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摘要接种疫苗是预防传染病最重要的手段之一。随着时间的推移，依据抗原成分，许多不同类型的疫苗已被开发。佐剂是提高疫苗接种效果的基本成分，尤其是其作为免疫反应的载体、储存库和刺激物等时，发挥的作用有所差异。多年来，疫苗中很少使用佐剂，而铝盐是最常用的佐剂。然而，近年来的研究集中在许多不同的新化合物上，其具有有效佐剂特性和高安全性。纳米技术和分子生物学等现代技术强有力地运用于抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的功效。目前，在疫苗生产中微粒、乳剂和免疫刺激物因有巨大潜力而备受关注。尽管一些研究报告了疫苗佐剂潜在的一些副作用，例如最近发现的ASIA，但疫苗的巨大价值仍然是毋庸置疑的。事实上，最近的COVID-19大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行病方面。在这一领域，对佐剂的研究在生产愈发有效的疫苗中发挥主导作用。关键词：疫苗接种，佐剂，现代技术，未来展望。1.引言疫苗接种无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在短短的两个多世纪，疫苗使我们能够实现不同寻常的目标，例如彻底消灭天花，在世界大部分地区消灭小儿麻痹症，以及在一些国家大幅度降低许多传染病的死亡率和发病率。在世界上许多地方疫苗接种政策是公共卫生的基石，安全有效的疫苗受到人们极大的关注。疫苗的效力不仅取决于抗原成分，还取决于佐剂，其以一种更有效的方式刺激免疫系统。佐剂被定义为添加到疫苗中的成分，以改善对抗原的免疫反应。此外，佐剂有几个优点，如减少每剂疫苗的抗原量和疫苗接种次数，在某些情况下，它们增加抗原成分的稳定性，延长其半衰期并间接提高其免疫原性。现有许多不同类型的佐剂用于疫苗生产（表1）。表1 根据佐剂的主要作用机制分类佐剂根据不同的标准进行分组，例如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最受关注的分类系统之一是基于其作用机制，将其分为两大类:递送系统(颗粒)和免疫增强剂。另一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前面的佐剂具有某些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与佐剂相结合，特别是作为抗原载体。此外，它们能够通过激活先天免疫系统诱导局部促炎反应，导致免疫细胞募集到免疫部位。确切地说，抗原-佐剂复合物通过病原体相关分子模式(PAMPs)激活模式识别受体(PRR)途径。这引起先天免疫细胞的激活，伴随有细胞因子和趋化因子的产生。同样的途径被免疫增强剂直接激活（图1）。图1 佐剂的作用机制添加佐剂对老年人使用的疫苗特别有效，因为这类受试者会出现免疫衰老的生理现象，它在自然感染或人工刺激(接种疫苗)后导致免疫反应减弱。在这种情况下，佐剂的存在可使疫苗克服这一限制。而且，佐剂对亚单位疫苗特别有用，因为亚单位疫苗通常免疫原性弱，无法单独刺激强烈的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如获得认证的脑膜炎球菌结合疫苗不含佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。表2列出了目前认证的佐剂疫苗。表2 当前通过FDA和EMA认证的人用佐剂疫苗如表所示，目前绝大多数由EMA和FDA批准的人用疫苗都包括铝盐佐剂。鉴于这些佐剂是疫苗配方中使用最早的佐剂，为了提高疫苗的安全性和有效性，增加新佐剂的数量是绝对必要的，因此，有必要加强对具有佐剂特性的新分子和因子的研究，增加体外和体内研究的数量。与此同时，由于佐剂的使用和研究、新细胞底物的使用或工艺变更或转移申请方面的监管挑战，新产品的批准可能会受到延迟和提高成本。这方面可能成为抑制新奇事物、增加成本和延迟疫苗适用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。此外，2019冠状病毒病大流行凸显了获得有效疫苗以应对新的大流行潜在威胁的重要性。事实上，COVID-19的RNA疫苗具有内在佐剂特性，其与编码RNA载体的脂质体成分相关。然而，最新认证的COVID-19疫苗是基于含有刺突蛋白的经典平台，并添加了一种名为Matrix-M的新佐剂，该佐剂含有皂角提取物的成分A和C。在选择疫苗佐剂时需要考虑很多方面，其中安全性是第一位。一种好的佐剂必须是安全的，耐受性好，易于生产的；具有良好的药学特性(pH值、渗透压、内毒素水平等)以及保质期长；最后，在经济上可行。在不影响佐剂安全性的前提下兼顾所有这些特性是很困难的。因此，目前使用的疫苗中佐剂应用较少。尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来，人们对这些产品产生了许多担忧。一种反对疫苗的文化即“疫苗犹豫”已在世界范围内蔓延。2019冠状病毒病(COVID-19)大流行刺激了“疫苗犹豫”，它一方面表明了疫苗接种作为抵抗传染病基本武器的重要性，但另一方面也凸显了一部分人的犹豫行为。许多研究已报道了造成这种态度的几个原因，但许多研究表明，最主要的原因是疫苗副作用的恐惧和疫苗组成的不信任，特别是佐剂是一种比其他成分更能引起公众关注的成分。事实上，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，其通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑，轻微的全身不适和流感样症状，这些影响通常在接种疫苗几小时或几天后消失，很少有过敏反应或其他严重副作用的病例报道。这篇综述评价了当前使用的疫苗佐剂，评估正在进行关于佐剂的特性和未来可能使用的研究，强调科学文献中存在的潜在问题和副作用的依据。2.递送系统2.1 矿物盐铝盐20世纪20年代发现了铝盐的佐剂特性，1926年人们开始用这些化合物作为疫苗佐剂。最初考虑在培养基中添加铝盐，以便诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，从而帮助其纯化。然而，其结果表明，铝沉淀抗原比可溶性抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长和最常用的佐剂，目前认证的疫苗中约有三分之一含有铝。因此，铝盐是疫苗佐剂中安全性测试最多的佐剂。人类通过不同的途径接触到铝，尤其是食物和空气。它主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后进行扩散，然后经过三步排除过程，可是这一过程永远不会完成。低于3%的吸入铝和1%的摄入铝扩散到整个生物体。然而，在人体中发现95%的铝通过受污染的食物摄入的。世界卫生组织(WHO)规定通过食物摄入铝的最高水平应为1mg/kg/d(成人为60至70mg/d)。最后，铝包含在肠外溶液内，因此，通过注射扩散到血液和各种体液区室，在这种情况下，为了避免铝的积累，其在静脉注射溶液中的浓度应<25g/L。铝一旦被生物体吸收，在人体组织中扩散。大部分金属储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。对于患有慢性肾病的人来说，铝不能被清除，并随着时间的推移而积累，尤其是在骨骼和神经系统中积累。在这类病人中高水平的铝会沉积在大脑中引起脑病。在大鼠体内注射同位素铝-26 (26Al)后其精确地量化了铝对大脑的渗透。在生理条件下，铝的脑渗透被量化为每克脑组织的0.001%～0.005%，这与给药途径和化学形式无关。2010年Goullé等量化了人组织中铝水平，其应用电感耦合等离子体与质谱检测相结合的技术对20例已故患者进行分析，这些患者以前没有接触过金属，也没有接受过任何含铝或其他微量矿物质的治疗，以湿重表示的中位数结果如下:肺=0.47g/g，脑=0.19g/g，肝脏=0.15g/g，心脏=0.10g/g，肌肉=0.08g/g和肾脏=0.06g/g。铝主要通过泌尿系统被生物体缓慢排出。有些铝会永久沉积在人体内，其含量会随着接触程度和年龄的增加而增加。在成年人体内永久沉积铝的量约为30～50mg。在疫苗中铝以结晶氢氧化铝(AlH)复杂聚合物或无定形羟磷酸铝(AlP)的簇状纳米颗粒形式存在。AlH呈针状纳米颗粒(Ø20nm)，而AlP在透射电镜下呈网状。这两种形式通常溶于柠檬酸盐，但AlP比AlH更易溶解。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附到佐剂颗粒表面。铝盐抗原结合增强抗原提呈细胞(APCs)对抗原的摄取和提呈。而且，铝盐刺激NLRP3炎症小体的作用，导致IL-1β和IL-18的产生，引起局部炎症和APCs的募集。许多疫苗是抗原吸附在AlH或AlP上(例如，白喉和破伤风疫苗、无细胞百日咳疫苗、乙型肝炎疫苗以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗)。因为它们的免疫原性弱，需要增强免疫反应，以便引起有效的疫苗接种。在欧洲，《欧洲药典》规定疫苗中的铝含量最高不超过1.25mg/剂。在美国，《美国联邦法规》规定生物制品(包括疫苗)中的铝含量为0.85mg/剂。铝主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物盐的形式存在于食物中，而无机铝化合物的佐剂是难溶的，这是佐剂作用方式的一部分。因此，由于铝在生理pH值下的溶解度较差，肌肉注射或皮下注射后疫苗中铝的吸收率预计会非常慢。为了评估肌肉注射后铝的动力学，Flarend等人进行了一些体内研究，通过肌肉注射26Al标记的AlH和AlP，其总铝剂量为0.85 mg，实验28天内AlH吸收率为17%，AlP吸收率为51%。26Al的最大血清浓度(Cmax)是2µg/L，即家兔铝的正常值(30µg/L)为7%。基于这些结果，肌内注射铝盐疫苗佐剂后铝Cmax的预期增加量为0.04µg/L，即平均血铝水平5 µg/L的0.8%。在本试验中，大脑中的铝水平浓度在10 - 8～10 - 7mg/g之间，即10−5～10−4µg/g，因此<0.0001µg/g，这比人脑中0.2µg/g的平均浓度低2000多倍。此外，一些研究评估了注射柠檬酸26Al后人体内铝的排泄情况。一项相当古老的研究表明，静脉注射26柠檬酸铝后，59%的注射剂量在一天内随尿排出，随后几天排出速度变慢(第5天平均滞留率为27%)，而最近的一项研究表明，在注射铝剂8年后，残留率约为2%。铝的毒性仅次于体液和组织中增加的金属水平。特别是当肾功能受损时，这种增加是排除它的能力而改变的。尤其血液透析的肾功能衰竭患者具有较高的铝水平，伴随可能的神经毒性风险。肾移植能够解决铝的过剩，并可能解决相关的神经毒性。多年来，科学家们一直在争论神经退行性疾病可能是铝致神经毒性，到目前为止，还没有确凿的证据表明，这一作用仍然存在争议。铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型和人体中进行了研究。在体外对细菌进行了一些研究，显示铝不存在致突变性，此外，使用对氧化诱变剂敏感的菌株后，对铝的氧化作用模式产生了疑问。在体外对细胞系进行了研究，以评估不同形式的铝可能的遗传毒性。研究人员在细胞系进行评估不同形式的铝可能引起的遗传毒性。一些科学家使用多个供体的淋巴细胞在动物模型中进行胚胎毒性研究，最后，在体内进行各种研究。在这些研究中最常用的技术是彗星试验和微核试验。有趣的是，研究结果往往不一致和相互矛盾，这可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尽管铝盐能够产生或多或少强烈的氧化应激，但仍不能肯定地说(在推荐剂量下)用作佐剂的铝盐会有毒性作用。2.2 乳剂这一类重要佐剂的前身是完全和不完全的弗氏佐剂。这两种佐剂都是油包水乳剂，其能够提呈抗原并刺激先天免疫系统。在其构造中完全弗氏佐剂(CFA)包括热杀死的分枝杆菌，它增强了刺激免疫反应，目前其诱导小鼠强烈的免疫激活和自身免疫(如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎)。然而，CFA能够引起强烈的和持久的局部炎症，这可能导致动物明显的疼痛，并可能在注射部位发生溃疡。不完全弗氏佐剂(IFA)不含分枝杆菌，在20世纪50年代被用作人流感疫苗的佐剂，与无佐剂的相同疫苗相比，它可以诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性是基于油性抗原沉积的特征，抗原在注射部位持续释放，这同时导致抗原寿命的增加以及强烈的局部先天免疫刺激，伴随吞噬、白细胞募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA的强烈副作用，疫苗配方中应用IFA及其人类的常规使用受到阻碍。特别是，毒性是含量高的非生物降解的废油以及它们的品质差引起的。2005年WHO进行的一项调查显示，大约100万名IFA患者进行免疫接种后出现了严重的副作用，例如在4万名接种疫苗的人中出现了无菌脓肿。2.2.1 MF59MF59是一种油包水乳剂，其由角鲨烯、Span 85和Tween 80组成，其溶解于pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液，平均粒径约为165 nm。这是1997年意大利批准的第一种用作人类疫苗的水包油乳剂。它目前用于三价和四价(TIV和QIV)流感疫苗Fluad (Seqirus)，这些疫苗最初仅用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体如幼儿和婴儿，并在H1N1大流行疫苗期间用于孕妇和幼儿。研究表明：MF59的存在可提高2岁以下儿童流感疫苗的有效性。MF59还作为HBV疫苗的佐剂进行了测试，其能够引起强烈的免疫反应，而且比铝诱导的免疫反应更好。MF59的作用机理与铝盐相似。注射部位的储存状况几乎可以忽略不计，因为研究表明其半衰期为42h。相反，MF59具有诱导细胞和体液免疫反应的强大能力，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4 (CCL4)，C-C基序趋化因子配体25 (CCL2)， C-C基序趋化因子配体5 (CCL5)和C-X-C Motif配体8 (CXCL8)，它反过来驱动白细胞募集、抗原摄取和迁移到淋巴结，触发适应性免疫反应。另外，研究报道，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，以及随后招募的MHCII+CD11b+细胞进入注射部位，引发强大的免疫应答。在35个国家数百万剂的应用证明了MF59是安全且耐受性良好。2.2.2 AS03AS03是由表面活性剂聚山梨酸酯80和角鲨烯和DL-α-生育酚两种可生物降解的油脂在磷酸盐缓冲盐水中组成的油包水佐剂乳液。这种佐剂已用于流感疫苗，引起类似MF59的免疫反应，也用于疟疾疫苗。2009年欧盟委员会批准AS03佐剂的疫苗Pandemrix上市，而2013年，美国食品和药物管理局(FDA)获批了一种AS03佐剂甲型流感(H5N1)单价疫苗。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗显示出强烈的免疫反应，甚至在接种疫苗6个月后也是如此。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的作用，我们比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的乳剂的作用。通过测定抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，我们得出结论是缺乏DL-α-生育酚导致免疫应答和抗体滴度降低。而且，有研究表明AS03能够通过激活NF-κB刺激免疫系统，诱导肌肉和淋巴结分泌细胞因子和趋化因子，促进先天免疫细胞的迁移。另外，AS03可刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步添加了两种强免疫刺激剂，即QS-21(一种从黄芪中提取的皂苷)和3- O -去酰基-40 -单磷酰脂质A (MPL)，以增强其免疫原性，从而形成AS02。2.3 微粒2.3.1 病毒样颗粒病毒样颗粒(VLP)是由自组装衣壳蛋白外壳组成的二十面体或棒状纳米颗粒(Ø 20 - 200nm)。长期以来，人们一直在研究并将其用于疫苗开发。它们是非传染性粒子，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一种被称为纳米疫苗的最重要代表之一新型疫苗，这种疫苗在疫苗开发中正变得越来越重要。VLP是一种智能纳米颗粒，因为它们是具有重复表位的外部病毒外壳形成，免疫系统将其识别为非自身，从而产生强烈的免疫反应。然而，它与天然病毒共有的这一特性，但并不具有感染的能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs的大小与病毒相似(通常在20-800nm之间)，并且经过快速有效的处理，即使在没有佐剂的情况下也能产生快速而持久的免疫反应。根据是否存在包膜，VLPs可分为非包膜VLPs和包膜VLPs (eVLP)，无包膜VLPs又可分为单衣壳蛋白VLPs和多衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。多衣壳无包膜的VLPs一个经典例子是由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的，它们能够自组装形成微粒。eVLP从宿主细胞获得脂质膜，在组装和出芽过程中表达，又分为单层、双层和多层。它们可以由不同的病毒类型形成，其表达系统包括大肠杆菌，酵母(酿酒酵母和毕赤酵母)、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中生产VLP采用一种称为“组装-然后纯化”的多步骤方法，首先利用衣壳蛋白的自发组装能力直接出现在表达细胞载体内，其次纯化新形成的颗粒。有时，为了获得较纯的颗粒，在细胞内组装后，新颗粒必须分解，从而使它们第二次重新组合。另一种制造方法使用无细胞体外组装加工系统，其组成与传统细胞方法的相反，特别是，它们在表达和纯化后，体外表达系统被用于生产衣壳蛋白自发组装的平台，而无需拆卸新形成的VLPs。目前，有两种重要的添加佐剂的疫苗使用纳米颗粒平台产生免疫:乙型肝炎和乳头瘤病毒(HPV)疫苗。当前，使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原的重组疫苗(HBsAg)，以VLPs的形式，用于预防乙肝感染，其利用重组DNA技术，以酿酒酵母为表达载体生产疫苗。每个剂量含有10µg/0.5 mL VLPs(儿童)或20µg/mL(成人)，两者都吸附于氢氧化铝。该疫苗接种于15岁以下的婴儿、儿童和青少年，或感染乙型肝炎的高危人群，在乙肝病毒携带者母亲所生的新生儿中也显示出极好的免疫原性(95% - 99%的有效性)。乙肝疫苗似乎能提供至少10年的免疫力。HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒粒子是非包膜的，含有双链DNA (dsDNA)。衣壳具有二十面体对称性，由主要结构蛋白和次要结构蛋白组成，即L1蛋白和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些病毒基因型可导致90%的宫颈癌和80-95%的肛门生殖器癌，建议从9岁开始对男性和女性接种。九价型HPV疫苗含有9种不同HPV基因型(6、11、16、18、31、45、53、58)的L1蛋白形成VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它是一种不含病毒基因组的蛋白质结构，不具有传染性和致癌性。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂(AlP)协同使用可产生良好的免疫应答，因此预防宫颈癌达90%。此外，事实证明，疫苗诱导的抗体能够穿过胎盘，保护新生儿免受HPV 6和11的感染。2.3.2 病毒颗粒病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是重组流感病毒包膜形成的VLPs，由血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和磷脂(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱)组成，缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒颗粒生产流感疫苗。自此，出现了这类疫苗有效性的科学证据，并用于预防甲型肝炎(Epaxal)和流感(Inflexal)的两种疫苗。Inflexal Ⅴ是一种适用于所有年龄组的佐剂流感疫苗，对健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人都有良好的疗效。它能诱导B细胞应答并产生特异性抗体。病毒颗粒保留了血凝素的受体结合能力和膜融合活性，但缺乏病毒性RNA，它们结合后不能诱导细胞感染。而且与亚基和分裂病毒粒子流感疫苗相比，这种结合能力增加了它们的免疫原性。病毒颗粒作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞(APCs)的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。然而，由于它们较弱的佐剂特性，病毒颗粒不能有效的激活APC和促进交叉呈递。这种内在的限制可以通过添加更强的佐剂来去除。例如基于TLR4配体单磷酰脂质A (MPLA)和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜上的病毒颗粒，研制了一种新型流感疫苗。在体外，与未添加佐剂的病毒颗粒相比，吸附了MPLA的病毒颗粒能够诱导更强的APCs活化。此外，具有MPLA佐剂的病毒颗粒免疫小鼠诱导特异性CTLs的产生。生产的流感病毒颗粒使用洗涤剂(乙二醇)-正十二烷基单醚(C12E8)溶解病毒包膜，随后进行超离心并去除病毒核衣壳，然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂和包膜糖蛋白重新组装，形成约100-200 nm的颗粒。研究表明，这一过程形成的流感病毒颗粒表现出与野生型病毒非常相似的融合特性。流感病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与核内体膜融合。由于膜融合活性，不同的大分子可以被包裹在病毒颗粒腔内到达靶细胞的细胞质。例如，包裹在病毒颗粒内的DTA(白喉毒素的A亚基)可以成功地转运到靶细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制，甚至质粒DNA也可被包裹在阳离子脂质形成的病毒颗粒内。这种病毒颗粒DNA可以有效地转染靶细胞。病毒颗粒传递系统和佐剂的显著优势是能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和管腔上。而且，在疫苗生产中病毒颗粒比VLPs更受欢迎，因为后者由于其蛋白质结构运动受到限制。此外，将抗原吸附到病毒颗粒的液体磷脂双分子层表面会刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已批准病毒颗粒作为人类使用的纳米载体，因为它们具有很高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗引起较弱的免疫反应相比，病毒颗粒能够诱导强大的体液和细胞免疫，这与自然感染和其他强效佐剂具有非常相似的方式。目前为止，除了上述两种流感和甲型肝炎的基于病毒颗粒的疫苗外，这几种基于病毒颗粒的HIV、HPV、RSV和疟疾疫苗也在研究。艾滋病毒颗粒疫苗在临床I期显示出符合期望的结果，有可能很快会上市。尽管疫苗可以通过肌肉注射或皮下注射，但粘膜途径可能引起更强的免疫反应，因为艾滋病毒传播的主要途径是粘膜组织，因此，强大的粘膜抗体产生是抵抗HIV感染的重要防御机制。研究人员已经从流感病毒中制备了基于HIV病毒颗粒的疫苗，其主要通过吸附一些HIV-1毒力抗原，如gp41和p1肽，并加入3M -052和一种增加病毒颗粒膜硬度的耐热佐剂。另一项研究，一种热稳定性的HIV-1病毒颗粒疫苗由流感包膜的病毒颗粒组成，其含有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂，外加3M-052、toll样受体(TLR7/8)和海藻糖。关于HPV，一些研究侧重于含有E6和E7蛋白的基于病毒颗粒的疫苗，其通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒颗粒诱导了强烈的CTL反应，并阻止了HPV16+向癌症转化。此外，用E7病毒颗粒免疫诱导了抗E7的IgG抗体反应。3.免疫增强剂3.1 TLR1/2激动剂在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种由Pam3Csk4(Pam3)和多肌苷:多胞苷酸(polyI:C)组成的强效佐剂体系，其分别为强效TLR1/2和TLR3激动剂。Lee等人研究表明L-pampo诱导的抗HBV抗体的产生比明矾更强，并且还参与细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，还研究了抗SARS-CoV-2的有效佐剂。具体而言，与广泛使用的佐剂相比，SARS-CoV-2抗原如受体结合域(RBD)和S1抗原，或RBD- Fc接合L-pampo可对SARS-CoV-2产生强烈的体液和细胞免疫应答。此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最有效的配体。研究表明，从细菌脂蛋白中提取的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2)通过TLR2-和myd88依赖的信号通路激活免疫细胞。除MALP-2外，Pam2CSK4和Pam3CSK4也是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为治疗利什曼原虫、疟疾和流感等传染病的药物。TLR3受体激动剂在发现TLRs之前，一种合成的dsRNA，即[poly(I:C)]被发现具有高度诱导IFN产生的能力。TLR3是一种检测病毒dsRNA的细胞核内体的受体，它识别poly(I:C)，因为它在结构上模拟病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引起Th1细胞因子反应。在TLR3- poly(I:C)相互作用后产生的I型IFN对于常规树突状细胞(cDCs)有效激活CD8 T细胞反应尤为重要。另外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。由于这些原因，poly(I:C)作为一种潜在的佐剂已被广泛研究，然而，poly(I:C)对人体有毒性作用。因此，科学家们的关注点已集中在poly(I:C)的衍生物，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成的TLR3激动剂，如ARNAX, IPH3102和RGC100。Poly(ICLC)是羧甲基纤维素中的poly-L-赖氨酸，与poly(I:C)类似，其能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶具有较高的抗性，同时具有较高的免疫刺激作用。poly(ICLC)的一个有趣的方面是能够诱导天然免疫途径中其他几个基因序列的表达，包括炎性体和补体系统AS，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已经使用聚(ICLC)作为传染病的候选疫苗，如恶性疟原虫和HIV以及癌症。研究表明，与其他TLR激动剂(如LPS和CpG)相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫应答，这是疫苗接种的一个积极方面。Poly(IC12U)通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的错配降低Poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它导致I型IFN的产量低于poly(I:C)。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，poly(IC12U)与TLR3结合，但不与MDA5结合。与poly(ICLC)类似，一些研究将ploy(IC12U)作为HIV、流感和癌症疫苗的佐剂。ARNAX是一种具有佐剂潜力的TLR3激动剂，它是一种TLR3特异性配体，其毒性低于poly(I:C)。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS通路(RIG-I和/或MDA5的激活)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种包括GpC磷酸化寡脱氧核苷酸和dsRNA的配体，该配体被TLR3识别并内化到核内体中。由于RNA链的长度相对较短，该配体能够激活TLR3，同时避免MDA5的检测。在小鼠模型中，佐剂不能诱导血清炎症细胞因子水平的显著增加，但有利于DC交叉呈递抗原并引发Th1谱。研究ARNAX最重要的两个领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。3.2 TLR4激动剂TLR4激动剂作为疫苗佐剂有AS01、AS02和AS04，它们都含有TLR4内体的配体MPLA。具体来说，AS01已被用于开发疟疾、艾滋病毒和结核病的疫苗。AS01是一种包裹在脂质体结构中复合佐剂，其由两种不同的免疫刺激分子MPLA和QS-21组成。QS-21是一种天然的三萜苷类皂苷类物质，提取自枇杷膏的树皮。这两种化合物利用脂质体作为载体通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内体TLR4，诱导TRIF依赖的信号通路。单独使用QS-21具有重要而不利的溶血作用，可诱导细胞死亡。然而，溶血活性的QS-21和随后的细胞死亡通过脂质体包封终止。AS01激活细胞凋亡蛋白酶-1，从而促进NLRP3炎性体的激活和从APCs中释放IL-1β和IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，尤其是淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DC的成熟并诱导Th1型免疫反应。3.3 TLR5激动剂TLR5是一种识别细菌鞭毛蛋白的受体，它由几种免疫细胞表达。TLR5与配体的结合导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α， IL-1β， IL-6和NO。此外，鞭毛蛋白能够引起Th1和Th2反应，而不像其他TLR配体只能够引起Th1反应。另外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎性体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白不依赖TLR5或NLRC4的模型能够发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，在小鼠模型中这两种受体都不存在时，佐剂的能力大大降低，这表明至少需要一种受体存在才能驱动免疫反应；而两者的存在提供了最好的免疫结果。研究表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人群中仍能维持其佐剂作用，例如HIV阳性的病人。Cui等评论了使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是抗原给药，该方法成功地诱导了黏膜免疫反应，对防止呼吸道和胃肠道感染至关重要。研究人员已经开展了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与不同的流感抗原联合使用，如灭活的PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV)H5N1都获得了强大的免疫反应(特别是产生IgA的粘膜)。在活减毒细菌中修饰的鞭毛蛋白获得了嵌合鞭毛蛋白或鞭毛蛋白抗原复合物，例如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中用于传染病和癌症的佐剂疫苗。迄今为止，至少有三种用鞭毛作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段:两种是流感病毒，另一种是鼠疫耶尔森氏菌。3.4 TLR7/8激动剂一些研究表明TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫应答。与TLR7/8结合的配体产生高水平的I型IFN，IL-12, TNF-α和IL-1β。另外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活和促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，也能调动CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。TLR7/8激动剂最重要的代表是一些合成的小分子，命名为咪喹莫特(R837)和瑞喹莫特(R848)，其属于咪唑喹啉类。当今咪喹莫特被批准用于治疗生殖器疣、浅表基底细胞癌和光化性角化病，而雷西喹莫特已被研究用于抗病毒和抗癌治疗。然而，这些小分子已被证明有一些内在的限制。特别是，它们可以扩散到远离给药部位的地方，从而远离抗原，从而降低疗效并诱发全身副作用。因此，研究已证明这些分子与铝佐剂的直接结合能够提高疫苗的效力。先前的一些研究将咪唑喹啉类药物与HIV-1 Gag蛋白或整个灭活流感病毒直接偶联，增加了Th1应答和抗原特异性的T细胞数量。此外，它与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲体、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明铝和各种其他合成聚合物的偶联显著增加了咪唑喹啉类药物的递送，并促进了DC和抗原特异性T细胞的成熟。而且，咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂(如MPLA (TLR4)和MPLA + CpG ODN (TLR4和TLR9)混合研究表明，这种组合增加了先天免疫反应，产生了显著抗原特异性中和抗体和改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选药物的卓越潜力。3.5. TLR9激动剂TLR9自然识别以未甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸为代表的细菌DNA基序，通过myd88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序用于具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。在自然杀伤细胞、B细胞和pDCs中，CpG-ODNs产生强大的趋化因子、细胞因子和抗体，驱动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，研究人员已开发了三种不同类型的CpG-ODN配体，其分为三类(A - C)，但只有B类分子作为佐剂用于临床试验。CpG-B ODN定位于核内体并引起pDCs成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用，增强抗体的产生。在小鼠模型中显示，CpG-B ODN作为佐剂可产生可观且持久的抗体，优于铝佐剂或非佐剂疫苗。最近许可的CpG 1018是一种具有较高的化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，可引发Th1型免疫反应，被用作乙肝疫苗Heplisav-B的佐剂。Heplisav-B中的CpG 1018提高了疫苗效力，与需要三剂才能产生最佳保护的传统乙型肝炎疫苗相比，只需接种两剂即可。目前为止，CpG 1018正在用于开发几种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗，另一种CpG ODN CpG 7909在HBV和疟疾疫苗临床评估中显示出令人鼓舞的效果，其他下一代TLR9激动剂已开发。一个有效的代表是MGN1703，其包括CG基序的小DNA分子，但它在结构上不同于CPG ODN。MGN1703是一段中间为双链的反向互补DNA组成，两个单链环包围，它包括三个非甲基化的CG基序并形成哑铃状结构，与线性分子CpG ODNs形成对比。MGN1703作为癌症疫苗的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，只有轻微或暂时的副作用。4.佐剂的潜在副作用:亚洲综合症尽管疫苗具有良好的安全性，但近年来，人们对疫苗可能产生的负面影响产生了新的关注，除了众所周知的副作用外，还描述了一种新的疾病分类学实体。最早由Shoenfeld等人提出实体是佐剂诱导的自身免疫/炎症综合征(ASIA)。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，这些疾病可能发生在暴露于佐剂后的易感遗传个体中。其特征主要是自身抗体的产生，一旦触发因子被移除，情况会好转。该综合征发病时，一些外部因素如感染性因子或佐剂(即粉尘、硅胶、铝盐等)作用于易感遗传背景，其通过自身免疫性疾病(ADI)发展相关的特定HLA抗原介导。尤其是这些患者中HLA-DRB1和PTPN22基因同时存在已证明是最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理情况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不相容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA背景的典型例子。除了疫苗中含有的常见佐剂外，许多其他物质如硅酮、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也具有佐剂的特性。Watad等人将ASIA标准分为主要标准和次要标准。在临床表现之前，主要标准包括暴露于各种外源性刺激(感染、接触佐剂)以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现，特定HLA模式(即HLA DRB1, HLA DQB1)的存在，以及自身免疫性疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。以前的一些研究表明含有铝盐的疫苗能引起ASIA。一个典型的例子是HPV四价疫苗(含铝盐)，据报道，接种疫苗后几周内易感受试者的自我免疫风险会增加，它或者是HBV疫苗。然而，Linneberg研究铝盐潜在副作用结果表明，与接受常规过敏治疗的对照组相比，经皮下多次过敏原联合氢氧化铝免疫治疗以及随后接受比三剂疫苗中含铝量高100倍人死亡率更低，自身免疫性疾病更少。科学家们的努力已转向研究生物标志物诊断ASIA或预测它的易感性(除了之前已经提到的)。例如，在患有ASIA受试者中ACE 1和IL-2受体增加50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率(缺乏免疫调节作用)。通过对500例ASIA的分析，Watad等人强调了易感性似乎与ASIA非常相关。这项研究表明，女性个体、吸烟者、以往患有自身免疫性疾病或家庭成员患有后者的人患ASIA的比例较高。其中多基因自身免疫性疾病最为常见，UCTD和Sjögren综合征患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%自身抗体检测阳性的患者中48.2%为ANA阳性。很明显，考虑到自身免疫/自身炎症状态的发展背后，其有环境和遗传因素。接种疫苗与出现症状之间的中位时间为一周(2天至5年)；48.2%的人群在接触至少一种疫苗后出现临床症状。然而，除了这一科学证据外，一些研究表明接种佐剂疫苗与ASIA之间没有关系。在这些研究中，已表明疫苗接种和自身免疫之间的联系可能是虚假的，因为存在混淆因素和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与自身免疫/炎症和免疫介导事件的潜在发生之间可能存在的联系不应成为降低疫苗接种覆盖率的“虚假神话”。实际上，疫苗不良事件很少发生。由于缺乏信息和可靠的数据，亚洲是一个恰当的总括性术语，可以把各种事件和显然不相关的反应集合在一起，这些反应的共同根源是暴露于疫苗、硅胶或其他外来物质。需要强调的是，即使未来的研究表明佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，然而，这不会削弱疫苗免疫实践所发挥的巨大和毋庸置疑的保护作用，疫苗免疫实践提供了许多临床益处；事实上，疫苗有助于根除和控制许多传染病，提高人类生活质量。5.结论疫苗接种一直是人类与传染病作斗争的最有力武器之一。由于这些有效和安全的预防手段，人类已能消灭人类历史上最可怕的敌人（病原微生物）。最近的COVID-19大流行充分强调了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展并为未来的大流行做准备。疫苗的效力取决于佐剂的基本特性和作用。关于疫苗接种的未来，必须更加重视这些分子，以便生产出越来越安全有效的疫苗。目前该领域的相关产品等研究正在进行，以便实现这一目标，造福人类。参考资料：Facciolà A, Visalli G, Laganà A, Di Pietro A. An Overview of Vaccine Adjuvants: Current Evidence and Future Perspectives. Vaccines (Basel). 2022 May 22;10(5):819. doi: 10.3390/vaccines10050819. PMID: 35632575; PMCID: PMC9147349.

点击上方图片链接可报名疫苗佐剂（Vaccine adjuvants）被定义为与疫苗抗原联合给药时能够增强疫苗免疫反应的强度、广度和持久性的各种成分，被广泛用于疫苗开发，是大部分疫苗产品不可缺少的组成部分。佐剂的范围可以涵盖从合成小分子化合物到复杂的天然提取物和纳米颗粒材料。常见的有矿物盐，微生物产物，乳液，皂苷，合成小分子激动剂，聚合物，纳米颗粒和脂质体。尽管佐剂长期以来一直广泛用于疫苗中，但它们增强免疫反应的机制尚未得到很好的表征，因此对佐剂的作用机制几乎没有系统的概括和总结。此外，现已有或正处于研发阶段的佐剂平台，业内普遍对机制、特性、免疫有效性和应用场景缺乏系统和深入的了解，难以匹配和设计适合特定疫苗的佐剂。这些原因导致目前的疫苗产品在临床实践与应用中渐显颓势，如无法提供长期保护性免疫，无法为老年、易感人群提供有效的免疫保护。2023年7月19日，来自四川大学华西医院的研究团队在Signal Transduction and Targeted Therapy上发表了题为“Vaccine adjuvants: mechanisms and platforms”的综述文章，在本文中详细解读了疫苗佐剂增强疫苗效力的作用机制，并对当前已有的佐剂平台（含在研）进行了分析汇总。疫苗佐剂的作用机制根据作用机制，佐剂通常被分为免疫刺激剂（Immunostimulants）和递送系统（Delivery Systems）两大类，但核心概念不外乎通过直接或间接帮助疫苗成分激活APC，促进抗原呈递信号（图1，①）和共刺激信号（图1，②）产生。抗原呈递信号的产生，首先由抗原被摄取和处理后呈递在APC表面的抗原肽-主要组织相容性复合体（MHC）上，并与naive T细胞表面TCR受体结合诱导T细胞的激活。共刺激信号包括表达在APC表面的共刺激分子（例如 CD40、CD80、CD86）和分泌的炎性细胞因子（例如 IL-6、IL-10、IL-12 和 TNF-α），通过与naive T细胞表面共刺激受体（CD28或细胞因子受体）结合，诱导T细胞激活，增强适应性免疫反应。图1. 佐剂的作用机制示意图免疫刺激剂免疫刺激剂通常为危险信号分子(Danger signal molecules)，以化学合成的小分子激动剂充当PAMP，DAMP，通过靶向APC上的模式识别受体(PRR)，触发先天免疫反应并诱导APC的激活和成熟。APC成熟后终止抗原吞噬活性，并增强其抗原呈递和表达高水平共刺激信号和细胞因子的能力，启动并增强适应性免疫反应。需要注意的是，不同类型的免疫刺激剂会通过不同PRR发出信号并导致不同的细胞因子分泌。目前所使用的免疫刺激剂主要按靶向受体的不同分为4类（图2）。图2. 免疫刺激剂作用机制靶向TLRs免疫刺激剂通过靶向激活TLRs（Toll 样受体），可以增强抗原呈递并上调共刺激信号和细胞因子表达（图2a）。TLR1，TLR2，TLR4，TLR5和TLR6通常在细胞表面表达，主要识别生物膜成分，包含脂质，脂蛋白和蛋白质。作用于该类TLRs的相应免疫刺激剂将促进促炎细胞因子，如IL-1β，TNF-α和IL-6的产生，并最终激活Th1或Th2型免疫应答。TLR3、TLR7、TLR8和TLR9是在细胞囊泡中表达并与核酸反应的细胞内TLRs。相应类型的免疫刺激剂激活这些细胞内TLR通常会导致I型干扰素的产生。27I型干扰素可促进Th1细胞分化并调节其功能。此外，I型干扰素通过常规树突状细胞（DC）促进抗原交叉呈递到CD8 T细胞，并直接刺激CD8 T细胞的增殖。靶向cGAS-STING通路cGAS-STING全称为环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合酶-干扰素基因刺激因子，该通路在协调先天免疫和适应性免疫方面具有独特的作用，受到佐剂研发科学家们的广泛青睐（图2b）。cGAS是一种细胞质DNA受体，被双链DNA激活后将促进胞质单磷酸腺苷(Adenosine monophosphate, AMP)和鸟苷单磷酸(guanosine monophosphate, GMP)环化形成环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP)。随后cGAMP将与STING二聚体的V形结合域结合，引起STING的构象变化，聚集和活化，并激活NF-κB和IRF3，促进促炎细胞因子和I型干扰素表达。靶向CLRsC型凝集素受体（CLR）是一个超家族，包括Dectin-1，Dectin-2，MINCLE，DC-SIGN，CD206，CD205等，主要位于细胞膜上，作为抗原受体参与抗原捕获和抗原呈递（图2c）。具有碳水化合物结构的免疫刺激剂通常会激活CLR，随后诱导APC启动抗原的内化，加工和呈递，以增强适应性免疫应答。此外，一部分免疫刺激剂激活CLRs后可激活不同信号通路，诱导特定细胞因子的表达，控制naive T细胞的极化方向。如β-葡聚糖通过激活Dectin-1诱导Syk激酶磷酸化，进而激活NF-κB通路，促进促炎细胞因子IL12，IL-1β，IL6和IL23的表达，诱导naive T细胞分化为Th1和Th17细胞。Th1细胞诱导强烈的CTLs（细胞毒性T淋巴细胞）反应，并驱动B细胞中免疫球蛋白转化为IgG2a。Th17效应细胞的特征在于产生IL-17，IL-17F和IL-22，并通过募集中性粒细胞引发大量炎症反应。靶向其他PRRs 除上述机制外，免疫激动剂还可激活其他PRRs，主要分为核苷酸结合寡聚结构域样受体(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs) 和视黄酸诱导基因I样受体(Retinoic acid-inducible gene I-like receptors, RLRs)。核苷酸结合寡聚化结构域1(NOD1)、核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)是NLRs家族的主要成员。免疫刺激剂通过激活该类受体可诱导APC上调MHC II，增强抗原呈递。此外，该类受体的激活将导致促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的表达，驱动naive T细胞偏向极化为Th2型细胞，产生Th2细胞免疫反应。视黄酸诱导基因I(RIG-I)和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)是RLRs家族的主要成员，主要识别RNA。激活RIG-I和MDA5将导致IRF3和IRF7的激活，进而诱导I型干扰素的表达。靶向这两种受体的免疫刺激剂最终偏向于导致Th1细胞和CTL的产生。递送系统递送系统通常被定义为搭载抗原以增加APCs对抗原摄取和呈递的载体材料。主要促进抗原的呈递，包括APCs对抗原的识别、摄取和内化。因此，递送系统通常可以以一种或多种方式增强抗原呈递信号（图3）。图3. 递送系统作用机制延长抗原生物利用度目前延长抗原生物利用度的策略主要有（1）允许抗原持续释放；（2）形成免疫生态位；（3）为抗原载物提供保护延长生物利用度，使APCs有足够抗原促进MHC抗原肽信号产生。抗原持续释放目前已被证实可实现抗原持续释放的递送系统，包括纳米乳液递送系统(MF59, AS03)，可注射水凝胶以及可生物降解的PLGA或聚酐聚合物制成的固体聚合物颗粒。此外，具有大孔结构的自组装支架也具有缓慢释放抗原的能力，且还可同时搭载免疫刺激剂来释放炎症信号，提高血清抗体水平和CTL水平。形成免疫生态位一些递送系统可以通过在注射部位形成抗原库/免疫生态位来实现更高效的免疫活化。除了延长抗原在免疫系统中的作用时间，还可招募更多的免疫细胞浸润注射部位，这将增加抗原的摄取并提供局部炎症线索来激活随后的适应性免疫反应。先天免疫细胞的浸润会进一步使得生态位形成递送材料比常规递送材料具有更强大的免疫激活能力，并可掺入细胞因子，增加细胞迁移。可注射聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯热敏水凝胶可同时包封GM-CSF和卵清蛋白，增加注射部位DCs的募集，并提高抗原摄取效率。介孔二氧化硅棒是一种具有自佐剂效应的递送材料，可以激活NLRP3先天免疫路径。当注射到小鼠体内时，它会增加先天免疫细胞对注射部位的浸润并增强免疫反应。为抗原载物提供保护递送系统可以通过保护以DNA和mRNA为主的抗原免受体内酶的分解来延长抗原的生物利用度，从而保持其生物活性。mRNA抗原容易被细胞外血清中的RNA酶降解。LNP是一种经过验证的有效mRNA递送系统，其基本功能之一是封装mRNA并保护其免受降解RNA酶的影响。增强APCs靶向性 递送系统可通过两种主要方式增强APCs靶向性。第一种方法是通过模拟病原体的大小、维度和空间结构，利用微尺度或纳米级材料来促进APC摄取抗原。与可溶性抗原相比，用脂质体纳米颗粒包封抗原可改善APC对抗原的识别和内吞作用，从而增加抗原呈递和诱导更高幅度和更高亲和力的抗体。此外，免疫系统会以高度敏感的方式识别和响应病原体固有的高度有序和重复的空间结构，自组装蛋白质纳米颗粒和其他多价颗粒递送系统通过模拟病原体的这类结构可有效增加APCs抗原摄取率。值得注意的是，即使没有补充其他免疫刺激剂，这些递送系统也能引起强烈的体液和细胞免疫反应。递送系统高度有序和重复的空间结构也有利于B细胞受体（BCR）的共聚集，导致B细胞的强激活。第二种方法是通过直接靶向APCs表面特定受体（Fc受体，CLR）增加抗原摄取。纳米颗粒递送系统的表面可以被特异性修饰以主动靶向特定的细胞群。使用CLRs配体（通常是碳水化合物，如甘露糖）来修饰递送系统将导致抗原更直接地靶向特异性DC，从而增强抗原摄取。淋巴结递送由于淋巴结是初始免疫反应的部位，聚集大量先天免疫细胞和淋巴细胞，因此成为递送系统的关键靶点。常用方法通过设计合适尺寸和表面特性（如电荷和疏水性）可以使递送载体通过被动扩散进入淋巴管和淋巴结。据报道，最佳尺寸在通常在5到100 nm之间，若过小就会进入毛细血管而太大就难以通过淋巴管内皮细胞间隙。在该种方法中，递送材料通常设计为携带负电荷，避免与淋巴管间质基质中带负电荷的糖胺聚糖相互作用降低通过效率。另一种方式被称为内源性白蛋白“搭便车”机制。内源性白蛋白是脂肪酸分子的转运蛋白，利用其在淋巴系统中的循环特性，将抗原与内源性白蛋白结合，可实现淋巴结的靶向。早前报道的一项具有亲脂性尾巴的肿瘤肽疫苗通过结合白蛋白在淋巴结中大量积累，小鼠注射后使T细胞产量增加30倍，抗肿瘤功效显著增强。抗原的交叉呈递抗原的交叉呈递是外源性抗原通过MHC I分子呈递给CD8 T细胞的过程，也是抗病毒感染疫苗和癌症疫苗设计中的重要一步。在正常情况下，外源性抗原大多仅由APC单独内化，并由MHC II分子呈递给CD4 T细胞，不会发生任何交叉呈递。研究已报道三种主要方式：质子海绵效应当具有质子胺基团的阳离子聚合物或脂质递送载体被APC内化后将缓冲内涵体/溶酶体的酸性环境，导致大量氯离子和细胞质的水流入使得内涵体/溶酶体肿胀破裂，释放抗原并促进MHC I分子抗原的交叉呈递。内涵体/溶酶体膜融合一些递送系统通过融合或结合内涵体/溶酶体膜来破坏稳定性，促进抗原释放。颗粒化乳液(PAPE)就可通过结合内涵体/溶酶体膜，破环其稳定性，使抗原释放到细胞质中并交叉呈递给CD8 T细胞。光化学内化释放技术将光敏剂掺入递送系统中和抗原一起递送，光敏剂暴露于特定光源后会被激发形成单线态氧(singlet oxygen)，导致脂质过氧化和内涵体膜破坏，使抗原释放到细胞质中，增强CD8 T细胞介导的免疫应答。经典佐剂平台铝佐剂，MF59，AS01，AS03，AS04和CpG ODN 1018是经典的人用疫苗佐剂。它们已被广泛批准用于各种疫苗，并用于增加疫苗抗体滴度和增强细胞免疫反应。铝佐剂铝佐剂是第一类获准用于人用疫苗的佐剂，上市疫苗中常用的两种铝基佐剂是氢氧化铝和磷酸铝，具有广泛认可的安全性和可靠性。铝佐剂通过促进Th1细胞反应来增强IgG2和IgE抗体的产生。然而，铝助剂的作用机制很复杂，学术界仍在争论，但已在延长抗原的生物利用度和激活先天免疫途径的PRR这两个机制上得到了充分的认识。铝佐剂可以充当与抗原紧密结合并持续释放抗原的递送系统延长抗原的生物利用度并增加抗原呈递。此外，铝佐剂也可作为免疫刺激剂诱导DAMPs的产生，从而激活先天免疫途径的PRR，从而产生IL-1β和Th2型免疫应答等细胞因子。有研究表明，铝佐剂可在注射部位诱导宿主细胞死亡并释放宿主DNA或尿酸充当内源性危险信号，作为DAMPs诱导先天免疫途径的激活。目前学术界的争论点在于铝佐剂靶向的PRR，但并不影响铝佐剂成为疫苗行业的首选佐剂。含铝佐剂广泛用于预防和治疗各种疾病，包括白喉、破伤风、脑膜炎和乙型肝炎病毒（HBV）疫苗，已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，铝佐剂也有一些缺点，包括难以诱导强烈的细胞免疫反应和引起不良反应（红斑，过敏反应）的可能性。目前佐剂研究科学家致力于改进配方和开发纳米铝佐剂来克服现有的缺点。 图4. 铝佐剂激活的信号通路乳佐剂MF59由角鲨烯、吐温80和司盘85组成。MF59于1997年获准作为流感疫苗佐剂，成为第一个获准用于人用疫苗的非铝佐剂。MF59乳剂具有抗原递送和免疫刺激的双重功能。MF59可用作乳液递送系统，当与抗原共同递送时，它可以延长抗原与免疫系统的相互作用，并通过在淋巴结中缓慢释放抗原来增加抗原呈递，可激活更多的APC抗原信号呈递。此外，MF59还充当免疫刺激剂。MF59可以靶向特定的PRR，并通过诱导产生内源性危险信号激活先天免疫细胞。在肌肉中施用MF59可激活先天免疫细胞，如巨噬细胞和DC，并促进趋化因子如CC-趋化因子配体2（CCL2），CCL4，CCL5和CXC-趋化因子配体8（CXCL8）的产生。这些趋化因子又可以将更多的先天免疫细胞募集到注射部位以进一步放大免疫反应，并促进这些招募的先天免疫细胞迁移到引流淋巴结以激活B细胞和T细胞。然而，MF59的确切靶向PRR尚不清楚，一般认为MF59可能通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径起作用。简而言之，接种MF59佐剂会导致Th2偏向的免疫反应和体内Th1反应的弱诱导。目前，MF59已广泛应用于多种人用疫苗中，并显示出良好的安全性和有效性。AS03由α-生育酚、角鲨烯和吐温80组成，和MF59佐剂作用相似。与MF59一样，AS03通过NLRP3非依赖性ASC激活途径和TLR非依赖性MyD88激活途径发挥免疫刺激作用。此外，AS03还含有α-生育酚作为额外的免疫刺激剂成分。研究表明，α-生育酚参与调节某些趋化因子和细胞因子的表达，如CCL2、CCL3、白细胞介素6和CXCL1，可增强APC的抗原摄取，增加募集到引流淋巴结的先天免疫细胞的数量。一般来说，AS03也主要诱导Th2偏向的免疫反应，对Th1反应的诱导较弱。AS03主要用于多种流感疫苗中，以增加抗体的滴度和持久性。最近，AS03在COVID-19疫苗（NCT04450004，NCT04405908）的开发中也显示出良好的临床益处。基于TLR激动剂分子的佐剂AS04是通过铝吸附TLR4激动剂分子制备的，含有铝佐剂，因此还具有免疫刺激和传递抗原的功能。但AS04的免疫刺激功能强于铝佐剂，这是因为AS04含有一种更有效的免疫刺激分子，称为单磷酰脂质A（MPLA）。MPLA是从LPS中分离出的低毒性衍生物，可以特异性激活APC上的TLR4，导致NK-κB的激活和促炎细胞因子的表达，从而产生更强的Th1细胞反应。此外，当将补充AS04的疫苗与仅补充铝佐剂的疫苗进行比较时，发现补充AS04的疫苗诱导了更高水平的抗体。这证明了TLR4激动剂MPLA在AS04中起到重要作用。总体而言，AS04可以诱导比铝佐剂更强的抗体反应和Th1细胞反应，并诱导更平衡的Th1 / Th2免疫反应。目前被批准主要用于人瘤病毒（HPV）疫苗（Cervarix）和HBV疫苗（Fendrix），增加抗体产生和抗原特异性T细胞的活化。CpG ODN 1018是一种人工合成的单链DNA分子，作为TLR激动剂已被广泛研究。CpG ODN 1018特异性激活TLR9，并导致TRF7的激活，进而导致促炎细胞因子和I型干扰素的表达，最终引起强烈的Th1型细胞反应和细胞毒性T细胞产生。CpG ODN 1018最初被批准用于HBV疫苗，目前正在临床试验中作为COVID-19疫苗（NCT04450004，NCT04405908）的潜在疫苗佐剂进行评估。三叶草生物SCB-2019的CpG ODN 1018佐剂COVID-19疫苗已经在国内获紧急使用授权。微粒佐剂系统AS01是一种经典的脂质体微粒佐剂系统，含有免疫刺激剂MPLA和从Quillaja Saponaria(QS)树皮中提取的称为QS-21的活性成分，具有抗原呈递和免疫刺激的双重功能。该脂质体是一种中空磷脂双层人造膜，可用于抗原的包封和递送，保护抗原不被降解并延长其生物利用度，从而使APC能够捕获更多的抗原信号。AS01的MPLA通过TLR4激活先天免疫系统，促进Th1型反应增加。QS-21激活APC中的NLRP3，随后激活半胱天冬酶1以促进活性细胞因子IL1β，IL18和IL33的表达。此外，还发现QS-21可促进内涵体逃逸并促进交叉呈递。总体而言，这两种免疫刺激剂成分协同作用，使AS01诱导以Th1为主的免疫反应并促进CTL的产生。AS01是已获得许可的疟疾和带状疱疹疫苗的一部分。最近，AS01还被应用于开发针对结核病的新型肽疫苗（M72 / AS01E），并显示出在健康成人中预防结核病的安全性和有效性前景（NCT01755598，NCT01755598）。研究中的佐剂平台目前被广泛使用的佐剂在增强疫苗效力的同时也暴露了一些问题。例如，它们增强疫苗免疫力的能力较弱，不提供长期保护性免疫力，对老年人群效果较差。此外，这些批准的佐剂大多只能诱导抗体反应，诱导CD8 T细胞介导的细胞免疫能力较弱，这对于针对病毒感染性疾病和癌症疫苗至关重要。大多数许可佐剂的作用机制在很大程度上仍不清楚，这可能导致这些佐剂的不当使用和无法控制的副作用。因此，需要新型佐剂来解决这些问题。双链核糖核酸 （dsRNA）人工体外合成的双链RNA（dsRNA）可以靶向并激活APC上的TLR3和MDA5，导致促炎细胞因子如IL-12和I型干扰素的产生，并促进强Th1极化免疫反应和CTL的产生。Poly-I：C及其修饰的变体Poly-ICLC是研究最多的合成dsRNA免疫刺激剂。在体外实验中，poly-I：C和poly-ICLC诱导人外周血单核细胞来源DC的成熟，促进IFN-β和促炎细胞因子IL-6和IL-12的分泌，使外源性抗原与CD8 T细胞发生交叉呈递并触发Th1极化免疫反应。poly-I：C和poly-ICLC在临床上多用于肽疫苗，DC疫苗和全细胞疫苗，主要用于多种癌症疫苗的开发。在癌症疫苗中添加poly-I：C或poly-ICLC可增强疫苗诱导的抗肿瘤T细胞和NK细胞反应，从而有助于肿瘤消退或根除。然而，值得注意的是，poly-I：C/poly-ICLC 除了具有触发强大免疫反应的功能外，还可能具有剂量依赖性全身发热和凝血异常等副作用。因此，应考虑合理的给药系统以保护其免受降解，在剂量上需要确保激活APCs并减少副作用。图5. 目前用于癌症疫苗开发的poly-I：C/poly-ICLCGLA及其衍生物吡喃葡萄糖脂质A（GLA）是一种人工合成的LPS模拟物，是MPLA的替代品，通过激活APC上的TLR4在体内诱导Th1型免疫反应。GLA通常制备为吡喃葡萄糖基脂质A-水性纳米悬浮液（GLA-AF），吡喃葡萄糖基脂质A-稳定乳液（GLA-SE），吡喃葡萄糖脂质A-脂质体（GLA-LS）和吡喃葡萄糖脂质A-氢氧化铝（GLA-明矾），以GLA-SE在临床前和临床研究中研究最多。在几项临床试验中，当GLA-SE被用作结核病疫苗的佐剂并针对ID93重组蛋白进行测试时，发现该疫苗可诱导高滴度抗原特异性抗体产生和CD4 T反应，在接种疫苗的人群中显示出良好的安全性和免疫原性（NCT01599897，NCT02465216，NCT02508376，NCT01927159）。咪唑喹啉咪唑喹啉能够激活TLR 7/8通路，激活NF-κB和IRF7，促进促炎细胞因子和I型干扰素的表达，引起强大的Th1细胞免疫反应和CTLs产生。咪喹莫特（R837）、瑞西莫特（R848）和3M-052（也称为替拉莫德）是临床前和临床环境中研究最多的咪唑喹啉佐剂。大量证据表明，R837在黑色素瘤、HPV、乳腺癌和T细胞淋巴瘤疫苗中表现出很强的佐剂作用。病毒疫苗和肿瘤疫苗与R848相结合已被证明可诱导更强的体液反应和CD8 T细胞免疫反应。然而，咪唑喹啉作为疫苗佐剂仍存在一些缺点。具体而言，它们经常从注射部位扩散至全身，从而远离抗原，降低疗效并诱发全身副作用。因此，这些咪唑喹啉佐剂需要与合成聚合物支架、纳米凝胶、脂质基纳米颗粒或其他递送材料偶联，以增强其免疫作用并减少其副作用。环状二核苷酸 （CDN）CDN可以靶向并激活cGAS-STING途径，导致IRF3和NF-κB的激活，诱导I型干扰素和促炎细胞因子的产生，刺激抗原交叉呈递并产生强烈的Th1型细胞响应和CTL响应。目前还未有使用这些合成CDN作为疫苗佐剂的具体例子。由于这些合成CDN在临床前和临床试验中已显示出显着增强人体免疫反应的能力，我们相信使用这些合成CDN作为疫苗佐剂的愿望将很快实现（NCT03172936，NCT03010176，NCT03010176，NCT04096638，NCT04020185），利用纳米颗粒包封CDNs被视为提高CDNs体内利用效率的策略。代谢佐剂 一些靶向代谢途径的小分子调节剂被发现可用作新型疫苗佐剂。靶向甲羟戊酸途径的小分子抑制剂在增加小鼠和食蟹猴的抗体滴度和增强细胞免疫反应方面显示出佐剂作用，延长抗原保留从而增强了抗原呈递。许多研究结果表明，细胞代谢途径的酶或调节因子可能是设计和开发新型佐剂的潜在靶标。锰佐剂及其衍生物锰（Mn）及其衍生物被发现具有潜在的佐剂活性，可充当cGAS的激活剂，诱导2'3'-cGAMP的非规范催化合成，并通过这种方式激活cGAS-STING的先天免疫途径，诱导I型干扰素的产生。研究人员开发了一系列基于Mn纳米助剂，例如纳米级锰凝胶（MnJ）。它不仅具有激活cGAS-STING通路作为免疫刺激剂诱导I型干扰素产生的能力，而且还具有携带抗原的递送系统作用。研究中的递送系统平台 脂质纳米颗粒LNP 是非病毒纳米脂质囊泡递送系统，由可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰脂质组成。可电离脂质是LNPs的主要成分，磷脂和胆固醇有助于LNPs的结构完整性，聚乙二醇改性有助于维持LNPs的稳定性。LNP的作用机制主要包括（1）为抗原提供有效的货物保护，延长其生物利用度;（2）增加抗原的粒径以靶向APCs并促进APCs吸收;（3）通过膜融合促进抗原从内体逃逸，引起CD8 T细胞免疫应答。LNP已被用于各种疫苗的递送，也被认为是目前最适合mRNA疫苗的递送系统聚合物颗粒聚合物颗粒一般分为天然聚合物颗粒和合成聚合物颗粒，主要实现抗原的缓慢释放。疫苗递送中最常用的天然聚合物是壳聚糖。壳聚糖具有高阳离子电荷和生物粘附特性。因此，壳聚糖可以通过静电相互作用与阴离子核酸形成紧密的络合物。此外，壳聚糖的生物粘附特性使其能够长时间与粘膜表面保持接触，促使抗原持续刺激免疫细胞，表明壳聚糖可能是核酸疫苗和粘膜疫苗的有前途的递送系统。此外，壳聚糖最近还被发现通过激活cGAS-STING通路诱导CD8 T细胞免疫的I型干扰素产生。与天然聚合物相比，合成聚合物颗粒通常具有更高的重现性和更可控的缓释速率。PLGA是一种合成聚合物颗粒材料，现在被广泛用作疫苗递送的载体。目前，PLGA颗粒作为癌症疫苗的输送系统已经经过临床测试（NCT01753089，NCT04751786）。此外，PLGA已被FDA批准用于兽用药物递送。因此，相信基于PLGA的疫苗递送系统将在不久的将来被批准用于人类疫苗。病毒样颗粒 （VLP）VLP来源于病毒衣壳的外壳蛋白，由蛋白质单体的自组装形成，其出色的粒径和几何形状使其成为递送疫苗抗原的有效平台，使疫苗很容易进入淋巴管，靶向淋巴结。由于VLPs的高度有序和重复的空间结构，非常有利于交联BCR，即使在没有T辅助（Th）细胞的情况下也能强烈激活B细胞。目前，基于VLP的疫苗已经取得成功，并且已经在市场上广泛使用，例如用于HPV的Cervarix®和Gardasil®，用于肝炎病毒的Sci-B-Vac™以及RTS,S VLP疫苗。蛋白质纳米颗粒笼（Caged protein nanoparticles）笼状蛋白质纳米颗粒通常由一系列重复的基序组成，这些基序允许抗原表位或抗原掺入其亚基结构中，从而使这些掺入的抗原表位或抗原显示在组装颗粒的表面上。与VLP类似，笼养蛋白质纳米颗粒具有高度有序和重复的空间结构以及淋巴结运输的最佳大小等特性。然而与VLP不同，笼状蛋白质纳米颗粒是非病毒来源的。蛋白质纳米颗粒中，铁蛋白应用最频繁。铁蛋白是一种具有八面体对称结构的蛋白质，由24个亚基自组装形成，每个亚基由四个α-螺旋束组成。无机纳米材料金纳米颗粒是常用的无机纳米材料输送系统之一。由于金纳米颗粒的大小、形态、疏水性、表面电荷、均匀性和分布等理化性质可以通过材料合成和表面化学修饰来精确调节，以形成特定的免疫类型，因此近年来金纳米粒子作为一种有前途的抗原递送系统获得了广泛关注。金纳米颗粒通过（1）保护抗原免受降解和（2）形成合理粒径的纳米疫苗以促进抗原直接转运到淋巴结来促进抗原呈递并增强适应性免疫反应。有研究报道，金纳米颗粒可以通过激活NLRP3炎症小体和促进Th2型细胞因子的产生来增强抗原特异性抗体的产生。与金纳米颗粒类似，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）也具有负载能力强和易于表面改性的特点。改良的MSN已被研究为有效的疫苗递送系统，当用作癌症疫苗递送系统时，它增加了抗原特异性CTL的产生，抑制了小鼠的肿瘤生长，提高了荷瘤小鼠的存活率。总结选择合适的佐剂来辅助抗原呈递和改善免疫反应是开发新疫苗的重要问题。在佐剂的选择上，除了需要考虑给药途径，病原体类型，抗原类型和疾病阶段外，还需要重视接种者的生物学特征，如种族、年龄、病史和遗传因素。此外，在作为疫苗产品研究时，还需要考虑佐剂的安全性和经济性。最终这些因素都将或多或少影响疫苗佐剂的有效性。撰文：三姐夫 来源：RNAScript识别微信二维码，添加小编，符合条件者即可申请加入微信群！请注明：姓名+研究方向！声明：本文旨在传递更多信息，版权归原作者所有。原创文章转载均需经过授权并注明来源，如涉及内容、版权或其他问题请时联系小编删除！文章仅代表作者个人观点，并不代表公众号立场。本公众号拥有对此声明的最终解释权！投稿邮箱：yck19876@163.com