Sodium Oligomannurarate

高尿酸血症( hyperuricemia,HUA) 不仅会导致尿酸结晶沉积在关节和软组织中,引发剧烈疼痛和功能障碍,还与心血管疾病、高血压和肾疾病的发生发展密切相关。尿酸在体内的重吸收及排泄有赖于尿酸转运体。其中,葡萄糖转运体 9(glucosetransporter 9, GLUT9) 和 尿 酸 盐 阴 离 子 转 运 体 1(urate-anion transporter 1,URAT1)主要参与尿酸的重吸收过程;而三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G2( ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)主要负责尿酸的排泄。GLUT9 由 SLC2A9基因编码,主要在人和小鼠肝细胞和肾小管中表达。URAT1 是由 SLC22A12 基因编码的尿酸-阴离子转运蛋白,主要表达在肾小管上皮细胞刷状缘膜。 ABCG2 由位于 4 号染色体上的 ABCG2 基因编码,是嘌呤核苷酸及其衍生物的转运蛋白,在肝、肾和肠中均有表达。由于啮齿类动物体内存在尿酸酶基因,尿酸可进一步分解为尿囊素而排出体外,因此,啮齿类动物与人类血清尿酸水平差异显著。近年来,随着基因敲除技术的发展,研究者可以更深入地探索 HUA 的病理生理机制。通过特异性敲除与尿酸代谢相关的基因,研究人员能够开发出模拟人类 HUA 的动物模型。这些模型不仅有助于揭示尿酸代谢紊乱的分子基础,还能够用于评估潜在治疗干预的效果和安全性。本文将探讨HUA 相关基因敲除动物模型的最新进展以及这些模型的局限性及潜在应用方向,以期推动 HUA 治疗策略的发展。 1.基于基因敲除技术构建的 HUA 啮齿类动物模型 1.1尿酸氧化酶(urate oxidase,Uox)基因敲除的HUA 大小鼠模型 由于 UOX 基因在人类和类人猿进化过程中经历了突变,导致人类的血清尿酸水平是其他哺乳动物的 10 倍。然而,不同于人类的是,啮齿类动物 Uox 基因仍然具有功能,能够编码尿酸酶将尿酸降解为尿囊素。为构造 HUA 动物模型,已有研究通过敲除小鼠 Uox 基因以产生类似于人类的模型来研究 HUA。WU 等于 1994 年首次采用胚胎干细胞同 源 重 组 技 术 构 建 了Uox基 因 敲 除 ( Uox-KO)小鼠模型,研究者将新霉素选择盒插入 Uox 基因外显子 3 中,打乱了开放阅读框,以此中断 Uox 基因表达。研究人员将该盒插入小鼠胚胎干细胞中,经同源重组和筛选后,将靶向胚胎干细胞注射到 C57BL/6J 小鼠的囊胚中,从而产生嵌合体;杂合的 Uox+ / -小鼠通过杂交产生纯合的 UoxKO 小鼠品系。Uox-KO 小鼠的血清尿酸水平为654.5 ± 101.15 μmol / L, 是野生型 ( 53.6 ± 17.9μmol / L)和杂合子小鼠(83. 3 ± 29. 8 μmol / L)的 10倍左右。Uox-KO 小鼠可存活,但 4 周时纯合子小鼠死亡率高达 65%,且其肾出现了严重病变,肾活检可见多囊、尿酸结晶沉积、肾小管变性及肾小球萎缩。另外,杂合子交配产生的 Uox-KO 小鼠占所有后代的百分比为 7.1%,远低于孟德尔遗传定律预期的比例,这表明 Uox 基因敲除与胚胎致死率升高有关。由此可见,初代 Uox-KO 小鼠出现胚胎致死性且死亡率高,限制了其在研究中的广泛应用。2018 年 LU 等采用转录激活因子样核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术,在纯 C57BL / 6J 遗传背景上建立了 Uox-KO 小鼠。这些 Uox-KO 小鼠的尿酸水平升高,展现出与人类 HUA 患者相似的尿酸水平升高模式,即尿酸水平在 420 ~ 520 μmol / L 之间稳定升高,且雄性 UoxKO 小鼠的尿酸水平高于雌性小鼠,约 40%的 UoxKO 小鼠存活至 62 周。但小鼠出现了肾单位坏死、肾小管间质纤维化等肾功能障碍表现,雄性小鼠表现出糖耐量受损,这可能与胰岛细胞受损胰岛素分泌减少相关;而雌性小鼠出现高血压及脂代谢紊乱。  该 HUA 小鼠模型展现出与 HUA 患者相似的血清尿酸水平,且死亡率低于 WU 等所报道的死亡率。存活下来的 Uox-KO 小鼠在长达 62 周的时间里保持稳定的高血清尿酸水平,证明该模型可能适合长期研究。但这种小鼠因自身免疫力较差,需在无菌环境下饲养,因此较难推广使用。基于以上所构建的基因敲除小鼠均出现存活率较低问题,2020 年 YU 等用 CRISPR/ Cas9 技术敲除大鼠 Uox 基因,产生的 Uox-KO 大鼠一年存活率可达 95%,其尿酸水平尽管远高于野生型大鼠,但并未达到预期水平。雄性 Uox-KO 大鼠血清尿酸水平 287.4± 113.6μmol/L 显著高于雌性大鼠237.4±123.8μmol / L,但所有 Uox-KO 大鼠的血清尿酸水平均不足以诊断为 HUA。为了建立“真正的”HUA(血清尿酸 > 420μmol / L)模型,应增加其他措施,如增加嘌呤摄入量或限制尿酸盐排泄。 从代谢角度分析,该 Uox-KO 大鼠未观察到明显的血脂和血糖的明显紊乱。尽管尿酸酶缺乏可显著影响甘油三酯和低密度脂蛋白水平,但评价血脂的各项指标均接近或在正常范围内。虽然 Uox-KO 大鼠的相关肾功能指标血肌酐(serum creatinine,Scr)及尿素氮(blood urea nitrogen,BUN) 也接近或在正常范围内,但这并不意味着敲除大鼠 Uox 基因对其肾功能没有负面影响,Uox-KO 大鼠 BUN 显著高于野生型大鼠,且 Uox-KO 大鼠的肾组织学检查提示肾小球与肾小管有轻微损伤。CRISPR/Cas9 系统作为一种基因编辑技术,以其精准的靶向能力和高成功率的多 sgRNA 转染而受到广泛应用。 该技术能够实现基因的敲入、重排、激活、抑制、重组以及敲除,具备高效性、专一性和成熟性等优势。这可能是该模型存活率及肾损伤优于前两种建模小鼠的原因所在。故笔者认为考虑到该模型大鼠1年存活率高,且肾损伤小于 Uox-KO 小鼠,因此基于 CRISPR/ Cas9 技术构建的 Uox-KO 大鼠在应用上较 Uox-KO 小鼠更为广泛。由于 建 立 纯 合 子 基 因 敲 除 鼠 存 活 率 较 低,PANG 等近期报道了一种条件性基因敲除小鼠,研究者使用 Cre / loxP 基因打靶系统产生了肝特异性 Uox 基因敲除(conditional knockout Uox-deficient,UoxCKO)小鼠。与野生型小鼠对照,UoxCKO 小鼠肝Uox 表达显著抑制,但肾及肠道 Uox 表达接近对照组。UoxCKO 小鼠 23 周存活率可稳定至 90%,4 ~ 22周龄的 UoxCKO 小鼠,血清尿酸水平在 394 ~ 521μmol / L,显著高于野生型小鼠(102~184μmol/L),与人类 HUA 观察到的水平相当。 UoxCKO 小鼠肝嘌呤从头合成路径增加, 引起体内肌苷酸 ( inosinemonophosphate, IMP )、 腺 苷 酸 ( adenosinemonophosphate, AMP ) 和 鸟 苷 酸 ( guanosinemonophosphate, GMP ) 平 显 著 升 高。研 究 发 现UoxCKO 小鼠肾中与尿酸重吸收相关的有机阴离子转运蛋白 1( organic anion transporter,OAT1)表达减少,同时出现了肾小管内尿酸结晶沉积和肾小管间质疾病。成年 UoxCKO 小鼠也表现出尿液浓缩能力的丧失和进行性梗阻性肾疾病。30周龄 UoxCKO 小鼠的 24h饮水量显著高于对照组小鼠,24 h 尿量增加约 7 倍。由此可见,与传统的纯合子 Uox-KO 小鼠相比,UoxCKO 小鼠不仅展现出与人类 HUA 患者相似的高尿酸水平,而且具有更高的存活率。尽管这种模型出现了进行性的肾小管间质损伤,但其肾损伤的特点与未经治疗的长期 HUA 患者的慢性肾损伤相似。因此,这一模型可作为研究 HUA 在慢性肾病中的病理机制的工具。 1.2 Slc2a9(Glut9)基因敲除 HUA 小鼠模型 GLUT9 蛋白是葡萄糖转运蛋白家族的一员,也被命名为 SLC2A9,已被明确证明为尿酸转运体,它主要在肾、肝中表达,介导对尿酸的重吸收,其序列突变会引起人类低尿酸血症。Glut9 基因敲除分为 全 身 系 统 性 及 器 官 特 异 性 敲 除, 全 身 性Glut9- / -( together yielded Glut9, G9KO ) 小 鼠 由Glut9+ / -小鼠杂交产生,G9KO 后代占总出生后代的比例大约是孟德尔频率的一半,提示该基因的缺失会造成部分胚胎死亡。G9KO 小鼠尿酸重吸收受到严重抑制,血清尿酸浓度比杂合子及野生型小鼠升高 5~10 倍。这与人类情况恰恰相反,考虑为在没有 GLUT9 的情况下,肝对尿酸的摄取受限从而引起HUA。 同时 G9KO 小鼠摄水量和 24 h 尿量增加,表明肾浓缩功能缺陷。肾病理提示存在肾小管间质肾炎,伴有皮质萎缩和肾积水,类似于人类尿酸盐肾病。而肝特异性 Glut9 基因敲除 ( liver-specificGlut9KO,LG9KO)小鼠同样表现出血清尿酸水平显著升高及尿量增加,且 LG9KO 小鼠的血清尿酸升高程度高于 G9KO 小鼠,这可用 LG9KO 小鼠肾中的GLUT9 重吸收尿酸盐导致血清尿酸相对升高解释。LG9KO 小鼠虽然尿量较野生型小鼠增加,但是小鼠肾组织学仍正常。G9KO 小鼠的肾损害类似于人类急性 HUA 肾病。因此,对 G9KO 小鼠的研究可能有助于探究相关疾病发生机制。GLUT9 蛋白不仅在小鼠肝、肾中表达,同时也在肠细胞膜基底侧表达。肠道细胞特异性 Glut9 缺陷 小 鼠 ( G9EKO)与野生型小鼠相比,表现出 65%的尿酸摄取缺陷, 粪便尿酸浓度也显著降低。 由此可见,G9EKO 小鼠的肠道细胞摄取和排出尿酸功能受损。G9EKO 小鼠的血清尿酸浓度及尿液中尿酸浓度显著高于野生型小鼠,但 G9EKO 小鼠表现出代谢综合征相关特征。G9EKO 小鼠的总胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯显著升高,且出现早期胰岛素抵抗特征,空腹血浆胰岛素大约增加了 40%,同时心脏出现肥厚重塑表现。可见, G9EKO 小鼠表现出HUA 患者的常见并发症,包括非酒精性脂肪性肝病和心血管疾病。因此本模型可以用来探讨 HUA 在代谢综合征及其并发症中发挥的作用。在 四 环 素 诱 导 的 肾 特 异 性 Glut9 敲 除(subsequently called kidney-inducible KO,kiKO)小鼠中研究人员发现肝 Glut9 基因表达也部分下降。kiKO 小鼠尿液中尿酸/ 肌酐值及尿量增加,但比较kiKO 小鼠与野生型小鼠的血清尿酸水平时,两组并无显著性差异。其原因可能是与人类相比,小鼠体内表达尿酸酶,它已经将血液中尿酸水平降至最低,可能不会进一步降低;其次,kiKO 小鼠肝 Glut9基因被部分敲除,而小鼠肝中 Glut9 的缺失会导致血清尿酸水平的强烈增加。在 kiKO 小鼠中,肝Glut9 的微小缺失可能足以钝化这些小鼠预期的低尿酸血症。最后,肾或其他器官中其他尿酸盐转运体的代偿机制可能会保持尿酸恒定。因此,可以观察到四环素诱导的 Glut9 基因敲除方法在精确性方面未能完全达到预期效果,这表明该技术仍需在未来的研究中得到进一步的改进和优化。 1.3 Abcg2 基因敲除 HUA 小鼠模型 ABCG2 是一种高容量尿酸排泄蛋白,在多种器官的 顶 膜 上 表 达, 包 括 肠、 肝 和 肾。TAKADA等构建了雄性 Abcg2 基因敲除小鼠,为使该模型的尿酸代谢与人类相似,对 Abcg2 基因敲除小鼠采用氧嗪酸钾干预。与野生型小鼠相比,经氧嗪酸钾处理 的 Abcg2 基 因 敲 除 小 鼠 的 尿 酸 排 泄 分 数(fractional excretion of urate clearance,尿酸排泄率/肌酐排泄率) 和血清尿酸水平增加,而肠道尿酸盐的排泄减少。由于 ABCG2 蛋白被认为是介导肾尿酸盐排泄的媒介,该转运体基因缺失预期结果为增加血清尿酸浓度,减少尿液中尿酸盐的排泄。然而,在本研究中尿酸排泄分数反而增加,显示出相反的结论。这可能是因为在 Abcg2 基因敲除小鼠中,肠道尿酸盐排泄减少引起血清尿酸值升高,同时有实验表明 Abcg2 基因敲除小鼠肾 URAT1 的表达减少,URAT1 蛋白介导尿酸的重新收,从而引起尿酸在体内的重吸收减少,这可能是尿液中尿酸水平上升的原因。 1.4 其他基因敲除 HUA 小鼠模型 除了上述基因外,还有更多的基因敲除小鼠被开发。Slc22a12 基因编码尿酸转运蛋白 URAT1,介导 尿 酸 在 体 内 的 重 吸 收。研 究 者 通 过 与pMC1neo-PolyA 交换外显子 1-4 来靶向敲除小鼠Slc22a12 基因,Slc22a12 (Urat1)基因敲除小鼠没有表现出明显的异常, 生长和繁殖正常。Slc22a12(Urat1)基因敲除小鼠并未出现预期的低尿酸血症,与野生型小鼠相比血清尿酸水平未见明显差异。同时敲除 Urat1 和 Uox 基因小鼠与 Uox 单基因敲除小鼠之间的血清尿酸水平并无明显差异,使用别嘌醇后,Urat1 和 Uox 基因敲除小鼠出现低尿酸血症,是合适的肾性低尿酸动物模型。部分 Urat1 和 Uox基因敲除小鼠观察到血肌酐值升高,即双基因敲除小鼠可以出现急性肾损伤。  GLUT12 与 GLUT9属于同一蛋白质家族,GLUT12 也可以作为尿酸转运体调节血清尿酸浓度。Glut12-Uox 双敲小鼠血清尿酸水平升高,且小鼠的肝尿酸浓度与血清尿酸浓度相比显著较低,这意味着 Glut12 可能参与尿酸盐从血液到肝的转运,敲除 Glut12 后,尿酸无法进入肝细胞进一步代谢。Glut12-Uox 双敲小鼠和野生型小鼠相比,血液中肌酐浓度和肾尿酸排泄分数并无显著性差异,这表明 Glut12 缺乏不会导致严重的肾功能障碍或减少肾尿酸排泄。Tamm-Horsfall 蛋白由肾小管上皮细胞分泌,它在急性肾损伤中具有保护作用。研究人员为了探究 Tamm-Horsfall 蛋白与慢性肾病之间的联系,构建了 Tamm-Horsfall 蛋白基因敲除小鼠。老年 Tamm-Horsfall 蛋白基因敲除小鼠的血清尿酸水平显著高于同龄的野生型小鼠,这可能是因为钠耦合尿酸转运体 Slc5A8 和Slc22a12 以及钠氢交换体 在基因敲除小鼠近端肾小管中显著上调。 2.基于基因敲除技术构建的 HUA 斑马鱼及禽类模型 除了小鼠作为基因敲除的动物载体外,斑马鱼和人类的基因组高度相似,便于将疾病模型转化为人类疾病的背景,因此也有研究构建了 HUA 的斑马鱼动物模型。研究者使用 CRISPR/ Cas9 将终止密码子编辑进斑马鱼 uox 基因的外显子 2,从而介导了斑马鱼幼虫 uox 基因突变。uox-KO 斑马鱼胚胎出生时可以达到预期的孟德尔比例,没有明显的发育缺陷,且其寿命与野生型斑马鱼相似。综上,尽管 uox-KO 斑马鱼模型中尿酸水平升高,但并未影响其生存力,且健康状况良好,并具备繁殖后代的能力。该模型被用于研究尿酸水平升高对炎症细胞的影响,研究发现在 uox-KO 斑马鱼中中性粒细胞招募显著受到抑制,即尿酸水平增高可以抑制 uox-KO斑马鱼对晶体的急性炎症反应。斑马鱼因其与人类基因组的高度同源性等优势,值得在未来的HUA 动物模型研究中进一步探索。研究者可以推动使用其他动物,如禽类在 HUA基因修饰动物模型相关领域的应用,因为禽类诸如鸡、鹌鹑等不表达尿酸酶,可更好模拟人类体内尿酸的代谢情况。但我国 SPF 级鸡和鹌鹑的应用与研究较晚,技术尚不完善,尚不能满足研究者的需要。此外,禽类不属于哺乳类动物,与人类的生理生化方面的差异较大,故仍然具有一定的局限性。 3.基于基因敲除技术构建 HUA 动物模型的局限性不同基因的敲除对于动物模型的生存率及血清尿酸水平提高具有较大差异。Uox 基因敲除可以使尿酸水平较大幅度提高,但胚胎致死率较高,尿酸结晶常常沉积在肾组织造成肾损伤。且 Uox-KO小鼠 会 出 现 胰 岛 细 胞 的 损 伤, 造 成 糖 耐 量 受损。Glut9 基因敲除在全身系统地敲除及特定器官中敲除表现有所不同,肝特异性 Glut9 敲除小鼠 HUA 患病程度高于全身系统敲除小鼠,且全身系统 Glut9 敲除小鼠出现肾浓缩功能下降及胚胎致死性。肠道特异性 Glut9 敲除小鼠出现脂代谢紊乱、胰岛素抵抗以及心脏重构的现象。Urat1 敲除小鼠血清尿酸水平与野生型小鼠相比未见明显差异,因此不适用于建立 HUA 模型。Urat1 和Uox 基因敲除小鼠血清尿酸水平升高且与 Uox 单基因敲除小鼠之间的血清尿酸水平无明显差异,但部分双基因敲除小鼠出现急性肾损伤,血肌酐值升高。而 Glut12-Uox 双敲小鼠血清尿酸水平升高,且未导致严重的肾功能障碍。笔者认为,基因敲除是构建 HUA 动物模型的强有力工具,随着技术的进步,实验动物在存活率和血清尿酸水平升高程度上都有良好的表现,但常见的基因敲除鼠模型存在胚胎致死性、肾损害及代谢综合征相关问题,且基因敲除技术的准确性仍待提高。本文汇总了针对不同基因的造模方法、物种、所测血清尿酸水平,并对其局限性进行了评价,参见表 1 4.总结与展望 HUA 作为一种与多种并发症相关的代谢性疾病,其患病率的上升引起了广泛关注。为了深入探究 HUA 的病理机制并开发新的治疗策略,基因敲除技术为构建 HUA 动物模型提供了新的途径。本文集中讨论了 Uox、Slc2a9(Glut9) 和 Abcg2 等关键基因的敲除所构建的 HUA 动物模型,并对其优势与局限性进行了分析。通过这些模型,研究人员能够观察到血清尿酸水平的显著变化,并分析其对代谢、肾功能和心血管健康的影响。尽管这些模型在模拟人类 HUA 方面取得了一定的成功,但它们仍存在一些限制。例如,Uox 基因敲除小鼠的高死亡率和肾损伤问题,以及 Glut9 基因敲除模型中的代谢综合征特征。 此外,人类 HUA的定义是血清尿酸浓度高于 420μmol/L,然而定义啮齿类动物 HUA 的尿酸浓度阈值尚不明确。其次,在不同的基因敲除鼠模型中,报道的血清尿酸浓度不同,意味着无法进行多种模型间的比较。值得注意的是,与 HUA 相关的基因在人类和鼠组织中的表达存在差异。例如,编码尿酸酶的基因 UOX 在人类中是沉默的 ,而其在鼠的同源基因在多个组织中表达;SLC2A9 在人类的肾中主要表达,但小鼠的同源基因 Slc2a9 主要在肝中表达;ABCG2 在人类的小肠中主要表达,但小鼠的同源基因 Abcg2 主要在肾中表达。这些问题提示在未来的研究中需要进一步优化模型,以更精确地模拟人类疾病状态。  随着 CRISPR/ Cas9 等基因编辑技术的发展及选择与人体尿酸代谢更相似的建模动物,未来有望创建出更精确和更具代表性的 HUA 动物模型。这些模型将有助于深入理解尿酸代谢的复杂调控网络,揭示 HUA 与肾疾病和代谢综合征等其他疾病之间的关联,进而促进更安全、更有效的治疗策略的开发。 来源：中国实验动物学报 往期动物模型相关推文 ▶  D-半乳糖诱导脑老化模型机制的研究进展 ▶  PM2.5 对代谢相关脂肪性肝病模型小鼠 肝淋巴生成的影响 ▶  广州医科大学团队：甘露特钠或可阻断急性胰腺炎重症化 ▶  长爪沙鼠脑缺血和听觉障碍模型研究进展 ▶  吸烟害苦了周边人！王频/邹晓平/杭渤/毛建华团队发现三手烟暴露促进小鼠和人类胃肿瘤的发展 高创汇 高圣生物·模式动物·药效学评价项目 ▶ 转基因模式动物|条件性敲除鼠|纯合子筛选 ▶ 肿瘤原位模型|心梗模型|MCAO脑梗模型|脊髓/神经损伤模型|衰老模型等药效学建模 ▶ 类器官|药代动力学|体外药理学|分子病理学|动物影像学|行为学|毒理学研究

药渡/踏雪 阿尔茨海默病（AD）是全球医药界面临的一大挑战，也是最常见的痴呆症类型。其病因极为复杂，涉及衰老、遗传和环境等多种因素的共同作用。科学界提出了多种病理机制假说，包括胆碱能功能失调、淀粉样蛋白积累、tau蛋白异常、炎症反应、氧化应激、金属离子失衡、谷氨酸兴奋毒性、微生物-肠-脑轴紊乱以及异常自噬等。然而，这些病理因素之间的相互作用仍未完全解明，导致AD的主要诱因依然是个谜。 尽管过去几十年里科学家们进行了大量药物开发的尝试，但由于疗效不足或副作用较多，大多数药物都未能成功。以往获批的治疗药物大多只能暂时缓解症状，且常伴随副作用。最近FDA批准了三种新药——aducanumab、lecanemab和donanemab，它们显示出清除Aβ斑块并减缓认知衰退的潜力，但其长期疗效和安全性仍需进一步验证。 随着研究的深入，尤其是在免疫治疗领域的突破，AD治疗正从传统的单一靶点策略逐渐向小分子治疗模式转变。新一代AD小分子药物通过多种机制，如选择性靶向、双靶点、变构调节、共价结合、PROTACs技术以及蛋白-蛋白相互作用（PPI）调控，来优化药物特性、安全性和疗效。这种多维度的创新正在加速AD药物的开发进程，并减少相关挑战，为患者带来新的希望。 01 AD的发病机制 阿尔茨海默病（AD）的发病机制至今仍未完全明确，是一个复杂且充满谜团的领域。 Aβ的积累是AD的一个标志性病理特征，它源于淀粉样前体蛋白（APP）的逐步裂解，而APP的加工受到许多因素的调控。同时，Aβ的积累与载脂蛋白E（APOE）密切相关，特别是APOEε4等位基因，它是AD最强的遗传风险因素之一。 此外，tau蛋白作为神经原纤维缠结（NFTs）的主要成分，与AD的临床症状密切相关。 除了关键的β淀粉样蛋白（Aβ）和tau蛋白外，乙酰胆碱缺乏、神经炎症、氧化应激、金属离子失衡、谷氨酸失调、胰岛素抵抗、肠道微生物群异常、胆固醇稳态破坏、线粒体功能障碍和自噬异常等多种因素也可能在其中扮演重要角色（图1）。 图1. AD发病机制示意图 这些病理机制并非独立存在，而是彼此交互，构成了AD发展的复杂网络。理解这些复杂的相互作用，不仅有助于揭示AD的根本原因，也为开发更有效的治疗方法提供了重要线索。 02 信号通路与AD发病机制的关联 神经炎症信号通路 AD中的多种病理因素，如Aβ、促炎细胞因子和氧化应激，可激活小胶质细胞，启动下游信号通路，如MAPK、NF-κB和PI3K/Akt。这些通路的激活进一步促进小胶质细胞的活化和炎症介质的产生，加剧神经毒性。 溶酶体功能障碍 溶酶体在维持细胞内环境稳定中起着关键作用，其功能障碍与AD的发展密切相关。AD中溶酶体酸化缺陷可能削弱Aβ的清除，导致细胞外Aβ斑块的积累。 胆固醇代谢异常 胆固醇在AD中也扮演着重要角色。胆固醇的合成、运输、代谢和清除失衡可能通过介导Aβ、tau、炎症等病理变化促进AD的进展。 线粒体功能障碍 线粒体是细胞能量的主要来源，其功能障碍在AD中表现为能量代谢缺陷、氧化应激增加、钙离子失衡和线粒体动力学异常等，可导致神经元功能障碍甚至凋亡。 钙信号通路 钙信号在AD中也受到干扰。细胞内钙浓度的升高和钙信号通路的异常可影响内质网、线粒体和溶酶体等细胞器的功能，导致神经退行性疾病的发生。 胰岛素信号通路 胰岛素信号通路与AD密切相关。在AD大脑中，胰岛素信号通路受损，导致糖原合成酶激酶-3（GSK-3）活性增加，tau蛋白磷酸化和Aβ产生增加。 神经营养信号通路失调 神经营养因子在AD中减少，导致神经元的生存、生长和分化受到影响，突触可塑性和神经元信号功能减弱。 血脑屏障功能障碍 血脑屏障的破坏与AD的发展密切相关。血脑屏障的完整性受损、运输功能改变、脑血流量减少和神经炎症等都可能导致AD的病理变化。 03 AD的诊断标志物：寻找疾病的线索   影像学标志物 磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）等分子成像技术可用于检测AD 患者的脑部结构和功能变化。结构MRI可评估海马和内嗅皮层萎缩；18FDG-PET可检测后扣带回和颞顶叶的葡萄糖代谢降低；PET成像可显示Aβ和tau沉积。 然而，这些方法在诊断AD时存在局限性，不能准确区分AD与其他具有相似病理的神经退行性疾病。 脑脊液标志物 脑脊液中的Aβ42、磷酸化tau（P-tau）和总tau（T-tau）等是AD的重要标志物。P- tau181浓度是区分AD与非AD痴呆的最准确指标。 虽然amyloid和tau PET以及脑脊液标志物可特异性指示AD相关病理，但它们之间并不完全等同。研究表明，amyloid PET与脑脊液结果高度负相关，而脑脊液P-tau 与tau PET结果不一致。 血液标志物 血液标志物为AD的诊断提供了一种经济、方便、微创且高度可及的选择。许多脑脊液标志物（如Aβ、P-tau、NfL、GFAP）在血液中也有应用，随着高灵敏度分析平台和检测技术的进步，血液标志物的诊断精度和可靠性不断提高。 04 传统AD药物的探索之路 传统的阿尔茨海默病（AD）治疗药物主要包括乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEIs）和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂（图2）。 图2. FDA/中国批准的AD治疗药物 AChEIs家族中，最早被批准用于AD治疗的药物是他克林。该药物通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，增加乙酰胆碱的浓度和作用时间，进而提升患者的认知和行为能力。然而，由于他克林的肝毒性问题，它虽在1993年获批，但最终在2013年被市场撤回。尽管如此，他克林在多靶点配体研究中仍具备潜力。 在AChEIs中，后续开发的多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏被称为第二代药物。这些药物不仅在选择性方面更为优越，副作用更少，且药代动力学特性更好，因而成为AD治疗的一线药物。 美金刚是NMDA受体拮抗剂中唯一被FDA批准用于中度至重度AD治疗的药物。美金刚通过调节谷氨酸传递和多巴胺受体的活性，在一定程度上改善了患者的认知功能、日常生活能力和行为表现。此外，美金刚与多奈哌齐的固定剂量组合药物Namzaric，为中度至重度AD患者提供了另一种治疗选择。尽管这些药物在调节神经递质方面表现出色，但它们无法改变疾病的进程，这为新药的设计提供了重要参考。 近年来，研究者们提出了“疾病修饰治疗”的概念，旨在通过干预AD的基本生物机制，阻止疾病进展，并为患者提供持久的治疗益处。2019年，中国有条件批准了一种从海藻中提取的寡糖盐GV-971作为AD的治疗药物。GV-971的作用机制被认为是通过抑制肠道菌群失调引发的神经炎症，并破坏Aβ纤维的形成来抵抗AD。研究显示，GV-971能够依赖性别改变肠道微生物群的组成和丰度，调节微生物代谢和外周炎症，从而减少神经炎症和淀粉样病变。目前，GV-971的两个四期临床试验正在进行中，预计将持续到2025年。 在AD治疗领域，单克隆抗体如Aducanumab、Lecanemab和Donanemab也取得了一定进展。这些抗体主要针对Aβ蛋白，显示出不同的疗效和副作用。Aducanumab在2021年获得FDA加速批准，虽然备受争议，但其清除Aβ斑块和减缓认知衰退的能力不容忽视。随后，Lecanemab在2023年获得批准，Donanemab也于2024年获批。然而，这些药物的使用也伴随着显著的影像学异常风险和高昂的治疗费用。 此外，新兴药物Brexpiprazole也显示出对AD症状的缓解效果。Brexpiprazole原本用于治疗抑郁症和精神分裂症，通过作用于5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素受体，能够有效减轻AD患者的焦虑症状。随着研究的深入，这些新药为AD的治疗提供了多样化的靶点选择，并为阻止或逆转AD的进展带来了新的希望。 05 突破传统：下一代AD治疗的潜在药物 传统AD药物的疗效有限，而且在临床试验中失败率较高，主要原因在于疗效不足或副作用过大。这些问题促使新一代AD药物的开发标准不断提高，目标是为患者提供多样化且精准的治疗方案，能够根据个人的独特病理过程量身定制。随着对疾病机制的深入理解和药物开发技术的进步，创新性AD药物的开发正逐步成为现实（表1）。 表1. 下一代的AD治疗药物 选择性抑制剂 随着对病理蛋白质生理功能的理解加深，选择性抑制剂的开发取得了显著进展。这些抑制剂能够特异性地靶向特定的蛋白类别、亚型或结构域，从而在疗效、安全性和耐受性方面提供更显著的优势。 例如，从五味子果实中提取的Kadsuranin和gomisin N分别是五味子素B的两种立体异构体，能够有效抑制GSK-3β。选择性GSK-3β抑制剂OCM-51在减少tau蛋白磷酸化的同时，能够防止β-连环蛋白信号通路的过度激活。 然而，开发选择性抑制剂面临诸多挑战，特别是在高度保守或同源的结合口袋中设计出高选择性的抑制剂。为此，发现目标酶上的额外口袋、优化目标、以及使用计算工具可能成为解决这一难题的新策略。 双靶点抑制剂 由于AD的多因素性质和单靶点药物效果有限，寻找有效的双靶点或多靶点抑制剂成为新的研究方向。这些抑制剂能够对一个或多个靶点产生相加或协同作用，从而提高疗效、延长治疗效果、减少副作用并降低药物剂量。 例如，抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）的双靶点药物不仅能通过增加乙酰胆碱水平缓解AD患者的认知障碍，还可以延缓Aβ斑块的形成。Ladostigil是一种AChE/MAO-B抑制剂，在II期临床试验中表现出良好的耐受性和安全性。 虽然多靶点药物对单个靶点的活性可能低于单靶点药物，但通过多靶点调节的协同效应可以获得更好的疗效和更少的不良反应。 变构调节剂 变构调节剂通过与受体的正构位点不同的区域结合，诱导构象变化来调节正构配体的亲和力和/或效力，或直接调节受体活性。这些药物可以产生正、负或中性效应。例如，γ-分泌酶的变构调节剂可促进产生较短、毒性较小的Aβ亚型，而选择性正变构调节剂（PAMs）则靶向α7烟碱乙酰胆碱受体（α7 nAChR）亚型，减缓遗忘小鼠模型中的情景/工作记忆衰退。 变构调节剂在AD药物开发中具有巨大的潜力，但同时也面临挑战，需要更多的体外和体内研究来评估化合物的功能效果和影响其特性的因素。 共价抑制剂 共价抑制剂通过与目标蛋白形成共价键，展现出卓越的效力、选择性和作用持续时间。例如，具有丙烯酰胺弹头的化合物59能够与GSK-3β共价结合，显著降低AD小鼠海马中的APP和p-tau蛋白的表达，并改善其空间学习和记忆能力。 尽管共价抑制剂可能存在潜在的毒性问题，但通过优化亲电试剂的反应性和可逆性、设计非共价支架、调整剂量等方式，可以提高其选择性并降低毒性。 PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体） PROTACs利用泛素-蛋白酶体系统精确靶向并降解特定蛋白质，从而提高药物的作用准确性和速度。 在AD药物开发中，PROTACs可以靶向tau蛋白、磷酸激酶GSK-3β、组蛋白去乙酰化酶（HDACs）、BET蛋白和转甲状腺素蛋白（TTR）-Aβ相互作用等。然而，PROTACs也面临挑战，如E3连接酶的选择有限、化合物分子量较大导致血脑屏障穿透性差等。 靶向PPI网络 蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在维持细胞功能中起着至关重要的作用，而异常的蛋白质相互作用与许多疾病的发病机制密切相关。在AD中，Aβ和tau蛋白的错误折叠和聚集涉及复杂的PPI网络。例如，Aβ与白细胞免疫球蛋白样受体B2（LilrB2）的相互作用会负向调节突触和记忆，而Aβ与转甲状腺素蛋白（TTR）的相互作用则可以减少Aβ聚集和毒性。通过阻断或调节这些相互作用，小分子抑制剂有望减轻AD的病理过程。 小 结 总之，AD的发病机制极为复杂，目前仍存在诸多未解之谜。然而，在药物研发等方面却不断涌现新的进展。鉴于此，我们必须继续深入研究阿尔茨海默病的发病机制，致力于开发更加安全、有效的药物，以便为AD患者提供更好的治疗选择。 未来，随着科学技术的持续进步，我们坚信一定能够攻克阿尔茨海默病这个难题，为患者及其家庭带来崭新的希望。 参考资料： 1. Recent advances in Alzheimer’s disease: Mechanisms, clinical trials and new drug development strategies. 2. Perspectives and challenges in patient stratification in Alzheimer’s disease. 3. New approaches to symptomatic treatments for Alzheimer’s disease. 4. Alzheimer’s disease clinical spectrum: diagnosis and management. 往 期 推 荐 1 “水土不服”的阿托品 2 时代的脚步已走到TCE双抗爆发的前夜 _ 3 药王放了个大 _ *声明：本稿件为转载，仅用于分享，不代表本公众号立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们将第一时间更正或删除，谢谢！ 投稿请添加小助手：bioclub666