VRC-01

中文摘要 蛋白质纳米颗粒作为抗原展示载体，与天然病原体大小相似，能够有效帮助抗原提高其稳定性和免疫原性。临床试验研究表明，蛋白质纳米颗粒可被应用于新型疫苗的开发。此文对蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学特性，以及蛋白质颗粒在疫苗研发中的应用进行综述，旨在为蛋白质纳米颗粒的进一步研究提供参考。 正文 接种疫苗是预防疾病感染最有效的方法之一，常见疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等，但部分研发策略还存在问题，如重组亚单位疫苗虽然成分明确、安全性高，但往往因缺乏病原体相关分子模式而无法高效诱导APC成熟，需要佐剂提高免疫原性，激活机体适应性免疫应答。 随着纳米技术的发展，脂质体、微粒、无机和聚合物、蛋白质等均能够被制成纳米颗粒，高效递送药物或诊断试剂到靶点。纳米颗粒大小适宜、表面可修饰，可以增强疫苗抗原在机体内的渗透性和半衰期，提高递送率。目前基于纳米颗粒的靶向治疗与诊断被广泛应用，其中蛋白质纳米颗粒已能获取清晰的原子级晶体结构，且能够在结构和基因上被操纵。基于此，研究者提出了将亚单位疫苗的抗原分子结合在蛋白质纳米颗粒表面形成与病原体相似的多价分子模式，以实现对免疫系统的有效刺激，这成为新的疫苗研发策略。 1 蛋白质纳米颗粒疫苗的免疫学 1.1 免疫刺激 纳米颗粒疫苗能够增强淋巴运输、增加APC在淋巴结中的捕获以及通过多价受体交联增加抗原特异性B细胞的活化。蛋白质纳米颗粒疫苗中抗原能够自组装成寡聚的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），具有良好的免疫原性，对于一些抗原无法自组装成纳米颗粒的亚单位疫苗，可通过将这些抗原附着到寡聚的蛋白纳米颗粒上来完成自组装。 纳米颗粒疫苗主要在次级淋巴器官中诱导适应性免疫应答，皮下或肌内注射后，通过淋巴引流或免疫细胞来介导疫苗抗原从注射部位到淋巴结（lymph node，LN）的运输。对于直接淋巴引流，疫苗颗粒的相对分子质量和尺寸至关重要。直径在10~200 nm范围内的纳米颗粒可通过淋巴管内皮细胞连接处直接扩散进入淋巴管向LN输送，最佳尺寸约为40 nm。小于10 nm的分子会扩散到血液中进行全身循环，较大的颗粒倾向于在注射部位附近积存，需要特化细胞如树突状细胞携带进入淋巴系统，大约24 h才能到达LN。因此，直径10~200 nm的蛋白质纳米颗粒能够快速进入淋巴结，刺激免疫系统。 1.2 免疫加强 在纳米颗粒表面密集展示抗原通常可以有效增加免疫原性，如肽抗原在体内因缺乏重复表位会被快速清除，导致体液应答较差，而在颗粒支架上多聚化时会产生强烈的抗原特异性抗体应答。蛋白质纳米颗粒还可以增加抗原的稳定性并保持所需的表位构象，如HIV包膜蛋白Env三聚体与自组装蛋白支架的融合已被成功应用于确保抗原折叠成正确的构象。纳米颗粒还可以作为多价抗原展示平台，以高度有序的方式在表面呈现抗原的多个拷贝，可以同时结合多个B细胞抗原受体，增加亲和力，从而诱导更强的B细胞活化。 预防性疫苗的有效性取决于能否产生持久的T细胞依赖的IgG抗体应答。APC对抗原的呈递取决于抗原相关的特异性，包括大小、形状、表面电荷、亲水性以及受体之间的相互作用。其中抗原的大小是影响APC有效吸收的重要因素，纳米颗粒具有带电荷、疏水或受体相互作用特性的大表面，这导致APC与抗原颗粒的相互作用比与可溶性蛋白质的相互作用更好。通过将抗原附着在纳米颗粒上，使疫苗增加到最佳尺寸范围，提高了APC的有效摄取，更多地呈递抗原以激活Th。 1.3 免疫靶向 蛋白质纳米颗粒还可以被应用于开发免疫逃逸病原体的疫苗，例如HIV、流感和疟疾等疫苗。部分病毒特异性抗体（一般多为非中和抗体）与病毒结合后，可通过其Fc段与某些表面表达FcR的细胞结合从而介导病毒进入这些细胞，从而增强了病毒感染性的过程，其中HIV和登革热病毒特异性抗体存在抗体依赖性增强作用。为了避免这一不良反应，研究者从抗原中分离出中和表位并将其构建于蛋白质纳米颗粒表面，可以增加抗原的呈递作用，从而产生强烈的中和性体液免疫应答。除了中和表位之外，在蛋白质纳米颗粒上引入T细胞表位还可激活细胞介导的免疫应答，通用CD4+ T细胞表位可以通过募集Th帮助建立针对抗原的体液应答，而CD8+ T细胞表位可以产生针对特定病原体的杀伤性T细胞。 2 蛋白质纳米颗粒疫苗的应用 蛋白质纳米颗粒在人体中有很好的安全性和有效性。病毒衣壳是目前研究最多的天然蛋白颗粒，例如HPV和HBV的VLP。研究表明，接种二价HPV疫苗1次即能提供有效、持久的免疫效果。目前已发现来自不同生物的天然蛋白质，例如铁蛋白、二氧四氢喋啶合酶（lumazine synthase，LS）等能够自组装成纳米颗粒。这些自组装的蛋白质纳米颗粒展示抗原分子的平台技术也逐渐成熟，在临床前研究中，蛋白质纳米颗粒可显著提高抗体对多种抗原，包括呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）融合前F蛋白、HIV-1的包膜蛋白、流感病毒血凝素（hemagglutinin， HA）和新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的刺突蛋白（spike protein，S）的中和效力或广度。目前展示病毒糖蛋白抗原的蛋白质纳米颗粒疫苗正在进行临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147）评估。此外，通过计算机设计的蛋白质纳米颗粒，具有强大的自组装优势和低免疫原性，也可以作为通用的多价抗原呈递平台。 2.1 VLP VLP是1种自组装系统，可在1种或多种病毒蛋白表达后自发形成病毒状颗粒，具有对称的二十面体或棒状结构，由于缺乏复制酶和编码病毒蛋白的核酸而无法复制。HPV疫苗如二价Cervarix、四价Gardasil-4和九价Gardasil-9，含有由主要衣壳蛋白L1自组装而成的L1-VLP，具有免疫原性并能够诱导高滴度的保护性中和抗体。中和抗体由VLP上的重复表位触发，这些表位可通过B细胞受体或Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）交联激活B细胞。此外，L1蛋白也富含Th表位。 从慢性HBV感染者的血浆中纯化获得的乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）， 可自组装成24~31 nm的纳米颗粒。重组乙型肝炎疫苗通过培养携带HBsAg基因的酵母细胞表达平台获得的HBsAg可自组装形成纳米颗粒。戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）也可以通过形成重组VLP提高免疫效果。由杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达HEV的衣壳蛋白，获得的HEV-VLP能够预防感染。此外研究者发现HE-VLP外表面的环结构域允许外源表位的插入，而不影响VLP的形成，被认为有可能作为抗原载体。 对下一代流感疫苗的需求一直是对新型VLP疫苗进行研究的最大驱动力之一。流感病毒的VLP是由基质蛋白M1支持的脂质双分子层上的HA和神经氨酸酶抗原自组装产生直径100~150 nm的非传染性颗粒，与天然的流感病毒类似。目前多项流感VLP疫苗的安全性与免疫原性临床研究（NCT01014806、NCT01072799、NCT00903552等）已完成。 2.2 铁蛋白 铁蛋白是1种铁储存蛋白，普遍存在于几乎所有的生物体，包括细菌、真菌、植物和动物。铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由4个螺旋束组成。它们自组装成1个八面体对称的球形结构蛋白质纳米笼，外径约为12 nm，内径约为8 nm，内部空腔提供了封闭环境隔绝铁和外部环境。铁蛋白自组装具有强大的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒，能够在85 ℃以下保持稳定，并能在中性pH条件下耐受相当高水平的变性剂，非常适合携带和暴露免疫原。此外，由于铁蛋白由8个单位组成，每个单位均为三轴对称，因此它可以呈现三聚体抗原的支架。许多病毒的主要抗原以三聚体形式发挥作用，例如流感病毒的HA、SARS-CoV-2的S和呼吸道合胞病毒的F蛋白等。将这些抗原分子融合到铁蛋白上能够形成与天然结构相似的三聚体。Kanekiyo等将流感病毒HA与铁蛋白基因融合，获得了HA-铁蛋白纳米颗粒。在抗原性方面，使用这种流感纳米颗粒疫苗进行免疫接种引起的血凝抑制抗体滴度大约是灭活疫苗的11倍。此外，它引发了2个高度保守结构域的中和抗体应答，提高了流感病毒免疫的效力和广度。 铁蛋白纳米颗粒也被用于SARS-CoV-2疫苗的研究，研究者利用铁蛋白纳米颗粒展示多价SARS-CoV-2 S，与单独的S相比在免疫小鼠后会引发更强烈的中和抗体应答。研究者利用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的受体结合域（receptor binding domain，RBD）和七肽重复单位共价结合在铁蛋白纳米颗粒表面。与单体SARS-CoV-2疫苗相比，纳米颗粒疫苗能引起更强大的中和抗体和细胞免疫应答，能显著降低攻毒小鼠的病毒载量，在恒河猴中诱导了持续的中和抗体和细胞免疫应答。 研究团队采用SARS-CoV-2 S RBD与H7N9 HA的保守茎部区域HA2进行融合，并引入人铁蛋白，构建了可以同时抗SARS-CoV-2及流感病毒的疫苗。在小鼠体内验证该疫苗的免疫原性，发现其能够诱导针对多种SARS-CoV-2变异株的中和抗体。针对流感病毒的数据显示，该疫苗能诱导高水平的针对H7的抗体应答及较强的针对H3的抗体应答。在随后的攻毒实验中，发现疫苗对H7N9的致死性攻击有完全的保护，对H3N2的致病性攻击同样保护效果良好。 铁蛋白纳米颗粒引起免疫应答的潜力已被证明是针对多种病原体的，并且可以快速、低成本地生产。目前基于铁蛋白纳米颗粒的疫苗已经进入了临床试验（NCT03186781、NCT04784767、NCT04645147等）。 2.3 LS LS存在于细菌、真菌和植物中，是参与核黄素生物合成的酶。LS因物种而异，由大小和亚基数不同的同源寡聚体组成，包括五聚体、十聚体和二十面体的六十聚体。所有LS单体的N端和C端都暴露在其表面并面向外，允许在2个不同的位置插入外源抗原序列，不会影响二十面体结构的形成。二十面体的LS也显示出强大的构象稳定性。以上特征使二十面体LS成为展示抗原的有吸引力的支架。Berguer等证实LS可在体外刺激小鼠的骨髓树突状细胞，上调共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ类抗原的水平，同时还证明LS能提高TLR4通路的mRNA、趋化因子和细胞因子的水平。 Jardine等采用嗜热菌Aquifex aeolicus的六十聚体LS作为抗原展示的纳米颗粒平台，构建了靶向HIV的gp120胞外结构域的免疫原eOD-GT6，能够强效刺激产生VRC01类中和抗体。相比之下，单体并不具有激活B细胞的活性，三聚体激活B细胞的效率和速度远不如形成六十聚体的纳米颗粒。Zhang等使用SpyTag/SpyCatcher系统将SARS-CoV-2的S三聚体在LS纳米颗粒上展示。他们对LS纳米颗粒进行了N-糖基化修饰，从而提高了蛋白质溶解度和表达。SARS-CoV-2 S的LS比单独的S能够引发更高的中和抗体应答，用0.08 µg的SARS-CoV-2 S-LS纳米颗粒进行小鼠疫苗接种可诱导与2.0 µg单独的S相似的中和抗体水平。 2.4 I53-50蛋白 研究者们基于天然蛋白质纳米颗粒的自组装能力，设计出许多具有自组装功能的蛋白质复合物。Bale等精确设计的自组装蛋白纳米颗粒I53-50由2种寡聚蛋白组成，包括三聚体I53-50 A和五聚体I53-50 B。分别表达和纯化这2个组分，并将其混合后可高效地组装成高度有序、均匀的二十面体颗粒，直径在24~40 nm。组装发生速度与病毒衣壳的组装速度相近，并且能够通过电荷互补性控制分子货物的包装。I53-50A能够保持抗原分子天然稳定的构象，这一特点使它在HIV、RSV、SARS-CoV-2的疫苗研究中得到了广泛的应用。 研究者利用I53-50成功展示了20个不同毒株稳定的SOSIP三聚体，SOSIP位点是通过引入连接gp120和gp41亚基的人工二硫键（SOS），以及gp41胞外域（IP）的异亮氨酸-脯氨酸突变（I559P）形成。免疫研究表明，与传统的单组分纳米颗粒系统相比，该三聚体可以提高抗体应答的质量，并且在具有顶点-近端中和表位的SOSIP三聚体时最有效。此外有研究在I53-50纳米颗粒外部呈现了RSV-F糖蛋白三聚体重复结构的免疫原DS-Cav1（融合前稳定的F抗原），在小鼠和非人灵长类动物实验中，20个DS-Cav1三聚体的全价纳米颗粒免疫原诱导的中和抗体应答是三聚体DS-Cav1的10倍。 Walls等在I53-50纳米颗粒中展示了60个SARS-CoV-2 S的RBD，在低剂量的情况下诱导的中和抗体滴度约是预融合稳定S的10倍。SARS-CoV-2 RBD纳米颗粒诱导的抗体靶向多个不同的表位，这表明它们可能不容易逃避突变，并表现出比人恢复期血清更低的结合中和率，这可能会降低发生疫苗相关的呼吸道疾病的风险。目前研究者已启动了GMP生产工作，以推进SARS-CoV-2-RBD纳米颗粒疫苗进入临床。这些结果推动了I53-50纳米颗粒作为疫苗载体的持续开发。 3 蛋白质纳米颗粒疫苗的构建策略 蛋白质纳米颗粒可以通过其组成蛋白的异体以重组形式获得，这种能力有助于通过合理的设计，赋予蛋白质纳米颗粒有用的、非天然的功能。基于分子组装机制允许纳米颗粒蛋白和抗原分别在各自最佳的表达系统中产生，以保持其天然的构象。为了有效地呈递和与细胞受体的相互作用，抗原保持其结构稳定性和构象是至关重要的。同时抗原可能会干扰纳米颗粒亚基间相互作用，阻碍其组装成纳米颗粒。目前有3种方法可以用来整合病毒抗原与纳米颗粒蛋白：基因融合、化学偶联以及SpyTag/SpyCatcher系统。 基因融合可以使抗原与纳米颗粒蛋白整合，表达后纳米颗粒蛋白的自组装导致抗原多价展示。但基因融合可能造成纳米颗粒蛋白亚基和/或抗原的不当折叠，导致支架组装抑制或抗原活性丧失。需要合适的设计以维持抗原与纳米颗粒的构象稳定，例如在抗原与纳米颗粒分子之间插入柔性的Linker，以保证2个组分的正确折叠。 SpyCatcher/SpyTag系统是一种快速稳定的不可逆肽-蛋白质连接方法，由化脓性链球菌纤连蛋白结合蛋白的胶原蛋白黏附素结构域改造而来，含有13个氨基酸的SpyTag和含有138个氨基酸的SpyCatcher。SpyTag中的天冬氨酸能和SpyCatcher上的赖氨酸在相邻的谷氨酸催化下自发反应生成异肽共价键。将SpyTag和SpyCatcher分别偶联纳米颗粒蛋白和抗原分子，表达纯化后，在体外混合得到展示多价抗原的纳米颗粒。 化学偶联使用交联剂与蛋白质氨基酸残基的侧链相互作用，实现抗原分子与纳米颗粒蛋白亚基的连接。最常见的反应是通过交联剂的 N-羟基琥珀酰亚胺臂对蛋白质纳米颗粒上的赖氨酸或N末端的氨基进行酰化，然后通过交联剂的马来酰亚胺臂烷基化抗原上的半胱氨酸。由于半胱氨酸在蛋白质表面很少见，因此通常可以通过点诱变引入单个暴露的半胱氨酸。化学偶联的VLP包括噬菌体Qβ和烟草花叶病毒，已进入多项临床试验，包括用于2型糖尿病患者的IL-1β疫苗和用于戒烟的尼古丁疫苗。蛋白质纳米颗粒表面存在多个赖氨酸，导致偶联产物的异质性。同时引入反应性半胱氨酸可能干扰抗原中预先存在的二硫键的形成。 4 总结与展望 在过去10年中，蛋白质纳米颗粒作为抗原展示的载体被广泛应用于疫苗的研发，特别是对SARS-CoV-2疫苗的研究，引起了研究者对蛋白质纳米颗粒平台的极大兴趣。蛋白质纳米颗粒作为抗原的展示平台在疫苗研发中拥有巨大的潜力，它们可应用于多种病原体，能够显著提高抗原的免疫原性和稳定性，引发持久的保护作用。同时拥有重组蛋白的优势，能够快速、低成本生产。 使用蛋白质纳米颗粒作为抗原的载体，也存在潜在的针对载体的抗体应答风险，同时引入的SpyCatcher/SpyTag蛋白也是外源性蛋白，在体内可能产生免疫原性。已知的自组装蛋白质纳米颗粒的数量是有限的，可通过计算设计具有原子级精度和可控组装的蛋白质纳米颗粒。此外，蛋白质纳米颗粒疫苗的临床研究数据不足，限制了其在人体的应用。总之，开发基于蛋白质纳米颗粒的疫苗具有广阔的前景，但也必将面临相关的挑战，需要更多的临床数据进一步证明蛋白质纳米颗粒在新型疫苗开发中的实用意义。 作者 张欣明综述  李媛媛审校 国药中生生物技术研究院有限公司疫苗研发课题组(一)， 北京  101111 通信作者：李媛媛， Email：lily13102@163.com 引用本文：张欣明, 李媛媛. 蛋白质纳米颗粒在疫苗研发中的应用 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(4): 238-244.   DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230705-00058 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:COVID-19大流行将疫苗学领域置于全球意识的中心，强调了疫苗作为变革性公共卫生工具的关键作用。疫苗的影响最近得到了认可，2023年诺贝尔生理学或医学奖授予Katalin Kariko和Drew Weissman，以表彰他们对mRNA疫苗开发的重要贡献。在这里，我们提供了一个历史视角，回顾了过去两个世纪中导致27种获得许可的疫苗开发的关键创新，以及有望在未来改变疫苗的最近进展。诸如反向疫苗学、合成生物学和基于结构的设计等技术革命，将对抗脑膜炎球菌B和呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗失败转化为成功。同样，mRNA疫苗的速度和灵活性深刻改变了疫苗开发，新型佐剂的进步有望彻底改变我们调节免疫的能力。在这里，我们重点介绍了系统免疫学领域的激动人心的新进展，这些进展正在改变我们对人体对疫苗免疫反应的机制理解，以及如何预测和操纵它们。此外，我们还讨论了主要的免疫学挑战，例如学习如何在人类中激发持久的保护性免疫反应。 1.引言 1796年，爱德华·詹纳首次实践了疫苗接种，这是现代医学中最古老、最具成本效益的医疗干预措施之一。尽管目前大约有27种获得许可的疫苗，为20多种病原体提供保护，但针对许多病原体的疫苗开发仍然具有挑战性。尽管如此，下一代抗原设计和mRNA疫苗快速发展的结合，导致了高效COVID-19疫苗的开发，并使疫苗学领域成为全球关注的焦点。COVID-19疫苗的快速开发是基于数十年在病原体监测、基因组学、基于结构的抗原设计、传递技术和人类免疫学方面的进展，在大流行期间汇聚而成的。这些疫苗的显著成功再次确认了疫苗作为救生设备的重要性，它们将继续在未来大流行的控制中发挥关键作用。自詹纳时代以来，疫苗领域的这种创新轨迹正在对疫苗学产生变革性影响。在这篇综述中，我们提供了疫苗学的历史视角，强调技术创新及其对未来疫苗开发的影响。我们将讨论分为四个部分：（1）首先，我们提供了疫苗学中一些关键创新的历史视角；（2）我们讨论了疫苗效力的相关性，这是最近系统免疫学进展推动的；（3）我们讨论了佐剂的机制基础和重要性；以及（4）最后，我们讨论了开发未来疫苗需要克服的主要挑战。 2.历史视角 2.1.减毒活疫苗和灭活疫苗 疫苗接种利用免疫系统的自然能力来对抗感染。最早的自然免疫描述可以追溯到公元前430年。雅典历史学家修昔底德在伯罗奔尼撒战争期间写了一份报告，描述了一种瘟疫，这种瘟疫导致雅典三分之一的人口死亡。这种传染非常具有破坏性，以至于即使在同一家庭中，也没有人敢照顾病人。然而，人们注意到一旦康复，个体就不会再生病，因此只有那些已经康复的人被指派照顾生病和垂死的人。这标志着与自然免疫相关的第一次具体线索。 然而，通过接触自然或故意感染来利用自然免疫，以产生抵抗力的能力，在人类历史上被广泛使用。一个广为人知的例子来自1000多年前的中国，观察到天花感染赋予了终身免疫，导致了预先暴露接种的过程。具体来说，从经历轻微感染的个体身上收集的干痂物质被用来接种（感染）健康个体，使他们对将来的暴露产生抵抗力。这种实践，被称为“人痘接种”，在世界许多地方变得流行，英国驻土耳其大使的妻子蒙塔古夫人在1720年代将人痘接种过程引入英格兰。从那时起，这种做法在18世纪扩展到西方世界。虽然人痘接种非常有效，但它也很危险，导致非常高的发烧和一些伤亡。疫苗的历史在1796年彻底改变了，当时乡村医生爱德华·詹纳观察到，从牛乳头传播给人类的轻度脓疱状疾病似乎也能赋予对天花的终身免疫（表1）。为了测试他的假设，詹纳用牛的脓疱内容物给一个小男孩詹姆斯·菲利普斯接种，并表明这个孩子对随后的天花挑战有抵抗力（图1）。这个新程序标志着疫苗接种领域的开始（以拉丁语中的牛vacca命名）。使用詹纳的原则，天花在1979年从地球上完全根除，几乎在詹纳发现可以通过轻微感染实现免疫的两个世纪后，特别是不需要经历严重疾病。詹纳的创新观察，即自然免疫可以通过最小的风险安全地实现，系统地有效地彻底改变了对抗病原体的战斗，并诞生了疫苗接种领域。 在詹纳实验近一个世纪后，罗伯特·科赫和路易·巴斯德发现传染病是由微生物引起的，路易·巴斯德推测接触减毒病原体也能赋予免疫（图1）。因此，巴斯德开始开发多种方法来干燥、加热灭活、暴露病原体于氧气中，或在不同的动物宿主中传递它们，以防止病原体引起疾病。巴斯德首先进行了一个概念验证，他证明了他能够保护鸡免于接种引起鸡霍乱的减毒细菌后死亡，现在已知为Pasteurella multocida，为减毒病原体疫苗开发铺平了道路。然后，他继续开发狂犬病疫苗，使用干燥空气来减弱狂犬病病毒的毒性，并表明他能够在动物中提供对疾病的保护。鉴于在动物中取得了有希望的结果，他随后在1885年成功地使用狂犬病疫苗挽救了被狂犬病狗咬伤的男孩约瑟夫·迈斯特的生命。 在巴斯德的成功之后不久，1890年，埃米尔·冯·贝林和柴田石川发现，从挑战白喉毒素后存活的豚鼠身上收集的血清能够治愈感染的动物，并在挑战前提供保护。到19世纪末，很明显传染病是由微生物引起的，血清转移可以预防和治疗疾病。此外，很明显通过减毒或杀死传染性病原体或接种非致命形式的病原体毒素生产的疫苗可以导致免疫，并为健康人群提供对疾病的保护。这些连续的创新浪潮导致了针对白喉、破伤风和炭疽的救命血清的生产。此外，还生产了针对伤寒、瘟疫、霍乱的灭活细菌疫苗，后来又生产了针对百日咳的疫苗（表1）。阿尔伯特·卡尔梅特和卡米尔·格埃尔因通过在动物中传递牛结核杆菌Mycobacterium bovis 230次来减毒细菌，从而产生了一种针对结核病的减毒活疫苗。这种以Bacille Calmette-Guérin命名的疫苗，是唯一获批准用于预防结核病的疫苗。1924年，英国的格伦尼和法国的拉蒙发现，使用甲醛可以完全解毒白喉和破伤风毒素。这一发现导致了至今仍在使用的针对白喉和破伤风的毒素疫苗的开发。 病毒疫苗是在几十年后开发的，当时人们可以在鸡蛋或细胞培养中大量培养病毒。1935年，马克斯·泰勒通过在实验室中传递病毒，开发了黄热病17D疫苗。同样，在1936年，托马斯·弗朗西斯能够将流感病毒在胚胎蛋中生长，这促进了1940年第一种流感疫苗的开发。然后，恩德斯、韦勒和罗宾斯为病毒生长开发了细胞培养基质的关键技术发展，包括1954年的索尔克疫苗和1963年的萨宾疫苗，用于脊髓灰质炎。在脊髓灰质炎疫苗之后，20世纪60年代，塞缪尔·卡茨、莫里斯·希勒曼和斯坦利·普洛特金分别开发了麻疹、腮腺炎和风疹疫苗。此外，在1975年，高桥三明开发了减毒活水痘疫苗，使用细胞培养中的连续传递，为开发许多其他病毒疫苗铺平了道路。 2.2.多糖和结合疫苗 1969年，Goldsheneider和Gotschlich报告说，对脑膜炎球菌荚膜多糖有抗体的人受到疾病的保护。这一观察引导他们开发了从细菌中纯化高分子量多糖的新方法，导致开发了针对脑膜炎球菌A和C的疫苗（图1）。这一在抗原纯化方面的主要创新为开发几种额外的荚膜多糖疫苗铺平了道路，包括肺炎球菌、流感嗜血杆菌和伤寒疫苗。然而，不幸的是，尽管多糖疫苗在成人和老年人中提供了强有力的保护，但这些疫苗在婴儿中的效力较差，婴儿最易受到这些感染的影响，部分原因是由于多糖疫苗刺激的T辅助（Th）反应不足。为了克服这一挑战，Porter Anderson、John Robbins、Rachel Schneerson和David Smith将多糖与载体蛋白（如白喉毒素或破伤风类毒素的非毒性形式）结合，提供强大的Th信号以促进对多糖的免疫。这一创新导致了针对流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌、肺炎球菌和伤寒的结合多糖疫苗的开发和许可。 2.3.重组DNA 在20世纪60年代末，已经开发了一系列可以杀死或减毒的病原体疫苗（表1）。征服新的疾病需要新技术。需要新技术的疾病之一是乙型肝炎，一种不能在培养中生长且不能减毒的病毒。1976年，Maurice Hilleman通过从病毒载量高的个体的血浆中纯化抗原，开发了一种灭活疫苗（图1）。该疫苗提供了对感染的保护，但由于安全和供应链问题，这种疫苗的可持续性受到质疑。值得注意的是，在1979年，Pablo Valenzuela和Bill Rutter发表了乙型肝炎表面抗原的核苷酸序列，到1982年，该团队设计了一种酵母菌株来生产表面蛋白作为重组抗原，与病毒产生的蛋白无法区分。酵母产生的抗原提供了无限的乙型肝炎表面抗原供应，并允许1986年第一种重组疫苗的许可。不久之后，在1992年，Lowi和Shiller从昆虫细胞中表达了人乳头瘤病毒（HPV）L1抗原。值得注意的是，昆虫细胞产生的L1抗原形成了类似病毒的纳米颗粒，诱导了强大的中和抗体，导致2006年用于预防宫颈癌的疫苗许可。受到这些结果的启发，重组DNA被用来设计百日咳鲍特菌表达一种失去毒性的突变百日咳毒素。这种遗传去毒化的毒素诱导的毒素中和抗体滴度比甲醛灭活的毒素高出5倍，这一进步导致了20世纪90年代中期无细胞百日咳疫苗的许可。 2.4.基因组学和反向疫苗学 在结合疫苗革命中，导致开发了针对脑膜炎球菌A、C、Y和W的疫苗，开发针对脑膜炎球菌B（MenB）（在欧洲和美国引起超过60%的脑膜炎球菌脑膜炎病例）的疫苗证明是困难的，因为MenB多糖与自身抗原相似。尽管多次努力寻找替代的MenB抗原，但迫切需要新技术。1995年，Craig Venter发表了第一个活生物体的基因组序列，为新型抗原发现奠定了基础（图1）。Craig Venter、Richard Moxon和Rino Rappuoli之间的联盟导致了完整的MenB基因组测序，发现了90多个新的表面抗原，其中30个诱导了杀菌抗体。选择了三个抗原并开发成疫苗，该疫苗于2013年获得许可。MenB疫苗开创了基因组革命，激发了当今疫苗发现基础的“反向疫苗学”领域。 2.5.基于结构的抗原设计 21世纪在X射线晶体学、冷冻电子显微镜和核磁共振方面取得了巨大进展，显著加速了疫苗开发，提供了可视化和工程化抗原的手段（图1）。确定抗原的原子结构，通常与保护性抗体复合，提供了推动强大中和反应所需的目标相互作用的解决方案。例如，使用结构引导设计，将三个变体的非重叠表位缝合成一个单一分子，创建了一个独特的通用MenB免疫原。类似地，尽管近50年的疫苗设计失败，呼吸道合胞病毒（RSV）的融合（F）蛋白的结构引导设计最终在2023年导致了高度免疫原性和保护性疫苗的开发。具体来说，含有关键中和抗体位点的前融合形式非常不稳定，倾向于进入不引发中和抗体反应的后融合状态。然而，在2012年，Jason McLellan、Peter Kwong和Barney Graham发表了F的前融合构象的首个X射线结构，使团队能够通过插入二硫键和三聚体化域来设计一个稳定的前融合抗原，稳定了分子并将其锁定在诱导强大中和抗体水平的前融合状态。两种稳定的F蛋白疫苗在2023年获得许可。使用同样的原则，COVID-19疫苗利用了为中东呼吸综合征（MERS）冠状病毒开发的结构引导方法，通过添加两个脯氨酸，将尖峰（S）抗原锁定在前融合状态，基于Jason McLellan之前对冠状病毒的工作。 图1. 历史上的技术突破推动了疫苗创新 该图表突出了疫苗领域历史上的主要进步，这些进步极大地加速了疫苗学领域的发展。 基于结构的稳定突变导致了能够结合一些最有效和广泛中和抗体的HIV包膜（Env）的开发。Rogier Sanders、John Moore和同事设计了BG505 SOSIP.664，将HIV Env抗原的两个亚单位gp120和gp41用二硫键连接，并用I559P替换稳定蛋白，将抗原锁定在前融合状态。首次在兔子和猕猴中使用BG505 SOSIP.664加佐剂进行免疫，成功诱导了显著的自体中和抗体反应。然而，这些抗体在对其他HIV株的中和广度上仍然表现有限。在一些长期感染HIV的人中，由于突变导致多种HIV变异株顺序出现，这使得开发广泛中和抗体（bNAbs）成为可能，这提出了模仿这种顺序暴露于不同Env蛋白的疫苗策略，可能有助于“引导”B细胞反应朝着产生bNAbs的克隆发展。这种方法涉及使用能够结合表达在原始抗原特异性B细胞（所谓的“种系靶向”）上的B细胞受体的免疫原进行初次免疫，然后用一系列与前一个略有不同的免疫原进行加强免疫，这些免疫原“引导”B细胞克隆沿着发展路径发展，最终产生产生bNAb的B细胞。例如，Bill Schief设计了一个最小的CD4结合位点抗原，eOD-GT8，这是一个被一些最有效和广泛的bNAbs（如VRC01）靶向的区域。在1期研究中，eOD-GT8能够触发VRC01家族的原始种系前体B细胞，这些细胞能够在转基因种系BCR表达小鼠中逐步发展。类似基于结构的种系靶向抗原方法也在为其他病原体（如流感）开发，目标是开发“通用流感疫苗”。然而，随着人工智能（AI）的爆炸性增长，基于结构的疫苗设计和种系靶向的创新步伐大大加快。AI驱动的蛋白质折叠预测现在可以预测几乎所有肽/蛋白质的结构，使稳定突变的快速整合、工程化形状免疫优势以及选择最小区域进行嫁接蛋白设计成为可能。 2.6.合成生物学、病毒载体和mRNA疫苗 2010年，Don Gibson和Craig Venter开创了轻松制作合成基因的能力，这使得能够直接从基因组序列合成疫苗，而无需接触病原体。第一个例子是在2013年，当时中国疾病控制中心（CDC）在互联网上发布了一种新的禽H7N9病毒序列。该病毒在中国已导致三人死亡，并具备大流行株的所有特性。虽然许多团队试图获取病毒以制作传统疫苗，但Craig Venter在圣地亚哥的团队第二天下载了序列，并在一天内合成了血凝素（HAI）和神经氨酸酶基因，然后连夜运送到诺华。这些基因被用来制作两种疫苗：（1）通过反向遗传学生产的常规亚单位疫苗，随后在鸡蛋和细胞培养中病毒生长和（2）RNA疫苗（图1）。RNA疫苗和用于生产常规疫苗的重组流感株在序列可用后1周准备好，比病毒用于传统疫苗开发提前了几个月。亚单位疫苗是第一个从合成生物学衍生并在临床试验中成功测试的疫苗。 然而，又过了7年，我们才看到合成疫苗彻底改变了现代疫苗学。2020年1月10日，中国CDC在互联网上发布了SARS-CoV-2病毒的基因组序列。第二天，全球超过350个实验室能够下载序列并开始生成S抗原的合成基因。合成基因被用来制作完全合成的mRNA疫苗；构建重组病毒载体（主要是不复制的腺病毒）；或构建重组哺乳动物、昆虫或植物细胞以表达S蛋白。所有方法都很有效，但mRNA在获得紧急使用授权方面是最快的，从序列可用后仅11个月。66病毒载体是第二个获得许可的，而重组蛋白由于需要发酵和纯化过程以及添加佐剂而被推迟。尽管蛋白质生产延迟，但蛋白质工程的技术创新，特别是在纳米颗粒设计方面，导致了强大、持久和广泛的免疫原性，标志着使用新的蛋白质设计策略优化免疫的机会。 然而，合成疫苗的力量不仅限于传染性目标，因为反向疫苗学、基因测序和合成疫苗设计的革命已经改变了癌症疫苗领域，并承诺也将影响耐受性疫苗领域。在肿瘤学领域，癌症中专有免疫原性新抗原的发现导致了快速定义肿瘤中独特专有基因突变（新抗原）的测序算法的开发，与健康参考组织基因组相比，以构建个性化癌症疫苗。新抗原序列被用来设计个性化合成疫苗中的新表位序列，这些疫苗在治疗胰腺癌和黑色素瘤方面已经开始显示出显著的前景。 图2. 人类传染病的主要疫苗平台 这幅卡通展示了过去200年中演变出的各种疫苗平台，以及属于每个疫苗平台类别的已许可疫苗的例子。对于一些最近开发的疫苗，包括COVID-19和RSV疫苗，我们在括号内标明了疫苗开发者。 3.测量和预测疫苗结果 尽管疫苗在限制COVID-19疾病方面具有显著的保护作用，但针对结核病、HIV、疟疾等的疫苗仍未能引发保护性免疫反应。因此，尽管抗原测序、抗原设计和新型疫苗输送方式发生了革命性变化，疫苗设计过程中的一个关键组成部分仍未被充分利用，这与专门和选择性地训练免疫反应以驱动保护性免疫反应有关。除了疫苗技术的爆炸性增长外，免疫学技术也出现了并行的爆炸性增长，这些技术提供了对各种病原体保护性免疫的签名和机制的洞察。然而，免疫学与众多可用疫苗平台的完全融合尚未完全实现，但可能会推动疫苗开发的下一次革命，确保每种疫苗都被战略性地设计，以利用最有可能控制和清除目标病原体的免疫反应。 3.1.保护性相关物 历史上，候选疫苗的成功是通过一系列漫长的临床前研究和临床试验来评估疫苗的安全性和针对症状性疾病、严重疾病或感染的有效性。通常，疫苗开发流程包括在动物模型中对候选疫苗进行临床前测试，然后进行第一阶段临床研究以评估安全性，然后进行第二阶段研究以评估疫苗的免疫原性，然后进行第三阶段有效性研究，通常涉及数万名受试者，以最终确定疫苗针对症状性感染的有效性。第三阶段试验的高成本和时间投入已成为快速评估许多有前景的疫苗候选物以刺激有效免疫反应能力的主要障碍。评估疫苗有效性的另一种途径是所谓的控制人类感染模型（CHIM），在这种模型中，接受疫苗或安慰剂的健康志愿者在受控环境中故意暴露于病原体。已经为包括疟疾、流感、伤寒、霍乱、百日咳、志贺氏菌和COVID-19在内的几种感染建立了CHIM。值得注意的是，口服霍乱活疫苗Vaxchora是第一种基于CHIM研究获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗。 对于许多疫苗来说，疫苗接种引发的抗原特异性抗体的数量被用作免疫学终点，标志着被认为是疫苗效力替代物的“保护性相关物”。只有少数疫苗仅凭保护性相关物获得许可，这仅在由于病原体循环有限而无法进行效力试验的情况下。因此，对于大多数病原体，需要进行效力试验，这在很大程度上与监管机构对免疫相关终点真正预测影响的不确定性有关。 保护性相关物通常在接种疫苗后几周内测量，代表在受保护个体中富集的免疫学生物标志物，与那些感染/疾病的人相比。这些相关物传统上用于针对同一病原体的有前景的新疫苗候选物的监管批准，或用于同一疫苗在之前未评估过的人群中的扩展监管批准。几乎所有临床批准的疫苗都使用针对病原体的抗体作为保护性相关物，最近的活减毒基孔肯雅热疫苗就是例证。具体来说，针对病原体的抗体滴度被用来量化对病毒和细菌病原体的保护水平，中和抗体滴度被用来量化对病毒或细菌毒素的免疫力，吞噬细胞抗体滴度被用来鉴定抗菌活性。能够引发与这些免疫相关物相当或更高水平的疫苗被认为已经达到了保护性免疫的标志。这些测试已经很好地标准化，相对容易进行。对于每种病原体，在临床前开发期间建立了特定的抗体测量，以定义具有最高预测价值的生物标志物。 3.2.重新定义相关物 尽管抗体滴度作为许多疫苗的保护性相关物被广泛使用，但仅关注抗体忽略了免疫系统的复杂性，免疫系统已经进化出多种防御机制，包括T细胞和先天免疫来对抗病原体。因此，在某些情况下，保护性免疫与抗体反应无关。例如，对于水痘病毒疫苗接种，水痘特异性T细胞已被证明是防止水痘病毒再激活的最佳指标，并已被建议作为儿童和老年人的潜在保护性相关物。同样，尽管1/40的HAI抗体滴度通常被用作保护性相关物，但包括大量病毒特异性流感特异性T细胞反应和抗体依赖性细胞毒性在内的其他免疫标志物与降低突破性疾病有关，无论接种疫苗后的抗体滴度如何。同样，对于COVID-19疫苗，对中和抗性病毒的持久保护能够引起全球传播波，可能由疫苗诱导的T细胞免疫反应、先天免疫或替代抗体功能赋予。因此，确定与疾病保护相关的确切免疫机制可以为设计更有效的下一代疫苗或指导增强活动提供非常宝贵的见解。 对于许多复杂的病原体，如HIV、疟疾和结核病，传统的抗体测量未能在疫苗设计中提供预测价值，保护性免疫的相关物尚未得到很好的定义。例如，在早期HIV疫苗试验中，即使在非常高的HIV Env结合滴度下也发生了感染。相反，随后三十年的研究表明，广谱中和抗体（bNAbs），而不是结合抗体或类型特异性中和抗体，对于保护这种快速进化的病原体至关重要。同样，如上所述，对于RSV，针对F蛋白稳定形式的中和抗体滴度，而不是针对未折叠F蛋白的总抗体，是开发保护性RSV疫苗的关键免疫决定因素。然而，有趣的是，与中和抗体相比，结合抗体滴度在COVID-19疫苗接种后对疾病的保护同样具有预测性。 与HIV疫苗失败类似，能够诱导强烈抗体反应的疫苗仅对结核病和疟疾提供部分保护。针对这些复杂病原体的许多疫苗候选物的失败突显了我们对保护性免疫机制范围的不完整理解，这些机制有助于控制或清除这些感染。对于这些感染，T细胞和B细胞反应以及先天反应，特别是局部化的器官反应，已被牵涉到控制和清除中。因此，可能需要放弃为抗体滴度开发的简单线性功能签名模型。实际上，之前旨在确定与保护相关的抗体阈值的策略可能不太可能有助于解释对这些复杂病原体的保护。相反，“共保护性相关物”可能更合适，多种免疫机制的平衡可能协调地和互补地有助于识别、控制和清除病原体。例如，当满足两个条件时，可能实现对病原体的保护：（1）CD8组织驻留记忆（TRM）细胞的频率达到给定阈值，以及（2）中和抗体滴度的大小达到某个阈值。此外，这些免疫反应可能在人群中相互补偿，以这样的方式，诱导更高幅度的T细胞或抗原依赖性细胞毒性（ADCC）的疫苗可能需要较低的中和抗体阈值以提供对感染的持久保护。 因此，随着我们对哺乳动物免疫反应的复杂性的认识不断加深，包括T细胞、先天免疫以及抗体效应功能的协调作用，迫切需要深入理解人类对疫苗接种的免疫反应。因此，开发融合免疫学和疫苗学创新的策略提供了一个前所未有的机会，以表征保护性免疫反应，并利用这种反应构建“目标免疫档案”（TIP），以帮助指导设计高度保护性疫苗接种策略。类似于系统生物学在COVID-19大流行中的最近应用，定义疫苗接种后保护性免疫反应的变革性影响可以提供塑造疫苗诱导免疫以对未来病原体提供最广泛保护所需的保护机制的关键见解。 图3. 系统免疫学工具箱 这幅卡通描绘了过去几十年中出现的新技术，这些技术是疫苗学和免疫评估革命的关键。 3.3.系统生物学转变疫苗学 人类免疫系统由数十种特殊细胞亚群组成，这些细胞亚群广泛分布在全身各个器官中。疫苗接种导致涉及多个器官中多种细胞类型的协调作用的复杂级联事件，如果成功，可以产生提供针对特定病原体的保护和免疫记忆的免疫反应。在人类基因组项目之后，高通量“组学”技术的出现，如RNA测序（RNAseq）、高分辨率质谱蛋白质组学/代谢组学、CyTOF质谱细胞仪（CyTOF）、表观基因组分析、单细胞RNA测序和测序的可移动元件可访问染色质测定（ATAC-seq）以及全基因组CRISPR筛选，以及在人工智能方面的惊人进步，为解读人类对疫苗接种的免疫反应的复杂性提供了强大的方法。 这种方法的第一个概念验证是使用系统生物学工具定义预测疫苗接种免疫反应的早期分子签名，来自对活减毒黄热病YF-17D疫苗免疫原性的免疫学预测的系统生物学分析，这是迄今为止最有效的疫苗之一。该疫苗已在全球范围内为超过6亿人接种，有效性超过95%。通过分析血液中的转录、细胞和细胞因子反应，并定义疫苗接种后几天内诱导的分子相关物，全面分析健康成人对YF-17D疫苗的免疫反应，与几周后发生的抗原特异性CD8+ T细胞反应和中和抗体反应相关。在两项独立研究中，YF-17D疫苗在疫苗接种后几天内诱导了强烈的1型干扰素（IFN）抗病毒签名。此外，机器学习工具能够以超过90%的准确率预测独立盲试中的抗原特异性CD8+ T细胞和中和抗体反应。这些研究为使用基于系统的分析对其他疫苗进行分析铺平了道路，包括针对流感、脑膜炎球菌感染、带状疱疹、疟疾和SARS-CoV-2的疫苗。同样，最近的一项研究整合了来自28项研究的820名成人的3000多个样本的转录数据，并分析了疫苗诱导的抗体反应签名。分析显示，指向稳健浆细胞反应的转录签名与所有疫苗的抗体反应幅度相关且具有预测性。因此，系统生物学方法不仅可以定义个体疫苗后的免疫原性生物标志物，还可以识别预测疫苗反应的共同免疫生物标志物，跨越疫苗类型和平台。 系统生物学工具的使用还揭示了新的感染保护相关物。例如，Kazmin等人分析了接受三剂AS01b佐剂RTS,S疟疾疫苗或接受两次RTS,S/AS01b免疫的人类免疫反应，这些免疫是在用表达环孢子蛋白（CSP）的腺病毒35（Ad35）载体进行初次免疫后进行的，然后在最终免疫后3周通过暴露于感染疟原虫的蚊子进行控制人类疟疾挑战（CHMI）。两种疫苗均实现了50%的保护，但保护的相关物不同。在仅使用RTS,S方案中，挑战前的CSP特异性抗体滴度与保护相关，与此一致，血液转录签名在最终疫苗接种后7天与挑战前的抗体滴度以及保护相关。然而，在接受Ad35-CSP初次免疫的组中，抗体反应较低且与保护无关。相反，与保护相关的是多功能性CD4+ T细胞的频率，早期先天免疫和树突细胞（DC）激活的签名与保护高度相关。这项研究强调了在CHMI研究中使用基于系统的方法定义相关物的效用，并证明了通过多种机制实现对P.falciparum的保护性免疫。 在上述RTS,S疫苗的CHIM研究中进行的深度抗体分析揭示了ADCC和中性粒细胞吞噬CSP特异性抗体在预防疟疾感染中的重要作用，这突出了体液免疫反应的质量特征而非数量特征。同样，在一项通过静脉注射BCG疫苗的非人灵长类动物研究中，该疫苗对结核分枝杆菌（Mtb）提供了接近无菌的保护，系统免疫学分析和深度抗体分析揭示了CD4辅助T细胞、补体固定抗体和自然杀伤（NK）细胞之间的重要协调作用，提供了与控制肺部细菌相关的保护性签名的意外见解。总的来说，这些研究强调了在CHIM和灵长类动物挑战研究中使用基于系统的方法定义保护相关物的效用。 此外，深度抗体分析的使用揭示了针对多种病原体的保护中意想不到的抗体效应机制。具体来说，深度功能性体液分析揭示了在两种不同的免疫途径和两种不同的疫苗平台中，吞噬细胞抗体在保护灵长类动物免受HIV类似物猴免疫缺陷病毒（SIV）感染中的关键作用。这些数据表明，除了bNAbs外，抗体促进吞噬作用的能力也可能导致病毒颗粒的快速清除。同样，深度抗体分析指出，单核细胞吞噬作用在预防RSV感染中的关键作用，以及中性粒细胞吞噬作用和补体激活在预防埃博拉病毒感染中的关键作用。系统免疫学分析还提供了疫苗如何被免疫系统调节以引发保护性免疫反应的重要见解。例如，它们揭示了宿主微生物群在塑造疫苗诱导的免疫中的作用的首次因果证据，胆固醇代谢在塑造疫苗反应中的关键作用，以及氨基酸感应途径的一般控制非抑郁2（GCN2）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）与疫苗反应幅度之间的未被重视的联系。此外，最近的研究揭示了佐剂通过表观遗传印记先天免疫诱导广泛抗病毒防御的新机制，这一发现导致了“表观遗传佐剂”的概念目前正在进行评估。这些研究共同为疫苗设计提供了关键线索，以克服可能涉及减弱免疫的潜在途径，包括使用替代疫苗平台或佐剂。 4.佐剂 101 早在20世纪20年代，就已经清楚地表明，整个杀死或活减毒疫苗本身是有效的疫苗，并能引发强烈的免疫反应。然而，像白喉或破伤风类毒素疫苗这样的亚单位疫苗引起的免疫反应弱且短暂，这表明这些组分疫苗需要一些帮助才能使它们稳定有效。测试了几种可能的佐剂（拉丁语中的adjuvare意味着帮助），最终确定氢氧化物或磷酸盐的铝（称为明矾）作为稳定剂和疫苗诱导免疫的增强剂。自从最初许可以来的70多年里，明矾是唯一用于数十亿婴儿和成人疫苗的佐剂，这得益于其卓越的安全性和有效性。尽管其他几种佐剂在临床前模型中显示出强大的效果，但由于安全性或耐受性问题，它们大多数未获准用于人类。事实上，佐剂开发的主要障碍之一是有时它们可能引起不良反应。这可以是局部的（例如，红斑或疼痛）或全身的（例如，发烧和肌肉痛）。在极少数情况下，也可能发生严重的不良事件，如过敏性反应。 尽管如此，纯化抗原的开发，单独使用时免疫原性较差，需要开发新的佐剂以增强疫苗的免疫原性。因此，M59，一种油包水乳液，是第二种获准用于人类的佐剂，于1997年获批，旨在提高季节性流感疫苗的免疫原性。在一项针对儿童的头对头试验中，接受MF-59佐剂疫苗的儿童对实验室确认的流感的有效性为86%，而对照组为43%，并被证明是诱导对新兴大流行H5N1禽流感免疫所必需的。不久之后，开发了第二种油包水乳液（AS03）。这两种佐剂均已获得许可，并在2009年H1N1猪流感大流行中使用。此外，最近，AS03与几种COVID-19疫苗结合使用，包括在哺乳动物、昆虫或植物细胞中表达的抗原。这些佐剂不仅能够增加抗体滴度，而且还能在反应低下的人群中增强免疫力，包括老年人。 在1990年代合成疫苗革命期间，先天免疫和模式识别受体的发现促进了新型佐剂的发现、开发和合理设计。第一种被许可的设计佐剂是AS04，由明矾和单磷酸脂A（MPL）组成，是Toll样受体4（TLR4）的选择性激动剂。AS04被包含在一种获批的HPV疫苗中，并显示出卓越的安全性和免疫原性。第二个被许可的设计佐剂是AS01，一种基于脂质体的配方，含有MPL和皂苷QS-21。这种佐剂最初于2015年获得许可，与儿童RTS,S疟疾疫苗一起使用，以克服通常在幼儿中观察到的反应低下，但后来也获准用于带状疱疹疫苗的开发，并推荐给老年人使用。然而，最近，该佐剂与稳定的preF RSV疫苗结合使用，获得了与对病毒的强大保护相关的许可。 除了油包水佐剂之外，还发现了额外的先天免疫受体，触发了小分子或寡核苷酸筛选，以识别多种TLR、STING和NOD的新激动剂。在这些筛选中，鉴定了几种TLR9寡核苷酸激动剂、几种TLR7/TLR8和新型STING刺激小分子激动剂。其中，TLR9激动剂CpG寡脱氧核苷酸（ODN）1018寡核苷酸被发现，并最近在一种佐剂乙肝疫苗中获得许可，该疫苗提供与传统的三剂疫苗方案相当的免疫，仅需两剂疫苗。此外，这种CpG还在几种基于S蛋白的COVID-19疫苗中使用。同样，已经鉴定了几种TLR7/TLR8激动剂，包括新型合成咪唑喹啉3M052、Alhydroxiquim-II和AS37，这些小分子因其触发强烈抗体反应的能力而被选中。AS37通过带有间隔物和磷酸尾巴进行工程改造，以通过吸附到疫苗上来保持佐剂共定位，从而避免非靶向炎症刺激。这些佐剂诱导强烈的细胞免疫，并在基于蛋白的COVID-19疫苗中诱导增强的ADCC诱导抗体。最近，Alhydroxiquim-II，一种TLR7/TLR8激动剂，也与明矾结合使用，在数百万不同年龄段的人中使用灭活病毒COVID-19疫苗，为该分子的安全性和佐剂性提供了有力证据。此外，3M052已在几种啮齿动物和灵长类动物HIV疫苗试验中使用，导致细胞和体液免疫反应的强烈扩展，能够中和更广泛的病毒。此外，在COVID-19大流行期间的紧急情况也使得额外的佐剂的测试和许可成为可能，包括Matrix-M，一种基于皂苷的佐剂，已在重组S蛋白疫苗的背景下获得许可。总之，在过去的27年中，由于免疫学上的发现，佐剂工具箱得到了显著扩展。此外，佐剂之间的新兴比较分析开始指出它们在诱导T细胞、B细胞、功能性抗体和持久反应方面的能力差异。 5.疫苗学中的主要免疫学挑战 将免疫学工具应用于疫苗学不仅有望指导疫苗开发以触发最有效的TIP，而且有望帮助解决疫苗学中的主要挑战。这些挑战（“普遍挑战”）存在于大多数疫苗中，无论特定病原体如何，包括免疫学挑战（例如，实现持久的保护性免疫）以及监管挑战。此外，还有其他社会（例如，疫苗犹豫）和经济（例如，融资）挑战，这些超出了本综述的范围。在当前讨论中，我们将主要关注免疫学挑战。尽管如此，我们将提及一些监管挑战，包括建立保护性相关物和反应原性，因为它们与我们对人类免疫系统的新兴知识直接相关。此外，COVID-19经验强调了全球对大流行病防备的迫切需求，流行病防备创新联盟（CEPI）倡导了“100天任务”，以开发和部署针对下一次大流行的疫苗。我们认为，解决每一个挑战的关键在于我们预测、理解和操纵人类对疫苗接种的免疫反应的能力。特别是，我们将讨论以下挑战：（1）开发“终身疫苗”，诱导高度持久和广泛的免疫反应；（2）在人类中诱导大量CD8+ T细胞反应；（3）在粘膜组织中利用抗体、T细胞和先天反应之间的协同作用；（4）与疫苗诱导的保护和反应原性的机制和相关物缺乏知识相关的监管挑战；以及（5）在100天内开发大流行疫苗。下面，我们讨论这些普遍挑战，并讨论克服这些挑战的潜在策略。 5.1.开发终身疫苗 在疫苗学中，刺激持久的保护性免疫是一个主要挑战。通常认为，预先存在的抗体介导的保护作用是通过防止宿主细胞感染来实现的。相比之下，对严重疾病的保护被认为依赖于抗原特异性CD8+ T细胞，这些细胞杀死感染的细胞，从而限制病毒负担。然而，如下所述，疫苗诱导的对感染和/或疾病的保护可以通过多种免疫机制的协调作用来介导，包括预先存在的抗体水平、抗原特异性记忆B细胞和T细胞反应以及先天免疫。因此，理解疫苗持久保护性免疫的性质需要全面了解不同的免疫机制，这些机制可能因病原体而异，因传播地点而异，或因病原体引起疾病的部位而异。尽管如此，从历史上看，中和抗体反应被认为是许多感染（如麻疹、腮腺炎、水痘、天花和黄热病以及COVID-19）的主要保护性免疫机制。同样，在细菌疫苗的情况下，杀菌抗体和促进巨噬细胞吞噬细菌的吞噬细胞抗体在机制上与对几种细菌的保护相关。因此，引发长期抗体反应是开发终身疫苗的关键一步，这种疫苗在单次免疫后能诱导持久的保护。 Slifka及其同事的一项开创性研究表明，在美国成年人口中，许多病毒感染（如麻疹、腮腺炎和水痘）会诱导出非常稳定的中和抗体滴度，其半衰期估计从水痘-带状疱疹病毒（水痘）的50年到天花疫苗病毒的92年，甚至超过500年和3000年不等。与此一致，活病毒疫苗能诱导可以持续一生的抗体反应。与对病毒和活病毒疫苗的高度持久抗体反应相比，对破伤风和白喉抗原的抗体反应更快地减少，估计半衰期分别为11年和19年。此外，已经记录到对诸如季节性流感、百日咳鲍特菌、伤寒沙门菌和脑膜炎奈瑟菌等灭活亚单位疫苗的抗体滴度下降，以及针对HIV和疟疾的候选疫苗。对疫苗诱导的免疫反应持久性数据解释的一个警告是，对地方性病原体的亚临床暴露可能会增强免疫反应并导致增强的持久性。然而，在天花疫苗接种的情况下，估计可能是准确的，因为天花在1980年被根除，在美国，没有已知的可感染人类的内源性正痘病毒。 最近对COVID-19 mRNA疫苗的研究表明，对原始WA.1株的结合或中和抗体反应的持久性在初次接种后的6-12个月内下降了10倍，衰减率约为56天。在第三次或第四次加强免疫后，抗体滴度增加，但体液免疫反应的持久性只有适度改善，大约76天的半衰期。然而，对主要关注变体（VOCs）的中和活性峰值较低，对奥密克戎BA.2.75.2、BQ.1.1和XBB.1.5的中和抗体滴度大幅下降（与WA.1株相比，滴度分别下降了48倍、71倍和66倍），6个月后反应下降到检测限以下。这些数据强调了两个关键点：（1）mRNA疫苗诱导的免疫反应从免疫原性高峰下降，（2）这些疫苗没有诱导与类型特异性反应相同水平的广谱中和抗体。相反，疫苗诱导的T细胞和记忆B细胞免疫反应在时间上非常稳定。然而，逃避中和抗体反应的VOCs的频繁出现，加上抗体滴度的下降，使得需要定期加强免疫。然而，鉴于加强免疫只提供短暂的传播阻断活动窗口，并且即使对中和抗性变体，对严重疾病和死亡的保护也持续存在，建议对可能没有强大记忆反应能够迅速控制和清除病原体的脆弱人群进行常规加强免疫。 在解释COVID-19疫苗接种后保护性免疫持久性的数据时，有两个主要警告：（1）几乎所有研究仅在接种疫苗后的前6-12个月内估计抗体反应的半衰期，这是大多数疫苗已知抗体滴度迅速下降的时期，随后在接下来的几个月和几年中抗体滴度更稳定地维持。因此，缺乏长期抗体滴度的数据，如Slifka研究所捕获的，以及缺乏任何加强免疫，对评估COVID-19 mRNA疫苗诱导的免疫反应的真实长期持久性构成挑战。（2）假设对COVID-19的保护仅由中和抗体介导。在这种情况下，即使在接种疫苗后，对严重疾病和死亡的保护也持续存在，即使是对中和抗性VOCs，这表明除了血清中和抗体滴度之外，疫苗诱导的免疫反应也提供了保护。提出了几种替代的相关物，包括交叉反应性T细胞反应、持续的VOC抗性吞噬细胞抗体，或者能够补充VOC特异性中和抗体反应的快速演变的记忆体液免疫反应。因此，虽然中和抗体可能在免疫后不久就会减少，但了解细胞免疫的下降和抗体的Fc介导功能是完全理解对COVID-19免疫保护持久性的关键。 我们的当前COVID-19疫苗的最终目标是减少疾病，但未来COVID-19疫苗以及针对呼吸道病原体的疫苗的最终目标将是阻止传播。然而，阻断传播需要在上呼吸道等传播部位产生大量抗体。对维持抗体滴度的免疫机制的理解仍处于初期阶段。在小鼠和人类中的实验表明，骨髓中长寿的抗体分泌浆细胞（LLPCs）在维持抗体滴度中发挥关键作用。因此，学习如何设计能够高效刺激LLPCs产生的疫苗是疫苗学中的一项重大挑战。活病毒疫苗黄热病疫苗YF-17D诱导的持久抗体反应与在不同树突细胞亚群上触发多个TLRs有关，这提出了一种可能性，即与灭活疫苗一起给予的佐剂可以诱导如此强大和持久的抗体反应。含有TLR4和TLR7/TLR8配体的合成聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米颗粒与可溶性抗原一起给药，在小鼠和非人灵长类动物中诱导了强大和持久的抗体反应、生发中心反应、滤泡Th细胞反应和LLPCs。此外，TLR配体组合诱导的抗体反应在小鼠中持续一生，需要激活多个树突细胞亚群和直接激活B细胞。同样，将3M-052包封到PLGA纳米颗粒中，诱导了非常高的幅度和持久的长寿骨髓血浆细胞反应，持续时间超过一年，目前正在临床测试中，以确定佐剂是否可以塑造持久性。沿着这条线，经历一些下降的COVID-19 mRNA疫苗，不触发TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或炎症体激活，也不触发坏死或焦亡细胞死亡途径。目前尚不清楚添加激活先天反应的佐剂是否可以增强免疫反应的持久性。 除了佐剂，最近的数据指出抗原释放动力学在塑造抗体反应持久性方面发挥关键作用。最近的研究表明，与作为一次性注射剂型给予的抗原和/或佐剂相比，具有延迟释放动力学的递送系统（如渗透泵或慢释放凝胶）可以增强抗体反应的幅度和持久性。虽然认为抗原释放的延迟动力学是增强和持久抗体反应的决定因素，但持续激活先天免疫细胞也可能有助于形成更强、更持久的生发中心（GCs），最终导致产生更高PCs以维持抗体反应。 图4. 疫苗学中的普遍挑战 该图表显示了疫苗设计中的主要未来挑战。在提高耐用性、增强细胞毒性T细胞、规划组织驻留免疫、快速开发疫苗以及围绕高度预测性的机制生物标志物制定监管策略方面取得的进展，有望彻底改变传染病疫苗乃至更广泛领域的疫苗开发。 5.2.在人类中诱导大量CD8+ T细胞反应 尽管大多数针对感染的疫苗接种策略都集中在诱导中和抗体反应上，但越来越多的证据支持CD8+ T细胞在抗病毒免疫中的关键作用，如HIV、疟疾、流感、COVID-19和癌症。抗原特异性CD8+ T细胞可以杀死病毒感染的细胞，减少病毒负担，清除感染细胞，并可能改善疾病症状。然而，尽管在小鼠中，活病毒疫苗或佐剂疫苗可以诱导强大的CD8+ T细胞反应，在人类中，只有活病毒疫苗可以诱导高幅度的抗原特异性效应CD8+ T细胞反应和记忆CD8+ T细胞反应。基于蛋白的疫苗主要诱导CD4+ T细胞反应，mRNA疫苗也在人类中诱导CD8+ T细胞免疫，尽管幅度小于活病毒疫苗。病毒载体诱导细胞毒性CD8免疫的倾向与初始病毒抗原负荷和先天信号有关。例如，在小鼠中的实验表明，YF-17D以依赖于MyD88的方式通过多个TLRs诱导抗原特异性CD8+ T细胞反应，表明针对特定TLRs的佐剂有潜力在人类中诱导CD8+ T细胞反应。与此一致，在小鼠中，TLR佐剂亚单位疫苗可以诱导显著的CD8+ T细胞反应。同样，通过C型凝集素受体DEC205将抗原传递给特定树突细胞，经典树突细胞类型1（cDC1），也已被证明可以促进抗原对CD8+ T细胞的交叉呈递。然而，在人类和非人灵长类动物中，即使与强效佐剂一起给药，亚单位疫苗也不能诱导与活病毒疫苗观察到的相当幅度的CD8+ T细胞反应。因此，学习如何在人类中诱导大量抗原特异性CD8+ T细胞反应仍然是疫苗学中的一项重大挑战，这可以通过更深入地了解在启动时所需的先天信号来克服，以释放这些强大的效应机制。 5.3.在粘膜组织中利用抗体、T细胞和先天反应的协同作用 最近的工作强调了TRMs的关键作用，它们在组织中长期存在，并提供针对病原体的前线哨兵功能。当病原体进入粘膜部位时，抗原特异性TRMs迅速激活，并在局部微环境中协调血浆细胞的募集和先天反应的激活。我们在非人灵长类动物中的最新研究表明，通过异质病毒载体方案接种疫苗，并与佐剂HIV Env蛋白结合使用，诱导了大量gag特异性CD8+ TRMs，与单独使用佐剂HIV Env免疫相比，增强了对粘膜SHIV挑战的持久保护。值得注意的是，在单独使用佐剂HIV Env免疫的动物组中，中和抗体滴度≥300与保护相关，但在异质载体加Env组中，与保护相关的中和抗体阈值要低得多。使用粘膜组织的单细胞转录组学，证明了原位TRM激活与增强的组织内先天反应有关，这一点通过粘膜先天细胞和CD4+ T细胞中的一组抗病毒限制因子得到证实。这些结果表明，异质病毒载体（HVV）免疫方案诱导的CD8+ TRMs与抗体反应和先天反应协同作用，介导对SHIV感染的保护。 与这些结果一致，并且根据最近对猕猴进行的针对SARS-CoV-2感染或疫苗接种的研究，如果中和抗体反应不是最优的，CD8+ T细胞反应也可能有所贡献。因此，未来的疫苗接种策略应该旨在利用抗体、TRM和先天反应在介导针对感染的保护中的协同作用。沿着这条线，最近的研究表明，在小鼠中通过静脉注射BCG疫苗后，持续的抗原特异性CD4+ Th1反应在肺部至少持续3个月，刺激持久的抗病毒先天反应，从而提供针对SARS-CoV-2及其变体、流感、SARS和相关冠状病毒的广泛保护。这些结果强调了在开发在粘膜组织中介导保护性免疫的新疫苗时，利用适应性和先天免疫系统的综合协同作用的重要性，称为“综合器官免疫”。 5.4.监管挑战 疫苗开发200年的经验已经建立了监管预期和流程，具有明确的安全协议、效力终点和免疫相关物，用于许可。然而，免疫学工具的迅速发展和我们对多种免疫机制协同贡献保护作用的越来越多的理解正在挑战历史教条，并提供新的见解以使疫苗更有效。从历史上看，大多数疫苗的许可是基于大型第三阶段效力试验。然而，大型第三阶段试验的高成本和时间框架对快速评估有前景的疫苗候选物构成了主要障碍。此外，几十年来，监管机构一直依赖于评估抗体滴度作为假定的保护性相关物，有时可以进行免疫桥接。然而，最近，与安全性和对人类免疫桥接相关的动物挑战模型的保护，使得基孔肯雅疫苗获得了许可。然而，如上所述，抗体反应仅代表对病原体保护性免疫反应的一个方面。系统免疫学方法已经提供了关于保护性免疫涉及的多种机制的深刻见解，并定义了疫苗接种后早期诱导的分子签名，这些可以预测随后的免疫反应。因此，该领域面临的一个主要挑战是如何将这种方法整合到监管框架中以加速疫苗开发。尽管建立探测细胞免疫功能的新型检测存在困难，但新的样本收集工具和高通量免疫学检测的爆炸性增长为疫苗设计、开发和许可提供了一条途径，可能的机制相关物的免疫。然而，为了使这一过程成功，开发机制相关物至关重要。同样重要的是将这种方法应用于定义“基线”（即，在疫苗接种前）的生物标志物或签名，这些可以预测不良反应。 5.5.在100天内开发大流行疫苗 虽然疫苗开发通常需要10年或更长时间，但抗击大流行需要非常快速的响应。在COVID-19大流行的情况下，新的技术如mRNA和病毒载体的可用性，加上公共部门的快速投资，导致临床试验的并行执行，仅在11个月内就获得了疫苗的紧急许可。然而，到那时，已经有7900万人被感染，已有170万人死于COVID-19。显然，疫苗开发还不够快。为了进一步加速疫苗开发，研究现在正集中在开发原型疫苗上，这将允许在短短100天内开发疫苗。在这种方法中，已被NIH、CEPI、G7和G20采纳，有人提议深入研究大流行潜力病毒家族中每一个成员（原型）的疫苗开发，以积累开发针对该家族病毒的疫苗所必需的基本知识。这涉及到确定保护性抗原及其保护性表位，以及制作稳定有效疫苗所需的基于结构的设计。至关重要的是，这也涉及到对保护性免疫的性质有更深入的理解，并确定疫苗接种后早期诱导的分子签名，这些可以用来预测第一阶段和第二阶段临床研究中的安全性和免疫原性，以及许可的监管要求。愿望是利用为原型疫苗积累的基本知识，在短短100天内开发针对同一家族病毒的疫苗。 6.结论 由于基因组学、蛋白质工程、免疫学和新的快速平台如RNA疫苗的引入，疫苗开发在过去几十年中发生了革命性变化。疫苗接种在过去两个世纪中在预防和控制感染方面非常成功，以至于社会已经变得自满。然而，COVID-19经验已经重新激发了疫苗领域的活力，并强调了在全球范围内政府、工业和学术界之间建立伙伴关系以快速开发疫苗的关键需求。这种势头，通过全球战略得以实现，可以将努力集中在开发针对造成全球大部分疾病负担的病原体的疫苗上。结合使用变革性免疫学工具，这些工具可以通知宿主免疫反应如何保护免受感染和疾病的机制，这些努力正在迅速开始转变疫苗学，并将无疑对下一代疫苗的开发产生持久影响。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。