因毒性休克和凋亡，淋巴细胞分化途径对ADA缺乏特别敏感。ADA缺乏还影响cAMP合成，破坏一般细胞信号传导，并在大多数其他组织中引起更广泛的病理学，包括大脑。 腺苷脱氨酸-重症联合免疫缺陷可以通过同种异体造血干细胞（HSC）移植和聚乙二醇化ADA（PEGADA）治疗。PEG-ADA具有长的血浆半衰期，可以帮助降低细胞内腺嘌呤积累，通过保持细胞外水平低并促进转运体介导的外流，缓解一些最严重的症状。骨髓移植受到HLA匹配供体的可用性和同种异体供体移植物抗宿主病（GVHD）的风险的限制。 欧洲药品管理局（EMA）已在欧盟（EU）许可ADA-SCID的基因治疗选择。Strimvelis是一份工程化的自体HSC制剂，用于表达功能性ADA。从受影响的人中分离出CD34阳性HSC细胞，并使用可溶性介质鸡尾酒扩增：FLT3L、KITL/SCF、THPO、IL3和IL6（FKT36）。在这种增殖状态下，细胞通过使用小鼠摩尔莫尼白血病病毒载体转导功能性ADA副本，其4070A包膜基因，针对Pit-2并介导HSC的有效转导。转导后的HSC池在非清髓性条件下调后重新输回，使用抗增殖剂如白消安抑制内源性HSC的增殖。 Strimvelis在临床试验中表现非常出色。对18名接受Strimvelis治疗的人的随访显示，他们全部存活（随访2-13年，中位数7年），并且他们足够健康，能够恢复正常的社会交往。几名患者能够返回学校。在可评估的患者中，ADA表达达到或超过正常水平的10%，并在所有髓系和淋巴系细胞中保持稳定，免疫功能成功重建，可以观察到对抗原挑战的反应。感染率显著降低，接受者在大多数情况下能够解决感染。几乎所有情况下都可以停止PEG-ADA治疗。无干预存活率保持在80%以上。这些结果与自体HSC移植相匹配，并且与其他所有治疗方法相比非常有利。 成功的T细胞群体重建并不能消除ADA-SCID的全部健康影响，因为它不能替代非造血系细胞中的ADA功能，但它有效地提供了（通过在红细胞中表达）现成的血浆ADA池，可以发挥与PEG-ADA相同的功能。同时，它消除了供体匹配HSC移植的供应问题以及与同种异体移植相关的风险（例如GvHD）。 4.2.使用Zynteglo HSCs的β-地中海贫血基因疗法 β-地中海贫血是最常见的遗传性贫血之一。它是常染色体隐性遗传，分布高度可变。在疟疾目前流行或近期流行的地区，其患病率接近1/1000活产儿，但在其他地方非常罕见。全球患病率接近1:100,000活产儿。 疾病表型取决于HBB（成人β-珠蛋白）基因中确切的遗传缺陷，这是血红蛋白的一个亚基。纯合子继承一个不产生功能性蛋白的等位基因会导致β-地中海贫血重度和严重的危及生命的贫血。纯合子继承一个功能部分丧失的突变会导致β-地中海贫血中间型和较轻的疾病。 β-地中海贫血具有贫血的所有典型特征，包括疲劳、虚弱和心悸。重度疾病还会导致肌肉萎缩、骨骼和软骨畸形、骨质疏松症和脾肿大。定期输血可以解决这些症状中的大部分，但它们通常也会导致铁过载，从而导致心脏、肝脏和内分泌并发症。 最近，一种体外基因疗法方法，Zynteglo被许可用于治疗重度、输血依赖性、β-地中海贫血。患者接受G-CSF和CXCR4/SDF-1拮抗剂治疗，这导致从骨髓大量增殖和动员HSCs进入血液。 从血液中收集CD34阳性HSCs并在实验室中用包含突变HBB（T87Q）的BB305慢病毒载体进行转导。BB305慢病毒载体具有自灭活设计，去除了LTR的转录活性。它包括整个HBB编码序列及其原生控制元素：β-珠蛋白启动子，其3′增强子和来自上游位点控制区的选定片段，促进高水平表达。T87Q变体赋予增强的抗镰状细胞活性，可以通过色谱法区分，作为生物标记物。患者在输注校正的HSCs之前用抑制骨髓增生的药物进行调理。 像Strimvelis一样，Zynteglo在临床试验中非常成功。大多数患者的血红蛋白水平长期改善，能够停止输血。大多数患者超过一年评估，血红蛋白水平接近正常化，无需输血。 5.通过操纵转录后RNA处理和翻译的基因疗法 基因表达水平可以在转录后使用能够干扰剪接、翻译或RNA降解的合成核酸分子进行调节，而不需要直接改变细胞的遗传物质（见图10）。由功能增益突变引起的疾病特别适合这种干预方法。 图10 真核细胞中基因表达的转录后控制。第一个控制点是在剪接过程中。真核细胞的剪接是由一系列剪接位点元素和因子控制的，同一个基因可以产生多个产物。细胞表达的剪接因子决定了剪接变体的平衡。成熟的RNA进一步通过降解来调节。一个特殊的蛋白质复合体识别双链RNA，然后将其作为模板来降解匹配的mRNA分子。这种机制（RNA干扰）允许细胞通过产生特殊的RNA分子（微小RNA或miRNA）来微调基因表达。剪接和RNA干扰可以通过人工寡核苷酸来控制。最后一个控制点是与核糖体结合和翻译启动。 通过RNA干扰控制细胞内的RNA水平，使用内源性（例如miRNA）或外源性（例如siRNA）双链RNA模板，针对特定的mRNA序列进行降解。人工合成的RNA分子（短发夹RNA，是人工miRNA模拟物）可以用来利用这个系统，选择性地针对mRNA分子进行降解（见图11）。 图11 寡核苷酸对基因表达的控制。(A) siRNA是由两个互补的20-21个核苷酸链组成的双链RNA分子，设计用于在退火后在3'端留下1-2个核苷酸的悬垂。Dicer蛋白复合体处理siRNA，并根据它们的物理性质结合一条链并降解另一条。任何能与选定链配对的mRNA序列都会被降解。人工siRNA分子被设计来强制选择非编码链。(B) 另一种设计是gapmer反义寡核苷酸（gASOs），由一个DNA核心和人工核苷酸组成。人工核苷酸对核酸酶具有抵抗力，并且对RNA具有高亲和力。当gapmer ASO与其靶RNA退火时，DNA核心形成一个DNA/RNA异源双链，从而招募RNaseH并标记目标RNA进行降解。gASOs对核酸酶的抵抗力允许其在细胞质中持久存在并产生持久的反应。 反义寡核苷酸（ASO）是设计用来与细胞内特定RNA目标配对的短核酸序列。通常，ASOs由具有增加稳定性的修饰核苷酸组成，经常包括人工核苷酸类似物，如吗啉和锁定/桥接核酸。ASOs可以以多种方式操纵mRNA的转录后命运，但这里我们将主要关注RNase H靶向（见图11）。剪接切换寡核苷酸（SSO）旨在与pre-mRNA序列中的剪接位点或剪接增强子/抑制子配对，并指导目标基因的替代剪接。RNA ASOs设计用来与5′或3′非翻译区（UTR）内的序列配对，可以抑制或增强mRNA翻译。 在这里，我们将讨论一些关键的RNA干扰和基于SSO的治疗示例，这些治疗最近已经通过临床试验，现在被用于治疗罕见病。特别是，我们将看看家族性转甲状腺素淀粉样变性（FTA）和脊髓性肌肉萎缩症（SMA）。 5.1.家族性转甲状腺素淀粉样变性：Onpattro RNAi和Tegsedi ASO 家族性转甲状腺素淀粉样变性是一种罕见的遗传性疾病，涉及转甲状腺素（TTR）基因，导致蛋白质错误折叠。错误折叠的蛋白质形成淀粉样物质，沉积并损害组织。这是一个缓慢渐进的过程，因此症状通常在成年后开始。确切的发病年龄是可变的，并且与疾病的进展有关。外周神经系统特别容易受损，因此神经病变是早期症状之一，但随着疾病的进展，眼睛、肾脏、心脏和中枢神经系统通常也会受到影响。FTA最终是致命的，平均在症状出现后10年内，发病年龄越小，疾病越具侵袭性。早期心脏受累的患者的预后极差。很少有患者能存活超过5年。 从遗传学上讲，FTA突变是常染色体显性遗传，但进展和外显率取决于确切的遗传缺陷。大多数患者是杂合子。FTA的全球患病率大约是1/10,000，尽管在某些种族群体或人群中观察到聚集，如葡萄牙、瑞典、日本和西非的某些地区。 目前治疗FTA的金标准是肝脏移植，因为肝脏是TTR的主要来源。肝脏移植可以阻止多发性神经病的发展，减慢但不能完全防止眼睛、心脏和肾脏的进行性退化。 在过去几年中，FDA批准了两种基于寡核苷酸的治疗药物用于FTA：Patisiran（Onpattro）和Inotersen（Tegsedi）。Onpattro是一种稳定的核酸脂质颗粒（SNALP）配方，含有针对TTR的短干扰RNA（siRNA—见图11）。Onpattro是新一代siRNA，使用DNA悬垂（dTdT）而不是RNA（UU），增加RNA抵抗力，效果更持久。此外，Onpattro在正义链上的大部分U和C残基被甲基化，以促进siRNA的正确链被纳入RISC（RNA诱导的沉默复合物）组装。Onpattro旨在靶向TTR转录本的3′非翻译区（UTR），并将抑制突变型和野生型形式的表达。这是可取的，因为一旦形成错误折叠的聚集体，它们可以诱导甚至野生型蛋白的错误折叠和沉积。Onpattro SNALP的配方由胆固醇和磷脂的1:1混合物组成。磷脂具有强烈的正电荷（阳离子与中性的比例为4:1），以促进与siRNA的复合物形成。使用的阳离子磷脂中有5%附有PEG2000（聚乙二醇2000MW）聚合物，形成鞘层，大大延长了SNALP的血浆半衰期。血浆中的脂质纳米颗粒通常被ApoE修饰，尽管有PEG鞘层，并且只在具有筛状内皮的组织中有效渗出；因此，它们自然靶向肝脏。在ApoE导向的内化后，SNALP与带负电荷的内体膜之间的正电荷相互作用，介导内体逃逸，将siRNA传递到细胞质中。SNALP的长半衰期和RISC组装的持久性，允许效果持续数天。 Onpattro在抑制TTR表达方面非常有效。在临床试验中，发现表达在5天内减少超过70%，并至少在20天内保持在这个水平以下。每3周输注一次Patisiran，持续18个月，几乎所有实现持续TTR抑制的患者都停止了疾病的进展。在疾病的多发性神经病和心肌病方面也观察到了小但显著的改善。对Onpattro的不良反应主要与脂质体配方的输注有关。严重的不良反应很少见。 Tegsedi是一种依赖RNaseH的GAPmer ASO配方（见图11），也针对TTR 3′UTR。内部DNA核心具有磷酸硫酯键，使其具有很强的抗降解能力，但也可能导致毒性。为了掩盖磷酸硫酯的毒性，中心核心两侧各有一个由五个2'-O-甲氧基乙基核苷酸残基组成的区域，这些残基也具有抗降解性。整个20-mer寡核苷酸与TTR 3′UTR中的目标序列互补，并且足够稳定，可以通过肌肉注射盐水制剂的方式输送，而不需要脂质体配方。ASO进入循环系统，并被各种组织中的细胞积极吸收，肝脏是主要场所。在临床试验中，患者在第一周接受了三次Inotersen注射，然后每周注射一段时间，持续64周。在第一周末，血浆TTR水平降低了约70%，并在整个64周期间保持在这个水平。像Onpattro一样，Tegsedi在整个治疗期间有效地停止了疾病的进展，尽管不同患者群体之间存在差异。 控制基因表达水平在关闭功能增益突变体方面至关重要。像其他基于核酸的疗法一样，一旦输送方法被优化，它可以被重新用于任何有效载荷。例如，研究脂质体siRNA输送为BioNTech和Moderna的SARS-CoV2 mRNA疫苗铺平了道路。 5.2.脊髓性肌肉萎缩症：Spinraza剪接切换寡核苷酸 脊髓性肌肉萎缩症是儿童遗传死亡的最常见原因，大约每10000例活产中有1例。它是由运动神经元存活1（SMN1）基因的失功能突变引起的。它是常染色体隐性的，表型的严重程度与高度相关的，但只有部分功能的SMN2基因的拷贝数和表达水平成反比。SMA是一种系统性疾病，由于SMN在全身表达，但下运动神经元对SMN功能的丧失特别敏感。 SMN2与SMN1有几个核苷酸的差异。关键是它以不同的方式进行剪接，通常有85%-90%的转录本通常跳过外显子7。截断的蛋白质异构体不稳定，迅速降解。SMN2在开发SMA的基于寡核苷酸的治疗中被证明是关键。Nusinersen（Spinraza）是一种SSO，旨在防止SMN2基因产物中外显子7的切除，从而增加全长、稳定的SMN蛋白的产生。20-mer SSO寡核苷酸由2'-O-甲氧基乙基（2MOE）核苷酸组成，这些核苷酸抵抗降解，更有效地配对，增强内含子剪接沉默子-N1（ISS-N1）的抑制。这种寡核苷酸直接通过腰穿注射到脊髓中。最初，给予少量频繁的注射以快速建立稳态，然后是更不频繁的维持剂量。在最近的临床试验中，调理方案是每两周三次剂量，然后是每4个月一次的维持方案。Spinraza在婴儿期发病的SMA（类型I）中证明非常有效，在生存和运动里程碑的实现方面取得了显著的改善，一些婴儿发展了在这种疾病的自然史中从未见过的技能。不良事件的发生率很高，但大多与这个脆弱的患者群体中复杂的脊髓注射程序有关。 Onpattro、Tegsedi和Spinraza等例子代表了寡核苷酸治疗领域的重要的里程碑，它们展示了在没有稳定遗传修饰的情况下，对基因表达进行持续、有效、直接控制的可能性。 5.3.寡核苷酸与病毒载体基因疗法的比较：Spinraza与Zolgensma Spinraza存在一个病毒载体基因疗法的替代品，这提供了一个独特的机会，可以直接比较这两种方法的有效性。Zolgensma（Onasemnogene Abeparvovec）是一种基于AAV的基因补充治疗，旨在通过单剂量直接和永久地恢复SMN1表达。Zolgensma表达盒的设计类似于Luxturna（见图5），使用混合的CMV-鸡β-肌动蛋白启动子来驱动SMN1 cDNA的表达。为了增强表达，设计中包含了一个人工内含子（来自SV40）和密码子优化。AVXS-101（Zolgensma的载体）的序列是专有的，确切的优化不在公共领域，但是通过使用类似的AAV9平台，已经证明了这种方法的有效性。采用了自互补设计（见图12），其中一个侧翼ITR是一个特别设计的变体，用于合成基因组二聚体，而不是单体。这种设计的优点在于它可以加速转基因表达，无需DNA合成，这可能是单链AAV载体的限速步骤。 图12 自互补AAV载体的生成。可以通过使用突变的ITR（蓝色，右图）来产生表达动力学更快的AAV变体，以破坏末端解决。因此，两条链未能分离，而是通过突变的ITR连接在一起。完整的病毒基因组仍然由正常的ITRs所环绕，因此它可以被复制和包装。一旦在宿主细胞中释放，两条链可以重新结合形成标记为(*)的结构。这种结构不依赖于第二链合成在细胞内稳定它并启动转基因表达。 Zolgensma在临床试验中表现非常好，显示出高反应率和显著的症状缓解。在SPR1NT 3期试验中，所有14名参与者都达到了无需辅助坐立的主要终点，其中11名和10名分别能够站立和行走。23名未接受治疗的SMA患者中没有一个达到这些发育里程碑。令人印象深刻的是，相当数量的儿童（根据终点不同，40%-80%）在规定的发育时间内达到了里程碑。运动评估显示，所有儿童在给药后迅速改善，并达到了正常分数的至少80%。通常，SMA儿童平均只达到正常分数的40%，并且随着年龄的增长，他们的分数会下降，而不是提高。所有儿童在研究期间都避免了机械通气的需要，13名儿童不需要辅助喂养。其他研究也证实了这些收益是持久的。这些结果与Spinraza相比是有利的。 实际上，Bitetti等人研究了之前接受Spinraza治疗的儿童，发现Zolgensma帮助儿童取得了进一步的收益，对Spinraza反应较差的儿童受益最大。这种改善反应的一个重要因素可能是Zolgensma提供的全身治疗，而Spinraza是通过鞘内注射给药，预期的直接有益效果应限于CNS。 尽管目前证据表明，与Spinraza相比，Zolgensma具有更高的疗效和反应率，但使用AAV9已经出现了安全问题。观察到两种常见的严重不良事件，肝毒性和血小板减少症。尽管这些不良效应在临床试验中是自限性的，但随后对临床数据的荟萃分析证实，大多数患者显示出肝损伤的证据，尽管这对类固醇治疗反应良好。2021年，Thomsen等人报告了两名接受Zolgensma治疗但因与治疗无关的原因死亡的婴儿的SMN1表达。在中枢神经系统容易观察到SMN1表达，但也在几个外周器官中，特别是在肝脏中，表达比CNS高出2-3个数量级。尽管AAV9载体肝毒性的原因尚不完全清楚，但对类固醇治疗的反应表明，它可能与对载体的免疫反应有关。遗憾的是，最近接受Zolgensma治疗的两名患者死于急性肝衰竭。两起死亡都发生在治疗后几周，就在皮质类固醇逐渐减少后。针对其他适应症的AAV载体的临床试验也出现了类似的严重不良事件，包括高载体剂量时的死亡。虽然Zolgensma迄今为止已经用于2300多人，但这些发现再次强调了需要更好地理解和控制病毒载体嗜性和相关的免疫反应，以开发更安全的治疗。 正如从Luxturna学到的教训预计将大大减少靶向视网膜病变所需的工作量一样，Zolgensma也将有助于开发其他针对中枢神经系统的基因疗法，从而为基因疗法治疗RDs的适用性提供进一步的证据。此外，随着这些方法被纳入主流临床实践，开发和生产成本的降低，我们可以预期治疗成本将从目前高价格标签显著降低。 6.结论和未来展望 在这篇综述中，我们通过一些成功临床应用的具体例子来展示基因疗法能够实现什么，以及它如何已经在帮助解决治疗罕见病的挑战。自从基因疗法首次被提出作为一种可能的治疗途径以来，大约已经过去了50年，这表明将一个新概念实施到临床实践中可能会多么复杂。一些获得许可的疗法符合最初的模式（基因补充以挽救遗传缺陷），但许多并非如此，因为它们涉及最近发现和适应的机制途径，如双链RNA干扰、剪接调节和外显子跳跃。在所有同种异体骨髓移植的累积经验基础上，用体外基因疗法治疗SCID取得了显著的初步成功，展示了现有临床实践对于实施新技术的重要性。将基因疗法应用于某些类型的SCID为开发针对其他免疫缺陷的临床基因疗法铺平了道路，并且还针对血液系统的其他疾病，如β-地中海贫血，从而展示了治疗策略如何能够相对快速地适应同一组织的不同类型的疾病。此外，血液细胞体外修饰技术的进步也带来了意想不到的成功，如CAR-T细胞。AAV9载体的类似扩展正在进行中，它们可以通过血管内输送穿过血脑屏障治疗CNS的遗传性疾病，正如首次用Zolgensma治疗SMA时所证明的那样。对于那些有兴趣追踪全球市场上的基因（和细胞）疗法的人来说，国际干细胞研究会维护了一个最新的地图。但请注意，这个资源不包括寡核苷酸疗法，因为它们在技术上不被FDA或EMA的先进治疗药物认为是基因疗法。 基因疗法技术在疫苗领域的应用，在抗击COVID-19方面取得了巨大的成功，基于mRNA和腺病毒的配方在创纪录的时间内被开发出来，并用于免疫世界上很大一部分人口。这些平台现在正在被探索用于疫苗学和罕见病治疗的其他应用，前景非常看好。 我们的讨论集中在基因疗法的一些临床成功上。因此，我们没有深入讨论尚未完全临床实施的其他基因疗法方法的最新进展。然而，为了结束我们的综述，我们简要引用了一些可能推动该领域前进的最新进展。这些包括合成病毒学、脂质纳米颗粒和膜活性肽作为关键的研究发展领域。同样，为了改变嗜性，AAV衣壳工程已经投入了大量资源，并且开始为体内靶向治疗提供优化的AAV血清型。然而，要结束这篇综述，很明显基因组编辑技术无疑是未来最有前途的治疗策略。 基于短合成RNA的CRISPR/Cas酶的可访问工程，极大地促进了通过包括indel介导的敲除、同源依赖修复、先导编辑、碱基编辑和转录的表观遗传调控在内的各种方法，在基因组中引入明确定义的遗传和表观遗传修饰。实际上，最近在转甲状腺素淀粉样变性、镰状细胞病和β-地中海贫血中使用CRISPR的临床试验为该技术及其为患者带来好处的激动人心的潜力提供了非常有希望的证明。

– Strong revenue performance, supporting increase in full-year revenue guidance to $750-800 million – – Regulatory filings for sepiapterin, Translarna™ and AADC gene therapy under review by FDA – – On track to achieve remaining 2024 clinical and regulatory milestones, including NDA submission for vatiquinone – WARREN, N.J., Nov. 7, 2024 /PRNewswire/ -- PTC Therapeutics, Inc., (NASDAQ: PTCT) today announced a corporate update and financial results for the third quarter ending September 30, 2024. "I am proud of our team's strong execution," said Matthew Klein, M.D., Chief Executive Officer. "We continue to achieve excellent revenue performance allowing us to raise full-year revenue guidance. In addition, we have submitted three approval applications to FDA so far this year, all of which have been accepted for review, and plan a fourth submission for vatiquinone for Friedreich ataxia in December. We are on our way to accomplishing all of our 2024 objectives and are in a strong financial position to execute on our long-term strategic plans." Key Corporate Updates: Third quarter 2024 total revenue of $197 million Third quarter 2024 revenue for the DMD franchise was $124 million Translarna™ (ataluren) net product revenue was $72 million, driven by continued access for patients in existing geographies, continued geographic expansion, high compliance and adherence, and dose adjustments. Emflaza® (deflazacort) net product revenue was $52 million, driven by new patient starts, continued brand loyalty, high compliance and adherence, and dose adjustments. Key Clinical and Regulatory Milestones: PTC submitted an NDA to the FDA for sepiapterin for the treatment of PKU. The file was accepted for review, and the regulatory action date is set for July 29, 2025. PTC resubmitted the NDA for Translarna for the treatment of nmDMD; the file was accepted, and a regulatory action date was not provided. The BLA for PTC's gene therapy for AADC deficiency remains on schedule for a regulatory action date of November 13, 2024. PTC received Fast Track Designation for the PTC518 Huntington's disease program. PTC plans to submit an NDA for vatiquinone for the treatment of Friedreich ataxia in December 2024. PTC expects to share topline data for the CardinALS trial of utreloxastat for the treatment of ALS in the fourth quarter of 2024. Third Quarter 2024 Financial Highlights: Total revenues were $196.8 million for the third quarter of 2024, compared to $196.6 million for the third quarter of 2023. Total revenue includes net product revenue across the commercial portfolio of $135.4 million for the third quarter of 2024, compared to $144.0 million for the third quarter of 2023. Total revenue also includes royalty and manufacturing revenue of $61.4 million in the third quarter of 2024, compared to $52.5 million for the third quarter of 2023. Translarna net product revenues were $72.3 million for the third quarter of 2024, compared to $69.0 million for the third quarter of 2023. Emflaza net product revenues were $51.9 million for the third quarter of 2024, compared to $67.4 million for the third quarter of 2023. Roche reported Evrysdi® 2024 year-to-date sales of approximately CHF 1.2 billion, resulting in royalty revenue of $61.4 million to PTC for the third quarter of 2024, compared to $50.2 million for the third quarter of 2023. Based on U.S. GAAP (Generally Accepted Accounting Principles), GAAP R&D expenses were $161.4 million for the third quarter of 2024, compared to $164.2 million for the third quarter of 2023. The decrease in research and development expenses reflects strategic portfolio prioritization, as PTC continues to focus its resources on its differentiated, high-potential R&D programs. Included in third quarter 2024 R&D expense is $50.0 million in regulatory success-based milestones related to the Censa acquisition. Non-GAAP R&D expenses were $152.0 million for the third quarter of 2024, excluding $9.4 million in non-cash, stock-based compensation expense, compared to $150.2 million for the third quarter of 2023, excluding $14.0 million in non-cash, stock-based compensation expense. GAAP SG&A expenses were $73.5 million for the third quarter of 2024, compared to $80.9 million for the third quarter of 2023. The decrease in selling, general and administrative expenses reflects lower employee costs as a result of the reduction in workforce in 2023. Non-GAAP SG&A expenses were $63.1 million for the third quarter of 2024, excluding $10.3 million in non-cash, stock-based compensation expense, compared to $67.9 million for the third quarter of 2023, excluding $13.0 million in non-cash, stock-based compensation expense. Change in the fair value of deferred and contingent consideration was a loss of $0.7 million for the third quarter of 2024, compared to a loss of $1.5 million for the third quarter of 2023. Tangible asset impairment and losses (gains) on transactions, net, was a loss of $1.8 million for the third quarter of 2024, compared to $0.0 million for the third quarter of 2023. These results were primarily related to fixed asset impairments. Net loss was $106.7 million for the third quarter of 2024, compared to net loss of $133.0 million for the third quarter of 2023. Cash, cash equivalents, and marketable securities was $1,013.4 million on September 30, 2024, compared to $876.7 million on December 31, 2023. Shares issued and outstanding as of September 30, 2024, were 76,952,124. PTC Updates Full Year 2024 Financial Guidance: PTC anticipates total revenues for full year 2024 to be between $750 million and $800 million. PTC anticipates GAAP R&D and SG&A expenses for full year 2024 to be between $740 million and $835 million, including expected R&D expense milestone payments of up to $65 million. PTC anticipates non-GAAP R&D and SG&A expenses for full year 2024 to be between $660 million and $755 million, including expected R&D expense milestone payments of up to $65 million and excluding estimated non-cash, stock-based compensation expense of $80 million. PTC anticipates up to $90 million of payments for full year 2024 upon achievement of potential regulatory success-based milestones from previous acquisitions, of which up to $65 million will be recorded as R&D operating expenses. As of September 30, 2024, $85 million in milestones have been achieved, of which $65 million has been recorded as R&D operating expenses and $20 million as contingent consideration payable. Non-GAAP Financial Measures: In this press release, the financial results of PTC are provided in accordance with GAAP and using certain non-GAAP financial measures. In particular, the non-GAAP R&D and SG&A expense financial measures exclude non-cash, stock-based compensation expense. These non-GAAP financial measures are provided as a complement to financial measures reported in GAAP because management uses these non-GAAP financial measures when assessing and identifying operational trends. In management's opinion, these non-GAAP financial measures are useful to investors and other users of PTC's financial statements by providing greater transparency into the historical and projected operating performance of PTC and the company's future outlook. Non-GAAP financial measures are not an alternative for financial measures prepared in accordance with GAAP. Quantitative reconciliations of the non-GAAP financial measures to their respective closest equivalent GAAP financial measures are included in the table below. Acronyms: AADC: Aromatic l-Amino Acid Decarboxylase ALS: Amyotrophic Lateral Sclerosis BLA: Biologics License Application CHF: Confoederatio Helvetica Francs (Swiss francs) DMD: Duchenne Muscular Dystrophy FA: Friedreich Ataxia FDA: U.S. Food and Drug Administration GAAP: Generally Accepted Accounting Principles HD: Huntington's Disease NDA: New Drug Application nmDMD: Nonsense Mutation Duchenne Muscular Dystrophy PKU: Phenylketonuria R&D: Research and Development SG&A: Selling, General, and Administrative Today's Conference Call and Webcast Reminder: To access the call by phone, please click here to register and you will be provided with dial-in details. To avoid delays, we recommend participants dial in to the conference call 15 minutes prior to the start of the call. The webcast conference call can be accessed on the Investor section of the PTC website at . A replay of the call will be available approximately two hours after completion of the call and will be archived on the company's website for 30 days following the call. About PTC Therapeutics, Inc. PTC is a global biopharmaceutical company focused on the discovery, development and commercialization of clinically differentiated medicines that provide benefits to children and adults living with rare disorders. PTC's ability to globally commercialize products is the foundation that drives investment in a robust and diversified pipeline of transformative medicines and our mission to provide access to best-in-class treatments for patients who have an unmet medical need. The company's strategy is to leverage its strong scientific expertise and global commercial infrastructure to maximize value for its patients and other stakeholders. To learn more about PTC, please visit us at and follow us on Facebook, X, and LinkedIn. For More Information: Investors: Ellen Cavaleri +1 (615) 618-6228 [email protected] Media: Jeanine Clemente +1 (908) 912-9406 [email protected] Forward-Looking Statements: This press release contains forward-looking statements within the meaning of The Private Securities Litigation Reform Act of 1995. All statements contained in this release, other than statements of historic fact, are forward-looking statements, including the information provided under the heading "PTC Updates Full Year 2024 Financial Guidance", including with respect to (i) 2024 total revenue guidance, (ii) 2024 GAAP and non-GAAP R&D and SG&A expense guidance and (iii) 2024 acquisition related milestone payment guidance, and statements regarding: the future expectations, plans and prospects for PTC, including with respect to the expected timing of clinical trials and studies, availability of data, regulatory submissions and responses, commercialization and other matters with respect to its products and product candidates; PTC's strategy, future operations, future financial position, future revenues, projected costs; the extent, timing and financial aspects of our strategic pipeline prioritization and reductions in workforce; and the objectives of management. Other forward-looking statements may be identified by the words, "guidance", "plan," "anticipate," "believe," "estimate," "expect," "intend," "may," "target," "potential," "will," "would," "could," "should," "continue," and similar expressions. PTC's actual results, performance or achievements could differ materially from those expressed or implied by forward-looking statements it makes as a result of a variety of risks and uncertainties, including those related to: the outcome of pricing, coverage and reimbursement negotiations with third party payors for PTC's products or product candidates that PTC commercializes or may commercialize in the future; PTC's ability to maintain its marketing authorization of Translarna for the treatment of nmDMD in Brazil, Russia, the European Economic Area (EEA) and other regions, including whether the European Commission adopts the negative opinion from the Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) for the conditional marketing authorization for Translarna in the EEA, or PTC's ability to identify other potential mechanisms by which it may provide Translarna to nmDMD patients in the EEA; PTC's ability to use the clinical data from its international drug registry study and real-world evidence concerning Translarna's benefits to support a continued marketing authorization for Translarna for the treatment of nmDMD in the EEA; PTC's ability to use the results of Study 041, a randomized, 18-month, placebo-controlled clinical trial of Translarna for the treatment of nmDMD followed by an 18-month open-label extension, and from its international drug registry study to support a marketing approval for Translarna for the treatment of nmDMD in the United States; whether investigators agree with PTC's interpretation of the results of clinical trials and the totality of clinical data from its trials in Translarna; expectations with respect to Upstaza, including any regulatory submissions and potential approvals, commercialization, manufacturing capabilities, the potential achievement of development, regulatory and sales milestones and contingent payments that PTC may be obligated to make; expectations with respect to sepiapterin, including any regulatory submissions and potential approvals, commercialization, the potential achievement of development, regulatory and sales milestones and contingent payments that PTC may be obligated to make; expectations with respect to the commercialization of Evrysdi under PTC's SMA collaboration; expectations with respect to the commercialization of Tegsedi and Waylivra; the timing of and actual expenses incurred in connection with the discontinuation of PTC's preclinical and early research programs in gene therapy and reductions in workforce, which may be in different periods and may be materially higher than estimated; the savings that may result from the discontinuation of PTC's strategic pipeline prioritization and reductions in workforce, which may be materially less than expected; significant business effects, including the effects of industry, market, economic, political or regulatory conditions; changes in tax and other laws, regulations, rates and policies; the eligible patient base and commercial potential of PTC's products and product candidates; PTC's scientific approach and general development progress; PTC's ability to satisfy its obligations under the terms of its lease agreements; the sufficiency of PTC's cash resources and its ability to obtain adequate financing in the future for its foreseeable and unforeseeable operating expenses and capital expenditures; and the factors discussed in the "Risk Factors" section of PTC's most recent Annual Report on Form 10-K, as well as any updates to these risk factors filed from time to time in PTC's other filings with the SEC. You are urged to carefully consider all such factors. As with any pharmaceutical under development, there are significant risks in the development, regulatory approval and commercialization of new products. There are no guarantees that any product will receive or maintain regulatory approval in any territory, or prove to be commercially successful, including Translarna, Emflaza, Upstaza, Evrysdi, Tegsedi, Waylivra or sepiapterin. The forward-looking statements contained herein represent PTC's views only as of the date of this press release and PTC does not undertake or plan to update or revise any such forward-looking statements to reflect actual results or changes in plans, prospects, assumptions, estimates or projections, or other circumstances occurring after the date of this press release except as required by law. SOURCE PTC Therapeutics, Inc. 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