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摘要:佐剂性和递送性是mRNA疫苗设计的两个关键方面。在现代mRNA疫苗中，佐剂功能被整合到mRNA疫苗纳米颗粒中，允许抗原mRNA和佐剂以统一的、一体化的形式共递送。在这种配方中，许多mRNA疫苗利用mRNA的免疫刺激性特性以及疫苗载体组分（包括脂质和聚合物）作为佐剂。然而，需要谨慎设计，因为过度的佐剂性和不当的先天免疫信号激活反而会阻碍疫苗效果并引发不良反应。mRNA疫苗还需要递送系统来实现在淋巴器官内的抗原呈递细胞（APCs）中的抗原表达。一些疫苗直接针对淋巴器官中的APCs，而另一些则依赖于APCs在摄取mRNA疫苗后迁移到引流淋巴结。本综述探讨了这些过程的当前机制理解以及基于这种理解正在进行的提高疫苗安全性和有效性的尝试。 1.引言 mRNA为疫苗提供了一个强大的工具。在传染病的情况下，一旦建立了mRNA递送平台，只需改变mRNA序列，疫苗就可以针对各种病原体。这一特性使得两种mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273在由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）爆发后的一年内迅速获得紧急批准。这些疫苗在各种疫苗形式中展示了高效果，对控制大流行起到了关键作用。mRNA疫苗有效诱导中和抗体，有助于其在预防SARS-CoV-2感染方面的高效性。此外，mRNA疫苗还激发细胞免疫反应，这些反应比体液免疫反应更持久，更能抵抗病毒突变。细胞免疫可能在预防COVID-19的严重疾病和死亡中发挥关键作用。mRNA疫苗的广泛免疫原性，包括细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的诱导，也使其成为癌症疫苗的一个有吸引力的候选者。mRNA癌症疫苗通过针对共享的肿瘤相关抗原和来自每个患者基因突变的新抗原，在临床试验中显示出有希望的结果。新抗原疫苗的准备需要在识别癌症基因突变并预测合适的表位后迅速适应。在这方面，mRNA疫苗允许通过改变mRNA序列，简单地对应于每个患者中的突变蛋白，快速且方便地准备。从安全角度来看，mRNA在注射后一周内迅速降解，在体内持续存在的风险最小。最近的一项研究在人体样本中解决了这个问题，显示mRNA在接种后一个月内通过定量PCR（qPCR）检测不到。每年数十亿剂的可扩展性是另一个关键属性，特别是在大流行中。 早在1990年代中期就有关于针对传染病和癌症的mRNA疫苗的记录。然而，它们需要多年的研究和技术突破才能达到目前的临床成功，特别是在mRNA合成和递送系统领域。在前者中，mRNA的假尿苷修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，并提高了蛋白质翻译效率。其他关键技术包括添加5'帽和聚A尾，编码和非翻译区域的序列优化，以及去除体外转录mRNA的杂质。这些mRNA合成技术通过避免不良的炎症反应来提高mRNA疫苗的安全性，并通过增加抗原产生效率来增强疫苗效果。mRNA疫苗还需要递送系统来保护mRNA免受酶降解，将mRNA递送到APCs和淋巴组织，并促进mRNA在细胞内的运输到细胞质中的翻译位点。此外，最近的研究表明递送纳米颗粒作为免疫刺激性佐剂的作用。值得注意的是，在2010年代中期之前，大多数mRNA疫苗临床试验采用了体外mRNA递送后的APC移植。然而，体外策略需要在移植前进行临床级别的细胞培养的繁琐程序，限制了mRNA在癌症免疫疗法中的应用。最近的技术进步使得有效的体内mRNA递送成为可能，扩大了mRNA在传染病疫苗中的应用，并避免了癌症疫苗中繁琐的体外程序。在上述描述的mRNA疫苗的各种设计属性中，本综述关注两个问题：疫苗佐剂性和针对APCs和淋巴器官的递送系统，这在疫苗开发中尤为重要。同时，我们将读者重定向到其他综述中，以获得mRNA递送系统的一般描述，特定于COVID-19疫苗的主题，以及mRNA疫苗的临床概况。 2.佐剂性 2.1.佐剂性概述 免疫刺激性佐剂通过引发先天免疫反应，将抗原表达与适应性免疫诱导联系起来，从而提高疫苗效果的效率和持久性。在由重组蛋白或编码蛋白的核酸衍生的现代疫苗中，佐剂的作用变得越来越重要。值得注意的是，这些疫苗缺乏传统活减毒和灭活疫苗中存在的许多病原体相关分子模式（PAMPs），这些模式充当佐剂。在两种批准的mRNA COVID-19疫苗中，佐剂功能被整合到离子化脂质基脂质纳米颗粒（iLNPs）配方中，作为内置佐剂，而不是作为额外的佐剂补充。事实上，小鼠和人类对mRNA iLNPs的强烈先天免疫反应在疫苗功能中发挥着关键作用。iLNPs的脂质组分和mRNA分子都有助于mRNA疫苗中的佐剂性。内置佐剂方法允许mRNA疫苗的简单一体化配方，有助于平稳的临床转化。此外，一体化配方使得抗原mRNA和佐剂能够共递送到相同的APCs中，有效激活表达从递送的mRNA中得到的抗原蛋白的APCs。在这方面，重组蛋白疫苗的广泛研究表明共递送抗原和佐剂的好处。在一项开创性研究中，共包埋CpG DNA和卵清蛋白（OVA）的聚（D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物）（PLGA）微球在诱导小鼠抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性方面优于分别包埋这两种组分的微球混合物。尽管佐剂在疫苗接种中起着关键作用，但佐剂性应该精确控制，以在最佳强度下激活适当的信号通路，因为过度和意外的佐剂性会带来安全问题，并对疫苗效果产生负面影响。本节提供了关于mRNA疫苗中佐剂性的机制理解和开发的观点。 2.2.当前mRNA疫苗的先天免疫反应 mRNA通过几种先天免疫受体触发先天免疫反应，包括内体内的Toll样受体（TLRs）和细胞质中的视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑素瘤分化相关蛋白5（MDA5）（图1(a)）。每个受体的首选配体分别是TLR3的>45碱基对（bp）双链RNA（dsRNA），TLR7,8的>20核苷酸（nt）单链RNA（ssRNA），MDA-5的几千bp dsRNA，以及RIG-I的>20 nt dsRNA，其在5'端有一个三磷酸基团。这些受体的主要适配分子分别是TLR3的Toll/白介素-1（IL-1）受体结构域包含的适配分子诱导干扰素-β（IFN-β）（TRIF），TLR7,8的髓样分化初级反应88（MyD88），以及MDA-5和RIG-I的线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。这些分子最终触发I型IFN和其他促炎细胞因子的产生。此外，mRNA的5'帽结构对于区分自身和非自身mRNA至关重要。5'帽结构基于第一和第二核糖体的2'O-甲基化状态进行分类。在Cap0中，第一和第二核糖体中都没有2'O-甲基化，在Cap1中，只有第一核糖体有2'O-甲基化，而在Cap2中，第一和第二核糖体都有2'O-甲基化。在高等真核生物中，mRNA具有Cap1或Cap2结构，留下Cap0 mRNA主要被RIG-I识别为非自身。最近的一项研究表明，与Cap1结构相比，Cap2结构进一步降低了mRNA对RIG-I的亲和力。 图1. mRNA疫苗诱导的先天免疫。(a) 外源性RNA的受体及其信号通路。ppp-dsRNA：在5'端具有三磷酸基团的双链RNA。(b) 对iLNPs脂质成分的先天免疫反应的潜在机制。 体外转录mRNA中的杂质，包括未加帽和长dsRNA，引发强烈的先天免疫反应。体外转录制备的未加帽RNA在5'末端有一个三磷酸基团，刺激RIG-I。尽管包括CleanCap在内的最新技术已经提高了加帽效率，但在CleanCap mRNA制备过程中产生的少量未加帽RNA仍然显著激活先天免疫反应。事实上，CleanCap mRNA溶液的南极磷酸酶处理，去除未加帽mRNA杂质的5'三磷酸基团，显著降低了培养巨噬细胞中的细胞因子反应。这一结果突出了CleanCap mRNA中未加帽mRNA污染物的显著免疫刺激。长dsRNA是先天免疫的强烈诱导剂，是从体外转录过程中的RNA模板转录RNA制备的。在这个过程中，从DNA模板制备的预期mRNA链作为模板合成互补的非预期RNA链，导致长dsRNA的形成。如后文讨论的，这些杂质对先天免疫反应可能会极大地影响mRNA疫苗接种的结果，需要仔细讨论在免疫刺激杂质的背景下的疫苗接种效果。 尽管mRNA疫苗需要先天免疫反应作为佐剂，但过度的反应会带来安全问题，并负面影响疫苗效果，如后文所述。此外，对体外转录mRNA的细胞反应通过诱导全局mRNA降解和损害翻译启动，对mRNA的蛋白表达效率产生负面影响（图1(a)）。2'-5'-联腺苷酸合成酶（OAS）的mRNA识别和随后的RNase L激活导致大量细胞内ssRNA降解。此外，外源RNA通过激活RNA依赖性蛋白激酶（PKR）和磷酸化翻译启动因子2-α（eIF-2α）损害蛋白翻译的启动过程。因此，mRNA疫苗的开发需要控制细胞对体外转录mRNA的感知。为此，许多mRNA疫苗使用假尿苷（Ψ）或N1-甲基-假尿苷（1 mΨ）的核苷修饰，这减轻了对mRNA的先天免疫反应。此外，使用高效液相色谱（HPLC）消除长dsRNA，并通过南极磷酸酶去除未加帽mRNA的5'三磷酸也减少了mRNA杂质的免疫刺激。mRNA纯化的更近期技术包括具有光敏疏水标签的帽类似物，用于从未加帽mRNA中纯化加帽mRNA，以及为最小化dsRNA产生的工程化RNA聚合酶。这些方法可以通过增加抗原蛋白翻译和减轻促炎反应来提高mRNA疫苗的安全性和有效性。 在当前mRNA疫苗广泛使用的iLNP配方中，其脂质组分是先天免疫反应的主要诱导剂。事实上，不含mRNA封装的空iLNPs在小鼠局部注射后诱导了强烈的促炎反应。值得注意的是，在去除离子化脂质组分后，促炎反应几乎消失，表明离子化脂质在免疫刺激中的关键作用。离子化脂质在细胞外pH下呈中性电荷，在内/溶酶体pH下变为阳离子。因此，离子化脂质被认为比无pH响应的传统阳离子脂质的炎症性小，因为使用离子化脂质而不是阳离子脂质可能减少LNP与细胞膜的相互作用及其随后的膜损伤。相反，将iLNP中的离子化脂质替换为阳离子脂质减少了对纳米颗粒的先天免疫反应。几份报告提供了iLNP先天免疫激活的机制见解（图1(b)）。如后文所述，几种离子化脂质特别激活先天免疫受体，包括TLRs和细胞内干扰素基因刺激剂（STING）。此外，mRNA iLNPs和其他纳米颗粒的研究表明，溶酶体破裂，mRNA递送的一个重要细胞内过程，通过炎症体激活引发先天免疫反应。在注射部位受损细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs），包括DNA、RNA和蛋白质，也可能在iLNP递送后刺激先天免疫受体。事实上，最近的一项动物研究表明，在肌肉注射（i.m.）批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后，包括双链DNA、高迁移率族蛋白盒（HMGB）1和尿酸在内的DAMPs血清水平急剧增加。在人类中，批准的COVID-19 mRNA疫苗诱导了强烈的局部反应，可能造成DAMPs的释放。 2.3.桥接佐剂性到疫苗效果 本节讨论先天免疫反应如何影响疫苗效果，重点关注iLNPs。最近的一项全面研究通过为各种受体准备基因敲除小鼠，调查了各种先天免疫受体在接种批准的COVID-19 mRNA疫苗BNT162b2后诱导体液和细胞免疫的参与情况。目标受体包括RNA感知途径中的TLR3、TLR7、RIG-I和MDA-5，炎症体中的NLR家族PYD结构域含有蛋白（NLRP）3和凋亡相关斑点蛋白含有C末端胱天蛋白酶募集结构域（ASC），以及TLR2、TLR4、TLR5、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）和STING，其中一些是离子化脂质介导的免疫刺激的潜在靶分子。在这些基因中，只有MDA-5基因敲除显著降低了疫苗接种后刺突抗原特异性CD8+T细胞的频率。更准确地说，MDA-5基因敲除减少了IFN-α的分泌，这是MDA-5信号传导的下游分子，并阻止了树突细胞的激活。此外，IFN-α/β受体（IFNAR）1基因敲除也损害了刺突特异性CD8+T细胞的诱导。这些结果揭示了MDA-5和IFN-α在诱导CD8+T细胞反应中的关键作用。MDA-5可能识别mRNA疫苗配方中的dsRNA或作为DAMPs释放的受损细胞中的dsRNA。 然而，体液免疫诱导的途径更为复杂。上述任何先天免疫受体的基因敲除都没有降低刺突特异性抗体的效率。此外，只有在IFNAR1基因敲除后检测到刺突特异性抗体的最小减少。这一结果与人类研究的结果一致。该人类研究评估了COVID-19 mRNA疫苗在由于TLR7、IFNAR1或干扰素调节转录因子（IRF）7的固有缺陷或对I型IFNs的自身抗体而患有先天性和获得性I型干扰素信号传导缺陷的患者中的有效性。mRNA疫苗在这些患者中有效地诱导了中和抗体和记忆B细胞，水平与健康对照组相当。同时，几项动物研究提供了对体液免疫诱导至关重要的途径的见解。MyD88基因敲除，该基因编码许多TLRs的适配蛋白，显著抑制了使用mRNA iLNP疫苗接种后抗原特异性滤泡辅助T（Tfh）和生发中心（GC）B细胞的诱导。此外，编码Tfh细胞分化中关键细胞因子的白介素（IL）-6基因敲除也消除了疫苗效果。相比之下，RIG-I和MDA-5的适配蛋白MAVS基因敲除后，疫苗效果得以维持。另一项关于自扩增RNA（saRNA）的研究也证明了IL-6在小鼠疫苗接种中的作用，表明IL-6基因敲除损害了抗体反应和Tfh细胞及GC B细胞的诱导。与此同时，IL-6基因敲除后，saRNA疫苗对致命性流感病毒挑战的保护效果得以保留。这些研究表明，在诱导体液免疫反应的先天免疫信号传导途径中存在冗余，而TLRs和IL-6发挥主要作用。 在人类疫苗接种中，第二剂COVID-19 mRNA疫苗大幅增强了体液和细胞免疫，并同时引起了比第一剂更严重的全身反应原性。这一观察结果意味着，第二剂后负责反应原性的促炎分子可能也有助于增强适应性免疫。先前的一项研究评估了人类BNT162b2疫苗接种者血浆中67种细胞因子的概况。其中，IFN-γ显示出一个独特的概况，特别是在第二剂后急剧增加。小鼠模型也在第二次接种BNT162b2后复制了IFN-γ水平的急剧增加，伴随着巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活。进一步分析揭示了CD4+和CD8+ T细胞在第二次接种后产生IFN-γ的显著贡献。有趣的是，IFN-γ受体中和抗体的给药减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的激活，证明了IFN-γ在第二剂后的佐剂功能。然而，IFN-γ受体中和抗体对抗原特异性抗体产生和CD4+及CD8+ T细胞诱导的效率影响很小。因此，需要进一步的研究来解读COVID-19 mRNA疫苗的佐剂性机制。 2.4.脂质和mRNA的佐剂性 iLNP佐剂性的另一个关键问题是，脂质和mRNA组分中哪一个主要促进免疫刺激，以及每个组分激活的信号通路是什么。一项全面的机制研究通过比较空iLNP与封装修饰mRNA的iLNP来解决这个问题。有趣的是，两种配方在小鼠皮内（i.d.）注射后4和24小时引流淋巴结中产生的细胞因子和趋化因子水平相似，表明脂质组分在对iLNP的先天免疫反应中占主导地位。因此，两种iLNP都作为佐剂，并提高了重组蛋白疫苗的效率，使其比AddaVax（模仿临床上批准的MF59佐剂的角鲨烯佐剂）更有效地产生抗原特异性抗体。有趣的是，空iLNP的佐剂效应在MyD88和MAVS基因敲除后大多得以维持，但在IL-6基因敲除后减少。因此，空iLNP可能通过IL-6分泌发挥其佐剂性。然而，同一研究的详细分析揭示了mRNA对mRNA iLNPs的先天免疫反应的贡献，即使mRNA在化学上被修饰以最小化免疫刺激。当比较空iLNP和装载mRNA的iLNP对其作为佐剂以提高重组蛋白疫苗的效率时，MyD88基因敲除减少了装载mRNA的iLNP的体液免疫诱导，而不是空iLNP。这一结果表明，mRNA而不是脂质组分激活了MyD88。在另一项研究中，非人类灵长类动物（NHPs）肌肉注射和皮内注射后，只有装载修饰mRNA的iLNP，而不是空iLNP，在引流淋巴结中的树突细胞中诱导了I型IFN表达和树突细胞的成熟，揭示了mRNA在iLNP佐剂性中的关键作用。 随着未修饰mRNA的使用和较少免疫刺激性的mRNA递送载体，mRNA的佐剂性变得更加明显。在这方面，用于癌症疫苗临床试验的阴离子脂质体比iLNPs的免疫刺激性小。有趣的是，当装载未修饰的mRNA时，阴离子脂质体提供了强大的CTL活性，但相反，当装载1 mΨ mRNA时，诱导了抗原特异性免疫耐受。这些研究强调了未修饰mRNA的佐剂性，将免疫耐受疫苗转化为抗癌疫苗。在装载未修饰mRNA的阴离子脂质体中，TLR7和IFNAR1基因敲除，而不是TLR3、4和9，减少了疫苗接种后树突细胞、NK细胞、T细胞和B细胞的激活。这一结果表明，mRNA通过TLR7识别和随后激活I型IFN在未修饰mRNA的佐剂性中的贡献。 2.5.设计递送系统以改善佐剂性 迄今为止回顾的机制理解意味着改善mRNA疫苗的佐剂性的好处，促进了这一领域的积极研究（表1）。事实上，在某些情况下，佐剂性，而不是抗原表达效率，可能决定疫苗接种的效果，其中提供增强免疫刺激和较低抗原表达的疫苗比提供效率较低的免疫刺激和增强抗原表达的疫苗表现更好。在设计mRNA疫苗佐剂时，首选包含抗原mRNA和佐剂的一体化疫苗配方，允许抗原和佐剂的共递送。如上所述，重组蛋白疫苗的研究已经显示了共递送抗原和佐剂对强大疫苗接种的好处。此外，这种简单的疫苗配方在临床转化中是有利的。 一种策略是将佐剂和mRNA共封装到相同的纳米颗粒中。基于脂质的系统有两个选择：将水溶性佐剂封装在水相中，或将疏水性佐剂封装在脂质相中（图2(a)）。前者的方法是iLNP封装锰，这是STING途径的激活剂，在针对SARS-CoV-2的疫苗接种中显示出有希望的结果。在后一种方法中，R848，一个小分子TLR7/8激动剂，被结合到棕榈酸中以并入阳离子mRNA脂质复合物。该脂质复合物显示出强大的CTL诱导和抗癌效果。另一个例子是Pam2Cys，一个由半胱氨酸、硫甘油和两个棕榈酸链组成的TLR2/6佐剂，被并入iLNP，从而增强了细胞和体液免疫反应。其他系统使用了α-半乳糖神经酰胺，它在APCs上呈现后激活不变自然杀伤T（NKT）细胞，证明了它们在针对癌症和疟疾的疫苗中的效用。针对疟疾的疫苗靶向感染的肝细胞。 除了使用额外的佐剂外，将佐剂性纳入可离子化或阳离子脂质是脂质基疫苗的一个选项（图2(a)）。无需额外的佐剂，这种方法通过最小化成分来简化疫苗配方，可能有利于临床转化。佐剂脂质具有激活先天免疫反应和促进mRNA递送的双重功能。例如，具有环胺头基的可离子化脂质比具有线性胺头基的脂质更有效地诱导先天免疫反应和针对癌症的抗原特异性CTL活性。有趣的是，STING基因敲除消除了由环胺iLNP诱导的先天和适应性免疫反应，表明可离子化脂质中的环胺激活了STING。最近的一项研究在环胺和烷基链之间引入了可生物降解的酯类连接物，以促进佐剂环胺的清除，提高安全性。另一项研究开发了一种类似阳离子脂质的材料，激活TLR4。由此产生的基于脂质的疫苗在野生型小鼠中提高了细胞免疫，但在TLR4基因敲除小鼠中没有提高，证明了TLR4信号在疫苗中的参与。将现有的佐剂或其组分结合到可离子化脂质上是更直接的方法。最近的一项研究设计了一种与TLR7/8佐剂结合的佐剂可离子化脂质体，提高了细胞和体液免疫的诱导效率。另一项研究将维生素E（临床上批准的AS03佐剂的组分）引入可离子化脂质的疏水尾部。含有维生素E的可离子化脂质展现出增强的佐剂性，比含有肉豆蔻酸或油酸尾部的对照可离子化脂质更有效地诱导CTL反应。 在脂质基配方中使用无机系统是另一个具有递送和佐剂功能的双功能系统的例子。先前的一项研究设计了由mRNA负载的钙磷酸核心和脂质层涂层组成的纳米颗粒（图2(b)）。钙磷酸核心在细胞外环境中稳定纳米颗粒，但在细胞内释放Ca2+。由此产生的细胞内Ca2+浓度增加触发树突细胞成熟的信号。此外，钙磷酸核心可以与抗原mRNA共同封装PD-L1 siRNA，用于免疫检查点阻断，进一步增强癌症疫苗的效果。 聚合物基系统，作为一大类mRNA递送系统，与脂质基系统相比，在mRNA疫苗配方中的关注度较小。先前的一项研究比较了聚聚体和iLNP中saRNA的疫苗效果。有趣的是，装载saRNA的iLNP在肌肉注射后远远优于装载saRNA的聚聚体，在细胞和体液免疫诱导方面，尽管聚聚体比iLNP提供了更有效的抗原表达。一致地，iLNP在诱导IL-6（mRNA疫苗佐剂性的关键分子）的表达方面比聚聚体更强。因此，作者将其低疫苗效率归因于其低佐剂性，尽管其他因素，包括递送到淋巴组织的效率，也可能影响疫苗效果。 与此同时，一些聚聚体系统在疫苗接种中提供了有希望的结果（图2(c)）。在几项临床试验中使用的精蛋白/mRNA聚聚体利用未修饰mRNA的佐剂性刺激TLR7（图2(d)）。在这个系统中，与精蛋白的mRNA复合增加了先天免疫反应，但与裸mRNA相比，在小鼠皮内注射后降低了抗原表达效率。因此，控制mRNA和精蛋白的混合比例，以在注射溶液中包含游离mRNA和精蛋白/mRNA聚聚体，以同时获得抗原表达和佐剂性。在一项机制研究中，TLR7基因敲除几乎完全抑制了聚聚体给药后的IL-12分泌。此外，聚聚体通过TLR7基因敲除减少了其CTL诱导潜力，而不是TLR9基因敲除，突出了TLR7佐剂性在这种疫苗配方中的作用。在另一个例子中，硅纳米颗粒被聚(乙二醇)（PEI）涂层，随后PEI交联，mRNA装载和甘露糖涂层。然后，移除硅核心，提供中空核心糖胶囊（图2(e)）。甘露糖的功能是靶向树突细胞并激活树突细胞作为佐剂。结果，这个系统为癌症疫苗提供了强大的CD4+和CD8+免疫。最近的研究还展示了mRNA疫苗中佐剂性多阳离子的潜力（图2(c)）。例如，用于mRNA复合的200-kDa阳离子壳聚糖也作为佐剂，通过激活STING和炎症体，增强抗原特异性细胞和体液免疫。在另一项研究中，具有C18侧链的多阳离子由于其佐剂性激活树突细胞和有效的淋巴结迁移，展现了有效的癌症疫苗效果。一项关于亚单位疫苗的研究也揭示了多阳离子佐剂性。在这项研究中，PEI通过释放宿主细胞的DNA作为DAMPs，激活IFN调节因子-3信号，发挥其佐剂性。这些研究表明了聚合物基系统在疫苗接种中的潜力，这尚未被充分探索。如前所述，iLNP也产生DAMPs，这可能作为佐剂。同时，过量的DAMPs可能引发自身免疫性疾病。例如，通过自身DNA过度激活cGAS-STING途径可能会引起艾卡迪-古特雷斯综合症和共济失调毛细血管扩张症。疫苗开发需要考虑这些风险。 图2. 提高mRNA疫苗佐剂效应的策略。(a) iLNPs或其他脂质系统。(b) 含有磷酸钙核心的脂质载体。(c) 聚复合物。(d) 普罗胺/mRNA聚复合物。(e) 用甘露糖涂层的空心糖胶囊。(f) 设计用于提高佐剂效应的mRNA。用于增强佐剂效应的策略和组分用粗体标出。 2.6.设计mRNA以提高佐剂性 调节mRNA佐剂性提供了另一种改善疫苗效果的选项。这种mRNA佐剂方法包括添加编码免疫刺激性蛋白的mRNA，并利用RNA分子的内在免疫刺激性特性（图2(f)）。这些策略允许使用单一纳米颗粒配方共递送抗原mRNA和佐剂RNA。此外，佐剂RNA在注射后几天内经历酶促降解，避免长时间的免疫刺激。关于编码免疫刺激性蛋白的mRNA，一项开创性的研究将抗原mRNA与三种类型的免疫刺激性mRNA混合，编码CD40配体、TLR4的组成性活性形式和CD70。这种设计显著提高了与单独注射裸mRNA相比的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞诱导和抗癌效果，在淋巴结内注射后。最近的研究证明了免疫刺激性mRNA在iLNP配方中的好处。例如，先前的一项研究通过筛选编码参与先天免疫信号传导的各种蛋白的mRNA物种，确定组成性活性STING mRNA是最有效的mRNA，能在小鼠中诱导CTL活性。另一项研究使用了编码C3d的mRNA，C3d是哺乳动物补体成分，能激活滤泡树突细胞和B细胞。C3d mRNA封装到iLNP中提高了抗原特异性细胞和体液免疫。 RNA分子，特别是dsRNA的内在免疫刺激性特性可以作为佐剂使用。在这方面，dsRNA的免疫刺激性特性可能对saRNA疫苗的疫苗效果产生积极或消极的影响。saRNA具有单链RNA病毒的复制机制，可以在宿主细胞内自我放大，提供抗原蛋白的持续表达。此外，细胞内增殖过程中的dsRNA中间体也可能增强细胞dsRNA受体的激活，以诱导先天免疫反应。这些特性使得使用低剂量的saRNA在动物和人类中进行有效的疫苗接种。然而，dsRNA中间体的持久性可能导致长时间的免疫刺激和PKR激活，可能在某些情况下对疫苗效果产生负面影响。事实上，IFNAR1或MAVS基因敲除提高了saRNA疫苗接种后体液或细胞免疫诱导的效率。此外，saRNA通过共表达MERS-CoV-2 ORF4a提高了其疫苗效率，该蛋白通过结合dsRNA抑制MDA-5和RIG-I的激活[86]，或天花病毒免疫逃逸蛋白阻断PKR和IFN-β的活性。 相反，使用dsRNA对先天免疫反应进行短暂刺激有助于改善mRNA疫苗以提高CTL活性。在这个策略中，dsRNA结构是通过将互补RNA与mRNA杂交到非复制mRNA中准备的（图3）。以前的研究评估了互补RNA与mRNA杂交在蛋白翻译效率和先天免疫反应方面的影响。当互补RNA靶向蛋白编码区域时，在与17 nt互补RNA杂交后翻译效率保持稳定（图3(a)），但在与23 nt或更长的RNA杂交后下降（图3(b)）。与mRNA杂交的短RNA在细胞内环境中特别被从mRNA上脱落，可能是通过翻译过程中蛋白质翻译机制的内源性解旋酶活性。这个过程可能允许从与17 nt互补RNA链杂交的mRNA中有效表达蛋白。关于佐剂性，23 nt或更长的互补RNA杂交，而不是17 nt互补RNA，增加了mRNA的免疫刺激性特性。同时，当靶向mRNA的非编码区域时，RNA杂交的影响是不同的。在先前的研究中，通过体外转录准备的120 nt poly U RNA与mRNA的120 nt poly A杂交。有趣的是，poly U杂交极大地增强了mRNA诱导先天免疫反应的能力，对翻译效率的影响最小（图3(c)），提供了具有佐剂性的mRNA的优秀配方。机制分析揭示了RIG-I在先天免疫激活中的主要作用。事实上，120 nt poly U RNA在体外转录时没有5'帽类似物，在5'端有一个三磷酸基团，是RIG-I的配体。在小鼠疫苗接种中，这种配方在淋巴结内裸mRNA的形式下增强了模型抗原mRNA的疫苗效果。然而，这个系统中的免疫刺激强度是不可控的。因此，后来的研究重新设计了这个系统，以实现对免疫刺激强度的微调。为此，通过17 nt互补RNA与mRNA杂交，准备了梳状结构的mRNA，精确设计了dsRNA牙齿以诱导RIG-I刺激。更重要的是，通过改变免疫刺激性牙齿的数量，这个策略使佐剂性的微调成为可能，以最大限度地提高疫苗效率，同时最小化不良反应。最终，这个系统提高了三种不同mRNA配方的CTL活性：阴离子脂质体、iLNP和聚乙二醇化聚聚体。 图3. mRNA与dsRNA佐剂杂交。展示了RNA杂交后的翻译效率和免疫刺激性。(a-c) 互补RNA与mRNA的编码区(a, b)和聚A区(c)杂交。(d) 梳状结构的mRNA与设计用于靶向mRNA编码区RIG-I的dsRNA杂交。 2.7.杰基尔和海德的佐剂特性 上述描述集中在mRNA疫苗中先天免疫反应的积极方面。然而，许多研究揭示了佐剂特性更为复杂的方面。例如，mRNA修饰在疫苗接种中提供了复杂的结果。像Ψ和1 mΨ这样的mRNA修饰减轻了对mRNA的先天免疫反应，即佐剂效应。未修饰的mRNA的佐剂效应对CTL诱导和抗体产生产生相反的效果。几项iLNP研究表明，未修饰的mRNA在诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应方面优于修饰的mRNA。根据最近的一项研究，不含核苷修饰的抗原mRNA包裹在iLNP中，比包裹1 mΨ修饰的抗原mRNA更有效地诱导抗原特异性CD8+ T细胞，包括那些对颗粒酶B呈阳性的细胞，并更有效地激活肿瘤浸润性树突状细胞。结果，未修饰的mRNA在小鼠模型的癌症疫苗中优于修饰的mRNA，显示出有效的肿瘤体积抑制和延长小鼠存活时间（图4（a））。引人注目的是，在一项使用编码荧光蛋白的mRNA的报告试验中，未修饰的mRNA在淋巴结和脾脏的树突状细胞和巨噬细胞中提供的报告蛋白表达效率远低于1 mΨ修饰的mRNA（图4（b））。这些结果证明了未修饰的mRNA在诱导CTL反应方面的潜力，即使以牺牲抗原表达效率为代价。在机制分析中，未修饰的mRNA比修饰的mRNA更有效地激活脾脏树突状细胞，并且使用抗IFNAR1抗体的给药减少了未修饰的mRNA在疫苗接种中的好处。因此，未修饰的mRNA可能通过I型IFN途径发挥其佐剂效应。 图4. 1 mΨ修饰对癌症疫苗接种的影响。(a) 装载卵清蛋白（OVA）mRNA的iLNP被肌肉内注射到皮下携带表达OVA的B16F0肿瘤的小鼠中。评估了肿瘤大小。(b) 使用iLNPs肌肉内注射0、40、70和100% 1 mΨ修饰的mCherry mRNA。量化了淋巴结和脾脏中常规类型1和2树突状细胞（cDC1和cDC2）中mCherry表达的效率。版权所有© 2022 sittplangkoon, Alameh, Weissman, Lin, Tam, Prompetchara和Palaga。 相反，与iLNP一起传递的1 mΨ mRNA在产生抗原特异性抗体方面比未修饰的mRNA更有效，这表明未修饰的mRNA中佐剂效应的负面影响。一项全面研究调查了1 mΨ修饰对基于iLNP的流感病毒疫苗在小鼠中结果的影响。在i.d.疫苗接种后，1 mΨ mRNA在诱导抗原特异性CD4+ T细胞和抗体方面优于未修饰的mRNA（图5（a）），伴随着脾脏中Tfh和GC B细胞的增强产生。这些结果可能反映了未修饰的mRNA佐剂效应的负面影响。同时，1 mΨ mRNA比未修饰的mRNA产生了更有效和持久的报告蛋白表达（图5（b））。值得注意的是，1 mΨ修饰对蛋白表达效率的好处在器官和细胞类型之间有所不同，在脾脏免疫细胞中尤为明显，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。因此，1 mΨ修饰的mRNA在免疫细胞中提供增强的抗原表达的能力也可能有助于其高疫苗潜力。最近的一项研究通过调查使用三种不同的iLNPs在小鼠和NHPs中1 mΨ修饰的效果，提供了关于先天免疫反应和抗体产生效率之间关系的机制见解。在研究中，1 mΨ修饰增加了抗体产生效率，并伴随着系统性趋化因子和细胞因子分泌的减少。更具体地说，在三种iLNPs中，两种在没有1 mΨ修饰的情况下诱导了大量I型IFN分泌的iLNPs，在1 mΨ修饰后获得了比其他iLNPs更大的疫苗效率好处，后者在没有修饰的情况下显示出最小的I型IFN反应。因此，I型干扰素反应可能是抑制疫苗结果的罪魁祸首。 图5. 1 mΨ修饰对传染病疫苗的影响。(a) 小鼠通过皮内注射使用iLNPs装载的未修饰或1 mΨ修饰的表达流感病毒血凝素（HA）的mRNA进行疫苗接种。评估了HA抑制滴度。(b) 在使用装载未修饰和1 mΨ修饰mRNA的iLNP皮内注射后评估荧光素酶表达效率。版权所有© 2018 Pardi等人。 mRNA杂质的免疫刺激也可能产生负面影响。在最近的一项iLNP mRNA疫苗研究中，C57BL6小鼠比BALB/c小鼠表现出更弱的体液免疫诱导。在这两种小鼠之间比较，C57BL6小鼠的树突状细胞产生的I型IFN比BALB/c小鼠多10倍以上。在使用HPLC从mRNA中去除dsRNA污染物后，C57BL6中的IFN产生被抑制，C57BL6小鼠中的抗体产生增加到与BALB/c小鼠观察到的水平相当。这些数据也表明了I型IFN对体液免疫诱导的抑制效应。在人类中，如上所述，I型IFN信号通路的缺陷并没有损害SARS-CoV-2 mRNA疫苗中的抗体产生。因此，人类的抗体产生可能不需要强烈的佐剂效应和I型IFN激活。从安全角度来看，1 mΨ修饰减轻了使用iLNP在NHPs中mRNA疫苗接种后系统性细胞因子和趋化因子的释放。因此，诱导最小I型IFN反应的mRNA疫苗配方可能在专注于体液免疫的疫苗中更实用。同时，也应注意到化学修饰的必要性仍然是有争议的。事实上，装载未修饰的mRNA的iLNP在NHPs中诱导了有效的体液免疫，其水平与临床批准的COVID-19疫苗装载1 mΨ mRNA的水平相当。 除了核苷修饰，I型IFN信号在CTL诱导中的作用提供了另一个复杂机制的例子，这些机制是佐剂效应的基础。值得注意的是，I型IFN信号根据疫苗接种途径对CTL诱导产生相反的效果。IFNAR1基因敲除或IFNAR1阻断抗体改善了局部给药后mRNA脂质复合物的CTL诱导效率，包括皮内(i.d.)、皮下(s.c.)和淋巴结内给药，显示出I型IFN信号对疫苗接种的负面影响。重要的是，即使没有从mRNA中大幅度提高蛋白表达效率，IFNAR1阻断也改善了疫苗接种效果。因此，除了抗原表达效率之外的机制，大概是I型IFN信号的过度佐剂效应，可能会损害疫苗接种效果。相反，IFNAR1基因敲除降低了系统性注射后CTL诱导的效率，显示出I型IFN佐剂效应的积极影响。根据对疫苗接种中I型IFN信号的后期机制研究，局部给药后的负面影响和系统性给药后的积极影响在条件性IFNAR1基因敲除的CD4+ T细胞中被消除，但在树突状细胞中没有。因此，I型IFN对CD4+ T细胞的作用可能解释了其在疫苗接种中相互矛盾的效果。 对于CD4+ T细胞的激活，I型IFN信号和抗原呈递的动力学在CD4+ T细胞的命运中起着关键作用。在抗原呈递给T细胞受体之前，I型IFN信号对T细胞具有抗增殖和促凋亡作用。另一方面，同时或延迟的I型IFN信号对T细胞具有增殖和抗凋亡作用。这种动力学上的差异可能解释了系统性给药和局部给药之间I型IFN的相互矛盾效果。系统性注射可能将mRNA直接送入脾脏树突状细胞，允许与I型IFN暴露相对快速和同时的抗原呈递，从而激活T细胞。另一方面，局部注射需要时间让组织残留的APCs迁移到淋巴器官。这可能会延迟抗原呈递，从而对T细胞功能产生负面影响。 最近的一项研究揭示了iLNP对先天和适应性免疫反应的长期影响，持续数周。有趣的是，预先注射装载非抗原mRNA的iLNP或空iLNP减少了2周后注射的后续iLNP疫苗产生抗体和GC B细胞的效果（图6(a,b)）。当预注射到疫苗接种的时间间隔从2周增加到8周时，抑制效果仍然存在，但程度较小。预注射降低了后续疫苗接种中mRNA iLNP的抗原表达效率，这可能有助于抑制效果。进一步的机制实验通过评估iLNP预注射对预防传染病的保护效果，调查了先天免疫在这种抑制效果中的作用。在这个实验中，接受装载非抗原mRNA的iLNP的小鼠在2周后被流感病毒和白色念珠菌挑战，其中先天免疫决定了对感染的易感性（图6(c)）。有趣的是，预注射对流感病毒（图6(d)）提供了保护效果，但加剧了白色念珠菌的感染（图6(e)）。iLNP预注射后血液中中性粒细胞水平的降低可能解释了白色念珠菌的结果，而涉及流感病毒挑战实验的机制尚不清楚。重要的是，两个结果都表明iLNP注射对先天免疫反应的长期影响对抗随后的传染病。通过显示iLNP对后续疫苗接种的抑制效果，这项研究可能具有临床意义。通过延长初次和加强剂量之间的时间间隔，提高了COVID-19疫苗在人类中的效力。初次剂量对加强剂量的抑制效果可能解释了这一临床结果。 图6. iLNP预注射对后续先天和适应性免疫反应的影响。(A-B) 装载非抗原mRNA (eGFP)、空iLNP (eLNP) 或PBS被皮内注射。两周后，注射装载血凝素（HA）的iLNP，随后在疫苗接种后两周评估疫苗效果。(a) 实验方案。(b) HA特异性抗体产生。(c-e) 注射装载非抗原mRNA的iLNP两周后，小鼠被流感病毒或白色念珠菌挑战。(c) 实验方案。(d, e) 流感病毒挑战后的病毒载量(d)和白色念珠菌挑战后的病毒载量(e)。版权所有© 2021 Qin等人。 总的来说，这一节提供了过度佐剂效应阻碍疫苗效果的例子，而佐剂效应是mRNA疫苗的重要组成部分，如前几节所描述的。免疫刺激的强度、信号通路和动力学可能部分解释了佐剂效应的杰基尔和海德特性，尽管需要进一步的机制研究来理解和控制佐剂效应的结果。 3.传递 3.1.传递概述 有效的疫苗接种需要在淋巴器官中表达抗原的APCs（抗原呈递细胞），包括淋巴结和脾脏，与T细胞和B细胞合作以诱导适应性免疫。mRNA疫苗在淋巴器官中的APCs实现抗原表达主要有两条途径（图7）。在一条途径中，mRNA疫苗在非淋巴组织给药后，残留的APCs在注射部位摄取抗原mRNA，然后通过淋巴管迁移到淋巴组织。这些过程需要数小时到数天。在APCs较少的组织中，这一途径需要mRNA疫苗引发的先天免疫反应触发免疫细胞向注射部位的浸润。将mRNA疫苗传递到富含APCs的组织，如皮肤组织，是利用这一途径的另一种策略。在另一条途径中，疫苗纳米颗粒通过淋巴管传递，直接将mRNA传递到淋巴组织中的APCs，这一过程需要数分钟到数小时。值得注意的是，淋巴管有对流以促进这一过程。这一途径需要具有适合淋巴运输的尺寸和表面特性的纳米颗粒。此外，靶向配体可以帮助疫苗在淋巴组织中的积聚和保留，并将疫苗传递给特定类型的免疫细胞。从安全角度来看，疫苗在淋巴器官中的保留对于避免疫苗分布到非淋巴器官、异位抗原表达和先天免疫激活至关重要。以下各节将从传递的角度讨论mRNA疫苗接种，重点关注传递途径和纳米颗粒设计（表2）。每个部分首先一般性地描述每种疫苗传递途径，然后专注于mRNA疫苗接种。 图7. iLNP mRNA疫苗肌肉内注射后的可能机制。在一条途径中，iLNPs迁移到淋巴结以在淋巴结中的APCs中提供抗原蛋白表达。在另一条途径中，免疫细胞浸润到注射部位并在摄取抗原后迁移到淋巴结。 3.2.非淋巴组织的传递 大多数临床可用的疫苗都是注射到肌肉或皮下组织，尽管这些组织中APCs很少。因此，需要浸润注射部位的APCs摄取疫苗并迁移到近端引流淋巴结，以促进适应性免疫反应的协调激活。或者，疫苗可能直接通过淋巴管传递到这些淋巴结。与皮下途径相比，肌肉内注射通常在注射部位的不良事件风险较低，并诱导更强的免疫反应。肌肉组织通常血管和淋巴循环更丰富，允许疫苗有效运输到淋巴结。这可能解释了肌肉内注射途径相对于皮下途径在疫苗接种中的优势。相比之下，皮下给药的疫苗倾向于在注射部位停留较长时间，大概是因为皮下脂肪组织的血管化有限和物质交换能力低。因此，皮下途径在疫苗接种中依赖于APC迁移到淋巴结，而不是疫苗迁移。 在mRNA疫苗引起广泛关注之前，其他领域的广泛研究已经讨论了疫苗纳米颗粒的物理化学特性如何决定它们在细胞间质给药后的命运。特别是，它们的尺寸和表面特性，如电荷和亲水性，是它们淋巴结转移的决定因素。尺寸在10到100纳米之间，更具体地说是20-50纳米的纳米颗粒，适合穿越细胞间质并进入和通过淋巴管。然而，尺寸在100-200纳米的纳米颗粒表现出较差的淋巴结迁移能力，因为大约100纳米大小的水通道限制了它们通过细胞间质的扩散和对流。尺寸超过200纳米的纳米颗粒停留在注射部位，并完全依赖于APCs的摄取和APC迁移到淋巴结以提供疫苗效果。相反，小于10纳米的纳米颗粒更倾向于进入血管而不是淋巴管，因为尺寸允许穿透血毛细血管壁。此外，血毛细血管中的流动大约是淋巴流动的100-500倍，有助于清除纳米颗粒。 关于纳米颗粒的表面特性，带正电荷的纳米颗粒被注射部位的负电荷细胞膜和细胞外基质所困。相比之下，带负电荷或未带电荷的纳米颗粒缺乏这种局部相互作用，可以穿过淋巴管传递到淋巴结，显示出在疫苗接种中的适宜特性。用包括聚乙二醇（PEG）在内的亲水性隐形材料涂层纳米颗粒表面，可以进一步提高纳米颗粒向淋巴结的迁移效率，因为这种表面与细胞间质的相互作用最小。有趣的是，纳米颗粒的PEG化使超过100纳米尺寸的纳米颗粒转移成为可能，如120纳米尺寸的阴离子脂质体和250纳米尺寸的阳离子脂质体，大概是因为PEG化可能改善了纳米颗粒的胶体稳定性，并减少了它们在注射部位细胞间环境中的非特异性吸附。同时，纳米颗粒表面的PEG密度需要优化。例如，含有1摩尔% DSPE-PEG2000的阳离子脂质体在淋巴结中的保留时间延长，并且比含有5摩尔% DSPE-PEG2000的APCs摄取增强，而两种脂质体都有效地迁移到淋巴结。另一项研究也揭示了PEG密度优化对最大化疫苗效力的重要性。针对APCs的配体，如甘露糖衍生物和针对DC40、CD11c和DEC-205的抗体，也可以提高传递效率到APCs。然而，这些方法增加了制造的成本和复杂性。考虑到APCs的高吞噬活性以及它们在淋巴结中的丰富性，一旦纳米颗粒到达淋巴结中的APCs，调整纳米颗粒的物理化学特性可能就足够了。 这些关于纳米颗粒疫苗的研究为mRNA疫苗的开发提供了基础。根据之前的一项mRNA研究，直接将裸mRNA疫苗注射到淋巴结中可以产生强大的CTL反应，而裸mRNA疫苗在其他传递途径中，包括皮内、皮下和近淋巴结注射，未能诱导出可检测的疫苗效果。淋巴结内裸mRNA注射在针对新抗原的癌症疫苗的临床试验中也显示出有希望的结果。这些研究强调了在淋巴结中获得抗原表达的重要性。然而，淋巴结内注射需要在超声成像的指导下进行繁琐的操作，阻碍了广泛的临床应用。相比之下，在普通医疗护理中进行的局部注射，如皮下和肌肉内注射，针对的是非淋巴组织。因此，mRNA疫苗应该具有在传递到非淋巴组织后在淋巴组织中的APCs诱导抗原表达的功能。促进mRNA疫苗和APCs向淋巴结迁移是实现这一目的的两条主要途径（图7），而这两个途径通常无法区分。 有趣的是，mRNA iLNP在肌肉内注射后在引流淋巴结中有效地产生表达抗原的APCs，这可能有助于批准的COVID-19 mRNA疫苗的高效性。之前的一项研究通过正电子发射断层扫描-计算机断层摄影术跟踪了NHPs中放射性标记的iLNP。肌肉内注射后4小时内，iLNP在距离注射部位远达9.2厘米的淋巴结中提供了强烈的信号。其他研究通过观察小和大动物肌肉内注射iLNP后mRNA分布和报告蛋白表达，进一步深入了解了局部传递后mRNA iLNP在细胞水平上的过程。iLNP诱导免疫细胞浸润到注射部位，并在浸润的免疫细胞以及残留的成纤维细胞和脂肪细胞中提供报告蛋白表达。报告蛋白表达在注射后8小时在引流淋巴结中有效观察到，但在非引流淋巴结中未观察到。表达水平逐渐下降，但在注射后7天仍高于检测限。在淋巴结中的各种细胞类型中，位于被膜下和髓质窦的巨噬细胞表现出强大的报告表达，而树突状细胞和单核细胞的表达效率较低，T细胞和B细胞中几乎检测不到。巨噬细胞可能作为APCs通过与T细胞和B细胞的相互作用来触发强大的适应性免疫。值得注意的是，人类引流淋巴结在肌肉内疫苗接种后也显示出疫苗mRNA和抗原蛋白表达的有效积累。尽管上述研究没有精确区分在淋巴结中获得抗原表达的两条途径，即iLNP和APCs的迁移（图7），但iLNP在远处淋巴结的快速积累意味着iLNP迁移的贡献。此外，iLNP在全身器官中诱导了强大的蛋白表达，包括肝脏和脾脏，大概是通过iLNP迁移而不是APC迁移，突出了iLNP在注射部位以外传播的潜力。 几项研究试图进一步区分这两条途径的贡献。为了这个目的，最近的一项研究准备了一个在注射部位具有高效抗原蛋白表达效率而在引流淋巴结中效率低的系统。mRNA和空iLNP的混合物在肌肉内注射后在注射部位提供了可比较的蛋白表达水平，但与装载mRNA的iLNP相比，在引流淋巴结中的水平要低得多。值得注意的是，与装载mRNA的iLNP相比，mRNA和空iLNP的混合物在诱导体液和细胞免疫方面的效率要低得多。这些结果表明，淋巴结中抗原表达在疫苗接种中的重要贡献。尽管这项研究无法精确区分iLNPs和APCs的迁移，但可以合理假设装载mRNA的iLNP可能比mRNA和空iLNP的混合物更有效地将抗原mRNA传递到淋巴结。因此，结果表明iLNP迁移到引流淋巴结在疫苗接种中的重要角色。考虑到纳米颗粒的大小对其淋巴结迁移效率的影响，mRNA iLNPs的大小也可能影响其疫苗结果。在这种情况下，之前的一项研究使用小鼠中的135批iLNP进行回顾性研究，显示了抗体产生效率和iLNP大小之间的明确相关性。这一结果支持iLNP迁移到淋巴结在疫苗接种中的参与。同时，这种相关性在NHPs中变得不那么明显，这可能反映了小鼠和NHPs之间淋巴系统解剖学的差异。 另一项研究比较了iLNP、阳离子纳米乳和阳离子脂质体的疫苗效果，揭示了每种配方的目标细胞类型影响体液和细胞免疫的诱导效率（图8(a)）。肌肉内注射后，与其他配方相比，iLNP产生了更高水平的抗体产生，但细胞免疫水平较低（图8(b)）。在报告试验中，阳离子脂质体在小鼠的引流淋巴结中诱导蛋白表达的效率比其他配方更高。在培养细胞实验中，iLNP在蛋白表达方面对肌细胞的偏好超过了树突状细胞。相反，阳离子纳米乳和脂质体在树突状细胞中显示出高效的蛋白表达。基于这些结果，作者假设阳离子脂质体在淋巴结中的有效积累和有效的mRNA传递到树突状细胞有助于细胞免疫的强烈诱导。相比之下，iLNP可能主要在肌细胞中提供蛋白表达，然后APCs摄取肌细胞释放的抗原。这一过程可能更倾向于诱导体液免疫。重要的是，非APCs中的抗原蛋白表达以几种模式对疫苗结果做出贡献。当mRNA编码分泌性抗原时，APCs可以摄取非APCs分泌的抗原。在质粒DNA（pDNA）疫苗的研究中，编码分泌性OVA的pDNA在肌肉内和皮内裸注射后产生的抗OVA抗体水平比编码膜结合或细胞质OVA的更高，显示了抗原分泌的好处。同时，在mRNA iLNP疫苗中，编码细胞相关和分泌性血凝素（HA）的mRNA显示出可比的抗HA抗体产生，表明在这种情况下抗原分泌的作用边缘化。在另一种模式中，非APCs的细胞碎片也可以在疫苗接种后表达抗原的非APCs受损时向APCs提供抗原。 图8. 不同mRNA疫苗配方的接种效果。(a) mRNA疫苗配方。(b) 针对SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域（RBD）的每种疫苗配方诱导的体液和细胞免疫。版权所有© 2022 Shi等人。 一些研究表明mRNA疫苗不需要迁移到淋巴组织就能有效地进行疫苗接种。最近的一项研究对裸saRNA进行了皮内注射，该saRNA优选在皮肤温度范围（30-35°C）内复制，但在体温或超过37°C时变得失活。裸RNA分布在注射部位以外的其他器官是不可能的，因为在迁移到其他器官的过程中裸mRNA可能会被降解。此外，其他组织中非最佳温度限制了saRNA仅在皮肤中复制。即使仅在皮肤中表达抗原，这种疫苗配方也能诱导强大的细胞免疫。另一项研究表明，即使阳离子纳米乳基saRNA疫苗的分布最小化到淋巴结或其他器官，也能通过强烈的体液免疫诱导。在saRNA疫苗中，saRNA附着在纳米颗粒的表面，与脂质层内装载mRNA的iLNP相反。该研究比较了阳离子纳米乳和iLNP之间的生物分布和疫苗效果。在小鼠肌肉内注射后，纳米乳主要将蛋白表达限制在注射的肌肉中，而iLNP在引流淋巴结和肝脏中提供了强烈的蛋白表达。然而，纳米乳比iLNP诱导了更强烈的体液免疫反应，表明迁移到淋巴结在疫苗接种中并非不可或缺。值得注意的是，纳米乳的这种局部分布有助于避免全身炎症反应，而iLNP诱导了全身细胞因子释放和体重减轻。 值得注意的是，最近的一项研究揭示了NHPs中mRNA iLNP的大量系统分布，在肌肉内注射后在脾脏、肝脏和血浆中检测到注射的mRNA。这种系统分布可能在人类中引起安全问题，包括罕见的自身免疫性肝炎和心肌炎病例。自身免疫性肝炎的人类研究揭示了针对肝脏中尖峰蛋白的CD8+ T细胞的存在。这一结果表明，T细胞可能在mRNA疫苗接种后攻击表达尖峰蛋白的肝细胞。关于心肌炎，对mRNA疫苗接种后死亡的患者进行的mRNA分布调查揭示了在几位患者的心肌中存在疫苗衍生的mRNA。有趣的是，这些患者的心脏部分可视化显示心脏损伤的证据，有巨噬细胞浸润，而这种变化在心脏中未检测到疫苗mRNA的患者中要少得多。这些结果暗示了心肌炎和iLNP分布到心脏之间的因果关系。 尽管这些研究强调了mRNA疫苗系统分布的潜在安全风险，但mRNA疫苗更倾向于超越注射部位到淋巴器官。因此，研究人员试图开发能够迁移到引流淋巴结而不发生系统泄漏的mRNA疫苗配方。例如，之前的一项研究筛选了基于引流淋巴结中蛋白表达水平的iLNP配方，使用了一组可电离脂质和具有不同混合比例的四种脂质成分的iLNP。与BNT162b中使用的iLNP相比，最佳iLNP在淋巴结中提供了增强的蛋白表达，并最小化了肝脏或其他系统器官中的表达。另一项研究通过使用大约100 nm（小）、180 nm（中）和330 nm（大）大小的iLNP来调查iLNP大小的影响，从而提供了机制上的见解。肌肉内注射后，小型和中型iLNP从注射部位泄漏出来，在肝脏中积累并提供了强烈的蛋白表达，而大型iLNP显示出从注射部位的最小泄漏。 使用iLNP以外的传递系统也可能减少mRNA疫苗的系统泄漏，因为iLNP在肝脏积累中具有积极机制。血液中的载脂蛋白E（ApoE）与iLNP结合，通过肝脏中的低密度脂蛋白受体促进其被肝细胞吸收。没有这种积极机制，一些脂多聚复合物和多聚复合物避免了在肝脏中的积累，但允许有效地传递到淋巴器官，实现安全有效的疫苗接种。脂多聚复合物的研究比较了其分布与肌肉内注射后iLNP的分布（图9(a)）。脂多聚复合物在淋巴器官中，包括淋巴结和脾脏中，提供了有效的荧光素酶表达，而在肝脏中的表达最小，而肝脏是iLNP注射后表达荧光素酶的主要器官（图9(b)）。在脂多聚复合物注射后的定量PCR评估中，83%的mRNA停留在注射的肌肉中，其余的mRNA主要分布在血液中，只有0.06%分布在肝脏中（图9(c)）。这些结果表明了脂多聚复合物有利的分布概况。这种脂多聚复合物在小鼠和NHPs中诱导了针对SARS-CoV-2的强大疫苗接种，显示出对感染的保护效果。疫苗显示出可接受的安全性概况，全身细胞因子释放和白细胞的短暂增加。 图9. 脂多聚复合物的生物分布。(a) 脂多聚复合物的制备。(b) 脂多聚复合物和装载荧光素酶mRNA的iLNP肌肉注射后的荧光素酶表达分布。(c) 通过qPCR评估脂多聚复合物注射后的mRNA分布。饼图显示了每个器官中累积的mRNA拷贝数。版权所有© 2021 Yang等人。 3.3.皮内传递 与肌肉和皮下组织相比，皮肤是一个高度免疫原性的组织，为疫苗接种提供了一个有吸引力的场所。表皮中的免疫相关细胞包括角质形成细胞、APCs（如朗格汉斯细胞）、真皮树突状细胞和巨噬细胞，以及特定的T细胞亚群，它们共同作用于触发先天和适应性免疫。角质形成细胞占表皮细胞的80%，它们表达一系列模式识别受体，并通过分泌促炎细胞因子（IL-1α、IL-1β、IFN-α、IFN-β和G-CSF）以及促进朗格汉斯细胞迁移和分化的细胞因子（IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α），为发展免疫原性环境做出贡献。朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞擅长捕获抗原并迁移到引流淋巴结进行抗原呈递，从而激活适应性免疫反应。真皮环境富含血管和淋巴管，吸引免疫细胞并促进它们在对促炎刺激的反应中进入淋巴流动，允许疫苗有效地传递到淋巴结。 真皮组织作为免疫器官的这些有利特征促使多年来开发皮内mRNA疫苗。早期的动物研究已经证明了皮内普罗胺/mRNA疫苗针对传染病和癌症的潜力。皮内普罗胺/mRNA疫苗还在癌症疫苗的人类临床试验中提供了可检测的抗原特异性T细胞反应。此外，针对狂犬病病毒糖蛋白的皮内喷射普罗胺/mRNA疫苗在人类中诱导了强大的中和抗体和CD4+ T细胞反应，没有严重的安全问题。皮内给药途径即使在裸mRNA疫苗中也显示出其临床潜力。在一项临床试验中，使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂的裸mRNA疫苗针对几种肿瘤相关抗原，通过诱导对抗原有反应的CD4+和CD8+ T细胞，减缓了一些患者的肾癌进展。最近，BNT162b2和mRNA-1273，这两种基于iLNP的COVID-19疫苗在临床上被批准用于肌肉内给药，它们在临床试验中被测试了皮内注射的潜力。皮内注射10μg或20μg的mRNA-1273产生了几乎与肌肉内注射100μg mRNA相当的尖峰特异性抗体，表明皮内给药在剂量节省方面的潜力。BNT162b2的临床研究评估了作为灭活疫苗接种者的增强剂量的疫苗接种结果。在这些研究中，皮内注射五分之一剂量和肌肉内注射全剂量诱导了几乎相当的针对尖峰蛋白的体液和细胞免疫反应。值得注意的是，与全剂量注射BNT162b2相比，五分之一剂量的皮内疫苗接种减轻了系统性反应原性。 一项机制研究使用NHPs对皮内和肌肉内mRNA疫苗接种进行了详细比较。在针对流感病毒的基于iLNP的mRNA疫苗中，皮内途径在产生抗原特异性抗体和CD4+记忆T细胞方面优于肌肉内途径。皮内和肌肉内iLNP给药都导致循环中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞浸润到注射部位。值得注意的是，皮内给药刺激了CD209+残留真皮APCs的增殖。有趣的是，在皮内传递荧光标记的装载报告蛋白mRNA的iLNP后，CD1a+和CD209+真皮APCs有效地摄取了iLNP，提供了长达9天的报告蛋白表达，激活表达CD80，并迁移到引流淋巴结。这些真皮APCs可能增强了皮内传递后的疫苗效果。最近的一项研究评估了使用敲除这些细胞类型的小鼠在接种装载saRNA的iLNP后朗格汉斯细胞和常规类型1树突状细胞（cDC1）的贡献。缺乏这两种细胞类型的小鼠表现出血清中疫苗特异性抗体诱导和引流淋巴结中Tfh和GC B细胞反应受损（图10(a)）。有趣的是，那些只缺乏一种细胞类型的小鼠没有表现出疫苗效果受损，表明朗格汉斯细胞和cDC1s在mRNA疫苗接种中的冗余作用。同一研究还通过评估有无中性粒细胞耗竭的疫苗效果，探索了中性粒细胞在疫苗接种中的作用。中性粒细胞耗竭并没有显著减少Tfh和GC B细胞反应和抗体产生（图10(b)），表明在皮内mRNA疫苗接种中浸润中性粒细胞的较小贡献。如图7所示，mRNA疫苗有两种机制来获得APCs在淋巴结中的抗原表达：组织残留APCs迁移到淋巴结和mRNA疫苗纳米颗粒的迁移。在这种情况下，本节中的皮内疫苗接种研究表明，通过展示真皮组织残留APCs的关键作用，前一种机制做出了巨大贡献。同时，并非所有mRNA疫苗都受益于皮内给药途径。例如，以前的saRNA疫苗报告显示，皮内途径提供了与肌肉内途径相当或效率较低的疫苗效果。其他因素，包括抗原蛋白表达的效率、saRNA生物分布和佐剂效应，可能是这些设置中疫苗接种结果的决定因素。 图10. 朗格汉斯细胞（LCs）和常规树突状细胞1（cDC1）在皮内mRNA疫苗接种中的作用。使用iLNPs皮内注射表达HA的mRNA。(A) 在野生型（WT）小鼠或缺乏一个或两个LCs和cDC1的敲除小鼠中的抑制滴度。(B) 在疫苗接种前用中性粒细胞耗竭抗体（1A8）注射的WT小鼠中的抗体水平。版权所有© 2022 Ndeupen等人。 皮内疫苗接种途径在临床设置中面临技术困难和注射不准确的问题。这一问题促使了新的注射方法和设备的开发。其中，喷射注射器在狂犬病毒的临床试验中被使用。有趣的是，普罗胺/mRNA多聚体的喷射注射，而不是多聚体的针头注射，在人类中诱导了可检测的抗体产生。这一结果揭示了喷射注射改善疫苗效果的额外好处，大概是通过提高多聚体的传递效率。 微针提供了另一个有希望的皮内疫苗接种选择。例如，裸mRNA和脂质mRNA载体在用空心微针注射后在猪皮中提供了有效的报告蛋白表达，这种微针允许从每个针尖的孔中注入液体。最近的一项研究开发了由可溶解聚合物基质组成的微针，其中包含mRNA iLNP。微针在插入皮肤后30分钟内溶解以释放iLNP。这一系统在水平上显示出与相同iLNP的肌肉内注射相当的强大疫苗效果对抗SARS-CoV-2。此外，该系统可以在室温下耐受6个月的储存，储存后蛋白表达效率没有显著下降。 3.4.系统性传递 通过静脉注射进行的系统性给药提供了一条有效的途径，可以达到全身的器官或组织。与其它注射途径相比，其低侵入性、技术简单性和普遍适用性也具有吸引力。值得注意的是，通过系统性给药的重组蛋白癌症疫苗在治疗黑素瘤和结直肠癌方面显示出高疗效。在目标器官中，脾脏和淋巴结作为富含免疫细胞（包括T细胞、B细胞和树突状细胞）的二级淋巴器官，在疫苗接种中发挥关键作用。特别是，疫苗的主要靶器官是静脉注射的脾脏和局部给药的淋巴结。 多年来，除了mRNA疫苗领域外的研究已经解决了控制系统给药纳米颗粒生物分布的一个艰巨挑战。纳米颗粒的物理化学属性决定了它们在系统给药后的生物分布。例如，纳米颗粒应具有直径大于6纳米或分子量大于50 kDa，以避免通过肾脏肾小球滤过快速清除。尺寸在10到200纳米之间的纳米颗粒优先在肝脏中积累，肝脏是一个主要的清除器官。这一尺寸范围与肝脏窦状内皮细胞中的孔径（50-200纳米）和Kupfer细胞的大小依赖性吞噬活性一致。此外，肝脏窦状内的慢血流促进了纳米颗粒对窦状壁的捕获，肝脏的重量也是一个导致纳米颗粒在肝脏中积累的原因。疫苗纳米颗粒应避免这些清除和清除机制，以改善脾脏靶向。用生物相容性亲水性聚合物，如PEG或两性离子聚合物，涂层纳米颗粒表面，可以有效地减少纳米颗粒的肝脏摄取。PEG化肝脏窦状内皮壁，而不是纳米颗粒，也可以抑制纳米颗粒在肝脏中的积累。脾脏通过脾脏窦隙的内皮缝隙物理捕获大于200纳米的纳米颗粒，这些缝隙过滤血液成分，而微米级聚集体则受到肺微血管的捕获。此外，将纳米颗粒的表面电荷从正变为负或用亲水性聚合物修饰它们可以显著改善它们对脾脏的选择性。总的来说，略大于200纳米的大小、阴离子表面和亲水性隐形涂层可能是适合脾脏靶向的属性，而脾脏APCs的靶向配体可以进一步增强纳米颗粒在脾脏中的积累。 在mRNA疫苗领域，一项开创性研究已经证明了系统性mRNA疫苗在动物实验和人类临床试验中对抗癌症的效用。在该研究中，具有不同表面电荷的脂质体，通过改变mRNA和阳离子脂质体的混合比例制备，基于它们在系统注射到小鼠后在脾脏中的mRNA传递效率进行筛选。在报告试验中，用mRNA对阳离子脂质体的过量电荷比制备的阴离子脂质体，有效地将mRNA传递到脾脏、淋巴结和骨髓中的CD11c+树突状细胞，提供蛋白表达。这一系统在几种小鼠癌症模型中展示了有效的治疗效果，并在人类中诱导了可检测的抗原特异性T细胞。随后的临床试验通过靶向肿瘤相关抗原和新抗原展示了这一系统的强大的抗肿瘤效果。人类中的荧光-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，在这一阴离子脂质体传递后，脾脏中葡萄糖摄取选择性增加（图11），表明这一系统在人类中也成功地靶向脾脏。 图11. 通过系统给药使用脂质体靶向人类脾脏。在使用阴离子脂质体进行静脉疫苗接种后的人体中进行18F-2-脱氧-2-D-葡萄糖正电子发射断层扫描。脾脏被圈出。版权所有© 2018 Pektor等人。 这一临床成功正在促进针对脾脏的mRNA传递系统的开发。例如，向mRNA iLNP中添加阴离子脂质将iLNP从肝脏重新定向到脾脏，而iLNP具有肝脏的内在亲和性。随后的机制研究表明，添加阴离子脂质改变了血液循环中附着在iLNP上的蛋白质冠的组成，这可能决定了iLNPs的组织亲和性。同样，来自报告mRNA和聚阳离子的聚复合物在小鼠静脉注射后选择性地在脾脏和淋巴结中提供报告蛋白表达（图12(a)）。聚阳离子具有两性离子结构，向阳离子侧链添加了带负电荷的磷酸基团。在淋巴结中，CD4+ T细胞和巨噬细胞有效地表达了报告蛋白（图12(b)）。尽管阴离子纳米颗粒经常用于mRNA疫苗中靶向脾脏，但一种称为两亲性碳点的阳离子纳米颗粒也展示了选择性mRNA传递到脾脏。 图12. 使用聚复合物在小鼠中靶向淋巴组织。系统性注射编码荧光素酶（a）和tdTomato（b）的报告mRNA。（a）荧光素酶表达的分布。（b）淋巴结中表达tdTomato的细胞类型。版权所有© 2021美国化学会。 碳点是通过将疏水烷基链结合到基于多胺的纳米颗粒上制备的。通过体外筛选选出的两种碳点配方在系统注射后评估了其体内功能。其中一种实现了对脾脏的选择性mRNA传递，在癌症疫苗中诱导了有效的抗肿瘤活性。总的来说，这些系统利用纳米颗粒的物理化学属性进行脾脏靶向。然而，在大多数系统中，靶向的确切机制仍然不清楚，阐明这些机制将有助于未来合理设计脾脏靶向系统。 除了依赖于物理化学属性的策略外，配体基础系统也被追求作为一种实现细胞水平精确靶向的策略。一项开创性的研究将甘露糖配体附着在脂多聚复合物上，这增加了mRNA传递到脾脏树突状细胞的效率4倍。在应用于靶向肿瘤相关抗原的癌症疫苗时，脂多聚复合物显示出有效的抗肿瘤效果。然而，脂多聚复合物在脾脏以外的器官中诱导了蛋白表达，包括肝脏。为了提高对脾脏树突状细胞的选择性，随后的研究使用三甘露糖而不是单甘露糖作为配体。结果，三甘露糖脂多聚复合物将mRNA专门传递到脾脏，并在其他器官中最小化了传递mRNA的蛋白表达。此外，在小鼠中耗尽CD11c+ APCs后脾脏中的蛋白表达显著减少，显示出该系统在脾脏APCs中的高特异性。有趣的是，该系统诱导的CTL反应独立于I型IFN，因此即使带有1 mΨ修饰也保留了CTL活性。因此，装载1 mΨ修饰的mRNA的脂多聚复合物提供了有效的癌症疫苗，并最小化了系统性细胞因子释放的诱导。另一组使用唾液酸作为配体，靶向树突状细胞表面表达的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1 (Siglec-1) 作为iLNP的配体。有趣的是，将唾液酸引入iLNP显著增加了内体逃逸效率。结果，iLNP在系统给药后允许有效的mRNA传递到脾脏树突状细胞，从而增强了抗癌症疫苗。 3.5.粘膜传递 粘膜疫苗接种可以避免侵入性注射程序，并在粘膜相关淋巴组织（MALT）中触发强大的局部和系统免疫反应。特别是，包括肺在内的上呼吸道和下呼吸道的粘膜，是针对传染病的疫苗的一个有吸引力的场所。针对COVID-19的鼻内（i.n.）给药或吸入活减毒和腺病毒载体粘膜疫苗在临床试验中显示出有希望的结果。在粘膜免疫中，分泌到粘液中的IgA在中和和消除最初进入点的外来病原体中发挥重要作用，有效预防感染。此外，鼻内疫苗接种有效地诱导交叉反应性抗体，赋予广泛的交叉保护性免疫。这一特性对于预防具有高突变率的病毒（如RNA病毒）的感染是吸引人的。有效地诱导IgA分泌需要将抗原传递到位于粘液覆盖的上皮屏障下的淋巴组织中的APCs。粘膜上皮中的M细胞介导抗原从粘膜表面到固有层的采样。因此，以前的鼻内疫苗接种研究已经尝试促进疫苗穿透粘液以被M细胞吸收，证明了这一策略的可行性。在这种给药途径中，靶向APCs也是至关重要的，其中被APCs激活的B细胞在激活的CD4+ T细胞的协助下大量分泌IgA。值得注意的是，不同部位的粘膜具有交叉对话。因此，在粘膜部位的疫苗接种可以在远处的粘膜部位诱导抗原特异性免疫，促进整个粘膜系统对病原体感染的加强。除了粘膜IgA分泌外，激活的B细胞还为全身免疫提供系统性IgG分泌。此外，粘膜疫苗接种可以诱导细胞毒性CD8+ T细胞直接杀死感染细胞或表达抗原的细胞，激励其应用于癌症疫苗。 尽管粘膜疫苗接种具有这些优点，但mRNA疫苗的应用仍然具有挑战性，很少有报告涉及这一主题。在一项针对流感病毒和SARS-CoV-2的疫苗研究中，saRNA iLNP的鼻内（i.n.）给药产生的抗体滴度比其肌肉内（i.m.）注射低10倍以上，并且细胞免疫效率较低。机制分析显示肌肉内注射后的血清细胞因子水平高于鼻内给药。因此，作者通过鼻内途径的低佐剂效应来解释i.n.路线的疫苗效率降低。随后的一项研究在i.n.、i.m.和皮内（i.d.）saRNA疫苗接种中进行了更全面的比较，使用了4种不同的疫苗配方：固体LNP、聚合物纳米颗粒、阳离子LNP和iLNP。在每种配方中，i.n.疫苗接种一致地产生了比其他疫苗途径效率低的体液和细胞免疫，即使i.n.疫苗接种使用的mRNA剂量比其他两条途径高10倍。荧光素酶mRNA报告试验显示，荧光素酶表达在i.n.给药后仅持续几天，而肌肉内和皮内注射提供了超过10天的表达。因此，通过i.n.给药引入的saRNA细胞的快速清除可能解释了i.n. saRNA疫苗接种的低免疫原性。 与此同时，几份报告在利用基于脂质和聚合物系统的i.n. mRNA疫苗接种中展示了有希望的结果。在脂质系统方面，一项开创性的研究使用了一种商业脂质试剂进行i.n. mRNA疫苗接种，在小鼠模型中预防性和治疗性给药后诱导了抗癌症活性。在另一项研究中，mRNA被装载到使用普罗胺缩合的聚乙二醇化阳离子脂质体中。这一系统在培养细胞中展示了有效的抗原表达和免疫刺激，以及在小鼠中伴随CD4+和CD8+ T细胞有效诱导的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，通过用阳离子脂质替代两性离子辅助脂质来增强mRNA传递效率到粘膜组织，iLNP被用于i.n.疫苗接种。结果iLNP实现了有效的mRNA传递到粘膜APCs。最终，iLNP展示了与相同系统在装载编码SARS-CoV-2尖峰蛋白的受体结合域和补体C3蛋白的融合蛋白的mRNA后肌肉内疫苗接种观察到的水平相当的强系统IgG诱导。 在聚合物系统的领域，一系列研究试图克服阻碍mRNA疫苗到达APCs的鼻上皮屏障。虽然多聚阳离子通过打开上皮细胞之间的紧密连接有效地破坏屏障，但它们可能引起组织损伤。因此，这些研究通过将聚乙烯亚胺与环糊精结合来减轻细胞毒性，从而减少电荷密度。在i.n.疫苗接种后，得到的聚复合物成功地在鼻腔和阴道腔中产生了IgA，以及IgG和抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞。根据随后的机制研究，聚复合物在浅表颈、深颈和腋窝淋巴结中有效地提供了蛋白表达，并激活了淋巴结中的树突状细胞，从而增强了疫苗效率。在安全分析中，聚复合物没有引起血液中毒性标记物或细胞因子的增加，并且在鼻上皮和肝脏的组织切片中没有观察到异常。在最近的一项研究中，通过聚乙二醇化mRNA聚复合物传递到肺部尝试了粘膜疫苗接种。对于聚复合物的肺部传递，需要优化表面PEG密度。PEG减轻了由阳离子聚复合物引起的组织损伤，并促进了它们对粘膜的穿透，尽管它们表面密集的PEG层阻碍了进入目标细胞。疫苗研究首先通过基于传递效率到肺部的筛选优化了PEG密度和多阳离子结构。最优聚复合物在肺部APCs和上皮细胞中有效地提供了蛋白表达。在SARS-CoV-2疫苗方面，聚复合物在引流淋巴结中诱导了抗原特异性T细胞和B细胞，包括表达IgA的B细胞。此外，观察到抗原特异性组织驻留CD8+ T细胞和强粘膜IgG分泌，证明了成功诱导粘膜免疫。最终，该系统有效地保护了小鼠免受病毒挑战。然而，该系统未能诱导可检测的IgA分泌，需要进一步改进疫苗设计。 4.未来展望 mRNA疫苗需要多种功能，包括保护mRNA免受RNase攻击、以最小化非靶向分布为目标APCs和淋巴组织，以及时空控制先天免疫激活。虽然先天免疫的刺激对于有效的疫苗接种至关重要，但过度的佐剂效应可能导致不良反应并阻碍疫苗结果。在mRNA传递系统方面，mRNA纳米颗粒迁移到淋巴器官有利于疫苗效果。然而，它们广泛分布到非靶向组织，如肝脏和心脏，可能导致罕见但严重的不良反应。在mRNA疫苗中微调这些各种因素仍然具有挑战性，需要大规模筛选以确定最优的mRNA疫苗设计。例如，SM-102是一种用于批准的COVID-19疫苗mRNA-1273的可电离脂质，它是基于小鼠和NHPs中抗原产生能力从30种LNPs配方中筛选出来的。值得注意的是，可电离脂质结构的微小变化可能导致体液免疫诱导的显著差异，而pKa在6.6和6.9之间的可电离脂质往往表现出有效的疫苗效果。有趣的是，虽然五种领先的LNPs在小鼠中展示了可比的抗体产生效率，但它们在NHPs中导致了抗体诱导的大差异，强调了疫苗效力的物种特异性变化。更详细地解密结构-功能关系可能有利于未来疫苗开发，为此，正如本评论所讨论的，正在进行有力的机制分析。 前述的物种差异是纳米医学领域的一个重要问题。例如，临床前动物模型和人类之间在纳米药物生物分布上存在显著差异。吸附到纳米药物上的蛋白质冠在不同物种中的特异性变化可以通过影响克服多种生物学屏障的过程（如有限的组织扩散和不良的清除机制）来影响它们在各个物种中的分布。此外，对mRNA疫苗构成额外障碍的炎症反应在不同物种之间也有所不同。例如，小鼠对阴离子mRNA脂质体的耐受性比人类高，系统给药时炎症反应最小。小鼠在对炎症刺激的反应中更有效地产生抗炎IL-1ra，与人类相比，减轻了mRNA疫苗的系统反应原性。解决物种差异对未来疫苗开发至关重要。 尽管mRNA疫苗在对抗COVID-19方面取得了成功，但当前的mRNA疫苗仍需改进，特别是在减少反应原性方面。虽然在大流行期间，反应原性可能被认为是可以接受的，但人们需要反应原性更温和的mRNA疫苗配方，以用于反复增强针对COVID-19的免疫力，以及更广泛地应用于其他传染病。此外，强烈的反应原性也是疫苗犹豫的原因之一。关于反应原性和免疫原性（疫苗效果）是否可以分离的辩论仍在继续。在人类中，疫苗的系统反应原性在第二次剂量后比第一次剂量更常见，这表明适应性免疫在反应原性中的参与。此外，增强的反应原性与第二次剂量后系统IFN-γ分泌水平的升高相吻合，这在人类和小鼠中都有观察到。在小鼠研究中，CD4+和CD8+ T细胞是第二次剂量中IFN-γ的主要产生者，给予IFN-γ受体中和抗体减弱了巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞的激活。这些发现表明反应原性和免疫原性之间存在密切关系。然而，IFN-γ受体中和抗体对小鼠体液和细胞免疫诱导的效率影响很小。此外，系统反应原性的强度与人类体液和细胞免疫诱导的效果之间的相关性有限。这些结果表明反应原性和免疫原性有潜力被分离。关于佐剂效应，阐明负责反应原性和免疫原性的先天免疫信号通路可能有助于开发具有降低反应原性的高效疫苗。在淋巴结中有效积累且系统泄漏最小的mRNA传递系统可能在减轻系统不良反应的同时保持效果。 虽然这篇综述主要关注佐剂效应和mRNA传递系统，但与其他策略的结合对未来mRNA疫苗的设计至关重要。旨在延长抗原表达持续时间的RNA设计，包括saRNA和环状RNA，也可以增强mRNA疫苗的效力。saRNA疫苗ARCT-154在3期临床试验中作为加强疫苗接种，比BNT162b2或mRNA-1273的两剂接种后显示出更强的免疫原性。编码SARS-CoV-2尖峰蛋白受体结合域的环状RNA在小鼠和NHPs中诱导了强大的免疫反应，尽管环状RNA和线性mRNA之间的疫苗效果几乎相当。在重组蛋白疫苗的研究中，抗原和佐剂的暴露动力学对疫苗接种结果有很大影响，持续暴露导致增强的抗体产生。因此，在mRNA疫苗中调节动力学可以提高其效力。为了实现这一点，一些报告尝试通过水凝胶控制mRNA纳米颗粒的释放。例如，与基于脂质的商业试剂复合的mRNA被装载到基于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(pHEMA)的多孔支架上。在皮下注射后，这种支架保留mRNA超过3天，并提高了与mRNA注射相比的蛋白表达效率。最近的研究开发了一种由氧化石墨烯(GO)和线性聚乙烯亚胺(LPEI)组成的水凝胶，装载抗原mRNA和TLR7激动剂。这种水凝胶在小鼠注射后逐渐释放装载mRNA和激动剂的GO-LPEI纳米颗粒，超过一个月，同时在此期间保护mRNA免受降解。结果，水凝胶注射比纳米颗粒的注射提高了抗肿瘤效果。由mRNA编码的蛋白质的工程也大大影响疫苗接种效果。有趣的是，在mRNA疫苗中将SARS-CoV-2的尖峰蛋白工程化形成类病毒颗粒，提高了中和滴度10倍以上。在癌症疫苗中，准确的表位预测和与其他免疫疗法的结合是关键。优化佐剂效应和传递系统，结合上述其他策略，将大幅扩展mRNA疫苗在未来的潜力。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：疫苗是预防传染病最重要的工具之一。随着时间的推移，针对抗原成分开发了许多不同类型的疫苗。佐剂是提高疫苗实践效果的关键元素，通过多种不同的方式发挥作用，特别是作为载体、储存库和免疫反应的刺激物。多年来，疫苗中包含的佐剂很少，铝盐是最常用的佐剂。然而，最近的研究关注了许多具有有效佐剂特性和提高安全性的新化合物。现代技术如纳米技术和分子生物学已经有力地进入了抗原和佐剂成分的生产过程，从而提高了疫苗的效果。微粒、乳液和免疫刺激物因其在疫苗生产中的巨大潜力而备受关注。尽管有关疫苗佐剂的潜在副作用的研究已经报告，如最近认识到的ASIA综合征，但疫苗的巨大价值仍然不容置疑。事实上，最近的新冠大流行凸显了疫苗的重要性，特别是在管理未来潜在大流行方面。在这个领域，对佐剂的研究可能在生产越来越有效的疫苗中发挥领导作用。 1.引言 疫苗无疑是人类历史上最显著的健康成就之一。在两个多世纪的时间里，疫苗使我们能够实现诸如天花的彻底根除、世界上许多地区脊髓灰质炎的消失，以及多个国家许多传染病的死亡率和发病率的大幅下降等非凡目标。在世界许多地区，疫苗政策是公共卫生的基石，非常重视为人群保证安全有效的疫苗。疫苗的效果不仅取决于抗原成分，还取决于经常用来以更有效方式刺激免疫系统的佐剂。佐剂被定义为添加到疫苗中以改善对抗原的免疫反应的成分。此外，佐剂还有多种好处，如减少每剂疫苗中的抗原量和接种次数，在某些情况下，它们增加了抗原成分的稳定性，延长了其半衰期，间接提高了其免疫原性。现在有多种类型的佐剂可用于疫苗制造（表1）。 佐剂可以根据不同的标准进行分类，如它们的物理化学性质、来源和作用机制。最常遵循的分类系统之一是基于它们的作用机制，将它们分为两个主要类别：递送系统（颗粒状）和免疫增强剂。还有一类佐剂是粘膜佐剂，这是一组与前述佐剂共享一些特征的化合物。在递送系统佐剂中，抗原与作为抗原载体的佐剂相关联。此外，它们能够通过激活先天免疫系统来诱导局部炎症反应，导致免疫细胞被招募到注射部位。具体来说，抗原-佐剂复合物通过作为病原体相关分子模式（PAMPs）激活模式识别受体（PRR）途径。这导致先天免疫细胞的激活，产生细胞因子和趋化因子。免疫增强剂直接激活相同的途径（图1）。 图1. 佐剂的作用机制。 添加佐剂对于老年人使用的疫苗特别有用，因为这类受试者中发生的免疫衰老生理现象，这是导致自然感染或人工刺激（疫苗接种）后免疫反应减少的原因。在这种情况下，佐剂的存在可以代表一个有效的工具，以克服疫苗使用中的这一限制。此外，佐剂对于亚单位疫苗特别有用，因为它们通常太弱，无法单独刺激强大的免疫反应。然而，并非所有疫苗都需要佐剂。例如，许可的结合脑膜炎球菌疫苗不含有佐剂，因为与蛋白质载体的结合本身能够刺激良好的免疫反应。目前许可的佐剂疫苗列于表2。 正如表中所示，EMA和FDA目前许可用于人类使用的绝大多数疫苗都包含铝盐作为佐剂。这一点很重要，因为这些佐剂是疫苗配方中最古老的，并且增加新佐剂的数量显然是必要的，以提高疫苗的安全性和有效性。由于这些原因，加强具有佐剂特性的新分子和因素的研究，增加体外和体内研究的数量是至关重要的。同时，新产品的批准可能会因监管挑战而延迟和成本高昂，这些挑战涉及佐剂的使用和研究、新细胞基质的使用，或者申请流程变更或转移。这个方面可能代表一个阻碍创新、增加成本和延迟疫苗可用性的障碍，特别是在资源匮乏的国家。 此外，COVID-19大流行凸显了拥有有效疫苗的重要性，以应对新大流行的潜在威胁。事实上，许可的针对COVID-19的RNA疫苗具有与用作编码RNA载体的脂质体组分相关的内在佐剂特性。然而，最新许可的COVID-19疫苗是基于一个经典平台，包含刺突蛋白，并以添加一种名为Matrix-M的新佐剂为佐剂，该佐剂含有皂皮树Molina提取物的A部分和C部分。 在选择疫苗佐剂时，应考虑许多方面，其中安全性无疑是第一。一个好的佐剂必须首先是安全的、耐受性好的、易于生产的；具有良好的制药特性（pH值、渗透压、内毒素水平等）和持久的货架寿命；最后，经济上可行。在不影响佐剂安全性的情况下尊重所有这些特性是困难的。因此，目前使用的疫苗中包含的疫苗佐剂非常少。 尽管疫苗取得了巨大的成就，但近几十年来对这些产品产生了很多担忧。一种反对疫苗的文化，被称为“疫苗犹豫”，已经在全球传播。这在COVID-19大流行期间得到了鼓励，一方面，它强调了疫苗接种作为对抗传染病的重要武器的重要性，但另一方面，它也凸显了一部分人口的犹豫行为。已经报告了这种态度的多种原因，但许多研究表明，对副作用的恐惧和对疫苗成分的不信任是最常报告的。特别是，佐剂是比其它成分更容易引起公众担忧的成分。实际上，当存在时，疫苗的副作用通常是轻微和短暂的，通常表现为注射部位的局部疼痛和红斑、轻微的全身不适和类似流感的症状。这些效果通常在疫苗接种后几小时或几天内消失。很少有过敏性反应或其他严重副作用的报告。 本综述的目的是检验当前使用的疫苗佐剂，并评估有关新佐剂的特性及可能的未来用途的正在进行的研究，突出科学文献中关于潜在关注点和副作用的证据。 2.递送系统 2.1.矿物盐铝盐 铝盐的佐剂特性在20世纪20年代被发现，自1926年以来这些化合物一直被用作疫苗佐剂。最初考虑将添加到生长介质中的铝盐用于诱导破伤风和白喉抗原的沉淀，以帮助它们的纯化。然而，很快就发现这些铝沉淀的抗原比可溶性的抗原具有更强的免疫原性。因此，铝盐是使用时间最长且最常包含在疫苗中的佐剂，约有三分之一的当前许可疫苗含有铝。因此，铝盐在疫苗佐剂中是安全性测试最多的。 人类通过不同来源接触铝，尤其是食物和空气。铝主要通过消化道和呼吸道被人体吸收，随后扩散，然后是三步消除过程，尽管这从未完全完成。吸入的铝少于3%，摄入的铝少于1%在生物体内扩散。然而，通过污染食物的摄取是人体中可发现的95%的铝的来源。世界卫生组织（WHO）规定，通过食物摄取的铝的最大水平应为1毫克/公斤/天（成人60至70毫克/天）。最后，铝可能包含在肠外溶液中，因此可以通过注射传播，通过血液和各种体液隔室在体内扩散。在这种情况下，为了避免铝的积累，其在肠外溶液中的水平应小于25微克/升。 一旦被生物体吸收，铝就在体内组织中扩散。大部分金属随后储存在骨骼、肝脏、肺和神经系统中。在患有慢性肾脏病的人群中，铝不能被消除并随时间积累，特别是在骨骼和神经系统中。在这类患者中，高水平的铝可以沉积在大脑中，导致脑病。铝穿透大脑在一项体内实验中得到了精确量化，该实验在大鼠中注射同位素铝-26（26Al）后进行。在生理条件下，铝对大脑的穿透力从每克脑组织的0.001%到0.005%不等，与其给药途径和化学形式无关。2010年，Goullé等人使用结合了电感耦合等离子体和质谱检测的技术，在20名未接触过金属且未接受过含铝或其他微量矿物质治疗的已故患者的人体组织中量化了铝的水平。以湿重表示的中值结果如下：肺=0.47微克/克，大脑=0.19微克/克，肝脏=0.15微克/克，心脏=0.10微克/克，肌肉=0.08微克/克，肾脏=0.06微克/克。 铝被生物体缓慢排泄，主要通过泌尿系统。一些铝永久沉积在人体中，随着接触水平和年龄的增长而增加。这种永久沉积的铝量在成人中估计为30至50毫克。 在疫苗中，铝以晶体状的氢氧化铝（AlH）或无定形的磷酸铝（AlP）的复合聚合物形式存在，形成聚集的纳米颗粒。AlH呈针状纳米颗粒（直径20纳米），而AlP在透射电子显微镜下呈网状。两种形式通常都溶于柠檬酸，但AlP比AlH更易溶。抗原通过静电相互作用和配体交换吸附在佐剂颗粒表面。铝盐/抗原结合增强了抗原呈递细胞（APCs）的抗原摄取和呈递。此外，铝盐刺激NLRP3炎症体的激活，导致IL-1β和IL-18的产生，随后局部炎症和APCs的招募。 许多疫苗使用吸附在AlH或AlP上的抗原（例如，针对破伤风和白喉、无细胞百日咳、乙型肝炎以及肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗），因为它们免疫原性差，随后需要增强免疫反应以引起有效的疫苗接种。在欧洲，疫苗中的铝量由欧洲药典设定为每剂最大1.25毫克铝。在美国，美国联邦法规将生物制品（包括疫苗）中的铝量设定为0.85毫克/剂。与主要以可溶性柠檬酸盐或氯化物形式存在于食物中的铝相比，用作佐剂的无机铝化合物溶解度差；这是它们佐剂作用的一部分。因此，由于在生理pH值下溶解度差，预期肌肉内或皮下注射疫苗中的铝的吸收率会非常慢。 为了评估肌肉内注射后铝的动力学，已经进行了一些体内研究。Flarend等人进行的一项实验研究基于肌肉内注射标记有26Al的AlH和AlP，铝的总剂量为0.85毫克，显示了28天内AlH的吸收率为17%，AlP的吸收率为51%。26Al的最大血清浓度（Cmax）增加为2微克/升，即正常值（30微克/升）的7%。基于这些结果，可以评估肌肉内注射铝盐疫苗佐剂后预期的铝Cmax增加，将等于0.04微克/升，即平均血液中铝水平5微克/升的0.8%。在这个实验中，还评估了大脑中的铝水平，浓度在10-8至10-7毫克/克之间，即10-5至10-4微克/克，因此<0.0001微克/克；这比人脑中平均浓度0.2微克/克低2000多倍。此外，一些研究评估了人类注射26Al-citrate后的铝排泄。一项相当旧的研究表明，在静脉注射26Al-citrate后，59%的注射剂量在一天内通过尿液排出，随后几天排泄速度较慢（第5天的平均保留率为27%），而一项较新的研究表明，在注射铝剂量8年后，保留率约为2%。 铝的毒性是由于体内液体和组织中金属水平的增加。这种增加尤其是由于消除能力的改变，特别是当肾功能受损时。接受血液透析的肾功能衰竭患者尤其有更高风险的铝水平和可能的神经毒性。肾脏移植能够解决铝过剩问题，可能还有相关的神经毒性。多年来，科学家一直在辩论铝神经毒性作为神经退行性疾病原因的可能角色，即使到目前为止，没有确切的证据显示，这个角色仍然是有争议的。 铝的神经毒性已在体外、离体和体内动物模型以及人类中进行了研究。一些体外研究在细菌上进行，显示没有致突变性。此外，使用对氧化突变原敏感的菌株，对铝的氧化作用模式产生了怀疑。其他体外研究在细胞系上进行，以评估不同形式的铝的可能遗传毒性。一些科学家致力于离体研究，使用来自多个供体的淋巴细胞，动物模型中的胚胎毒性研究，最后是各种体内研究。在所有这些研究中，最常用的技术是彗星试验和微核试验。值得注意的是，结果往往是不一致和矛盾的，可能存在方法上的缺陷。因此，到目前为止，尚不可能肯定地说，用作佐剂的铝盐（在推荐剂量下）可能具有毒性效应，尽管它们能够产生或多或少的强烈氧化应激。 2.2.乳液 这一类重要佐剂的始祖是完全和不完全弗氏佐剂。这两种佐剂都是水包油乳液，能够携带抗原并刺激先天免疫系统。完全弗氏佐剂（CFA）在其结构中包含热杀死的结核菌，这增强了对免疫反应的刺激，目前用于体内实验以在小鼠中诱导强烈的免疫激活和自身免疫（如葡萄膜炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎）。然而，CFA能够引起强烈、持久的局部炎症，可能导致动物显著疼痛，并可能在注射部位出现溃疡。不完全弗氏佐剂（IFA）不含结核菌，20世纪50年代作为人类流感疫苗的佐剂使用；与没有佐剂的相同疫苗相比，它能诱导更强、更持久的抗体反应。IFA的佐剂活性基于其作为油性抗原沉积的特性，从注射部位持续释放抗原。这同时增加了抗原的寿命，并强烈刺激局部先天免疫系统，伴有吞噬作用、白细胞的募集和浸润以及细胞因子的产生。然而，IFA在疫苗配方中的引入及其在人类中的常规使用受到其引起的强烈副作用的阻碍。特别是，由高剂量不可生物降解的油脂以及它们的质量差引起的毒性。2005年世界卫生组织进行的一项调查显示，大约一百万人使用IFA进行免疫接种，其中4万人出现了严重的副作用，如无菌脓肿。 2.2.1.MF59 MF59是一种水包油乳液，由角鲨烯、Span 85和Tween 80在pH 6.5的10 mM柠檬酸钠缓冲液中组成，平均粒径约为165纳米。这是第一个作为佐剂批准用于人类疫苗使用的水包油乳液，于1997年在意大利获批。目前，它包含在佐剂化的三价和四价（TIV和QIV）流感疫苗Fluad（Seqirus）中，最初只用于65岁以上的人群，但后来被批准用于其他流感风险群体，如幼儿和婴儿，在H1N1大流行疫苗期间，还批准用于孕妇和幼儿。已经证明，MF59的存在增加了流感疫苗在2岁以下儿童中的有效性。MF59还在乙肝疫苗中作为佐剂进行了测试，能够触发令人印象深刻的免疫反应，比铝佐剂诱导的反应更好。关于作用机制，MF59具有与铝盐相似的效果。在注射部位的沉积活性相当小，因为研究表明其半衰期为42小时。相反，MF59具有强大的能力，能够诱导细胞和体液免疫反应，包括产生高滴度的功能性抗体。MF59的存在刺激局部先天免疫细胞分泌趋化因子，如C-C基序趋化因子配体4（CCL4）、C-C基序趋化因子配体25（CCL2）、C-C基序趋化因子配体5（CCL5）和C-X-C基序配体8（CXCL8），这些趋化因子反过来驱动白细胞的募集、抗原的摄取和迁移到淋巴结，并触发适应性免疫反应。此外，有研究报告称，MF59能够增加调节白细胞跨内皮迁移的基因簇的表达，并随后招募MHCII+CD11b+细胞到注射部位，引发强烈的免疫反应。MF59安全且耐受性良好，这一点已通过在超过35个国家接种的数百万剂次证明。 2.2.2.AS03 AS03是一种水包油佐剂乳液，由表面活性剂聚山梨醇酯80和两种可生物降解的油脂组成，即角鲨烯和DL-α-生育酚在磷酸盐缓冲液中。这种佐剂已用于流感疫苗，诱导与MF59类似的免疫反应，以及在疟疾疫苗中。欧洲委员会于2009年授权AS03佐剂疫苗Pandemrix上市，而AS03佐剂的流感A（H5N1）单价疫苗于2013年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。然而，α-生育酚的抗氧化和免疫刺激性特性似乎比MF59增强了免疫刺激。事实上，在6至35个月大的儿童中使用AS03佐剂流感疫苗，即使在接种后6个月，也显示出强烈的免疫反应。为了阐明DL-α-生育酚在AS03中的贡献，进行了一些研究，比较了AS03和缺乏DL-α-生育酚的相似乳液的效果。通过测量抗原摄取、免疫细胞募集和分泌的细胞因子水平，得出结论，缺乏DL-α-生育酚导致了较低的免疫反应和较低的抗体滴度。此外，已经显示AS03能够通过激活NF-κB来刺激免疫系统，这在肌肉和淋巴结中诱导细胞因子和趋化因子的分泌，并促进先天免疫细胞的迁移。此外，AS03可以刺激CD4+ T细胞特异性免疫反应，这可以决定持久的中和抗体产生和更高水平的记忆B细胞。AS03的成分进一步补充了两种强大的免疫刺激剂，QS-21（从皂皮树中提取的皂苷）和3-O-去酰基-40-单磷脂A（MPL），以增强其免疫原性，产生了AS02。 2.3.微粒 2.3.1.类病毒颗粒 类病毒颗粒（VLPs）是二十面体或杆状纳米颗粒（直径20-200纳米），由自组装的衣壳蛋白组成；长期以来，它们已被研究并用于疫苗开发。它们是非传染性颗粒，因为它们不包含任何遗传物质。它们是一类新疫苗（称为纳米疫苗）中最重要的代表之一，在疫苗开发中变得越来越重要。VLPs是智能纳米颗粒，因为它们由外部病毒壳层和重复表位组成，这些表位被免疫系统立即识别为非自身，产生强烈的免疫反应。这一特性与自然病毒共享，但并不伴有引起感染的有害能力。除了这些重复的结构基序外，VLPs在大小上与病毒相似（通常在20-800纳米之间），并经历了快速有效的处理，导致快速且持久的免疫反应的产生，即使在没有佐剂的情况下也是如此。VLPs可以根据有无包膜被分类为非包膜VLPs和包膜VLPs（eVLPs）。非包膜VLPs可以进一步分为单个或多个衣壳蛋白VLPs，以及单层、双层和三层VLPs。由乳头瘤病毒L1和L2蛋白形成的多衣壳非包膜VLPs是一个经典的例子，它们能够自组装形成微粒。eVLPs在组装和出芽过程中从宿主细胞获得其脂质膜。它们也分为单层、双层和多层。它们可以通过使用各种细胞系统的不同病毒类型通过不同的技术制造，其中包括大肠杆菌、酵母（酿酒酵母和毕赤酵母）、杆状病毒、哺乳动物细胞、植物细胞和无细胞系统。在细胞系统中制造VLPs采用一种称为“先组装后纯化”的多步骤方法，第一步利用衣壳蛋白在表达细胞载体内直接发生的自发组装能力。下一步包括新形成颗粒的纯化。有时，为了获得纯化的颗粒，在细胞组装后，需要解聚新颗粒，因此需要第二次重新组装它们。另一种制造方法使用无细胞体外组装处理系统，包括传统细胞方法的逆转。特别是，使用体外系统作为平台，在表达和纯化衣壳蛋白后诱导其自发组装，无需解聚新形成的VLPs。 目前，两种重要的佐剂疫苗使用纳米颗粒平台来诱导免疫：乙型肝炎和人乳头瘤病毒（HPV）疫苗。目前使用的乙型肝炎疫苗是一种含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的重组DNA疫苗，以VLPs的形式存在，用于预防乙型肝炎感染，并通过使用酿酒酵母作为表达载体的重组DNA技术生产。每剂含有10微克/0.5毫升的VLPs（儿童剂量）或20微克/毫升（成人剂量），两者都吸附在氢氧化铝水合物上。该疫苗接种给婴儿、儿童和15岁以下的青少年，或在有高风险感染乙型肝炎的群体中，也显示出在乙型肝炎携带者母亲所生的新生儿中有出色的免疫原性（95-99%的有效性）。乙型肝炎疫苗似乎至少能提供10年的免疫力。 HPV疫苗也是基于VLP平台的疫苗。HPV病毒是非包膜的，包含双链DNA（dsDNA）。衣壳具有二十面体对称性，由主要和次要结构蛋白组成，即L1和L2蛋白。目前的九价HPV疫苗可预防九种不同的病毒基因型，这些基因型负责90%的宫颈癌和80-95%的生殖器癌症，建议从9岁开始对男性和女性都进行接种。九价HPV疫苗包含九种不同基因型的HPV（6, 11, 16, 18, 31, 45, 53, 58）的L1蛋白形成的VLPs，并通过重组DNA技术合成。VLPs的优势在于它们是不含病毒基因组的蛋白结构，是非传染性和非致癌性的。目前用于表达L1蛋白的载体是酿酒酵母。VLPs与佐剂（AlP）的结合使用允许出色的免疫反应，因此除了能够保护新生儿免受HPV 6和11的感染外，还能提供90%的宫颈癌保护。 2.3.2.病毒体 病毒体是一种与天然病毒结构非常相似的疫苗平台。在结构上，它们是由重组流感病毒包膜形成的VLPs，包含血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和磷脂（磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱），缺乏病毒遗传物质。1975年首次提出使用病毒体制造流感疫苗。自那以后，关于这种疫苗有效性的科学证据已经出现，同时有两种疫苗用于预防甲型肝炎（Epaxal）和流感（Inflexal）。Inflexal V是一种适合所有年龄组的佐剂流感疫苗，在健康和免疫功能低下的儿童、成人和老年人中都具有良好的疗效。它能够诱导B细胞反应并产生特异性抗体。病毒体保留了病毒HA的受体结合能力和膜融合活性，但由于缺乏病毒RNA，它们在结合后无法在细胞中诱导感染。此外，这种结合能力使它们的免疫原性比亚单位和分裂病毒流感疫苗更高。病毒体作为一个完美的递送系统，能够将抗原转移到抗原呈递细胞（APCs）的细胞质中，并诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。然而，由于它们的佐剂特性较弱，病毒体在激活APCs和促进交叉呈递方面效率不高。这种固有限制可以通过添加更强的佐剂来消除。例如，最近开发了一种新型基于病毒体的流感疫苗，该疫苗补充了Toll样受体4（TLR4）配体单磷酸脂A（MPLA）和金属离子螯合脂质DOGS-NTA-Ni吸附到膜中。体外实验表明，吸附了MPLA的病毒体能够比没有添加佐剂的病毒体更强地激活APCs。此外，用这些MPLA佐剂病毒体对小鼠进行体内免疫接种，结果诱导了特异性CTLs。 流感病毒体的制造包括使用洗涤剂八(乙二醇)-n-十二烷基单醚（C12E8）溶解病毒包膜，随后进行超速离心和去除病毒核衣壳。然后，使用疏水珠从上清液中去除洗涤剂，随后病毒膜脂质和包膜糖蛋白重新组装形成大约100-200纳米的颗粒。已经证明，这个过程能够生产出与野生型病毒融合特性非常相似的流感病毒体。流感病毒体通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后与内体膜融合。不同的大分子可以封装在病毒体腔内，由于膜融合活性，能够到达目标细胞的细胞质。例如，已经证明，封装在病毒体中的DTA（白喉毒素的A亚单位）可以成功地运输到目标细胞的细胞质中，导致蛋白质合成的完全抑制。甚至质粒DNA也可以封装在由阳离子脂质形成的病毒体中。这种病毒体DNA可以用来有效地转染目标细胞。 病毒体递送系统和佐剂的显著优势在于它们能够通过疏水脂质相互作用将抗原吸附到它们的表面和腔室上。此外，与VLPs相比，病毒体在疫苗生产中更受青睐，因为后者由于其基于蛋白的结构而具有更有限的运动。此外，将抗原吸附到病毒体流动的磷脂双层表面刺激与宿主细胞受体的相互作用。FDA已经批准病毒体作为人类使用的纳米载体，因为它们具有非常高的耐受性和安全性。与亚单位疫苗相比，病毒体能够诱导强大的体液和细胞免疫，与自然感染和其他强效佐剂非常相似。 迄今为止，除了上述两种基于病毒体的流感和甲型肝炎疫苗外，还有几种基于病毒体的疫苗正在研究中，包括针对HIV、HPV、RSV和疟疾的疫苗。HIV病毒体疫苗在临床第一阶段显示出可接受的结果，可能很快就会上市。尽管疫苗可以通过肌肉内或皮下途径给药，但粘膜途径可能会引发更强的免疫反应，因为HIV传播的主要途径是通过粘膜组织。因此，强烈的粘膜抗体产生是抵御HIV感染的重要防御机制。一种基于HIV的病毒体疫苗是通过吸附一些HIV-1毒力抗原（如gp41和p1肽）并包括佐剂3M-052（一种增加病毒体膜刚性的热稳定佐剂）从流感病毒中制备的。在另一项研究中，一种热稳定的HIV-1病毒体疫苗由带有HA、NA、卵磷脂、脑磷脂和其他磷脂的流感病毒体组成，另外还包括3M-052、Toll样受体（TLR7/8）和糖分子海藻糖。 关于HPV，一些研究关注了基于病毒体的疫苗的效力，这些疫苗包含通过受体介导的内吞作用与宿主细胞膜融合的E6和E7蛋白。研究表明，重组HPV16 E7流感病毒体诱导了强烈的CTL反应，并防止了HPV16+转化癌症的发展。此外，用E7-病毒体免疫接种诱导了针对E7的IgG抗体反应。 3.免疫增强剂 3.1.TLR1/2激动剂 在TLR1/2激动剂中，L-pampo是一种强大的佐剂系统，由Pam3Csk4（Pam3）和多聚肌苷酸：多聚胞苷酸（polyI:C）组成，分别是强大的TLR1/2和TLR3激动剂。在Lee等人的研究中，L-pampo诱导了比氢氧化铝更强的针对HBV的抗体产生，并且还涉及细胞介导的免疫反应，如增加多功能CD4+ T细胞。此外，L-pampo也被研究作为针对SARS-CoV-2的强效佐剂。具体来说，SARS-CoV-2抗原（如受体结合域（RBD）和S1抗原或与L-pampo结合的RBD-Fc）刺激了比广泛使用的佐剂更强的针对SARS-CoV-2的体液和细胞免疫反应。 此外，细菌脂蛋白是TLR2识别的最强效的配体。已经表明，源自细菌脂蛋白的合成脂肽是B细胞和巨噬细胞的强激活剂，可以用作疫苗佐剂。来自发酵支原体的2 kDa巨噬细胞激活脂肽-2 (MALP-2) 通过TLR2-和MyD88依赖的信号传导途径激活免疫细胞。除了MALP-2，Pam2CSK4和Pam3CSK4是公认的TLR2激动剂，它们已被评估为针对利什曼病、疟疾和流感等传染病的治疗剂。 TLR3激动剂 在TLRs发现之前，合成的双链RNA polyriboisosinic:polyribocytidylic acid [poly(I:C)] 被发现具有很强的诱导IFN产生的能力。TLR3，一个检测病毒双链RNA的内质体受体，识别poly(I:C)，因为它在结构上模仿病毒RNA，从而诱导I型IFN和III型IFN的产生，并引发Th1细胞因子反应。由TLR3-poly(I:C)相互作用产生的I型IFN对于传统的树突状细胞(cDCs)有效地激活CD8 T细胞反应尤为重要。此外，poly(I:C)产生的I型IFN刺激T细胞的克隆扩增，增加效应T细胞的比例和抗原特异性B细胞的数量。基于所有这些原因，poly(I:C)已被广泛研究作为潜在的佐剂。然而，poly(I:C)对人类具有毒性。因此，科学家们的关注集中在poly(I:C)的衍生物上，如poly(ICLC)和poly(IC12U)，以及其他合成TLR3激动剂，如ARNAX、IPH 3102和RGC100。poly(ICLC)是聚-L-赖氨酸羧甲基纤维素，与poly(I:C)类似，能够刺激IFN的产生。然而，它对血清核酸酶表现出更高的抵抗力，同时具有更高的免疫刺激性。poly(ICLC)的一个有趣方面是其能够诱导先天免疫途径中其他几个遗传序列的表达，包括炎症体和补体系统，类似于活病毒疫苗。迄今为止，一些研究已将poly(ICLC)作为针对疟疾、HIV和癌症的疫苗候选物。已经表明，与其他TLR激动剂如LPS和CpG相比，poly(ICLC)能够引发更强的Th1免疫反应，这在疫苗接种中是一个积极方面。poly(IC12U)旨在通过尿嘧啶和鸟苷残基之间的不匹配来降低poly(I:C)的毒性。然而，尽管这种变化降低了毒性，但它产生的I型IFN比poly(I:C)少。与poly(I:C)和poly(ICLC)不同，已经表明poly(IC12U)能够结合TLR3但不结合MDA5。与poly(ICLC)类似，一些研究已将poly(IC12U)作为针对HIV、流感和癌症的疫苗中的佐剂。具有佐剂潜力的新型TLR3激动剂ARNAX是一种特异于TLR3的配体，特别生产出来以降低比poly(I:C)更低的毒性。poly(I:C)的毒性与其激活MAVS途径(激活RIG-I和/或MDA5)的能力有关。因此，Matsumoto等人开发了一种配体，包括GpC磷酸硫代寡脱氧核苷酸和双链RNA，该配体被TLR3识别并内化为内质体。该配体能够在不被MDA5检测的情况下激活TLR3，这是由于RNA链的相对较短长度。在小鼠模型中，该佐剂未能显著增加血清炎症细胞因子水平，但有利于DCs对抗原的交叉呈递，并引发Th1型反应。ARNAX研究的两个最重要领域是癌症免疫治疗和流感疫苗接种。 3.2.TLR4激动剂 作为疫苗佐剂研究的TLR4激动剂是AS01、AS02和AS04，它们都含有MPLA，即内质体TLR4的配体。具体来说，AS01已被用于开发针对疟疾、HIV和结核病的疫苗。AS01是一种结合佐剂系统，由MPLA和QS-21两种不同的免疫刺激性分子组成，它们被封装在脂质体结构中。QS-21是从皂皮树Molina的树皮中提取的天然三萜皂苷。这两种化合物使用脂质体作为载体，通过胆固醇依赖性内吞作用到达细胞。在细胞内，QS-21导致溶酶体不稳定，并促进蛋白激酶SYK的激活。MPLA连接内质体TLR4，诱导TRIF依赖性信号传导途径。单独使用QS-21具有重要且不利的溶血效应，诱导细胞死亡。然而，QS-21的溶血活性和随后的细胞死亡通过封装在脂质体中被消除。AS01激活caspase-1，从而促进NLRP3炎症体激活和APCs释放IL-1β以及IL-18。IL-18的释放导致IFN-γ的快速产生，特别是通过淋巴结中的自然杀伤细胞，从而促进DCs的成熟和Th1型免疫反应的诱导。 3.3.TLR5激动剂 TLR5是识别细菌鞭毛蛋白的受体，由多种免疫细胞表达。与配体的联系导致炎症途径的激活和许多炎症介质的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮。此外，鞭毛蛋白能够引发Th1和Th2反应，与其他只能主要诱导Th1反应的TLR配体不同。此外，鞭毛蛋白通过激活NLRC4炎症体诱导IL-1β的产生和释放。鞭毛蛋白能够在TLR5或NLRC4非依赖模型中发挥佐剂活性，但效率低于野生型。事实上，当小鼠模型中两个受体都不出现时，佐剂能力大大降低，这表明至少需要一个受体来驱动免疫反应；两者的存在提供了最佳的免疫结果。已经表明，鞭毛蛋白在免疫功能低下的人中保持其佐剂能力，例如在HIV+患者中。Cui等人回顾了所有使用鞭毛蛋白作为佐剂的研究。最简单的方法是将其与抗原一起给药；这种简单的方法成功地诱导了对抗呼吸和胃肠道感染至关重要的粘膜免疫反应。已经进行了许多研究，特别是关于鞭毛蛋白作为流感疫苗佐剂的作用。在这些研究中，使用了与不同流感抗原结合的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白，其中包括灭活PR8流感病毒(IPR8)、HA(H5N1)和禽流感病毒(AIV) H5N1，对于每一种抗原，都获得了强大的免疫反应（特别是粘膜IgA产生）。鞭毛蛋白还可以成功地修改以获得嵌合鞭毛蛋白或与活性减弱细菌如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)中的抗原鞭毛蛋白复合物。此外，重组鞭毛蛋白-抗原融合蛋白的生产已在动物模型中作为佐剂疫苗用于传染病和癌症。迄今为止，至少有三种使用鞭毛蛋白作为佐剂的疫苗处于临床试验阶段：两种针对流感病毒，一种针对鼠疫杆菌。 3.4.TLR7/8激动剂 一些研究表明，TLR7/8激动剂能够强烈诱导Th1免疫反应。配体与TLR7/8结合产生高水平的I型IFN、IL-12、TNF-α和IL-1β。此外，TLR7/8和TLR9激动剂是唯一能够激活并促进cDCs和浆细胞样树突状细胞(pDCs)克隆扩增的激动剂分子，同时动员CD14+CD16+炎症单核细胞和CD14dimCD16+巡逻单核细胞。最重要的代表性TLR7/8激动剂是一些名为伊马替莫德(R837)和雷西莫德(R848)的合成小分子，它们属于咪唑喹啉类。伊马替莫德目前已获批准并许可用于治疗生殖器疣、表浅基底细胞癌和角化病，而雷西莫德已研究其抗病毒和抗癌治疗用途。 然而，这些小分子已被证明具有一些固有的局限性。特别是，它们可以从给药部位扩散开来，远离抗原，从而降低效果并引起全身副作用。因此，已经表明将这些分子直接结合到铝佐剂上能够提高疫苗的效力。一些先前的研究将咪唑喹啉类直接结合到HIV-1 Gag蛋白或整个灭活的流感病毒上，增加了Th1反应和抗原特异性T细胞的数量。此外，与合成聚合物支架、脂质-聚合物两亲物、聚乙二醇(PEG)、纳米凝胶、明矾和各种其他合成聚合物的结合显著增加了咪唑喹啉的传递，并改善了树突状细胞的成熟和抗原特异性T细胞。此外，先前使用咪唑喹啉与一种或多种其他TLR激动剂（如MPLA（TLR4）和MPLA + CpG ODN（TLR4和TLR9））混合的研究显示，这种组合增加了先天免疫反应，显著产生抗原特异性中和抗体并改善Th1反应。所有这些创新方面都突出了TLR7/8激动剂作为佐剂候选物的极好潜力。 3.5.TLR9激动剂 TLR9自然识别由未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸代表的细菌DNA基序，通过MyD88依赖途径驱动先天免疫系统的激活。这些分子基序已被用作具有特定修饰的合成佐剂，以防止被核酸酶降解。CpG-ODNs在自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDCs)中引起强烈的化学因子、细胞因子和抗体产生，推动强烈的Th1型免疫反应。迄今为止，已经开发了属于三个类别（A-C）的三种不同类型的CpG-ODN配体，但只有属于类别B的分子已在临床试验中用作佐剂。CpG-B ODN定位于内质体并引起pDCs的成熟。此外，CpG-B ODN可以直接与B细胞相互作用以增强抗体产生。在小鼠模型中已经表明，作为佐剂的CpG-B ODN引起了相当持久的抗体产生，比铝佐剂或无佐剂疫苗更好。最近许可的CpG 1018，一种具有高化学稳定性和佐剂能力的寡核苷酸，能够引发Th1型免疫反应，用作乙肝疫苗Hepli-Sav-B中的佐剂。在Hepli-Sav-B中，CpG 1018提高了疫苗效力，只需要两剂的接种计划，相比之下传统乙肝疫苗需要三剂才能获得最佳保护。迄今为止，CpG 1018正在研究开发多种疫苗，包括针对黑色素瘤和COVID-19的疫苗。另一种CpG ODN，CpG 7909，也在临床评估中，并在HBV和疟疾疫苗接种中显示出令人鼓舞的结果。还开发了其他下一代TLR9激动剂。一个有效的代表是MGN1703，一种包含CG基序的小DNA分子，但其结构与CpG ODN不同。MGN1703由一段反向互补的DNA组成，中间是双链的，两侧是两个单链环，包括三个未甲基化的CG基序，形成一个哑铃形结构，与线性分子的CpG ODN形成对比。MGN1703已作为疫苗中的佐剂进行了测试，发现它能够激活先天和适应性免疫反应，副作用轻微或暂时。 4.佐剂的潜在副作用：ASIA综合征 尽管疫苗的安全性极佳，但近年来，人们对其可能的负面效应产生了新的关注，并在众所周知的上述副作用之外，描述了一种新的疾病实体。该实体是由佐剂引起的自身免疫/炎症综合征(ASIA)，首先由Shoenfeld等人提出。这种综合征包括一些免疫介导的疾病，很可能在遗传易感个体接触佐剂后发生。这种综合征的特征主要是产生自身抗体，并且一旦移除触发因素就会改善。在这种综合征的发作初期，一些外部因素，如感染性病原体或佐剂（例如尘埃、硅胶、铝盐等），作用于由特定HLA抗原介导的易发遗传背景，与自身免疫疾病(ADI)的发展相关。特别是，HLA-DRB1和PTPN22基因的同时存在已被证明是这些患者中最常见的自身免疫背景。根据最近的科学证据，一些病理状况，如结节病、Sjögren综合征(SS)、未分化结缔组织病(UCTD)、硅胶植入物不兼容综合征(SIIS)和免疫相关不良事件(irAEs)是ASIA综合征背景下的典型例子。除了疫苗中常见的佐剂外，许多其他物质如硅胶、石蜡、透明质酸、丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯也显示出佐剂特性。 根据Watad等人的说法，有两种类型的标准可以帮助诊断ASIA，分为主要和次要标准。主要标准包括在临床表现之前接触各种外源性刺激（感染、接触佐剂）以及出现典型的临床表现，如肌痛、肌炎、关节痛、关节炎、慢性疲劳、睡眠障碍、脱髓鞘、记忆丧失、发热和口干。次要标准包括自身抗体或针对佐剂的抗体的出现、特定HLA模式的存在（例如，HLA DRB1、HLA DQB1）以及自身免疫疾病的发展，即多发性硬化症或系统性硬化症。 一些先前的研究报告称，含有铝盐的疫苗有能力引发ASIA的发作。一个例子是由四价HPV疫苗（含铝盐）代表的，据报道在接种后几周内增加了易感个体自身免疫的风险，或乙肝疫苗。然而，Linneberg的一项重要研究关于铝盐的潜在副作用表明，接受皮下过敏免疫疗法的人多次接种含有氢氧化铝作为佐剂的过敏原，然后接受的铝量比三剂疫苗中包含的量高出约100倍，死亡率较低，并且比接受常规过敏疗法的对照组发展出更少的自身免疫疾病。科学家们的努力转向研究生物标志物以诊断ASIA或预测其易感性（除了前面已经提到的）。例如，ACE 1和IL-2受体在患有这种综合征的个体中增加了50%，维生素D的缺乏增加了ASIA的发病率（由于缺乏免疫调节效应）。强调易感性在ASIA的发作中似乎非常相关是很重要的，Watad等人通过分析500例ASIA综合征的病例很好地突出了这一点。这项研究表明，更高比例的女性个体、吸烟者以及那些以前有自身免疫疾病或家庭成员受影响的人患有ASIA。多基因自身免疫疾病在这些疾病中最常见，UCTD和Sjögren综合征的患病率最高，分别为38.8%和16.8%。在54.4%的自身抗体检测阳性的患者中，有48.2%是ANA阳性。考虑到自身免疫/炎症状态的发展背后有环境和遗传因素，这是显而易见的。暴露于疫苗接种和症状发作之间的中位时间为一周（2天至5年）；48.2%的人口在至少接触一次疫苗后出现临床症状。然而，除了这些科学证据外，一些研究显示接种佐剂疫苗和ASIA综合征之间没有关系。在这些研究中，已经表明疫苗接种和自身免疫之间的关联可能是由于混杂因素的存在和随机事件的结果，而不是真正的因果关系。疫苗接种或接触外来物质与潜在的自身免疫/炎症和免疫介导事件之间的可能联系不应该是降低疫苗接种覆盖率的“假神话”。 疫苗不良事件确实非常罕见。由于缺乏信息和强有力的数据，ASIA是一个恰当的总括术语，用来汇集与疫苗、硅胶或其他外来物质暴露作为共同根源的事件和表面上无关的反应。重要的是要强调，即使未来的研究显示佐剂和自身免疫之间存在真正的相关性，这也不会减少疫苗免疫实践所发挥的巨大且无可置疑的保护作用，它们提供了许多临床益处；事实上，疫苗已经有助于根除和控制许多可传播疾病，改善了人类生活质量。 5.结论 疫苗接种一直是并将继续是人类对抗传染病最有力的武器之一。多亏了这些有效且安全的预防工具，人类已经能够从世界许多地区根除人类历史上最可怕的敌人。最近COVID-19大流行很好地突出了疫苗接种的重要性，疫苗研究必须取得进一步进展，为未来的大流行做准备。疫苗的效果基于佐剂的基本属性和贡献。关于疫苗接种的未来，必须更加关注这些分子，以生产越来越安全有效的疫苗。这一领域的研究正在进行中，并且有几种产品正在研究中，以实现这一目标，造福人类。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 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