FLU-v(Imutex Ltd.)

摘要本综述分析了乙型流感的流行病学和生态学特征，乙型流感是最常见和最严重的呼吸道感染的流感病毒之一，介绍了开发交叉保护性乙型流感疫苗的各种策略，包括重组病毒、病毒样颗粒和重组蛋白，概述了病毒蛋白作为交叉保护性疫苗靶标，以及其他更新的广泛保护性疫苗策略。开发这种疫苗的重要性不仅在于预防乙型流感，还在于实现根除乙型流感病毒的愿景。关键词：乙型流感，病毒，系统发育谱系，病毒蛋白，单克隆抗体，交叉保护疫苗。1、背景乙型流感是最常见的引起呼吸道感染的流感病毒之一，会造成相当大的公共卫生负担。多项研究表明，20%-30%的流感病毒感染是由乙型流感病毒引起的。全球乙型流感研究（GIBS）数据库中一共覆盖了31个国家的820,301,2000例流感病例（2000年至2018年），其中，乙型流感病例数达419,167例（占23.4%）。在一些流感流行期间，与乙型流感有关的疾病的登记频率与甲型H1N1流感或甲型H3N2流感相同，甚至更常见。乙型流感病毒是流感流行相关发病率和死亡率的重要因素。疫苗毒株的选择具有复杂性，一方面，因为存在两种抗原性不同的系统发育谱系B/Yamagata和B/Victoria以及B/Yamagata谱系的两个分支之间的循环传播；另一方面，乙型流感病毒因不同地区的流行株不同而导致世卫组织推荐的疫苗毒株也可能与在特定地区传播的病毒不匹配。所以，开发一种具有广泛保护作用的疫苗毒株是必要的。世卫组织在“世卫组织下一代流感疫苗的首选产品特性”中宣布的今后十年最紧迫的任务之一是制造对严重和复杂形式的甲型和乙型流感提供长期保护的疫苗。许多国家正在开发这种通用疫苗，但重点是甲型流感疫苗。在本文中，我们试图概述交叉保护乙型流感疫苗的当前发展。流感疫苗病毒内部蛋白质（如PB1，NP和M1）的T细胞表位以及血凝素蛋白HA、神经氨酸酶NA的保守表位是开发设计针对B型流感的广泛保护性疫苗的基础。另外，研究mAb库将有助于鉴定靶蛋白/多肽抗原，并指导新型IBV疫苗的设计，以实现更广泛的保护。2、乙型流感感染的流行病学和生态学特征乙型流感病毒通常与甲型流感病毒共同传播，参与了几乎所有年度流感流行，并且在一些流行中占主导地位。世卫组织俄罗斯国家流感中心（圣彼得堡斯莫罗金采夫流感研究所）也获得了类似的数据。在过去十年的三个流行季节（2012-2013年，2014-2015年，2016-2017年），乙型流感相关疾病的登记频率与甲型流感（AH1N1，AH3N2）相同。在2017-2018年的流行中，乙型流感相关疾病比甲型流感引起的疾病高两倍（未发表的数据）。根据GIBS数据库，每七个流行季中约有1个的主要病毒类型是乙型流感病毒。乙型流感病例占流感总病例的比例因地域而异。与北部或南部半球的温带国家相比，热带区域国家的中位值显著更高。大多数IBV感染发生在儿童和青少年中。人们普遍认为，乙型流感的感染程度低于甲型流感，但目前的研究对这一概念提出了挑战。甲型流感和乙型流感在住院频率、ICU收治率或住院流感患者的死亡率方面无差异。此外，乙型流感在较年轻年龄组和14岁或以上人群中被描述为更严重的疾病。2017-2018年乙型流感主要流行的季节是重症病例最多的季节。根据欧盟/欧洲经济区国家的信息，在重症监护室报告的所有乙型流感感染病例和已知结果中，21%患者在2017/18年度死亡。在致命的乙型流感病例中，79%患者为60岁或以上。在B/Yamagata病毒主导的2012-2013季节也观察到病毒类型与年龄之间的类似相关性。在2019-2020年流感季节，65岁或以上的成年人因乙型流感感染而住院率最高。在≥10岁（相对于<6月龄）的儿童中，与乙型流感感染相关的死亡比例高于甲型流感，且与ICU收治几率相关性最大。一项对美国2004-2019年流感监测数据的分析显示，确诊流感的儿科死亡病例中有7%-51%与乙型流感相关，其中不包括2009-2010年大流行性死亡率。在2012-2013季节，美国乙型流感致死病例的儿科死亡人数达到致命性儿科流感病例的52%。由于第二种抗原性不同的FLUBV谱系的出现，以及社会因素（人口结构变化、城市化进程加快、全球人口流动性增加），FLUBV的进化和传播正在加速。与甲型流感病毒不同，尚未发现乙型流感病毒持续存在动物宿主的证据。仅报告了在海豹中分离到乙型流感（图1) 。研究还表明，猪容易感染乙型流感病毒。一项针对家猪群的血清学调查显示，7.3%的猪血清检测到乙型流感病毒抗体。此外，通过RT-PCR在从PRRSV（猪繁殖和呼吸综合征病毒）猪身上收集的三种鼻拭子中检测到乙型流感病毒。在实验环境中，FLUBV能够在豚鼠和雪貂的呼吸道中复制。然而，不能排除FLUBV的宿主范围比目前理解的要广，或者它们可能会随着时间的推移而扩大。图1 甲型和乙型流感病毒的天然宿主FLUBV 的重要流行病学特征（可能出现全新的大流行病毒）主要受到以下因素的制约：几乎不存在天然储库；人类和动物流感病毒之间缺乏基因重组。在不同的FLUBV谱系中存在基因重组。由于编码血凝素 （HA）、神经氨酸酶 （NA） 和 NS1 的基因突变的积累，也会出现抗原漂移。总体而言，这些表明FLUBV具有很高的适应性进化水平。根据 HA 抗原和基因变异，确定了两个不同的 FLUBV谱系。至少从 1983 年起，这些不同的品系（B/山形/16/88-like（BYam）或 B/维多利亚/2/87-like（BVic）病毒）就在全球范围内共同流行。根据中国科学家的研究，这两个主要的 HA 支系可能在20 世纪70年代初开始分化，维多利亚支系是由一个次要支系逐渐进化而来。如前所述，HA的特征将它们区分开来。到 1988 年，这两个血统的 HA1 结构域已有 27 个氨基酸残基不同。此时在 HA2 结构域之间检测到的氨基酸变化很少，系统发生学分析表明，流行的 B/Yamagata/16/88-like 病毒和 B/Victoria/2/87-like 病毒的 HA2 结构域也属于不同的谱系。然而，这两个 FLUBV 世系之间的 HA 氨基酸序列同源性高于季节性 FLUAV 两个亚型之间的同源性。全基因组分析表明，山形/维多利亚的差异不仅限于HA基因。PB1和PB2 系统发生树显示出与 HA 基因类似的深度分化。PB1 基因、PB2 基因和 HA 基因始终来自一个单系 。因此，Yamagata/Victoria 区分目前仅限于 PB2-PB1-HA 复合体。尽管一些研究表明交叉反应性血清抗体可能很重要，但两种 B 系之间的抗体交叉保护作用被认为很低。https://www-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/pmc/articles/PMC6338745/（访问日期：2022 年 3 月 20 日）-CR16 在实验条件下，BYam 系可能会诱导维多利亚系的交叉抗体反应，但反之则不那么有效。对从接种四价季节性疫苗（IIV-4）的个体中分离出的 B 细胞记忆和单克隆抗体（mAbs）的调查证实了 B/Yamagata H。这两个品系出现后，BVic 在 20 世纪80年代末占主导地位，而 BYam 则在 20 世纪 90 年代占上风。自 2001 年以来，FLUBV 的两个品系在每个流行季节都在全球范围内共同流行。此外，在同一季节和某些地区，两个品系的病毒可以以不同或相同的比例共同流行。Vijakrishna 等人的研究表明，一般来说，BYam 的抗原保守性和抗原漂移性较弱。与 BVic 相比，它们通过抗原漂移进化的能力较弱，受到的免疫选择压力也较小。BVic 系病毒在受体结合位点（RBS）附近的 HA 中含有更多的 氨基酸替换。而 BYam 病毒的变化频率较低，往往出现在距离 RBS 较远的位点上。后来，Langat 等人 利用更大的 FLUBV 全基因组序列数据集（2651 个）和更全面的分析模型，发现 BVic 和 BYam 系之间的抗原漂移率没有显著差异。这支持了 Bredford的观点。虽然 BVic 和 BYam 系的抗原漂移率相当，但它们的进化动态却不同。Yamagata系病毒形成了两个共同循环的支系：支系2（B/马萨诸塞州/02/2012）和支系3（B/威斯康星州/1/2010），它们也在整个病毒基因组中进行基因分离，而Victoria系病毒则表现出单一支系的抗原漂移。BYam群体长期缺乏系内重配，并表现出抗原群之间的交替优势。与此相反，BVic 病毒则有证据表明，随着时间的推移，Victoria 系内各支系之间会发生重配。BVic 病毒在广泛传播之前，在局部地理区域存在的时间更长。一般来说，系统发生分析表明，BYam/BVic 的系间重配（NA、NP）比 Yamagata 的系内重配更频繁。有趣的是，BVic 病毒获得 BYam 基因的系间重配比反向重配更为频繁。BYam和BVic共循环系病毒也会发生PA、NP、NA/NB、M1/BM2和NS1/NS2等片段的重组。大多数研究表明，在年轻人群中，BVic 病毒系比 BYam 病毒系更占优势。利用全球乙型流感监测（GIBS）数据库对两种病毒系的流行病学特征进行的综合比较分析也证实，乙型脑炎病毒和乙型脑炎病毒感染者的年龄分布不均。结果表明，比亚酶病例的平均年龄大于乙型脑炎病例。在大多数国家，BVic 病例往往沿着单峰曲线分布在年轻人（0-25 岁）中，10 岁以下为高峰。而白细胞介素瘤病例的年龄分布往往呈双峰曲线：一个较大的主峰（"10 岁以下者"）和一个较小的次峰（通常为 "25 至 50 岁者"）。一种可能的解释是，BVic 病毒和 BYam 病毒感染后的免疫持续时间不同。造成年龄分布不均的另一个原因是，不同血统的病毒会优先结合人体呼吸道中的不同硅酸受体。BVic病毒似乎同时具有结合α-2,3-和α-2,6-链式硅酸的能力；BYam病毒则主要结合α-2,6-链式硅酸。众所周知，与成人相比，α-2,3-连接的硅唾液酸聚糖在儿童呼吸道组织中的表达量更高。利用 GIBS 发现了一个有趣的趋势：BVic 和 BYam 感染的地理分布不均。BVic在热带国家相对更常见，而BYam在温带气候国家更常见。FLUBV 两种病毒系地理分布不均的一个更可能的原因是全球各国的人口结构各不相同。热带国家的平均中位年龄低于温带气候国家。3、乙型流感病毒和基因组结构，作为交叉保护疫苗靶点的病毒蛋白乙型流感病毒与甲型流感病毒一样，都属于正粘病毒科。两种病毒的基因组都由八个负义单链 RNA 片段组成，编码 11 种蛋白质。在这两种病毒中，FLUA 和 FLUB 的 1、3、4 和 5 号片段每个片段只编码一种蛋白质：分别是 PB2、PA、HA 和 NP 蛋白（图 2）。图2 甲型流感病毒（左侧）和乙型流感病毒（右侧）基因组结构乙型流感病毒有一些不同之处。FLUAV 的第 2 段编码聚合酶亚基 PB1。在某些毒株中，该片段还编码具有凋亡活性的小辅助蛋白 PB1-F2。FLUBV 基因组中没有编码这种附属蛋白的片段。FLUAV 的第 6 个基因片段只编码 NA 蛋白，而 FLUBV 的第 6 个基因片段同时编码 NA 蛋白和 NB 基质蛋白。甲型流感病毒和乙型流感病毒的第 7 个区段都编码 M1 基质蛋白。第 7 节还通过 RNA 剪接编码 FLUAV 中的 M2 离子通道。在 FLUBV 中，BM2 膜蛋白由第 7 节段在交替（+2）阅读框中表达。BM2 是产生有活力的病毒后代所必需的，M2 在病毒中的结合减少会降低病毒的感染性。第 8 节编码干扰素拮抗剂 NS1 蛋白，并通过 mRNA 剪接编码 FLUAV 和 FLUBV 的 NEP/NS2 蛋白。一般来说，乙型流感病毒的组织结构与甲型流感病毒相似，有四种包膜蛋白：HA、NA、BM2 和 NB（而不是 M2）。与 FLUAV M2 蛋白一样，BM2 蛋白也是一个对 pH 值敏感的质子通道，对解衣过程至关重要。BM2 蛋白形成四聚体，极性残基衬托着形成的孔隙，这是金刚烷对 BM2 缺乏活性的一个重要特征。NB 蛋白是乙型流感病毒所特有的。它与病毒结合在一起，具有：18 个残基的 N 端外结构域、22 个残基的跨膜结构域和 60 个残基的细胞质尾部。NB 蛋白被认为也具有离子通道活性。但与离子通道 BM2 不同的是，NB 在跨高尔基网络中没有 pH 调节活性（AM2、BM2 和 CM2 离子通道具有这种活性）。研究表明，体外病毒复制不需要这种蛋白质，但它能促进体内病毒的有效复制。在感染动物体内，缺乏 NB 的病毒诱导的 IFN-ɑ 水平较低，但滴度和体重不变。血凝素是流感病毒的主要表面糖蛋白。它负责病毒附着，并通过与硅酸的相互作用进入宿主细胞。功能性 HA 单元是一个同源三聚体，每个单体由 HA1 和 HA2 两个结构域组成，通过二硫键连接。HA2 形成膜锚和长α-螺旋 "茎 "或 "柄"，HA1 形成远端球状头部，其中包含受体结合位点（RBS）和大部分抗原位点。HA 的头部结构域包含四个免疫优势、高度可变的抗原位点：120 环、150 环、160 环和 190 螺旋。这些是中和抗体的主要靶点，并会发生抗原漂移。中和抗体通过阻断（HA头部的）RBS与（宿主细胞上的）sialic acid受体之间的相互作用来防止感染。通过抗体的 Fab 片段与 HA RBS 之间的相互作用，阻止 HA 附着在细胞上。预防或减轻流感感染的其他方法包括：在病毒进入细胞时抑制病毒与内体膜之间的相互作用；抑制病毒排出；以及 Fc 受体介导的效应器功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）。这些Fc-Fcγ受体相互作用是广谱反应性HA头、HA柄和NA定向抗体在体内介导保护所必需的。广谱中和抗体（bnAbs）在这些过程中发挥着关键作用。值得注意的是，在成年人群中，非经典位点诱导的 HI 抗体滴度几乎与经典位点诱导的抗体滴度一样高，而且非经典抗体反应似乎随着年龄的增长而增加。4、将保守蛋白表位作为开发广泛保护性乙型流感疫苗的目标抗原要成功开发具有广泛保护作用的乙型流感疫苗，就必须了解保守表位的位置和具有广泛保护作用的抗体的作用机制。过去十年中，许多针对 IBV 表面蛋白 HA 和 NA 具有广泛反应性的 mAbs 已被描述。通过非中性抗体依赖性效应器功能的被动转移，已在小鼠体内证实了针对这两种病毒的保护作用。在特定情况下（季节性疫苗株、原发性人类感染），IBV 株系之间的交叉反应性体液反应也已得到描述。针对体内 FLUBV 感染的广泛 FLUBV 识别和广泛的预防/治疗保护可由替代表位介导。具有广泛保护作用的 mAbs 可结合以下部位的保守表位：HA 的柄部、HA 头底部的残余酯酶结构域、HA 球状头部的特定区域以及 NA 酶切位点。值得注意的是，具有广泛保护作用的 HA 靶向 mAbs 与 FLUAV 和 FLUBV 不同。对于 FLUAV，大多数广谱保护性 mAbs 都以柄结构域为靶标；只有少数特殊的 mAbs 与保守的头部结构域表位结合。对于 FLUBV，广谱保护性抗头部抗体更为常见。表 1 列出了其中一些 mAbs。表1 针对乙型流感病毒的交叉反应性单克隆抗体reyfus 等人利用接种疫苗的人的 B 细胞获得了三种广谱中和抗体，这些抗体与两种血统的 HAs都有结合：CR8033、CR8071 和 CR9114。分别给小鼠注射低剂量的这些 mAbs 可完全保护小鼠免受 BYam 和 BVic 系病毒的侵袭。CR8033 和 CR8071 mAbs 可在体外中和 FLUBV 两系的代表性病毒。CR9114 mAb 在体外没有显示出中和活性，但在体内却能提供完全的抗感染保护；这表明 Fc 介导的效应机制参与了抗体的作用。值得注意的是，CR9114 mAb 对甲型流感 H1、H3、H7 和 H9 亚型也有保护作用。抗体 CR8033、CR8071 和 CR9114 识别不同的抗原 HA 表位。根据三维重建，CR8033 的三个 Fabs 与受体结合袋和周围抗原位点重叠的表位上的 HA 三聚体结合。CR8071 与 HA 头底部的残余酯酶结构域结合。CR9114 结合并中和甲型和乙型流感 HA 柄上的一个表位。一种源自人类的 mAb（5A7）能够通过结合柄中 HA1 的 C 末端来中和 FLUBV。在小鼠模型中显示了它对 BVic 株致死性感染的保护作用。三种 mAbs（34B5、33F8 和 46B8）能中和 FLUBV 的两个品系和祖先毒株。抗体 46B8 对所有测试过的 FLUBV 株系都最有效（在中和试验中），时间跨度超过 70 年。它与 HA 的残余酯酶结构域中的一个保守表位结合，通过阻止膜融合步骤中低 pH 引起的 HA 构象变化来阻断 FLUBV 感染。不过，它并不能阻止病毒附着到细胞表面受体上。46B8 mAb 介导的抗体依赖性细胞毒性，虽然不能排除其他 Fc 依赖性效应器功能（如抗体依赖性吞噬作用、抗体依赖性呼吸溶解作用）对 46B8 的体内保护作用的贡献。C12G6 mAb 可交叉中和跨越 76 年 FLUBV 抗原进化史的代表性病毒，包括 BYam、BVic 和早期毒系的病毒。C12G6 具有广泛的预防和治疗活性（在小鼠和雪貂中），效果与奥司他韦相当。表位图显示，C12G6 的目标表位与 HA 区域的受体结合位点重叠。这说明了为什么它能如此有效地中和病毒。C12G6 可通过抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性反应抑制 FLUBV（阻止病毒进入、排出和 HA 介导的膜融合）。利用单细胞筛选技术从人类 B 细胞中获得了一些与 HA 中和或非中和的 mAbs。这些 mAbs 可识别来自两种血统的 HA。其中 11 种是柄结合型非中和剂，9 种是中和剂。后者中有四种在 HI 试验中表现出活性，但未作进一步分析。利用肽与支架的化学连接（CLIPS）技术确定了四种柄结合型中和 mAbs（不包括 TRL847）和两种以前发表的 FLUBV 柄结合型 mAbs 5A7和 CR9114）的表位。在某些情况下可以看到肽识别的趋同模式。例如，TRL849 mAb 和先前表征的 CR9114 mAb 可识别一组相关的肽，尽管它们的 氨基酸序列不同，体内活性也不同。三种 mAb（TRL845、TRL848 和 TRL849）对两种 IBV 系的多种菌株具有广泛的反应性和中和性。它们以及已发表的 mAb 5A7 在体内显示出很高的疗效。Arunkumar等人获得并鉴定了22种针对FLUBV HA的广义反应性（小鼠）特异性mAbs，其中相当一部分mAbs能识别并结合柄上的保守结构域（准确地说，是α螺旋上的）。虽然这些 mAbs 在体外对多种纯化的 FLUVs 没有显示出中和活性，但它们能完全或部分抵御来自两种血统的致死剂量的 FLUBV。在蚕特异性 ADCC 报告实验（测量与 Fcγ 受体的接触）中，保护水平与各自 mAbs 的活性之间也显示出很强的相关性。作者认为保护作用是由依赖 Fc 的效应器功能介导的，但似乎与表位无关。交叉反应抗体提供的保护程度有明确的等级。例如，研究表明，能够介导 HIA 的抗体对实验性 FLUBV 挑战具有最大的预防和治疗保护作用。单克隆抗体可提供中等程度的保护，其特点是可广泛识别 FLUBV 但无 HIA 活性。这些抗体通过 Fc 受体与宿主效应细胞接触来提供保护。最后，与 IBV 柄结构域结合的 mAbs 未能在体外中和，对实验性挑战的保护作用最弱。值得注意的是，与针对 FLUAV 的高度株特异性 HIA 抗体不同，季节性流感疫苗诱导的抗 FLUBV mAbs 通常能识别在 20 多年的抗原漂移过程中在各自的 FLUBV 抗原系中测试的所有株。分离出的多种人类 FLUBV 干结合抗体既能在体外中和，又能在小鼠体内提供有效的跨系保护。在人类中，与 FLUBV 干结合的血清抗体广泛流行，滴度随年龄或 IBV 感染而增加。利用 FLUAV 进行的研究证实，在小鼠挑战模型中，基于抗体的保护可通过直接中和病毒和/或通过 Fc 受体（FcR）https://www-ncbi-nlm-nih-gov.libproxy1.nus.edu.sg/pmc/articles/PMC6338745/（2022 年 3 月 20 日访问）-CR35 与宿主效应细胞接触来实现。当 mAb 失去通过其 Fab 结构域中和病毒的能力时，Fc 功能就会在保护中发挥关键作用。FcR 保护功能的参与能力高度依赖于病毒上的表位位置。一般来说，HA 柄特异性抗体可介导 ADCC，并与 FLUBV 的两个系统发育系和随时间演变的不同病毒产生交叉反应。在此之前，已检测到 FLUBV NA 球状头部结构域的高度保守表位和针对 FLUBV NA 的 mAbs，但未对这些抗体进行体内保护评估，也未解决与 NA 结合的抗体结构问题。后来的研究表明，从小鼠和兔子体内分离出的 NA 反应性 mAbs 对两种 IBV 均有保护作用。由于抗 NA 抗体能够与异源毒株的 NA 结合，从而抑制病毒从感染细胞中释放并随后传播，因此它们能够在病毒亚型中形成广泛的防御。Wohlbold 等人利用杂交瘤技术，鉴定出了一组针对 FLUBV NA 的五种具有广泛交叉反应性的小鼠 mAbs。在酶联凝集素试验（ELLA）中，所有 mAbs 都显示出与纯化的全病毒和重组 NA 的交叉反应，并在体外对 NA 的酶活性有功能抑制作用。当小鼠接受五次小鼠致死剂量（mLD50）的属于任一 HA 系的 FLUBV 病毒挑战后，以测试剂量（5 毫克/千克）预防性给药，它们能保护小鼠。在小鼠挑战模型中，1F2 mAb 在 72 hpi 给药后显示出优于奥司他韦标准治疗的疗效。保留的 NA 表位位于分子头部，与酶活性位点不同。对 RNA 与抗体 1F2 和 4F11 的 Fab 部分之间的复合物进行的电子显微镜分析表明，两种 Fab 的结合位点似乎并不直接与 NA 的酶活性位点重叠。因此，抑制 NA 可能并不需要与催化位点直接接触。它可能是通过结合或立体阻碍底物进入 NA 而产生的。4F11 和 1F2 的结构足迹彼此相邻，但又相互独立。与感染了 B/Malaysia/2506/04 (BVic) 或 B/Florida/04/06 (BYam) 病毒株的 MDCK 细胞培养时，所有五种 mAbs 都显示出 ADCC 活性。对人类 FLUBV NA B 细胞反应的详细分析显示，在 IIV 免疫 7 天后，NA 特异性外周血浆细胞同时扩增。这些浆细胞表达的 mAbs 对 FLUBV 两系（BVic、BYam）均具有抗病毒活性，对小鼠具有预防/治疗活性。这些 FLUBV NA 特异性 B 细胞克隆系持续存在于 CD138+ 长寿命骨髓浆细胞中。这项研究证实了 IIV 诱导具有广泛保护潜能的 FLUBV NA 特异性 B 细胞亚群的能力，这对开发具有广泛保护潜能的流感疫苗非常重要。然而，与变异 HA 头部的毒株特异性抗体相比，这种广泛的交叉反应性抗体非常罕见，而且在免疫中处于次要地位。相反，广泛交叉反应的 CD8 T 细胞非常丰富，可导致对流感的大量免疫反应。T 细胞免疫与对流感感染的广泛保护相关。CD8 T 细胞（CTLs）对广泛的异种保护性免疫做出了特殊贡献。流感特异性 CD8 T 细胞可在不同 IAV 亚型和 FLUBV 两系中提供交叉保护。CD4 T 细胞在免疫反应中发挥着重要作用，通常是核心作用，它们通过提高亲和力和转换抗体类别，为 B 细胞合成有效的中和抗体提供 "帮助"。它们还能促进病毒特异性 CD8 T 淋巴细胞反应的发展和维持。此外，以高度保守的流感病毒蛋白为靶点的 CD4 T 细胞具有交叉反应性，甚至能抵御新型和可能大流行的流感毒株。CD4 效应 T 细胞通过刺激 B 细胞成熟和抗体产生，以及通过穿孔素介导的细胞溶解活性（可控制病毒复制），提供不依赖于 IFNγ 的保护。在开发旨在提供有效 T 细胞免疫的疫苗时，应考虑到 CD4 T 细胞的这种非传统作用机制。T 细胞不能提供针对流感病毒的中和免疫力，但能减轻疾病的严重程度，缩短感染持续时间，从而促进疾病的康复。一些 CD4 和 CD8 T 细胞表位在 NP、M1 和 PB1 等内部蛋白中高度保守。这些保守表位已成为开发基于 T 细胞的交叉保护性流感疫苗的主要策略之一。CD8 T 细胞已发现三个 FLUBV NP 表位。其中一个是 NP+82-94 (MVVKLGEFYNQMM)，受 HLA-A*021 限制。另外两个（NP30-38 RPIIRPAT、NP263-271 ADRGLLRDI）受 HLA-B8 限制。然而，只有 NP30-38 肽能诱导 FLUBV 特异性多克隆 CTL 产生γ干扰素。据推测，针对 FLUBV 的 CTL 反应优先针对 HLA-B8 表位。上述 HLA 在人类中很常见；这表明，由于 NP T 细胞表位在全球的高流行率，预计大多数人都能识别该等位基因。在健康捐献者的血液和肺组织中检测到了预先存在的 PB1413-421+ CD8 记忆 T 细胞，在感染 FLUAV 或 FLUBV 后会出现克隆扩增。此外，在大多数（80%）接受测试的供体中都发现了这种 CD8 T 细胞，因此在 HLA-A*02:01 供体中这种细胞非常丰富。候选疫苗 BM2SR 的保护机制部分源于对 FLUBV HA2 柄中更普遍的 CD8 T 细胞表位的反应。CD8 表位 YYSTAASSL（FLUBV HA2+++++190）与 MHC I 类有很高的亲和力，能有效诱导小鼠脾细胞产生 IL-2 和 TNF-α。因此，确定 T 细胞对 FLUAV 和 FLUBV 的交叉反应是了解普遍的抗流感 T 细胞免疫的关键一步。这种交叉反应为设计基于 T 细胞的 UIV 带来了希望。5、开发交叉保护性乙型流感疫苗的策略目前正在研究一些替代策略，以确定其作为通用流感疫苗 (UIV) 平台的潜力。传递平台包括：复制或非复制病毒载体；重组 VLP；重组蛋白或肽疫苗；以及 RNA/DNA 疫苗。此外，UIV 的开发工作主要集中在 FLUAV 上。然而，开发针对两种流感类型（A/B）的疫苗是流感疫苗开发领域的主要目标。迄今为止，已开发出两种包含 FLUAV 和 FLUBV 抗原的通用疫苗，它们仅处于临床试验阶段（表 2）。一种名为 Multimeric-001 的新型疫苗旨在预防季节性和大流行性流感病毒株，无论其是否发生变异。它含有来自甲型和乙型流感病毒特定蛋白（HA、NP、M1）的保守线性表位。该疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫。细胞介导免疫和 HAI 水平的升高支持 M-001 作为通用疫苗的潜力。该疫苗还有一个重要特性：与使用安慰剂接种相比，M-001 接种可提高对所有三种三价流感疫苗 (TIV) 株的血清转换率。表2 乙型流感通用疫苗候选者FLU-v 是 "通用"流感候选疫苗的又一范例，可针对大多数甲型/乙型流感病毒株提供长效保护。该疫苗含有四种多肽，分别代表流感病毒中具有免疫活性的保守区域：M1，32氨基酸（DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP）；NPA，21氨基酸（DLIFLARSALILRGSVAHKSC）；NPB，20氨基酸（PGIADIEDLTLLARSMVVR）；M2，24氨基酸（IIGILHLILWILDRLFFKCIYRLF）。FLU-v与佐剂ISA-51一起皮下注射。佐剂由轻质矿物油和表面活性剂系统组成，可制成油/水乳剂。所选的皮下注射途径既便于给药，又能增加与皮肤抗原呈递细胞的接触。在没有中和抗体的情况下，疫苗诱导的 CD8 T 细胞反应可保护小鼠免受流感病毒的致命挑战。临床研究表明，对 FLU-v 的细胞免疫反应与志愿者在接受流感挑战（A/H3N2、A/H1N1）后病毒脱落和症状的减少有关。迄今为止，FLU-v 已成功完成了 IIb 期临床试验。吉林大学开发了另一种通用疫苗模型（甲型/乙型流感）。研究人员以诺如病毒（NoV）P 蛋白为平台，展示了甲型 H1N1、甲型 H3N2 和乙型流感病毒 HA 的保守表位。NoV P 蛋白能够自组装成病毒样颗粒，被认为是开发预防传染病疫苗的良好平台。病毒样 P 颗粒由 24 份 NoV 荚膜蛋白的突起（P）结构域组成；它易于表达和纯化，极其稳定，免疫原性高。每个 P 结构域包含三个表面环，已被证明可用于外来抗原呈递。将 FLUAV H1、FLUAV H3 和 FLUBV 的 HA290-105 多肽序列分别插入环 1、环 2 和环 3。更准确地说 H1 FLUAV 共识 HA290-105 序列的一个拷贝（DIWTYNAELLVLLENE）被插入环 1（残基 G274 和 T275 之间）；H3 FLUAV 共识 HA290-105 序列的一个拷贝（DLWSYNAELLVALENQ）被插入环 2（残基 S372 和 N373 之间）；一个 FLUBV 共识 HA290-105 序列拷贝（DTISSQIELAVLLSNE）通过 GGGGS 连接器插入 NoV P 结构域的环 3（残基 G392 和 S393 之间）。对小鼠进行免疫接种后，这种嵌合 P 粒子可诱导针对亚型特异性 HA2 表位的强特异性 IgG Ab 反应。接种三价 HA2-PP 后，肺部的病毒滴度明显降低。有趣的是，三价 HA2-PP 诱导的血清抗体滴度会被亚型特异性病毒提高，反之亦然。HA茎部、NA 和内部蛋白（PB1、NP、M1）T 细胞表位的几种保守病毒抗原已被定义为引起交叉反应性免疫应答的靶标。2004 年，默克（Merck）商业实验室的一组研究人员研制出了首个针对乙型流感的广泛保护性候选疫苗。该疫苗的特点是基因融合：在所有 FLUBV 中都保留的一个裂解位点；脑膜炎奈瑟菌的膜表面蛋白复合物。用包含该序列的重组蛋白对小鼠进行免疫后，小鼠在受到来自任一系的致命 FLUBV 挑战后，存活率均为 100%。此外，该序列（PAKLLKER GFFGAIAGFLE）不仅在两个系统发育系的FLUBV中相同，而且与相应的FLUAV位点具有高度同源性。2017 年底，该多肽疫苗的第一阶段临床试验开始。先前的研究表明，针对 FLUAV HA 柄的抗体具有广泛的保护作用（156）。利用嵌合 HA（cHA）分子的策略，针对两种甲型流感亚型的广谱保护性疫苗正在被成功开发出来。基于嵌合 HA 的疫苗接种方案已适用于 FLUBV。疫苗株的 HA 含有来自 FLUAV HA 亚型（H5、H7 或 H8）的头部结构域和来自 IBV HAs 的茎部结构域。构建体被亚克隆到哺乳动物表达载体中，然后转染到人类胚胎肾脏 293T 细胞（HEK 293T）中。嵌合病毒也在杆状病毒系统中表达，以产生用于疫苗接种的抗原蛋白。为了将免疫反应从 HA 头部的免疫优势位点转向保守的 HA 柄结构域，首先用表达 cH5/B 的质粒 DNA 诱导小鼠，然后用 cH7/B 和 cH8/B 抗原进行蛋白疫苗接种。嵌合 HA/B 疫苗接种方案可诱导针对更多不同 FLUIBV 的交叉反应性非中和抗体，并保护小鼠免受来自两个系统发育系的 FLUBV 的致命挑战。血清转移实验和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）测定结果表明，这种保护作用是由抗体介导的，很可能是通过 Fc 效应器功能实现的。后来，一种基于 "马赛克 "HA（mHA）的通用乙型流感疫苗开发新方法被描述出来。通过用不同外来甲型流感 HA（H5、H8、H11、H13）的相应序列替换 B/Yamagata/16/88 病毒的四个主要抗原位点，构建了马赛克 HA。这种替换可以：克服主要抗原位点的优势；将免疫反应重新定向到头部和茎部结构域的次优势保守表位。使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达嵌合型 HA。疫苗接种方案包括质粒 DNA（mH13/BYam）原体，然后每隔 3 周用不同的 mHA 进行两次加强免疫。不出所料，候选乙型流感疫苗（乙型 mHA）的免疫接种诱导了针对两个系统发育系的乙型病毒的广泛反应性抗体应答。用 5 LD50 的乙型流感病毒连续挑战显示，接种 mHA 可对同源和异源 FLUBV 产生保护作用。作者认为，与 B cHA 病毒相比，mHA 病毒诱导的抗体具有更强的 ADCC 活性。作者对此解释如下：B mHA 方法能诱导出不同的抗体库；它包含交叉反应性、非 HI 活性和非中和的头部抗体，能诱导出比抗茎抗体更强的 ADCC。此外，B mHA 相对于 B cHA 更具优势。这是因为含有 B mHAs 的重组病毒在鸡蛋中生长旺盛，适合多种疫苗生产平台，包括重组 HA、灭活疫苗和减毒活疫苗。一种新型、M2缺陷、单一复制（M2SR）乙型流感疫苗在动物模型中显示出高度的保护作用。疫苗病毒的 RNA 包括：1、2、3、5、8 号段；缺少来自 B/Lee/1940 流感的整个 BM2 开放阅读框（ORF）的 7 号段；以及来自 B/Brisbane/60/2008 流感（B/Bris60，BVic 系）或 B/Wisconsin/01/2010 流感（B/WI01，BYam 系）的 HA 和 NA vRNA（4、6 号段）。M2SR 疫苗病毒（缺乏 BM2 离子通道蛋白的编码序列）在正常 MDCK 细胞中复制缺陷，但在稳定表达 BM2 蛋白的互补 MDCK 细胞中生长。BM2SR-WI01 和 BM2SR-Bris60the 疫苗在体内均无致病性，而且 BM2SR 病毒不会在小鼠呼吸道中复制。这些疫苗可诱导肺部适度的细胞浸润，并仅刺激有限的炎症反应。它们能诱导血清和粘膜抗体（IgA、IgG）以及针对 FLUBV 两系的细胞反应。在体内致死模型中，每种 BM2SR 疫苗都能提供完全的保护，防止感染漂移的和异源的 FLUBV。交叉保护很可能是针对高度保守的 HA 柄区的交叉反应 Abs 提供的。2019 年，该疫苗完成了 II 期临床试验。传统疫苗的重点是与流感病毒的主要表面抗原 HA 形成抗体，而神经氨酸酶作为流感疫苗的抗原却很少受到关注。因此，季节性流感疫苗与流感病毒感染不同，不能很好地代表关键的 NA 表位，也很少诱导 NA 反应性 B 细胞。不过，有证据表明，现代四价疫苗（QIVs）可诱导 NA 抗体，对人类的两种病毒系均具有广泛而有效的抗病毒活性。事实上，NA 抗体可提供可靠、广泛的保护，并有可能通过新的疫苗策略预防性地激发出来。用5 µg poly(I⋅C)佐剂重组乙型/山形/16/88 流感病毒 NA 进行免疫，可保护小鼠免受同源的 BYam 病毒或异源的 FLUBV 毒株 Vic87 和 Mal04 的 1.1 × 106 PFU 的挑战，这两种病毒都属于抗原性不同的 Victoria 系。乙型流感病毒 NA 并未像 FLUBV HA 一样分化成两个系，这可能是交叉反应良好的部分原因。此外，在 FLUBV NA 中还检测到了保守的线性 B 细胞表位。其中一个表位（DILLKFSPTEITAPT）与一些著名的 MHC II 类等位基因有高亲和性结合，可用作交叉保护性 FLUBV 疫苗的靶抗原。研究表明，重组 NA 蛋白免疫接种可显著减少 FLUBV 的脱落，并可防止或限制病毒从感染 BYam 或 BVic FLUBV 的豚鼠向天真受体的传播。然而，接受i.m.或i.n.接种的动物的病毒滴度相似，只有i.n.接种能有效阻止传播。作者提出了病毒脱落减少的机制。其一是，即使鼻腔滴度略有下降，也会对流感病毒的传播产生不利影响。第二种解释是，抑制病毒 NA 酶活性的脱氧核糖核酸改变了病毒的传播性。据报道，在缺乏 NA 活性的情况下，流感病毒往往会聚集在一起，这可能会对病毒的传播性产生负面影响。此外，病毒可能被天然防御蛋白（如粘蛋白）上的诱饵受体捕获，也会导致聚集和传播能力下降。最后，病毒有可能从感染宿主处有效释放并传播到易感宿主处，但病毒被抗 NA 抗原包被，削弱了其启动新感染的能力，从而被受体呼吸道中的粘蛋白困住。其他研究人员已经证明，针对病毒 NA 的粘膜免疫（不太重要的是血清抗体）在阻止宿主间有效传播方面发挥着重要作用。各种病毒被用作疫苗目标抗原的载体。结合保守流感病毒抗原的腺病毒载体疫苗是诱导粘膜和全身免疫并提供广泛保护的有效疫苗平台之一。以高度保守的 T 细胞抗原为靶标已成为开发交叉保护性流感疫苗的主要策略之一。此前有研究表明，仅用 rAd 编码的 NP 单剂量静注疫苗就能保护小鼠免受异源 FLUAV（包括 H1N1 大流行毒株）的感染。一位韩国研究人员获得了编码高度保守 NP 的复制缺陷腺病毒（rAd）（来源于 B/Yamagata/16/1988 或 B/Shangdong/7/1997），并开发出一种通用候选疫苗。B/Yamagata/16/1988 病毒的 NP 包括一个显性 CTL 表位 FSPIRITFL（rAd/B-NP(Y)），而 B/Shangdong/7/1997（Victoria 系）则包括表位 FSPIRVTFL（rAd/B-NP(V)，B-NP 位置 171 存在一个氨基酸变异）。因此，这两个菌株分别携带异亮氨酸或缬氨酸。给 BALB/c 小鼠接种两种设计的疫苗，并检测 NP 特异性免疫反应。两种rAd/B-NP疫苗具有相同的免疫原性，并能诱导相似的NP特异性CD8 T细胞和NP特异性体液免疫反应。尽管接种了相同疫苗的小鼠面临不同的病毒挑战，但它们体内都出现了大量相似的 Dd/NP(Y)166-174 或 Dd/NP(V)166-174 四聚体特异性 CD8 T 细胞。接种疫苗的小鼠在同源/异源 FLUBV 病毒挑战中存活下来，几乎没有发病。Dhakal 等人也获得了类似的数据。在接种 A/NP-r Ad 或 B/NP-r Ad 后，小鼠表现出强大的全身和肺部疫苗特异性 B 细胞和 T 细胞反应。候选疫苗对不同的流感病毒株产生了持久的保护作用。基于 NP 的疫苗的保护作用与肺部常驻记忆 CD8 T 细胞的建立有关。因此，NP 可进一步开发为 FLUBV 的交叉保护疫苗，或作为 FLUAV/FLUBV 通用疫苗的两种成分之一。长期以来，人们一直担心强效的局部 T 细胞反应可能会损伤肺部，但实验证明，尽管肺部存在 CD8 T 细胞反应，但接种疫苗后肺部并未受损，功能正常。接种 PBS 的小鼠与接种 A/NP-rAd 或 B/NP-rAd 的小鼠在总肺活量、肺顺应性、肺气流阻力或允许气体交换的肺扩散能力方面没有差异。这项研究为基于 T 细胞介导的保护的疫苗提供了重要支持。一种有前途且有趣的策略是设计可提供交叉型免疫力的嵌合 A/B 病毒。一些研究小组已经获得了各种嵌合构建体。以 PR/8/34、A/WSN/33、A/Len/134/17/57 或 B/Yamagata/16/88 为病毒骨架，获得了甲型和乙型流感病毒之间的工程重配体。已在动物身上研究了其中一些工程重配株的免疫原性和保护特性；它们在面对不同类型病毒的挑战时表现出不同程度的保护作用。6、结论2020年以前，乙型流感是最常见和最严重的呼吸道传染病之一，发病率呈上升趋势。SARS-CoV-2 的出现改变了急性呼吸道感染的病原学结构。不过，根据流行过程动力学的基本原理，SARS-CoV-2 在 2-3 年内显然不会像现在这样咄咄逼人，预防包括乙型流感在内的其他急性呼吸道病毒感染的问题将继续存在。虽然 FLUBV 抗原漂移不如 FLUAV 那么明显，但季节性疫苗每隔 2-4 年就需要更换 FLUB 疫苗株。属于不同系统发育系和两个抗原不同的 BYam 支系的病毒同时流通，使疫苗毒株的选择变得复杂，并突出了开发一种具有广泛保护作用的疫苗的明确需求。与 FLUA 相比，在选择指定的 FLUB 疫苗毒株时，另一项相对更困难的任务是地区流行毒株的变异。这可能导致世卫组织推荐的疫苗菌株与当地流行的菌株不一致。所描述的广谱保护性mAbs表明，病毒表面糖蛋白中存在保守表位。它们与两个系统发育系的病毒共有的内部蛋白的保守表位一样，可作为开发具有广泛保护性的乙型流感疫苗的基础。将广泛中和抗体与大量交叉反应 CD8 T 细胞相结合，对于针对不同流感病毒株的最佳普遍保护非常重要。这种疫苗能诱导免疫系统的细胞和体液两个分支产生免疫反应，从而提供长期保护。在开发通用 FLUA/FLUB 疫苗的同时，也在开发纯 FLUB 疫苗。后者的重要性不仅在于预防 FLUB，还在于从人类中根除 FLUBV 的诱人前景。由于缺乏持续的动物贮藏库，以及 FLUBV 糖蛋白的系统发育差异相对较小，因此在不久的将来开发出一种具有广泛保护作用的疫苗是完全可能的。参考资料：Tsybalova LM, Stepanova LA, Ramsay ES, Vasin AV. Influenza B: Prospects for the Development of Cross-Protective Vaccines. Viruses. 2022 Jun 17;14(6):1323. doi: 10.3390/v14061323. PMID: 35746794; PMCID: PMC9228933.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要传统流感疫苗产生毒株特异性抗体，不能提供针对不同流感病毒毒株的保护。此外，由于流感病毒频繁的抗原变化和漂移，需要每年重新配制和重新接种以匹配流行的毒株。因此，通用流感疫苗(UIV)的开发对于针对所有季节性流感病毒株的长期保护以及针对潜在疫情病毒的保护至关重要。开发UIV的最重要策略之一是选择最佳靶向抗原，以产生针对不同流感病毒株的广泛交叉反应性中和抗体或交叉反应性T细胞应答。然而，每种类型的UIV靶抗原对于产生针对不同流感病毒的足够免疫应答都有优点和局限性。在此，我们回顾了目前关于抗原使用的策略和前景，包括血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白和内部蛋白，用于通用流感疫苗的开发。关键词：流感，通用疫苗，抗原，免疫应答。1.介绍流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。根据抗原差异划分，流感病毒有四个属，A、B、C和D。在流感类型中，人类甲型流感病毒和乙型流感病毒都引起季节性流感，而甲型流感病毒(IAVs)是唯一引起大流行的病毒。IAVs分为两个系统发育类群，1和2。类群1病毒包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18，而类群2病毒包括H3、H4、H7、H10、H14和H15。乙型流感病毒分为两个谱系，B/Yamagata样和B/Victoria 。C型流感病毒不太流行，据报道仅在人类中引起轻微疾病，而D型流感病毒尚未感染人类，但会感染牛、猪、反刍动物、马和骆驼。接种疫苗被认为是控制流感感染的最有效方法，尽管现有的流感疫苗有一些局限性。目前，季节性流感疫苗主要有三种类型：减毒活疫苗、灭活疫苗和重组疫苗。减毒活流感疫苗(LAIV)被认为是传统灭活流感疫苗的替代品，因为它们能够模拟自然感染并诱导体液、细胞和粘膜免疫反应。40多年前，LAIV首次在俄罗斯使用，2003年在美国获得许可，2012年在欧洲获得许可，并已被证明对甲型流感病毒的抗原变种具有保护作用。季节性疫苗针对的流感病毒株是根据世界卫生组织协调的全球监测来选择的；因此，疫苗的有效性很大程度上取决于疫苗株与流行病毒之间的匹配。由于流感血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)糖蛋白的抗原快速转移和漂移，每年都需要重新配制和重新接种疫苗。尽管季节性流感疫苗每年更新以匹配流行毒株，但2004-2020年流感季节的疫苗有效性仅为10%至60%[10](图1)，据世界卫生组织估计，每年导致25万至50万人死亡。根据初步的季末估计，2019-2020年流感季节的流感疫苗有效性估计仅为39%[10]。除了季节性流行之外，流感大流行也是不可预测的重大全球威胁。1918年西班牙(H1N1病毒)、1957年亚洲(H2N1病毒)、1968年香港(H3N2病毒)和2009年猪(H1N1大流行病毒)流感这四场20世纪和21世纪最大的流行病造成了全球卫生危机，造成了巨大的死亡率和发病率和巨大的经济负担。2009年最近的流感大流行清楚地表明，流感疫苗不足以控制潜在的大流行和季节性流行病。因此，有必要提高目前流感疫苗的免疫原性和效力。此外，由SARS-CoV-2病毒引起并于2019年12月底首次出现的新冠肺炎仍在威胁全球健康，感染患者和死亡人数不断增加。此外，合并感染流感会使新冠肺炎患者的死亡风险增加一倍以上。因此，当新冠肺炎合并感染时，有效的流感疫苗对于限制严重后果至关重要。图1 2010-2020年流感季节的估计疫苗效力(VE)。数据改编自疾病控制和预防中心季节性流感疫苗有效性研究。疫苗效力的定义是，与未接种疫苗的人相比，接种疫苗的人患流感疾病的频率减少了百分比，这是使用美国疫苗效力网络的数据进行估计的。数据显示为调整后的总体VE(%)，可信区间为95%。已经做出了许多努力来开发通用流感疫苗(UIV)，这种疫苗能够对由类群1和类群2流感病毒引起的症状性疾病提供至少75%的效力，并在所有人群中持续保护至少12个月；然而，目前还没有商业UIV可用。已经探索了许多方法，包括靶向保守的抗原，如HA、NA、基质和内部蛋白，以及多个疫苗平台的应用，包括重组抗原/蛋白质疫苗、重组/重组流感病毒疫苗、病毒载体疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗、纳米颗粒疫苗、DNA/RNA疫苗和多平台疫苗。由于需要针对不同的季节性和潜在的大流行流感病毒株产生广泛的免疫反应，因此慎重选择UIV开发的靶向抗原是当务之急。在这篇综述中，我们总结了目前抗原靶向策略在UIV开发中的优势和局限性。2.基于HA的通用流感疫苗流感HA分子由两个不同的结构域组成，一个是由部分HA1组成的球形头部，另一个是由部分HA1和全部HA2组成的茎结构。传统的IAV疫苗依赖于针对可变HA头部结构域的中和抗体(Abs)的产生，因此该疫苗具有毒株特异性。目前的策略针对变化较小的HA区域，包括茎结构域或/和头部结构域内的保守表位。这些方法包括使用无头HA、嵌合HA、镶嵌HA、计算优化的广谱反应抗原(COBRA)和“呼吸”HA。2.1 无头HA针对保守的茎结构域的广泛中和抗体的发现促进了基于茎结构域的UIVs的发展。Graves等人于1983年首次尝试通过化学去除免疫优势的HA全球头部结构域来生产免疫优势的无头HA。然而，这种处理导致HA2茎结构域的构象变化和HA1茎结构域中构象表位的移除，这是结合广泛活性的抗茎抗体所必需的。其他努力，包括基因治疗和在大肠杆菌或昆虫细胞中表达无头HA；然而，无头HA的构象可能远不是最佳的，尽管它在病毒攻击后提供了同源、异源和异亚型保护。2015年，Imagliazzo等人和Yassine等人通过在分子的膜近端引入稳定元件，独立生成了稳定且正确折叠的无头HA。无头HA通过Fc依赖的机制，如抗原依赖的细胞毒性(ADCC)，诱导茎特异性抗体并保护动物免受H5N1病毒的异亚型攻击，而没有强大的中和抗体效价。这些发现不仅显示了无头HA在UIV发展中的潜在重要性，而且还表明了一种克服该分子构象变化的方法。然而，基于H1 HA柄的构建只提供了对类群1 IAV的保护。2016年，潘的研究小组首次报道，第1组无头HA微茎对类群1(H1和H5)和类群2(H3)流感病毒具有保护作用。此外，邓等人最近的一项研究表明，将由四聚体M2e配制的无头HA用于蛋白质纳米颗粒可以诱导持久的免疫反应，并保护小鼠免受同一组或两组不同IAV的挑战。虽然不断努力开发基于无头HA的UIV，但也有一些人担心HA干细胞特异性抗体诱导抗体依赖增强(ADE)。尽管上述研究值得进一步探索基于HA的无头UIV，但仔细评估无头HA诱导的抗体是否可以增强ADE，从而增加疾病严重程度是一个先决条件。2.2 嵌合HA除了无头HA外，另一种将免疫反应从HA头部转向HA茎的策略是使用嵌合HA(cHA)。这种方法包括通过与共享相同的茎结构域但不同的头部结构域的cHA连续接种来诱导抗茎抗体(图2)。cHA包括来自当前季节性IAV的HA茎结构域，例如H1、H3或B型流感病毒，以及来自外来禽流感病毒的HA头部结构域。第一次接种cHA可诱导出针对头和茎两个区域的抗体。用包含与第一次接种相同的茎域和不同的头域的另一cHA进行免疫导致对新的头域的初级响应和对固定的茎域的召回响应。用另一种由固定的HA茎结构域和不同的HA头部结构域组成的cHA进行额外的免疫可以进一步增强茎的反应。在不同的疫苗配方中接种cHA，如重组蛋白、病毒载体或基于核苷酸的疫苗，已被证明能诱导高茎反应性抗体，从而保护小鼠免受不同IAV的攻击。此外，连续接种CHA疫苗(CH8/1和CH5/1)在兔身上被证明是局部和系统耐受性良好的。由于这一策略同时诱导抗头和抗茎反应抗体，CHA提供的保护既通过中和抗体又通过非中和抗体(如ADCC活性)。用以CHA为基础的疫苗治疗雪貂可预防大流行性H1N1病毒感染。在雪貂模型中，连续接种CHA疫苗和减毒活疫苗还可以诱导HA茎特异的体液反应，授予针对不同IAV的保护性异型免疫，并诱导针对大流行H1N1病毒感染的长期免疫反应。最近，使用基于CHA的UIV的I期临床试验(NCT03300050)显示，该疫苗对人类使用是安全的(表1)。接种疫苗的健康成年人表现出非常高的抗茎抗体效价和持久的免疫反应图2 嵌合HA疫苗接种方法。在这个例子中，CHA疫苗包含来自H1 HA的茎结构域和来自外来禽类HA亚型的头部结构域。CHA可诱导对杆状H1HA的低抗体反应。然而，用含有相同茎H1HA结构域的其他CHA加强免疫，但外来禽亚型的不同HA头域增加了对H1HA茎结构域的抗体应答。CHA提供的保护是由中和抗体和非中和抗体(如ADCC)介导的。HA的结构采用瑞士模型(2021年4月5日访问https://www.swissmodel.expasy.org/，)。具有代表性的H1 Has来自甲型流感病毒(A/California/07/2009H1N1)，序列来自GenBank(ACQ55359.1)，或来自A型流感病毒(A/GOOSE/广东/1/1996(H5N1)，序列来自GenBank(YP_529486.1)。表1 临床试验中的多种通用流感疫苗。尽管基于CHA的疫苗可以诱导产生抗茎HA的抗体，并对同源和异种病毒攻击提供保护，但这种疫苗的保护效果可能仍然有限，这取决于嵌合抗原亚型。此外，需要对不同的嵌合疫苗进行多剂量疫苗接种，以诱导广谱的疫苗效力。因此，进一步的研究需要有计划的抗原选择和简化的疫苗策略。2.3 马赛克HA马赛克HAS(MHAs)的设计思想是不仅针对保守的茎区，而且针对主要抗原位点外的头部区域的表位产生抗体。鉴于一些单抗与不同流感毒株的HA头部结构域显示出交叉反应[46-48]，MHA被开发来最大限度地交叉反应和最小化遗传差异。MHA可以诱导针对HA头部和茎结构域的免疫反应(图3)。这与替换整个HA头部区域的CHA不同。具体地说，MHA是通过仅将头部HA的主要抗原位点替换为外来禽流感HA亚型的抗原位点来构建的。因此，MHA的保守头部和茎结构域来自H1、H3或B型流感病毒HA。MHA可诱导大量针对HA头区抗原位点的抗体和少量针对HA茎区保守表位的抗体。然而，用另一种不同的MHA(不同的抗原部位)增强可诱导针对HA头部和茎部位的抗原部位和保守表位的抗体。在小鼠模型中，发现用B型马赛克流感血凝素连续免疫可以诱导对同源和异种B型流感病毒株的交叉保护。接种马赛克H5 HA可增强抗体和T细胞反应，为小鼠抵御H5N1和H1N1病毒提供保护。接种H1马赛克HA或H3马赛克HA的小鼠也对不同的流感病毒株表现出广泛的免疫保护反应。Kingstad-Bakkle及其同事表明，通过聚酸酐纳米颗粒或改良的病毒Ankara传递的马赛克H5疫苗抗原可以在无特定病原体(SPF)和商业鸡只中诱导体液和细胞免疫反应。Florek等人的一项研究表明，用马赛克H5 HA免疫猕猴可以增加病毒清除，并引发能够介导ADCC活性的交叉反应抗体。最近，美国国家过敏和传染病研究所疫苗研究中心开发了一种镶嵌受体结合结构域(RBD)纳米颗粒，该纳米颗粒显示了来自H1 HA抗原的8个不同HA头域的多个副本。用这些镶嵌RBD纳米颗粒接种小鼠引起交叉反应的B细胞反应。尽管与基于CHA的疫苗相似，基于MHA的疫苗可以针对同源和异种病毒挑战提供更广泛的交叉反应保护，但这种疫苗的保护效果可能仍然有限，这取决于多剂量疫苗接种和选定的抗原亚型。因此，需要有计划的抗原选择和简化的疫苗策略进行进一步研究。2.4 COBRA HACOBRA策略应用一种计算方法来生成来自某一HA亚型的所有菌株的一致序列[57]。这种疫苗策略的主要目的是产生广泛的抗HA-Head反应，并增强HI[血凝抑制]活性。眼镜蛇HA方法已被证明是一种有效的策略，通过在小鼠、雪貂和非人类灵长类动物中诱导广泛反应的抗体，开发针对H1N1、H5N1和H3N1病毒组的流感疫苗。Carter等人报道，COBRA H1 HA抗原可以产生针对自1918年以来分离的17种人类季节性和大流行性H1N1病毒的抗头抗体。最近的一项研究表明，使用使用人和猪H1 HA序列设计的COBRA HA抗原可以保护小鼠免受猪和人来源的病毒。此外，Giles BM等人的动物研究表明，COBRA H5 HA抗原诱导的广谱抗体对25株高致病性禽流感H5N1病毒株具有HI活性。COBRA H3HA抗原已经被证明可以诱导HI抗体来保护小鼠免受一组H3N2型流感病毒的共同变异。最近，Ross等人开发了一种COBRA H3HA疫苗，方法是从2002年至2015年收集的22,144株人A(H3N2)病毒中产生一个一致的序列。与野生型HA疫苗相比，该候选疫苗显示出更高的HI活性。眼镜蛇H2 HA抗原也是使用人和禽类H2 HA序列开发的，使用这种疫苗产生了广泛交叉反应的抗体，可以对抗历史上的人H2病毒、禽类和最近在小鼠中分离的哺乳动物H2病毒。图3 马赛克HA疫苗接种方法。MHA疫苗包含一个头部结构域，其中可变的免疫优势抗原位点被外来禽类HA亚型的抗原位点取代，同时保留了头部和茎部结构域的保守区(在本例中为H1 HA)。MHA诱导的抗体对保守的抗原部位有较强的抗体反应，但对保守的保留区域只有微弱的抗体反应。然而，用来自其他外来禽类HA亚型的抗原位点增强MHA头部结构域可以增强对头部和茎结构域的抗体反应。HA的结构是使用Swiss-Model(https：//www.swissmod.expasy.org/，2021年4月5日访问)构建的。代表病毒为甲型流感病毒(A/California/07/2009(H1N1))，序列从GenBank(ACQ55359.1)获得。总体而言，COBRA HA方法是通过产生广泛反应的抗头HA抗体来预防广泛的流感病毒而开发UIV的有前景的策略之一。然而，有时产生的共识序列不能产生全功能的HA蛋白，因此它需要使用替代疫苗平台，如VLP。目前，眼镜蛇HA疫苗正处于临床前开发的后期阶段，需要进行临床试验研究，以调查其在人类身上的疫苗效果。2.5 “呼吸”HA基于HA的疫苗的最新进展是利用针对HA区域中隐藏的、保守的表位，称为“呼吸”HA策略[64]。Bangaru等人和Watanabe等人的研究表明，针对HA头部结构域界面中隐藏的、保守的表位的抗体可以提供对广谱IAV亚型的保护。例如，人类单抗fla-20识别位于220环和相邻90环的表位，这些表位通常埋藏在天然的HA三聚体中。这种抗体保护小鼠免受人类H1N1、H5N1、H3N2和H7N9病毒的亚致死和致命攻击。从灭活季节性流感疫苗免疫捐赠者的记忆B细胞中分离出的抗体(S5V2-19、H2214、S1V2-58、S8V2-17和S8V2-37)的集体广度针对HA结构域的界面上的新位点，并在小鼠中提供对第1组(H1、H2、H5和H9)和2组(H3、H7和H14)病毒的保护。然而，揭示隐藏表位的方法还需要进一步探索。据报道，HA结构域的糖基化参与了IAV的抗原漂移，使其能够逃避宿主的免疫反应。有趣的是，HA头部结构域的糖基化位点可以被修饰以暴露隐藏的保守表位，从而引导免疫反应到保守的HA结构域。以前的研究已经报道，接种高糖化HA头部结构域的小鼠表现出增强的、保守的茎结构域定向抗体，并且比接种野生型HA的小鼠具有更好的抗致命病毒攻击的保护。Lin等人的研究表明，以VLP、重组蛋白或腺病毒载体等不同剂型接种高糖化HA可诱导针对禽流感H5N1病毒的广泛中和抗体。另一项研究显示，接种CHO细胞克隆稳定表达的葡聚糖保护的HA抗原可以增加针对异源H5N1病毒的中和抗体的潜力。正如Bajic等人所报道的那样，HA结构域的高糖基化并不会抑制整体体液反应，而是会改变免疫优势模式并引发广泛的保护性抗体。综上所述，这些研究表明，高糖基化可能是一种很有前途的策略，可以在HA头部和茎结构域中发现隐藏的表位，从而促进未来新型UIV的开发。目前，流感疫苗设计中的糖基化仍在争论中。研究表明，糖基化对病毒感染性和宿主免疫反应具有重要作用。Wu等人报道，HA在N-142位的糖基化促进了H1N1流感病毒的传染性，糖位142对病毒逃避人类免疫反应是重要的。在血凝抑制试验和空斑减少中和试验中，在头部HA区域添加N-连接糖基化修饰也降低了抗体效价。因此，有必要确定流感疫苗开发所需的确切糖基。还应该进行各种研究，以更好地了解糖基化对疫苗效力的影响。3.基于NA的UIVs第二种主要糖蛋白NA通过其唾液酸酶和神经氨酸酶活性，在促进流感病毒粒子从感染细胞中释放方面发挥重要作用。NA的酶活性是奥司他韦和扎那米韦等抗病毒药物的关键靶点。与HA相似，NA也经历抗原性漂移，但速度较慢。此外，在小鼠和人类身上的研究表明，与抗HA抗体相比，抗NA抗体的衰退速度较慢。最近，流感病毒NA正在成为识别其活性部位的广泛保护性抗体的靶标。Stadlbauer等人描述了针对NA的人单抗，这种单抗可以中和甲型流感病毒，抑制神经氨酸酶活性，并在体内提供广泛的保护，防止与第1组(人N1和禽类N1、N4、N5和N8)、第2组(人N1、猪N3、禽类N2、N6、N7和N9)和B型流感病毒(B/Victoria/2/87谱系)在小鼠中的攻击。最近，Madsen等人发现，人单抗还可以中和不同的B型流感病毒(IBV)，抑制NA神经氨酸酶活性，诱导ADCC活性，并保护小鼠免受IBV攻击[82]。有了这些新的发现，NA可能是UIV的一个有吸引力的目标。在灭活疫苗中，NA的质量和数量各不相同。此外，这些疫苗可诱导约30%血清转换率的抗NA反应。先前的一项研究报告，NA特异性抗体可以通过干扰病毒出口来抑制流感病毒的复制。此外，针对保守NA表位的单抗还可以诱导ADCC活性，有助于保护小鼠免受B型流感病毒感染。Doyle等人报道，针对IAV保守NA序列的mAb在受到致命剂量H1N1和H3N2病毒攻击的小鼠中提供了异型保护。最近，接种重组B型流感病毒NA的豚鼠表现出病毒滴度降低，抗NA抗体水平高，病毒传播率下降。此外，已经证明一些H3N2病毒使用NA而不是HA来进行细胞附着，这表明NA抗体可能有助于阻止病毒附着。需要进一步的研究来解决这一假设。尽管NA有很多好处，但作为疫苗开发的靶点，它经常被忽视，并且由于标准化问题而没有被批准为有效的疫苗抗原，包括不适合量化NA含量的方法，以及缺乏简单的NA抗体测定方法。值得注意的是，疫苗中NA的含量可能与抗NA抗体反应相关，尽管疫苗中免疫优势HA头域的存在可能导致NA成为免疫亚优势。增加疫苗中NA的含量，同时改进NA定量方法，有助于提高抗NA免疫力。此外，储存的疫苗批次中的神经氨酸酶活性随着时间的推移而下降，这取决于所使用的菌株；因此，需要特定的储存条件来保持其活性。据我们所知，到目前为止还没有开展甲型流感疫苗的临床试验；因此，疫苗的开发变得更具挑战性，需要做出更多努力才能使其可用。应进行甲型流感疫苗的临床试验和观察性研究，以评估其在人类身上的疫苗效果。4.基于M2e的UIVS基质蛋白2(M 2)是一种跨膜蛋白，可分为细胞外N末端结构域(M2e)、跨膜结构域和细胞内C末端结构域。M2蛋白对于甲型流感病毒的适合性是必不可少的，对于病毒进入后内体的脱壳过程也是至关重要的。由于M2e高度保守，它是UIV的潜在靶点。然而，与HA和NA相比，M2e较小，免疫原性较低，导致单独给药时免疫反应较低。为了解决这个问题，研究人员试图通过加入载体蛋白、使用纳米颗粒制剂、呈现在VLP上(包括其他流感蛋白)或添加佐剂来增加M2E的免疫原性。目前认为抗M2e单抗不能中和病毒，但抗M2e单抗可与感染细胞表达的M2e蛋白结合，通过抑制病毒萌发减少病毒复制。其他提供保护的机制包括抗M2e抗体介导的细胞杀伤，通过补体依赖的细胞溶解、ADCC和/或抗体依赖的细胞吞噬作用来消除流感病毒感染的细胞。M2E特异性T细胞也可以介导对流感感染的保护。在动物模型中，基于M2e的多种疫苗配方对不同的流感病毒株显示出交叉保护作用。在小鼠中，显示在重组大肠杆菌来源的外膜囊泡上的M2e疫苗可以诱导抗M2e免疫以控制甲型流感病毒的复制，并对H1N1和H3N2的致命攻击提供100%的保护。含有来自人、猪和禽类IAV的M2e序列串联重复的VLP疫苗诱导细胞(巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和CD11b+树突状细胞)募集，并在感染部位产生炎性细胞因子和趋化因子，提供对H1N1、H3N2和H5N1 IAV亚型的保护。研究表明，含有M2e序列串联重复序列的融合蛋白与分枝杆菌HSP70佐剂片段的N端融合，可增强体液和细胞免疫，减少病毒脱落，保护小鼠免受H1N1、H3N2和H9N2病毒的攻击，并保护小鼠免受H9N2病毒的攻击。一种由乳酸乳球菌表面表达的M2e组成的活细菌疫苗降低了病毒负担，并延长了接种H5N2病毒攻击后的鸡的生存时间。此外，接种了不同M2e表位的鸡对H5N1表现出保护作用。虽然关于M2e疫苗在雪貂中的效力的研究很少，但M2e与携带者结合的免疫增加了抗M2e抗体，并减少了H1N1病毒攻击后雪貂肺内的病毒脱落。此外，最近发现，在大流行H1N1病毒攻击雪貂后，显示在大肠杆菌来源的外膜囊泡上的M2e疫苗可以降低肺病毒滴度。在人类中，M2e串联重复序列与乙肝核心蛋白(NCT00819013)融合的I期临床试验显示，尽管抗体效价随着时间的推移而下降，但可以诱导抗M2e抗体。重组M2e鞭毛蛋白流感疫苗(STF2.4xM2e或VAX102)已被证明是安全的，并在健康成年人(18-49岁)中诱导高水平的抗M2e抗体[114]；然而，该候选疫苗已不再处于开发阶段。另一项研究表明，在H3N2病毒攻击24小时后，静脉注射抗M2e单抗(TCN-032)(NCT01719874)的健康志愿者与安慰剂组相比，症状评分和病毒复制都有所降低。除了使用M2e作为疫苗抗原的研究外，FluGen Inc.(美国)还开发了一种缺乏M2基因的减毒单复制活病毒疫苗(表1)。该疫苗在健康成人(NCT03999554，NCT02822105，NCT03553940，Clinicaltrials.gov)中进行了安全性和免疫原性调查，目前正在50-85岁的成年人(NCT04785794，Clinicaltrials.gov)中进行调查。尽管基于M2e的疫苗显示出一些有希望的结果，但还没有实现商业化。因此，仍然需要对基于M2e的疫苗的有效性进行更广泛的临床研究，以提供证据证明这些疫苗可以保护人类免受不同流感病毒的侵袭。以M2E为基础的疫苗有一些局限性。抗M2e抗体可以预防A型流感病毒，但不能预防B型流感病毒，因为IBV中的M2蛋白结构不同。此外，由于免疫原性低，M2e可能不是一种独立的、通用的疫苗，但可能需要与携带者一起接种或其他疫苗，如季节性疫苗。此外，已有研究表明，融合到载体蛋白上的M2e可以诱导针对载体蛋白的免疫反应，当高剂量给予人类时，这可能会引起意想不到的副作用，如局部和全身不良反应。此外，对人类的临床试验表明，抗体滴度随着时间的推移而下降，这表明M2e应该与其他甲型流感抗原或佐剂一起使用，以实现可持续的免疫反应。5.基于内部蛋白的UIVs流感病毒的内部蛋白，如基质蛋白1(M1)和核蛋白(NP)是高度保守的。与在感染细胞表面表达的HA、NA和M2e不同，M1和NP在感染细胞内产生，由主要的组织相容性复合体分子加工和呈递，用于T细胞识别。因此，靶向内部蛋白也是一种有希望的策略，通过增强T细胞的交叉反应来改进当前的流感疫苗。在小鼠中，用壳聚糖佐剂对大肠杆菌表达的M1蛋白进行鼻腔免疫，分别对异源H1N1和H5N1病毒提供了70%和30%的保护。Liu等人发现，接种含有M1的DNA疫苗并用来自禽类H9N2的重组M1蛋白加强免疫的小鼠，可诱导体液和细胞免疫反应，并对同源病毒感染提供完全保护，对异型H1N1病毒感染提供部分保护。此外，几十年前，基于NP的DNA疫苗在动物模型中被证明对同源和异种流感病毒都具有保护作用。近年来，基于NP的mRNA疫苗已成为一种有吸引力的方法。用编码NP的信使核糖核酸疫苗在小鼠中诱导对流感病毒的跨株免疫。此外，通过将人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的蛋白转导结构域TAT-NP整合到NP中而产生的重组蛋白TAT-NP，增强了细胞免疫反应，并增强了对同源PR8、异亚型H9N2和H3N2IAV在小鼠中的保护效力。坎波等人。证明用重组NP疫苗OVX836免疫的小鼠表现出对H1N1和H3N2IAV的T细胞反应和保护效力。用第二代脂质佐剂稳定乳剂(SLA-SE)佐剂的NP免疫老龄小鼠，在PR8病毒致死攻击后，病毒清除和存活率都有所提高。将NP+M1+热休克蛋白60与水包油佐剂混合接种，可诱导强大的体液、粘膜和细胞免疫反应，抑制肺部病毒复制，并完全保护小鼠免受H7N9攻击。另一项研究表明，编码NP和M1的改良痘苗病毒安卡拉病毒载体(MVA−NP+M1)可作为佐剂增强小鼠、鸡和猪的抗体和T细胞反应。MVA−NP+M1候选疫苗自2011年以来已在多个临床试验中进行了测试(表1)。接种MVA−NP+M1的志愿者表现出流感症状和病毒脱落时间的减少。另一项临床试验表明，MVA−NP+M1在人类中是安全的，并诱导抗原特异性T细胞反应。该疫苗的安全性和免疫原性也在50岁以上的成年人中得到证实，其增强记忆T细胞和诱导多功能细胞因子的能力。此外，这种疫苗与季节性流感疫苗的结合被证明能增加50-85岁成年人的流感病毒特异性抗体反应和记忆T细胞。MVA-NP+M1疫苗正处于IIb期临床试验(NCT03880474)，以调查其对18岁及以上成年人的疗效。然而，这项试验因无效而被停止(2021年4月26日更新，Clinicaltrials.gov)。用一种新的重组猿腺病毒ChAdOx1NP+M1接种也被发现诱导T细胞免疫原性增加，(表1)。基于NP寡聚体的候选疫苗OVX836也在I期临床试验中进行了测试(NCT04192500和NCT03594890，Clinicaltrials.com，于2021年3月28日访问)，尽管结果尚未报告(表1)。尽管基于内部蛋白的流感疫苗在诱导T细胞免疫反应和交叉保护方面显示出良好的结果，但基于内部蛋白的疫苗诱导的抗体反应较弱，这是阻断流感病毒感染所必需的。此外，开发基于内部蛋白的T细胞疫苗的一个主要挑战是负责抗原肽结合和T细胞呈递的人类白细胞抗原单倍型的多样性。因此，为了生产有效的内部蛋白质疫苗，为所有具有不同人类白细胞抗原多样性的个体提供足够的覆盖，有必要在种族背景下进一步评估反应[134]。6.基于多种蛋白/多肽的UIVs考虑到不同基于蛋白质的疫苗的潜力，包含多个蛋白质或表位多肽的疫苗具有增强广泛交叉反应抗体和T细胞反应的潜力。这一疫苗策略已经用许多不同的疫苗平台和蛋白质组合进行了研究。表达NP和M1的病毒载体疫苗(ChAdOx1 NP+M1)和CHA疫苗的组合免疫诱导了针对分歧组2 IAV的HA、NP和M1的抗体反应，增强了T细胞对NP和M1的反应，并保护小鼠免受H3N2病毒的攻击。Park等人报道了一种表达M2和CHA的重组减毒H3N2型病毒，该病毒可以保护小鼠免受广泛的IAV感染，包括H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2。此外，含有保守的HA、M2e和NP蛋白的嵌合亚单位疫苗被证明可以保护小鼠免受同源和异种IAV的攻击。此外，用含有M2e和HA的双层蛋白纳米粒免疫的小鼠可以免受H1N1、H3N1、H5N1和H7N9病毒的攻击。此外，重组乳酸乳球菌表达的M1-HA2融合蛋白在鸡身上对H9N2病毒具有粘膜保护作用。使用这一策略开发的候选疫苗也在许多临床试验中进行了测试。多聚体-001(M-001)由以色列BiondVax制药有限公司开发，是一种基于多肽的疫苗，包含HA、M1和NP蛋白的B和T细胞表位。事实上，M-001已经在七个临床试验中进行了评估，结果令人振奋(表1)。M-001(NCT03450915)的II期试验表明，独立的M-001是HA疫苗的引爆剂，并提高了老年人的HI效价。此外，M-001可用作增强对三价流感疫苗的HI反应的引发剂，也可用作H5N1 IAV的引发剂或单独的疫苗。值得注意的是，在第三阶段临床试验中，M-001作为一种独立的尿路感染药物在50岁的成年人≥中也进行了安全性和临床疗效的评估。FP-01.1由免疫靶向系统有限公司(英国)开发，是一种以合成肽为基础的疫苗，含有6个来自甲型流感病毒NP、M和聚合酶碱性1和2蛋白的多肽(表1)。该疫苗在4个I期临床试验中进行了测试，显示出良好的安全性和耐受性。然而，FP-01.1已经不再处于开发阶段。Flu-v是由PepTcell(SEEK，英国)开发的由NP、M1和M2蛋白组成的合成肽疫苗(表1)。流感病毒已经在四个I期和II期临床试验中得到了彻底的研究。第一阶段研究的结果表明，Flu-v可以刺激细胞免疫，并减少症状和病毒脱落。临床第二阶段研究的结果表明，Flu-v减少了病毒的脱落和临床流感症状，并诱导了长期的细胞免疫。不过，这种疫苗的效力还有待进一步探索。总体而言，基于多种蛋白质/多肽的疫苗方法是通过多种蛋白质或多肽组合来开发UIVs的有前景的策略之一，但仍然存在局限性，如靶蛋白在亚型之间的序列差异。因此，应在设计的候选疫苗中筛选靶蛋白序列，以提供对不同毒株的广泛保护。还应选择好免疫优势区域，以获得最适合疫苗构建的表位。7.流感疫苗佐剂提高流感疫苗效力的一种方法是加入佐剂。三种主要佐剂，铝盐(明矾)、MF59和AS03，被纳入获得许可的流感疫苗。自20世纪20年代以来，明矾在美国和欧洲被广泛用于疫苗。先前的研究表明，明矾通过仓库效应、NLRF3炎症激活、CD4+T细胞的刺激和分化、树突状细胞膜的扰动和补体激活等机制刺激Th2偏向反应。众所周知，明矾能激发强大的体液免疫反应；然而，它只能最低限度地诱导ADCC。此外，明矾只能微弱地引起细胞免疫反应。MF59于1997年在意大利获得许可，被开发为老年人流感疫苗接种的佐剂。获得许可的流感疫苗，包括Focetria、Celtura和Fluad以及季节性流感疫苗，都包括MF59。研究表明，MF59显著增强了抗原特异性抗体的产生，并增强了Th1和Th2偏向的反应。然而，MF59可引起注射部位的疼痛、反应性，并可诱发炎症性关节炎。AS03佐剂已用于获得许可的疫苗Pandemrix、Arepanrix、Prepanrix和Q-PanH5N1。以往的研究表明，AS03可诱导注射肌肉和引流淋巴结产生炎性细胞因子和趋化因子，并促进单核细胞和树突状细胞向引流淋巴结的迁移。此外，AS03的包含会导致持续产生中和抗体和高频率的记忆B细胞。然而，研究报告称，AS03佐剂疫苗在接种后可能会导致睡眠障碍和发作性睡病。此外，已经测试了几种策略，例如使用Toll样受体激动剂或不同的佐剂组合，以克服常见佐剂的局限性。综上所述，每种佐剂都有独特的优点和缺点。因此，流感疫苗佐剂的选择对于提高疫苗抗原的免疫原性和提高疫苗效力至关重要。然而，需要更安全和更有效的佐剂来有效地改善针对疫苗抗原的体液和细胞免疫反应。8.总结流感大流行的持续威胁显著表明，有必要开发具有比现行流感疫苗更广泛和更强的保护效力的新型UIV，以抵御季节性和潜在的大流行毒株。然而，尽管作出了不断的努力，目前仍没有商用UIV可用。虽然各种流感抗原正在为UIV的开发进行测试，但不同的疫苗抗原有独特的优点和缺点。以HA为基础的疫苗主要诱导抗体应答，无头和嵌合HA疫苗主要针对保守的HA干区，而嵌合疫苗则同时针对头部和保守的HA区域。此外，计算优化的广谱反应抗原(COBRA)策略产生了一致的序列，允许激发针对不同病毒株的广谱反应抗体。针对隐藏的HA区域的呼吸性HA方法也显示出希望。目前的季节性流感疫苗使用NA和HA作为抗原。尽管基于NA的疫苗已显示出诱导免疫反应的作用，但由于其局限性，如标准化问题，NA目前在流感疫苗开发中作为抗原靶标被忽视。应对基于NA的流感疫苗进行进一步研究，以证明NA作为流感疫苗抗原的重要作用。此外，应该开发先进的技术来量化NA的绝对量，准确地测量NA抗体的反应，并在储存期间保持NA疫苗的神经氨酸酶活性。虽然M2e是一种保守的流感病毒蛋白，很有希望成为UIV的靶标，但它的免疫原性很低。因此，为了诱导强大的免疫反应，它应该与其他病毒蛋白或佐剂一起使用。此外，基于内部蛋白的疫苗主要诱导T细胞反应，促进流感感染细胞的杀伤，是利用多种蛋白质或多肽组合开发UIV的有前景的策略之一，但这些疫苗诱导的抗体反应较弱，应适当选择其中的免疫优势区域，以获得最合适的疫苗构建表位。由于具有增强疫苗免疫原性的能力，佐剂已被广泛应用于各种流感疫苗的研究中。使用合适的佐剂，如铝基佐剂、水包油佐剂如MF59、佐剂系统03、(AS03)或以Toll样受体(TLR)为基础的佐剂(如针对TLR4的佐剂)，或不同佐剂的组合，也有助于提高抗原免疫原性和疫苗效力。最后，针对以抗体为基础的传统疫苗的UIV将需要进行大规模的临床前和临床比较研究，以及用于商业UIV生产的疫苗生产和递送方案的标准化。参考资料：Nguyen QT, Choi YK. Targeting Antigens for Universal Influenza Vaccine Development. Viruses. 2021 May 24;13(6):973. doi: 10.3390/v13060973. PMID: 34073996; PMCID: PMC8225176.为推动我国生物制品全生命周期质量管理体系的建立，进一步提升生物制品的安全性和有效性，“2023生物制品全生命周期质量管理峰会”将于2023年9月22-23日在上海举办，主题为“质量为先、精益求精”。组委会将力邀知名制药企业质量专家、行业协会和监管部门领导、学术专家做精彩报告。将重点围绕抗体、ADC药物、疫苗、细胞和基因治疗药物、重组蛋白药物等领域的质量管理策略及要点进行探讨。会议内容时间：2023年9月22-23日（周五-周六）地点：上海（酒店定向通知）指导单位：上海市医药质量协会主办单位：四叶草会展、生物制品圈协办单位：奥星集团会议费用：为药企质量专家提供参会福利，报名FREE!（仅收取50元定金，含茶歇、会议资料等，定金概不退还）（如需用餐，2天午餐加收150元），先到先得，报完即止！请提前锁定！报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。