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摘要：人类间充质干细胞（hMSCs）已被证明具有作为多种疾病治疗方法的巨大潜力。由于它们具有免疫特权地位，异体hMSCs治疗方法是特别有吸引力的选择，需要改进它们的规模化和制造方法。基于微载体的生物反应器系统在自动化封闭系统中提供了比传统平面培养更高的体积hMSCs产量。然而，需要更复杂的生物工艺来成功地从平面培养转换到微载体。本文总结了从种子训练、接种、扩展和收获的平面培养到微载体hMSCs制造方案中涉及的关键步骤。还讨论了重要的生物反应器参数，如温度、pH值、溶解氧（DO）、混合、喂养策略和细胞计数技术。 1.引言  人类间充质干细胞（hMSCs）被认为对治疗许多类型的疾病具有开发前景。这些疾病（包括神经、骨骼和关节以及心血管疾病）大多数缺乏改变疾病进程的治疗选择。除了经典的研究表明hMSCs具有多系分化能力以及它们能够归巢或迁移到损伤部位之外，更近期的研究表明它们具有旁分泌和免疫调节效应。自1995年首次报道以来，hMSCs已在临床上进行了越来越多的测试，迄今为止在clinicaltrials.gov上注册的临床试验超过1100项。在这些试验中，使用自体和异体hMSC的试验数量直到2015年都是相当的，之后异体hMSC试验的数量超过了自体hMSC试验。这种趋势可能源于免疫调节的好处，这使得hMSCs具有免疫特权，因此不太可能触发细胞移植引起的免疫排斥，这在基于细胞的治疗中始终是一个关键问题。另一个好处是与自体细胞产品相比，异体细胞产品的制造成本降低：（每剂1490-1830美元）与自体细胞产品（每剂3630-4890美元）相比，基于一些假设。到目前为止，13个获批的基于hMSC的产品中有9个使用异体细胞。根据临床试验数据，移植效果依赖于一定数量的合格细胞（典型剂量范围从7000万到1.9亿个细胞，中位数为1亿个细胞）成功地被输注到受体。从原始细胞中获得足够的细胞数量需要大规模体外扩增方案。对于即将到来的后期临床试验和未来商业化的需要，持续增长的需要是一致地放大大量高质量hMSCs的高效系统。出于明显的经济原因，有效的制造规模化是一个理想的尝试，以增加异体hMSC治疗的可行性。为了在规模化制造中扩展依赖锚定的细胞，如hMSCs，有效利用可访问的表面决定了最大的体积生产力和制造批量大小。制造hMSCs的最常见现代方法依赖于多层容器，这些容器设计为在一个室内堆叠的层，以同时处理所有层，提供更高的空间效率和比常规T-瓶更经济的生物过程。尽管它们在传统培养器具上有所改进，但在这些多层容器中的hMSCs扩展几乎达到了临床相关所需的阈值细胞数量。为了进一步扩大过程，微载体系统提供了更高的表面积与体积比，最大化了空间效率。自1967年以来，微载体已在各种迭代中用于人类细胞培养。先锋研究表明，在完全可控的升规模生物反应器中hMSCs在微载体上的扩展。由于最近对制造经济学的增加兴趣，将hMSCs的使用从研究和开发阶段扩展到标准治疗的商业制造，工业经验研究报道，微载体生物反应器培养可以达到近80倍的体积细胞产量，同时仅占用当前良好生产规范（cGMP）制造空间的10%，制造成本降低（每平方厘米0.044美元）与多层容器培养（每平方厘米0.061美元）相比。基于这些原因，hMSC在微载体生物反应器系统中的生产开发代表了该领域的宝贵进展。总而言之，基于微载体的生物反应器系统是有利可图地制造商业化hMSC产品的一种新兴方法。 尽管微载体生物反应器培养在理论上只是改进的方法，用于生成足够的细胞进行移植，但其固有的制造过程与标准、成熟的平面培养有显著不同。例如，微载体培养需要动态流动来悬浮微载体并使大量培养基均匀化。这使得氧气、营养物质和细胞代谢物主要通过对流进行质量传递，这比平面培养所需的扩散要有效得多。同时，动态流动本身会对细胞产生剪切应力，细胞-微珠和细胞-细胞碰撞的频率，加上hMSCs对机械和物理力的敏感性，都被认为是影响细胞生长和质量的因素。另一个重要的不同是，微载体培养中的细胞生长表面与T-瓶或培养皿提供的平坦表面非常不同。在平面培养中，细胞本能地附着在平坦表面上，由于重力的作用，在接种后几小时内；相反，微载体上足够的细胞附着是由细胞-微珠碰撞决定的，除了粘附之外，可能需要超过一天。此外，与平面培养中的完整表面相比，微载体提供的表面是孤立的，这阻止了微珠之间的细胞迁移。换句话说，观察到细胞主要在单个微载体内增殖和扩散，强调了初始殖民效率的重要性，在2D平面培养中并不是一个关键因素。不完全的液体移除是微载体基础生物处理的另一个障碍。例如，完全的培养基更换对于T-瓶或多层容器来说是一个简单的常规程序。相比之下，微载体基础培养的典型培养基更换体积大约是25%到50%（表1），这取决于微载体床深度一旦所有微载体沉降到生物反应器底部。一个相关的障碍复杂化了细胞收获过程中的多个步骤是不完全的液体移除。因此，微载体生物反应器细胞收获过程的每一步，包括洗涤、细胞脱落、微载体过滤和细胞悬浮液浓度，都涉及特别的考虑和相应的策略，以最大限度地移除液体，而不对细胞质量或产量产生负面影响。此外，微载体生物反应器过程的规模化需要在非常大的规模上使用专业设备。由于典型的细胞过滤器只能通过几十毫升的细胞悬浮液，实验室规模的离心机限于升体积，两者都不是高效收获生物反应器体积的可行选择，这些体积可以扩展到几十甚至几百升的细胞悬浮液。因此，尽管这些新发展起来的生物反应器过程参数在细胞生长阶段改善了规模化过程，但它们为基于微载体的hMSCs生产创造了额外的下游体积相关挑战。需要进一步改进下游设备设计，以完全实现成功的过程开发。微载体悬浮在生物反应器中的优势，如易于扩展的容器设计、均匀的营养和氧气获取、细胞和培养基的实时在线/离线监测、喂养策略的多样化操作（即批处理、补料批处理和灌注）等，是显而易见的，过程（动态细胞附着、独特的扩展和原位收获）必须从平面培养的原始方法适应到微载体悬浮培养的需求。美国食品药品监督管理局（FDA）推荐实施过程分析技术（PAT），以阐明旨在促进创新和基于风险的监管决策的过程，在开发、制造和质量保证中。筛选关键过程参数并理解偏离过程对最终产品质量的影响至关重要。我们之前的研究表明，hMSCs属性和治疗效果的变化源于从平面培养到微载体之间的微环境差异，包括不连续的表面、凸曲率、微载体刚度、剪切应力、碰撞和聚集。在这里，我们提供了一个全面的审查，当在基于微载体的生物反应器中制造hMSCs时，生物处理变化的需要。大规模准备的过程也进行了讨论。 表 1.基于hMSC微载体的生物反应器工艺参数。 缩写：微载体（MC）、间充质干细胞（MSC）、人脂肪组织来源的MSC（hAD-MSC）、人骨髓来源的MSC（hBM-MSC）、人胎盘来源的MSC（hPL-MSC）、人脐带来源的MSC（hUC-MSC）、人脐带基质来源的MSC（hUCM-MSC）、人胎儿骨髓来源的MSC（hF-MSC）、人沃顿氏果冻来源的MSC（hWJ-MSC）。α：这些数字是根据作者的信息计算的。 2. 微载体基础hMSC制造的生物加工  可扩展性是微载体基础悬浮培养相对于传统平面培养的最大优势。开发基于微载体的hMSC制造面临的第一个挑战是微载体的选择。在生物反应器系统中的hMSC生产中已使用了多种类型的微载体，包括聚苯乙烯、明胶、右旋糖酐等。已有几项研究报告了筛选微载体用于hMSC生产的评估，主要关注三个关键培养步骤：(1) 粘附效率，(2) 生长速率和细胞扩展，(3) 脱落的便利性。Rafiq等人系统评估了13种商业微载体用于生物反应器中骨髓来源hMSC生产的适宜性，并确定塑料微载体是最优化的。Loubière等人比较了5种商业微载体用于脐带来源hMSC扩展，并证明尽管Cytodex-1展示了更高的细胞粘附效率和更好的细胞扩展性能，Star-Plus和Plastic-Plus分别在轨道和机械搅拌模式下被认为是更好的折衷选择。Leber等人筛选了6种商业微载体用于骨髓来源hMSCs和永生化细胞系hMSC-TERT的扩增，并在含血清或化学定义的培养基(Stem Cell 1)中进行了比较。他们的结果表明，玻璃涂层微载体支持含血清培养基中hMSC-TERT的生长和微珠间的转移，而增强粘附微载体在化学定义培养基中增强了细胞生长。综合来看，微载体的选择可能因不同系统和特定细胞类型而异。 尽管有多种微载体选择，它们共享相似的几何圆形形状，直径范围在100-300微米。在这个范围内，微载体提供了足够的体积表面积，而不影响细胞粘附和增殖支持。旨在最大化空间的微载体设计与精确控制培养环境的生物反应器系统特别有前景。例如，一升Synthemax II微载体培养，装载密度为16克/升，提供5760平方厘米，接近CellSTACK®-10提供的6360平方厘米。 将进一步讨论与接种、喂养和收获培养相关的生物工艺改进，以克服使用基于微载体的生物反应器系统所面临的挑战。 2.1. 种子培养 在大规模hMSC制造（>50升）中，直接将细胞库瓶中的细胞接种到生产规模的生物反应器中是不现实的，也不经济。因此，从冷冻瓶中解冻细胞，通过种子培养逐步传代到越来越大、体积更大的容器中，是制造过程的必要阶段。为了获得足够的生物反应器接种细胞，已经开发了种子培养过程，以从一规模高效地生成活细胞到随后更大的规模，最终接种生产规模的生物反应器。每个种子培养必须可靠地生成所需的预定细胞数量，同时始终维持细胞质量。因此，除了确保倍数扩展外，种子培养的质量最终决定了hMSC生产的下游成功。影响种子培养质量优化的最重要因素是时间框架，因为hMSC过度生长可能导致细胞-细胞接触抑制，延长的传代过程施加了不当的细胞压力，对下游生产阶段产生负面影响。 大多数先前的研究使用平面培养进行hMSC制造，因为其相对简单，处理时间较短，细胞扩展的差异较小，且细胞数量产量一致。然而，如果目标接种量超过了平面培养所能实现的规模，微载体培养也可以纳入种子培养。一个简化过程的有趣替代方案是直接将种子微载体从种子培养阶段转移到规模化的生物反应器中，使用新鲜培养基和空微载体。这种方法需要满意的细胞从种子微珠迁移到未种子微珠，但跳过了传代过程，如酶处理、机械力脱落、离心和细胞沉淀物的重悬。几项研究还证明了使用新鲜解冻细胞的接种准备的实用性，从而证明了用微载体完全替代平面培养是可行的。由于微载体培养的传代过程复杂性增加，种子培养更倾向于使用平面培养。 2.2. 接种 对于批量系统，需要更多的努力来建立设定点的培养条件。在细胞接种之前，微载体应充分水合并用培养基平衡，整个培养环境应在优化的温度、pH值和溶解氧(DO)下稳定，以便在接种引起的必要的干扰之后立即恢复培养条件。细胞接种后，hMSCs倾向于像在平面培养中一样粘附到表面上。然而，微载体上的细胞粘附比平面培养中的粘附更加困难，不仅是因为动态环境，还因为微载体表面的曲率。因此，大多数工艺开发研究最初都集中在实现高细胞粘附效率上。粘附效率可以通过微载体上粘附的细胞比例和/或与悬浮在上清中的细胞相比，与初始接种数量相比来确定，假设在分析时间框架内没有细胞生长或死亡。18到24小时是细胞粘附容易测量和可以忽略细胞增殖的公认时间框架。 除了细胞粘附之外，殖民效率也很重要。由于单个微载体表面提供的可扩展表面的不连续性，细胞传播被限制在被殖民的微载体内，无论微珠间的转移如何。殖民效率决定了微载体表面利用率，这可能影响最终的细胞产量。一般来说，微载体的细胞殖民效率是通过基于细胞对微珠比例的泊松分布估算的，假设细胞-微载体碰撞和成功粘附的事件是随机的、独立的和恒定的。例如，细胞对微珠比例为3时，被占据的微载体的理论预测为95%，而细胞对微珠比例为6时为99.8%。因此，通常使用3到6的细胞对微珠比例（表1）。实际上，微载体的数量是根据达到目标细胞数量所需的表面积来选择的，细胞接种密度是根据之前的平面培养经验和通常在3000到5000个细胞/平方厘米来计算的（表1）。为了提高细胞对微珠比例以获得更高的殖民效率，增加接种细胞数量通常比减少装载的微载体更有利。尽管殖民效率和细胞粘附同等重要，但很少有研究全面评估了两者的影响。 间歇性搅拌已被实施以增强微载体悬浮培养中的细胞粘附。Yuan等人在转瓶中的实验结果表明，在细胞接种后24小时，使用间歇性搅拌（3分钟以60转/分钟的搅拌，然后不搅拌27分钟）比连续以60转/分钟的搅拌增强了1.5到2倍的细胞粘附效率。对于间歇性搅拌，静止期增强了细胞粘附，而搅拌期增加了细胞殖民。如果静止期太长，增加的细胞粘附导致初始增长更高，但可能不是最高的最终细胞产量，因为微载体的利用有限。此外，由于依赖锚定的hMSCs的活性随着它们未附着在表面上的时间越长而降低，间歇性搅拌模式的平衡必须仔细优化以适应规模。 已经开发了几种方法来提高细胞粘附而不损害殖民效率。成功的hMSC粘附需要细胞-微载体碰撞和在碰撞期间细胞对微载体的充分结合。针对这一点的一种方法是增加碰撞的概率。增加碰撞概率的一种简单方法是在细胞粘附阶段减少工作体积。增加搅拌速度也可以提高碰撞频率；然而，由于碰撞期间的接触时间减少和由于更高的动能而加剧的流体剪切应力，最终可能会减少成功粘附。生物材料生物技术的进步也提高了结合力，例如涂有蛋白质或正电荷增强细胞粘附的微载体。例如，Shekaran等人研究了涂有纤维连接蛋白和/或聚-L-赖氨酸的聚己内酯微载体对hMSC粘附效率的影响，发现纤维连接蛋白和聚-L-赖氨酸的顺序涂层将总细胞粘附提高了约69.4%到78.3%。此外，也研究了培养基的影响。与血清补充培养基相比，在无血清和异种培养基中观察到降低的细胞粘附和增加的滞后阶段，证明了血清在细胞粘附中的基本作用。在另一项研究中，Gadelorge等人成功地使用0.5%的血小板裂解物(PL)在最初的24小时内增强细胞粘附，而不是在扩展阶段使用的5% PL。尽管取得了一些进展，但在微载体悬浮培养中提高细胞粘附效率的策略仍然是一个挑战。 2.3. 细胞扩展 当hMSCs牢固地粘附在微载体上后，细胞开始扩展。为了最大化细胞产量，必须维持一个优化的环境。在平面培养中，温度由孵化器控制，pH值通过培养基中的碳酸氢钠和CO2浓度保持平衡，氧气由环境空气供应，几乎完全的培养基更换提供营养替换和废物清除。在微载体培养中，这些参数都由生物反应器系统控制，保持优化的温度、pH值、溶解氧(DO)，执行控制搅拌、营养喂养（例如，葡萄糖和谷氨酰胺）和废物清除（例如，乳酸和氨）。与每批只需要喂养一次或两次的平面培养不同，基于微载体的生物反应器培养需要更复杂的生物工艺，以实现实时监测和控制，并采用适当的喂养策略，以动态维持最佳细胞生长。为了增加最终产量，细胞培养系统旨在扩大工作体积和细胞浓度，因此需要开发支持细胞数量最大倍数增加的喂养方案。 2.3.1. 搅拌（搅动和摇摆） 在悬浮培养中在微载体上培养细胞需要某种形式的搅拌。先前的报告总结了搅拌引起的流体剪切应力和动态环境引起的碰撞以及随后的聚集对hMSCs治疗潜力的影响。研究的结论是保持搅拌尽可能低的速度，仅满足质量传递的需求，并避免微载体在死角的积累。搅拌槽式生物反应器已广泛用于微载体悬浮培养。通过可视化或粒子图像测速可以轻松估计维持微载体悬浮所需的最低搅拌速度。NS1和NS1u是常用的标准，代表搅拌器速度。NS1定义为完全悬浮所有微载体的阈值搅拌，但不保证均匀的微载体分散。NS1u定义为确保即使微载体与容器底部接触也没有静止微载体的最小搅拌。当考虑使用基于微载体的生物反应器系统进行hMSCs规模化生产时，混合的一个重要因素是体积能量耗散。这表明了维持微载体悬浮所需的每单位体积的功率输入，与搅拌速度成正比。因此，搅拌速度通常随着培养时间的增加而增加，以抵消装载有增殖细胞的较重微载体、较大的工作体积或多微载体聚集。与混合有关的另一个因素是搅拌器尖端速度，在这一点上是整个生物反应器中剪切应力最高的地方，因此对细胞的潜在损伤最严重。因此，搅拌器的尺寸和几何形状可能对活性至关重要。可能的情况是，一小部分细胞暴露在局部高剪切应力下，但平均剪切应力暴露仍然很低。 为了绕过剪切应力的潜在风险，其他类型的生物反应器，包括固定床生物反应器、中空纤维生物反应器和波纹运动生物反应器，也已用于扩展hMSCs。在波纹生物反应器中的微载体悬浮已显示出显著较低的剪切应力。然而，在这些系统中进行原位细胞收获时可能会遇到挑战，因为需要更高的剪切应力才能将细胞从微载体上分离。特定类型的微载体，如可溶解微载体，代表了克服这个问题的一个选择。 2.3.2. 控制系统（温度和pH值和DO） 无论培养类型如何，hMSC培养的最佳温度设定点为37°C。生物反应器通常配备有温度控制单元，该单元接收来自温度传感器的信号，并根据需要控制加热或冷却系统的能力。在生物反应器培养中调节温度有两种方式。一种是维持生物反应器的水套或附着在生物反应器袋上的金属板的温度，另一种是直接通过热电偶或温度传感器测量大体积培养的温度，然后用加热毯或垫加热生物反应器。前者可能由于间接测量而有一些偏差，而后者需要更多关注以了解温度传感器和加热源的相对位置。虽然在搅拌模式下，热传递和温度分布应该在整个培养中均匀，但在培养不处于搅拌状态时（例如，当沉降微载体进行培养基更换时）可能并非如此。由于整个培养过程中热传递效率低下而产生的任何温度梯度可能导致特定区域过热。因此，当搅拌关闭时，加热功能也应该关闭。 平面培养中的pH值通过孵化器中的5% CO2浓度和培养基中的NaHCO3平衡。尽管没有直接控制，但在平面培养中，高表面积-体积比率容易维持pH值在一定范围内。相反，含有高细胞密度的动态微载体培养需要更具体的pH值控制。如表1所示，pH设定点在7到7.5之间，pH可以通过稀释的碱（例如，NaOH，NaHCO3）和稀释的酸（例如，H2SO4）或CO2气体控制。两项研究已成功地仅通过使用5% CO2气体维持pH值。尽管每次使用前都必须校准在线pH探头，但离线校准（即，立即用离线pH计测量的培养样品）提高了细胞扩展期间的测量精度，特别是对于长期培养。 溶解氧（DO）是维持代谢活动和细胞生长的必需因素。向生物反应器培养供应氧气有两种方式：覆盖通气和鼓泡通气。对于覆盖通气，气体不断被泵入顶部空间以调节影响培养基中溶解气体的分压。概念是将纯氧泵入覆盖层可以加速氧气的溶解性。鼓泡通气通过在底部产生小气泡将氧气供应到培养基中，从而增加气液（氧-培养基）界面面积和气体滞留时间。由于hMSCs的低氧需求（1.2–3.8 × 10^−17 mol氧气s−1 cell−1）与细菌和酵母相比，DO通常可以通过覆盖通气来维持。迄今为止，很少有研究在基于微载体的hMSC生产中实施鼓泡。然而，如果细胞密度达到一定水平，气液表面积与体积比太低，可以应用鼓泡。一个考虑因素是，因为鼓泡可能会增加细胞的剪切力，并可能导致气液界面起泡，可能需要添加消泡剂。 氧气传递速率，表示生物反应器中氧气质量传递的熟练程度，由界面面积、质量传递系数和氧气浓度梯度决定。界面面积由几何参数决定，包括生物反应器的形状和尺寸以及鼓泡气泡的大小。因此，气泡尺寸越小，界面面积就越大，从而增强了氧气传递。氧气质量传递系数受培养基配方、混合、能量耗散、暴露时间等的影响。例如，Shah等人的实验结果表明，当在气流速率为0.05 vvm的2升旋转运动生物反应器中将搅拌速度从6提高到20 rpm时，体积氧气质量传递系数（kLa）从2提高到3.4 h−1，这表明较高的搅拌速度提高了氧气传递效率。氧气浓度梯度取决于溶解氧浓度与培养基中饱和浓度之间的差异。因此，顶部空间中的纯氧导致这个梯度的增加并加速氧气输送。 2.3.3. 培养基和喂养策略 与平面培养类似，用于基于微载体的生物反应器中hMSC扩展的最常见培养基是添加了FBS的DMEM或αMEM。最近对追求无异种培养的兴趣，以减少未定义的动物来源成分的影响，已测试并证明了人血清或血小板裂解物成功替代了FBS用于无异种微载体悬浮培养的生物反应器。此外，这些培养物用于治疗目的的潜力，导致开发了几种专门用于微载体基础培养系统中hMSC扩展的商业化培养基，包括MesenCultTM-XF、PRIME-XV MSC Expansion SFM、StemPro® MSC SFM XenoFree、MSCGMTM BulletKitTM。 一些因素被添加到生长培养基中以实现特定目的。例如，添加聚合物如0.1% Pluronic F68有助于通过减少细胞的疏水性来保护细胞，从而减少剪切诱导的损伤，并促进hMSC粘附到微载体上。这在用气体鼓泡培养时特别有益，并使气泡破裂。实际上，培养基的选择应该根据适当的喂养策略进行优化，并由各个培养系统决定。 由于培养基是hMSC生产的主要成本来源，明智的喂养计划将使用最少的培养基体积，以获得最大的细胞产量，而不会对细胞质量产生负面影响。培养基使用效率可以表示为每百万细胞的培养基消耗量（mL/10^6 cells）。使用这个描述符，可以比较不同研究之间的培养基成本。批处理培养是过程开发的便利和经济参考。优点包括操作简便、污染风险低和培养基用量减少。由于营养的限制，无法实现高细胞培养密度，因此批处理培养不理想用于hMSC制造评估。然而，批处理培养非常适合与最终产量无关的过程开发，如细胞系筛选、微载体筛选、细胞粘附改进、营养限制确定、生物反应器参数优化、批处理间变异性澄清等。 常见的hMSC微载体基础培养通常实施补料批处理作为喂养策略，以避免与营养相关的生长抑制，包括培养基添加和培养基更换。培养基添加同时补充营养和稀释代谢废物。由于这种方法缺乏排水程序，因此不必停止搅拌。这种方法的另一个好处是保留了hMSC分泌的细胞因子，并且在扩展过程中没有细胞损失。不幸的是，这种策略所需的增加工作体积导致每单位体积的细胞产量减少。部分培养基更换在补充培养基之前从生物反应器培养中去除代谢废物，并保持最大体积生产力。这个培养基去除步骤需要不搅拌10到20分钟以使微载体沉降。所需的确切时间可能因微载体密度、生物反应器规模、细胞聚集程度或其他影响微载体从培养基上清中沉降的能力的因素而异。通过离线培养基分析优化交换培养基的频率和部分，以防止营养耗尽和废物积累。大多数研究选择的培养基交换量等于或小于工作体积的50%（表1）。这既减少了排水过程中的微载体损失，也保留了已知可以增强扩展的hMSC分泌的细胞因子。在某些情况下，如果离线培养基分析推断特定已知营养组分的耗尽将很快发生（根据细胞生长曲线），可以提供更高浓度的这种组分作为添加剂来补偿短缺并维持细胞增殖速率。 连续交换模式（连续培养基交换）稳定地向生物反应器提供新鲜培养基，并同时将用尽的培养基泵出培养。这种策略可以比未修改的培养物实现更高的细胞密度。Cunha等人利用相同的培养基用量在基于微载体的搅拌槽式生物反应器中比较了每天20%工作体积的连续培养与每2.5天50%工作体积的补料批处理培养的性能。他们的结果表明，连续培养可以达到更高的细胞浓度，达到3.7 × 10^5 cell/mL的14.6倍扩展，与补料批处理培养的2.9 × 10^5 cell/mL的11.5倍扩展相比。连续流速可以根据生长和离线培养基分析进行调整，以补充必要的营养，最小化培养基波动。 2.3.4. 微载体添加 除了培养基补充外，一些研究还测试了添加新鲜、裸露的微载体作为一种方法，为现有细胞提供更多的扩展表面并稀释细胞密集度。这种方法依赖于高效的微珠间的细胞迁移。即使在各种培养系统和几种培养基中使用恒定搅拌维持的培养中，微珠间转移的可行性也得到了很好的证明。先前的一项研究建立了一种方法，在第6天向搅拌槽式生物反应器中添加新鲜微载体，然后从第6天到第9天进行间歇性搅拌（即，15转/分钟5分钟，静止55分钟），以实现更好的细胞从微珠到微珠的迁移，从而最大限度地提高微载体的殖民。这可能是一种创新技术，为高细胞密度培养提供增加的体积表面积并减少聚集程度。尽管有希望，但该过程需要优化以确定微载体添加的理想时间框架、新鲜微载体的数量以及整体提高细胞微珠间转移。 2.4. 收获 一旦生物反应器控制系统和优化的培养基喂养策略显示出扩展hMSCs的能力，下一步就是确定收获这些细胞作为最终产品的最佳时间。与平面培养不同，基于微载体的培养提出了hMSC收获的挑战。在收获时，hMSCs通常占据了大多数微载体，微载体聚集的程度非常高，可能会进一步增加与收获细胞相关的困难。使用从平面培养中修改的程序作为指南，微载体培养中的整个收获过程从微载体上的细胞分离开始。这包括排干培养基、添加并用PBS洗涤、排干PBS、添加解离缓冲液进行培养和用培养基熄灭。然后，包括以下步骤，以有效地去除微载体并浓缩大量细胞悬浮液，以便进行后续的下游生物过程。从培养系统移除液体的每个步骤都不可避免地会导致一些细胞的损失。例如，排干废培养基或洗涤缓冲液也可能去除一些带有粘附hMSCs的微载体，微载体去除和细胞悬浮液/浓缩步骤都涉及一些细胞的损失。分离效率可能是降低总细胞产量的另一个因素。因此，已经开发了许多方法来提高hMSC收获效率。 收获效率最关键的部分是细胞分离程序。Nienow等人报告了在15毫升ambrTM和100毫升DASGIP生物反应器以及100毫升转瓶中使用解离试剂Trypsin-EDTA、TrypLE Express和Accutase优化hMSC微载体培养中的分离效率的21种组合。从本质上讲，他们的方案利用了解离试剂的短暂强烈搅拌期，结合了达到最大分离效率所需的化学反应和物理力。分离效率可以随时通过在显微镜下检查样品来检查，看看微载体是否仍然附着在细胞上。此外，一旦细胞被分离成单个细胞或大小小于湍流的Kolmogorov尺度的小簇，细胞将不再受到流体剪切应力的影响。细胞分离后，需要去除微载体以获得纯净的细胞悬浮液。可以使用无菌筛子过滤掉微载体。为了适应大规模制备的高容量，市售的一次性滤袋也可用。例如，Thermo Fisher Scientific的Harvestainer™ BioProcess容器旨在封闭系统中将微载体珠子与收获肉汤分离，包括3升、12升、25升和50升的不同尺寸，应该能够覆盖迄今为止开发的大多数规模。这涉及在无菌容器内组装一个微筛袋，以允许微载体被截留在筛袋中，而分离的细胞将通过它。EMD Millipore的OptiCap® XL 1胶囊还提供了有效的过滤，以将细胞与微载体分离。筛网尺寸必须在微载体直径和细胞直径之间，范围从60到100微米（表1）。 无论采取哪种方法，收获过程都需要几个复杂的步骤，必须及时进行。为了减少复杂性，已经开发了创造性的微载体类型，以简化程序并提高生产速度和效率。可溶解微载体是一种创新的方法，可以轻松地检索所有细胞，而不需要进一步的过滤，并且在升规模的生物反应器培养中已经使用。热响应微载体也已测试用于热提升收获。尽管取得了这些进展，但仍有改进的空间，以加速收获过程。 去除微载体后，经过澄清的hMSC悬浮液通常包含的体积（>20升）大于来自可比平面培养的体积。实验室升规模的离心机缺乏处理这些大体积的能力。已经开发了用于高效细胞浓缩的最新连续流技术。切向流过滤，也称为交叉流过滤，是一种通过将流动方向设置为垂直于过滤方向（顾名思义）来提高渗透流速的设计。有许多商业产品可用，包括Pall Corporation的Cadence™ Single-Pass和PallSep™系统，Millipore的Cogent M1 TFF系统，Cytiva的UniFlux和ÄKTA flux等。另一种设计是逆流连续离心。这些系统可以利用流体流与离心力相反的平衡将细胞保留在流化床上，例如Sartorius Stedim的kSep®系统或Terumo BCT的Elutra®细胞分离系统。这些方法加速了从大规模体积中浓缩细胞的处理时间，并减少了细胞暴露于离心力的时间。仍然需要进一步优化以获得最大的hMSC产量。 3. 取样和细胞计数  这些细胞作为治疗药物的效力取决于能否获得大量健康活性的hMSCs。因此，准确和一致地计算悬浮细胞的方法非常重要。此外，由于微载体的干扰以及它们在培养中的固有聚集，基于微载体的生物反应器培养中的细胞计数变得更加具有挑战性。与消耗营养物质和积累废物相比，确定细胞数量被视为支持和确认成功细胞扩展的最直接证据，因此也指导未来过程开发的决策和方向。从本质上讲，细胞计数是整个生物过程的关键参考。在计数细胞之前，必须收集代表性样品。取样口位置、取样时的搅拌速度、处理样品的过程，所有这些因素都可能改变计数的细胞数量。优化取样方法是第一步，尤其是对于细胞培养的后期阶段，当hMSCs在多微载体聚集体中生长时，这可能是一个挑战。 细胞计数是一个相对直接的过程，已经为来自平面培养的均匀细胞悬浮液建立了许多方法。方法是计算固定体积内的细胞数量，然后将该数量转换为样品大小，再转换为整个培养系统。当使用聚集的微载体工作时，需要修改方法。 一般来说，在微载体培养中计算细胞的方法有几种：(1) 细胞从微载体上分离后的计数；(2) 微载体溶解后的细胞计数；(3) 细胞溶解后微载体的核计数；(4) DNA定量；(5) 代谢测定。具有简单步骤和高通量的计数方法理想且比基于测定的方法更受欢迎。此外，由于可溶解微载体并不总是可行的，细胞从微载体上分离和细胞溶解微载体通常是更合适的选择（图1）。 图 1.细胞解离和细胞裂解方法。基于微载体的生物反应器培养物的细胞计数方法。 除了使用血细胞计数器进行手动细胞计数外，自动细胞计数器已广泛用于hMSC制造，以快速测量复制样品中的细胞数量。尽管理论只是计算所有细胞并由细胞膜的完整性确定活性，不同的自动细胞计数器可能会产生不同的结果。台盼蓝增强了带有活性信息的细胞计数，而荧光染料，如吖啶橙、钙黄绿素、DAPI、碘化丙啶等，可以通过自动细胞和核计数器显示更高的颜色对比度，用于计算有或没有裂解缓冲液的活细胞和死细胞。这些自动计数器主要分析染色细胞/核的图像并计算颗粒数量。重要的是，应根据细胞/核大小设置门限，以排除样品中可能存在的无关细胞碎片或破裂的核。自动计数器的典型认证范围是10^4到10^7，因为这提供了足够的颗粒进行计数，但并不过于拥挤，以至于设备无法识别单个颗粒。值得注意的是，对于来自平面培养的细胞工作良好的自动细胞计数器在计数来自微载体培养的细胞时可能效率较低，因为有微载体堵塞装载工具的风险。 4. 结论  我们先前的研究检查并总结了当从平面培养转换到微载体时微环境变化导致的hMSC治疗潜力的改变。发现成骨和软骨系的分化潜力显著增加，而脂肪系的分化潜力减少。还观察到迁移能力、抗炎和免疫调节能力的改善。我们也承认了来自微载体培养的不足之处——主要是由不连续生长表面和生物反应器内剪切应力分布不均匀引起的异质性。然而，尽管存在局限性，基于微载体的生物反应器系统仍然是生产hMSC产品商业化最有前途和盈利的方法。本综述着重于微载体基础生物反应器的发展，这些反应器最有潜力用于规模化过程。我们还讨论了微载体培养所需的生物加工变更，包括种子培养、接种、扩展、收获和细胞计数。还回顾了生物反应器参数，如温度、pH值、DO、混合和喂养。最后，我们详细介绍了在hMSC微载体培养中应用的各种细胞计数方法。