更新于：2024-06-19
NCI-4650
更新于：2024-06-19
概要
基本信息
原研机构 |
在研机构 |
非在研机构- |
最高研发阶段临床2期 |
首次获批日期- |
最高研发阶段(中国)- |
特殊审评- |
关联
1
项与 NCI-4650 相关的临床试验A Phase I/II Trial to Evaluate the Safety and Immunogenicity of a Messenger RNA (mRNA)-Based, Personalized Cancer Vaccine Against Neoantigens Expressed by the Autologous Cancer
Background:
Exome sequencing can identify certain gene mutations in a person's tumor. This can then be used to create cancer treatments. In this study, researchers will make a treatment called a messenger ribonucleic acid (mRNA) vaccine. The vaccine might cause certain tumors to shrink.
Objective:
To see if the mRNA vaccine is safe and can cause metastatic melanoma or epithelial tumors to shrink.
Eligibility:
People 18-70 years old with metastatic melanoma or epithelial cancer
Design:
Participants will be screened under protocol 99-C-0128.
Participants will provide samples under protocol 03-C-0277:
Participants will provide a piece of their tumor from a previous surgery or biopsy.
Participants will have leukapheresis: Blood is removed through a needle in one arm and circulated through a machine that takes out the white blood cells. The blood is then returned through a needle in the other arm.
Participants will have many tests:
Scans and x-rays
Heart and lung function tests
Blood and urine tests
Participants will receive the mRNA vaccine every 2 weeks for up to 8 weeks. They will get the vaccine as an injection into the upper arm or thigh. They may receive a second course of vaccines if the study doctor determines it is needed.
Participants will have follow-up visits approximately 2 weeks after their final vaccine, then 1 month later, then every 1-2 months for the first year, and then once a year for up to 5 years. Each visit may take up to 2 days and include:
Physical exam
Blood tests
Scans
Leukapheresis at the first visit
Exome sequencing can identify certain gene mutations in a person's tumor. This can then be used to create cancer treatments. In this study, researchers will make a treatment called a messenger ribonucleic acid (mRNA) vaccine. The vaccine might cause certain tumors to shrink.
Objective:
To see if the mRNA vaccine is safe and can cause metastatic melanoma or epithelial tumors to shrink.
Eligibility:
People 18-70 years old with metastatic melanoma or epithelial cancer
Design:
Participants will be screened under protocol 99-C-0128.
Participants will provide samples under protocol 03-C-0277:
Participants will provide a piece of their tumor from a previous surgery or biopsy.
Participants will have leukapheresis: Blood is removed through a needle in one arm and circulated through a machine that takes out the white blood cells. The blood is then returned through a needle in the other arm.
Participants will have many tests:
Scans and x-rays
Heart and lung function tests
Blood and urine tests
Participants will receive the mRNA vaccine every 2 weeks for up to 8 weeks. They will get the vaccine as an injection into the upper arm or thigh. They may receive a second course of vaccines if the study doctor determines it is needed.
Participants will have follow-up visits approximately 2 weeks after their final vaccine, then 1 month later, then every 1-2 months for the first year, and then once a year for up to 5 years. Each visit may take up to 2 days and include:
Physical exam
Blood tests
Scans
Leukapheresis at the first visit
开始日期2018-05-18 |
申办/合作机构 |
100 项与 NCI-4650 相关的临床结果
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100 项与 NCI-4650 相关的转化医学
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100 项与 NCI-4650 相关的专利（医药）
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3
项与 NCI-4650 相关的新闻（医药）2023-10-08
疫苗在预防传染病传播方面已被证明具有显著的功效，每年挽救了无数人的生命。近几十年来，疫苗的广泛应用使天花得以消灭，脊髓灰质炎、麻疹和其他传染病的发病率极低。世界卫生组织报告说，接种疫苗每年可以防止大约200万人死于麻疹、流感、百日咳和破伤风。此外，在癌症管理中使用疫苗在临床前试验中显示出强大的功效，成为免疫肿瘤学领域最有前途的治疗方法之一，并获得更多的关注。传统疫苗有几个缺点，可能会限制它们在疾病预防和治疗中的应用。例如，开发树突状细胞(DC)疫苗的基本程序涉及一个劳动密集型和耗时的过程，需要制备患者自身细胞。基于微生物的疫苗的工程和制造需要复杂而复杂的过程。肽疫苗表现出MHC限制，选择性地激活单克隆T细胞，因此具有较高的免疫逃逸风险DNA疫苗存在基因组改变、长期表达和产生抗DNA自身抗体的风险，这可能阻碍其在人类中的应用。因此，选择一种对疾病预防和治疗有前景价值的合适疫苗至关重要。与传统疫苗相比，使用信使RNA (mRNA)的疫苗具有多种有益的特征，mRNA是一种作为蛋白质翻译模板的单核苷酸序列。mRNA疫苗使用体细胞作为自然诱导先天免疫和适应性免疫的核心设施，实现蛋白质产物的翻译后修饰和全部功能，允许在生物反应器中不能产生的多聚体和多用途蛋白质在宿主细胞中正确的翻译折叠和组装，并将产生的细胞内和跨膜蛋白质转移到合适的细胞位置。mRNA疫苗可以根据疾病的独特属性设计编码任何抗原。此外，与DNA疫苗相比，mRNA疫苗避免了宿主基因组插入突变的潜在风险，并可调节所选抗原的表达。从商业角度来看，mRNA疫苗可以通过无细胞过程快速开发和大规模生产，因为它在体外的转录反应效率高，成本效益高。尽管与其他疫苗形式相比，mRNA本身也有一些缺点，例如稳定性差和免疫原性强，这限制了mRNA疫苗在体内的使用，但在修饰和递送方面的改进在很大程度上解决了这些障碍，确保了体内稳定性的维持，以及在启动强大的免疫反应和持久功能引起的不可逆不良反应之间的平衡。因此，mRNA疫苗已成为预防和治疗许多疾病的一种有希望的方式。图1 mRNA疫苗对免疫激活的双重作用mRNA疫苗研制mRNA疫苗的开发是几十年来广泛研究的成果。mRNA的发现可追溯到1961年，并于1969年首次实现了其体外蛋白表达的分离。1990年，体外转录的mRNA被成功验证为在小鼠骨骼肌细胞体内合成蛋白质的模板，标志着mRNA在体内表达的突破，为mRNA疫苗的开发奠定了基础。然而，mRNA疫苗的开发最初面临有限的投资，主要是由于对其不稳定性、体内运输效率低下和可能的先天免疫原性。但仍因其安全性、直接设计和简单制造，mRNA的研究一直在持续。最终，这些疫苗在当前控制大流行的努力中发挥了关键作用。迄今为止，已经建立了一个开发mRNA疫苗的综合框架，包括设计、合成和递送技术。图2 开发mRNA疫苗的流程mRNA设计由于mRNA的不稳定性和翻译效率低下，mRNA疫苗的发展面临着一个主要障碍。在体外，转录的mRNA包括5' cap, ORF, 3'非编码区(3' UTR), 5'非编码区(5' UTR)和a poly(A) tail五个主要元素，它们都模拟了内源性mRNA的结构。为了提高mRNA的翻译效率，科学家们设计了各种技术来修饰这些成分并优化mRNA的设计。 5' cap是一种位于成熟mRNA分子5'末端的修饰的核苷酸结构，包括一个通过三磷酸链与mRNA连接的鸟嘌呤核苷酸，在鸟嘌呤的第7位和/或第一个转录核苷酸的2'位置有额外的甲基化。5' cap在mRNA稳定性和功能的几个方面起着至关重要的作用，包括保护mRNA免受外切酶的侵害，提高mRNA的翻译效率，促进细胞核到细胞质的运输。在mRNA疫苗中，包含 5' cap结构对于mRNA分子的稳定和促进对编码蛋白的有效翻译至关重要。poly(A) tail是mRNA的一个关键的转录后修饰，对mRNA的稳定性、输出和翻译有重要作用。在真核细胞中，mRNA的成熟过程涉及在mRNA分子的3'端添加一个长链的腺嘌呤核苷酸，其典型长度范围为50-250个核苷酸。poly(A) tail一个关键功能是保护mRNA免受外切酶的侵害。此外，poly(A) tail促进mRNA从细胞核输出到细胞质，在细胞质中它可以被翻译成蛋白质，还参与蛋白质合成的起始。在mRNA疫苗中引入poly(A) tail有两个关键目的：第一，稳定mRNA分子并保护其免受细胞酶的降解。第二，提高mRNA的翻译效率，导致抗原表达增加和更有效的免疫反应。UTR在mRNA基因表达调控中起着至关重要的作用。具体来说，5' UTR在调节mRNA稳定性和翻译效率方面至关重要，5' UTR的选择性剪接可以改变mRNA的翻译效率。同样，3' UTR通过结合调控蛋白和microrna来调节mRNA的稳定性，这些蛋白和microrna可以破坏或稳定mRNA。在mRNA疫苗设计中，UTR被精心设计以优化蛋白质表达和免疫反应对5' UTR进行修饰可提高翻译效率，对3' UTR进行修饰可稳定mRNA并延长蛋白表达，从而提高mRNA疫苗的免疫原性和有效性。ORF以起始密码子开始，以终止密码子结束，是mRNA被核糖体翻译成蛋白质的关键片段。ORF的长度从几百到几千个核苷酸不等。ORF的序列决定了合成蛋白的身份和结构，因此对mRNA的有效性起着关键作用。在mRNA疫苗的背景下，ORF设计直接影响目标抗原的产生。mRNA疫苗技术的进步促进了它们针对新出现的传染病的快速设计和生产。ORF序列已被优化，以提高mRNA的稳定性和翻译效率。此外，在ORF中使用非天然氨基酸可以扩大抗原呈递的表位库，从而潜在地诱导更广泛的免疫反应。开发高效的ORF设计策略对mRNA疫苗的成功至关重要。这些努力有望开发出更有效、更通用的mRNA疫苗，在疾病预防和治疗方面具有广阔的应用前景。值得注意的是，由于修饰核苷能够提高mRNA分子的稳定性、翻译效率和免疫原性，它们在mRNA技术中得到了广泛的应用。这些核苷类似物可以在体外转录中整合到mRNA序列中，从而形成相对于未修饰的mRNA分子具有优越性能的修饰mRNA分子。在mRNA中最常用的修饰核苷有假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和2-硫尿嘧啶。假尿嘧啶提高mRNA的稳定性和翻译效率，同时降低先天免疫反应的激活。5-甲基胞苷提高蛋白表达水平，而2-硫脲通过增加mRNA与核糖体的结合亲和力来提高翻译精度其他修饰，包括Nl -甲基伪尿嘧啶和5-甲氧基尿嘧啶，也被用来提高mRNA的稳定性和翻译效率在mRNA技术中掺入修饰核苷为开发更有效和更安全的基于mRNA的疗法，包括针对各种人类疾病的疫苗和基因疗法带来了巨大的希望。mRNA疫苗合成通过体外转录产生mRNA涉及使用RNA聚合酶从活细胞外的DNA模板合成mRNA。上游过程需要使用质粒作为模板，并使用T7, SP6或T3 RNA聚合酶将其转录成初级mRNA。这个反应只需要几个小时，每毫升反应产生几毫克的初级mRNA。随后，在转录过程中使用Cap类似物代替天然底物或通过使用RNA 2' - o-核糖转移酶、RNA甲基转移酶和甲基供体底物的两步酶促反应对初级mRNA进行反应。尽管利用Cap类似物是一种快速而实用的方法，但其使用受到相对较高的成本和由此产生的m7GpppN帽结构相关的不稳定性的阻碍。相反，两步酶促反应产生更稳定的m7GpppN帽结构，这还需要额外的步骤和酶反应，以及对合适的酶和甲基供体底物的精心选择为了达到临床质量标准，上游产生的mRNA需要经过多个纯化步骤才能从反应混合物中分离纯化。大小排斥色谱法是一种常用的方法，用于分离mRNA分子基于其大小和形状。这种方法既简单又温和，可以有效地去除杂质，包括残留的DNA、RNA和蛋白质。反相高效液相色谱法根据mRNA分子的疏水性分离mRNA分子，从而提供高分辨率和纯度，但费时且需要昂贵的设备。亲和层析是另一种纯化mRNA疫苗的策略，利用特异性配体捕获和纯化用于疾病预防和治疗的mRNA疫苗。这种方法可以提供高特异性和产率，但可能需要额外的配体固定步骤，并且可能昂贵。离子交换色谱法是另一种常见的mRNA纯化方法，它根据分子的电荷分离分子纯化mRNA分子结构与。尽管该方法收率和纯度高，但可能需要多个步骤和仔细优化才能获得最佳结果。除了基于色谱的方法外，基于沉淀的方法，包括异丙醇或乙醇沉淀，也可用于纯化mRNA疫苗这些方法简单且具有成本效益，但在去除杂质方面效果较差，并且可能需要再悬浮和质量控制的额外步骤。最终，选择mRNA疫苗的纯化方法取决于各种因素，包括所需的纯度水平、可扩展性、成本和下游应用。mRNA疫苗递送由于RNA固有的不稳定性和需要保护其在细胞外环境中不被降解，将mRNA疫苗递送到细胞中提出了重大挑战。在过去的几十年里，研究人员探索了各种递送系统来克服这些挑战并增强mRNA疫苗的功效。最早的方法之一是使用裸mRNA分子，直接注射到细胞或组织中。在此，mRNA在没有载体的情况下递送，允许其在细胞内被翻译成抗原蛋白。虽然裸mRNA疫苗相对容易生产，并且在临床前研究中显示出前景，但它们的稳定性较差，并且可能比携带载体的mRNA疫苗引起的免疫反应更弱。另一种早期方法是mRNA-DC疫苗，它涉及在DCs上装载编码所需抗原的mRNA。然后DCs将抗原呈递给免疫系统，导致强大的免疫应答。这种方法在治疗癌症和传染病的临床前研究中显示出前景。近年来，脂质纳米颗粒(LNPs)和多聚复合物/聚合物纳米颗粒是两种最常用的mRNA疫苗递送系统。LNPs由于其生物相容性、稳定性和保护mRNA免受降解的能力，被广泛用作mRNA疫苗的递送系统。LNPs可以根据其脂质成分的性质、表面电荷和表面修饰进行分类。一类是阳离子LNPs，带正电的脂质成分与带负电的mRNA磷酸主链相互作用，促进后者进入靶细胞以前的研究已经提供了证据，证明了可电离LNP疫苗对不同传染病的有效性。作为基于mRNA的疫苗的递送载体，可电离LNPs具有巨大的潜力。这些纳米颗粒由一个由脂质双分子层包裹的mRNA核心组成，脂质双分子层包含可电离的脂质，可以有效地封装mRNA并防止其在细胞外环境中降解。此外，可电离的脂质有助于促进mRNA货物的内体释放和细胞质运输，这对有效的蛋白质表达至关重要。聚乙二醇(PEG)修饰的LNPs表面有一层聚乙二醇亲水性涂层，提高了生物相容性，降低了毒性。多聚体和聚合纳米颗粒是用于mRNA疫苗的多用途递送系统，已被广泛研究。多聚物是由带正电的聚合物(如聚乙烯亚胺)和带负电的mRNA分子之间的静电相互作用形成的它们有效地保护mRNA免受降解，促进细胞摄取，并由于它们的阳离子电荷而增强免疫原性聚合物纳米颗粒可以由多种聚合物形成，包括聚乳酸-羟基乙酸和聚乙二醇，mRNA可以通过多种机制被封装，包括静电相互作用、疏水相互作用和共价键。与多聚物和LNPs相比，它们具有较低的免疫原性和毒性，可以通过工程设计来增强其稳定性和靶向特异性。然而，它们的转染效率可能低于LNPs，并且它们的生产可能更加复杂和昂贵。一般来说，递送系统的选择取决于几个因素，包括mRNA疫苗的特异性和所需的转染效率、安全性、稳定性和靶特异性。mRNA疫苗佐剂免疫原性调节是mRNA疫苗开发中一个不可忽视的问题。尽管体外转录mRNA显示出一定的自我辅助潜力，但通常不足以引发全面的保护性免疫，需要强化重复/加强方案才能达到最佳效果多种策略已被应用于mRNA疫苗佐剂来调节其免疫原性。TriMix是一种mRNA的组合，编码三种不同的免疫刺激蛋白:CD40配体(CD40L)， CD70，以及组成活性Toll样受体4 (TLR4)。由于其改善DC活化和增强CD8+ T细胞反应的能力，TriMix已被纳入许多疫苗接种研究。此外，阳离子脂质的利用被广泛认为具有改善RNA摄取和促进其内体逃逸的能力，从而增加mRNA疫苗的佐剂活性。此外，合成mRNA序列与聚合载体的结合已被证明可增强各种亚基疫苗的佐剂性。研究人员开发了一种混合纳米颗粒系统，该系统包括聚乳酸-乙醇酸核和脂质壳，用于同时递送mRNA和疏水性TLR7佐剂。聚乳酸-羟基乙酸促进了细胞核内佐剂的整合，而脂质壳通过静电相互作用使mRNA的装载成为可能。这种方法已经证明了针对特定抗原的有效免疫反应和高度有效的抗肿瘤活性。传染病中的mRNA疫苗mRNA疫苗是通过编码疾病特异性抗原来预防传染病的。迄今为止，许多使用mRNA疫苗诱导抗病毒免疫的临床前和临床试验已经在多种传染病中进行，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2、寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、水痘带状疱疹病毒和狂犬病毒。图3 mRNA疫苗在传染病中的应用前景严重急性呼吸综合征冠状病毒mRNA疫苗自2021年初以来，严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)已在全球感染了无数人，并造成数百万人死亡。大多数SARS-CoV2感染不会对先前没有疾病的人构成威胁生命的风险。然而，在严重感染的情况下，肺部会引发不受控制的免疫反应，破坏上皮细胞和肺泡，导致肺水肿，血管通透性的危险增加和死亡。在SARS-CoV-2表面发现的刺突蛋白，通过与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2受体结合，促进病毒进入宿主细胞。因此，刺突蛋白代表了编码受体结合域或全长刺突蛋白的SARS-CoV-2 mRNA疫苗的主要靶标。迄今为止，两种针对2019冠状病毒病(COVID-19)刺突蛋白的mRNA疫苗已获得批准并在全球广泛使用。这些疫苗包括Moderna开发的mRNA-1273和BioNTech/ Pfizer开发的BNT162b2。与此同时，其他几种靶向刺突蛋白的mRNA疫苗目前正在进行临床试验，以评估其安全性和有效性。mRNA疫苗的问题之一是需要极低温储存，这限制了它们在条件差和经济水平低的地区的应用。CVnCoV是由CureVac AG开发的一种化学未修饰的编码S-2P的mRNA疫苗，在±5°C下稳定至少3个月，于2020年4月首次报道。使用CVnCoV的临床前模型显示，该疫苗诱导了强大的体液反应和强大的T细胞反应，并有效诱导IFN-γ+ TNF+ T细胞。ARCoV是一种编码RBD蛋白的LNP mRNA疫苗，由Abogen公司于2020年开发。在接种疫苗的小鼠中进一步感染SARS-CoV-2表明，ARCoV保护小鼠免受SARS-CoV-2感染，在接种疫苗的小鼠的肺部没有可测量的病毒RNA。LUNAR-COV19是一种自我复制的mRNA疫苗，编码S-2P抗原，由Arcturus公司于2020年开发，目的是通过单次低剂量给药提供强大的免疫力用于临床前模型的LUNAR-COV19诱导了CD44+CD62L-效应/记忆亚群扩增的强大T细胞反应，增强了IFN-γ+ CD8+/CD4+ T细胞的比例，并导致高滴度的中和抗体的强效体液反应。总之，mRNA疫苗的批准不仅保护了许多人免受COVID-19的侵害，而且为开发针对其他疾病的mRNA疫苗提供了宝贵的经验。值得注意的是，尽管已经制备出多种抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗并用于人体，但仍存在未解决的问题，其作用机制尚不清楚。例如，mRNA疫苗对人类COVID-19提供保护的持续时间，以及如何增加主要保护上呼吸道的IgA抗体的水平，目前尚不清楚。如何降低不良反应的发生率，以往的临床试验表明，mRNA疫苗诱导的全身性不良事件发生率仍高于灭活病毒疫苗或蛋白质亚基引发的全身性不良事件发生率。寨卡病毒mRNA疫苗寨卡病毒(ZIKV)是一种具有阳性的RNA病毒，单链基因组长度为11000个。碱基感染寨卡病毒的人通常会出现持续两到七天的发烧、头痛、皮疹、不适和结膜炎。然而，它对祖神经细胞的偏向性在少数情况下导致神经发育性出生缺陷和先天性畸形。预防接种疫苗是预防寨卡病毒感染并发症的唯一选择，因为目前为止还没有出现针对这种病毒的药物。膜蛋白和包膜蛋白是寨卡病毒mRNA疫苗的常见抗原。迄今为止，基于mRNA平台开发的几种寨卡病毒疫苗已在临床前模型中进行了测试。一项挑战研究表明，用mRNA疫苗治疗的小鼠和非人灵长类动物对寨卡病毒感染具有保护作用。同年，Richner等人开发了一种lnp封闭的mRNA疫苗，编码原始型和变体ZIKV膜糖蛋白。两剂mRNA疫苗增强了对寨卡病毒的血清中和反应，并保护小鼠免受寨卡病毒感染。mRNA疫苗的有效性也在小鼠妊娠模型中进行了评估。尽管寨卡病毒mRNA疫苗在临床前研究中的结果很有希望，但还需要进一步的人体临床试验。人类免疫缺陷病毒mRNA疫苗人类免疫缺陷病毒(HIV)是逆转录病毒科慢病毒属的一员，分为HIV-1和HIV- 2两种类型。HIV引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，全球有7500万人感染，导致3200多万人死于艾滋病。尽管进行了30年的研究，但目前还没有有效的预防性疫苗，这主要是因为在HIV包膜中发现的蛋白质具有显著的抗原多样性，其密集的“聚糖屏蔽”隐藏了关键包膜蛋白的表位。迄今为止，已在临床研究中研究了多种mRNA疫苗。候选疫苗利用启动和增强策略来引发靶向B细胞反应，目的是产生广泛中和的抗HIV抗体。值得注意的是，mRNA HIV疫苗的研制仍处于初级阶段。需要更多的研究来优化这种治疗策略，以获得持久的免疫反应。这些研究的重点是同时给药，帮助重新激活HIV储存库，使其对免疫系统可见，并可能最终提高mRNA HIV疫苗的功效。抗流感病毒mRNA疫苗流感病毒是正粘病毒科的成员，主要由四种流感病毒组成:A、B、C和D型;其中，A型和B型临床与人类疾病相关。抗流感病毒mRNA疫苗的典型靶标是病毒表面的糖蛋白血凝素(HA)，因为它介导病毒进入。然而，由于流感病毒的快速突变导致抗原漂移，mRNA疫苗的HA抗原成分需要每年审查和修改。这一特点使mRNA疫苗成为预防流感病毒感染和控制疾病传播的最合适方式。诱导的抗原特异性抗体反应已被发现与小鼠对病毒攻击的保护有效性相关。总的来说，生产速度快的mRNA疫苗可能成为治疗流感病毒的重要手段，但需要进一步的随机研究来证实mRNA流感疫苗的安全性和有效性。巨细胞病毒mRNA疫苗人巨细胞病毒(CMV)属于乙型疱疹病毒亚科，基因组大小为236千碱基。初次感染后，巨细胞病毒通常建立潜伏状态，在宿主体内持续存在而不引起活动性疾病。免疫功能低下个体的病毒再激活可导致危及生命的并发症，包括肺、胃肠道、肝脏、眼睛或中枢神经系统。巨细胞病毒被认为是先天性畸形最普遍的感染性原因，在10-15%的病例中会导致感音神经性听力损失、发育迟缓和胎儿死亡。病毒包膜糖蛋白(g) gB和gH/gL的存在促进了病毒进入宿主细胞的过程，细胞-细胞融合事件允许病毒传播。迄今为止还没有关于CMV mRNA疫苗的安全性、反应原性、安全性和免疫原性的临床数据报道。呼吸道合胞病毒(RSV)是一种包膜病毒，属于副粘病毒科肺炎病毒属，是婴幼儿中最常见的病原体，可引起急性下呼吸道感染，免疫力低下的老年人也容易感染呼吸道合胞病毒。融合蛋白(F蛋白)是人体免疫系统对抗RSV的靶标;因此，通常选择它作为疫苗开发的抗原。然而，当RSV附着在靶细胞上时，F蛋白被修饰为预融合形式，隐藏了有效的中和表位，导致RSV的免疫逃避。儿童经常被呼吸道合胞病毒感染，迄今为止在这一阶段进行的临床试验很少，但已针对成人开展了临床试验。尽管已经开展了多项临床研究，但几乎所有研究仍处于早期阶段，mRNA疫苗对下呼吸道急性感染的预防作用仍有待确定。抗水痘-带状疱疹病毒mRNA疫苗水痘带状疱疹病毒(VZV)，也称为人类疱疹病毒3型，是一种具有双链DNA基因组的甲型疱疹病毒，广泛分布于人群中原发性VZV感染导致水痘(水痘)，并在神经节神经元中潜伏。潜伏性VZV在严重者由于细胞对VZV的免疫力下降而被重新激活，引起疱疹后神经痛，可能导致持续数月的难以忍受的疼痛，影响患者的生活质量。VZV编码10种糖蛋白:ORFS/L、gK、gN、gC、gB、gH、gM、gL、gI和gE。mRNA疫苗是未来生产VZV疫苗的合适平台，尽管结果的可转译性很有希望，但仍然迫切需要更多的临床和临床前研究，重点关注疫苗的有效性和安全性。狂犬病毒mRNA疫苗狂犬病毒是横纹肌病毒科的一种负链RNA病毒，可引起狂犬病，狂犬病是一种人畜共患病毒性疾病，致死率接近100%狂犬病毒通过表面糖蛋白RABV-G与细胞靶标结合，进入周围神经和中枢神经系统。未来的研究应侧重于提高抗体滴度，诱导更长时间的免疫反应，从而可能有助于生产更便宜、更容易获得的狂犬病疫苗，以满足公共卫生需求。癌症mRNA疫苗癌症mRNA疫苗通常用于治疗，而不是用于传染病的预防。事实上，它通常被设计为编码肿瘤相关抗原(TAAs)或新抗原来激活抗肿瘤免疫反应。迄今为止，美国国家医学图书馆(ClinicalTrials.gov)已经注册了许多研究mRNA疫苗对各种癌症效果的临床试验，包括黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、血液系统癌、消化系统癌和乳腺癌。图4 mRNA疫苗在癌症中的应用前景黑色素瘤mRNA疫苗黑色素瘤是由广泛分布于体内(如皮肤、粘膜、葡萄膜、内耳、直肠)的黑色素细胞恶性转化而产生的。皮肤黑色素瘤是最常见的类型，占所有新诊断的原发性恶性肿瘤的约1.7%，占全球所有癌症死亡率的约0.7%。基于DC的mRNA疫苗主要用于对抗黑色素瘤。早在1996年，Boczkowski等人就进行了过继性mRNA脉冲DC转移，发现编码卵清蛋白(OVA)的DC脉冲mRNA疫苗可以保护小鼠免受表达OVA的肿瘤细胞的侵袭，并显著减少B16/F10.9肿瘤模型中的肺转移。近年来，多种基于DC的mRNA疫苗已在黑色素瘤患者中进行了测试。免疫佐剂通常用于刺激和扩增对目标抗原的免疫应答，以调节mRNA疫苗的体内免疫原性。TriMix主要被用作一种基于DC的黑色素瘤mRNA疫苗，因为它编码激活刺激因子CD40L (CD4+ T细胞激活因子)、共刺激分子CD70 (CD8+T细胞激活因子)和组成型活性TLR4 (DC抗原呈递启动子)。尽管基于体外转录的形式不如基于DC的形式常见，但分子生物技术的发展使这种形式在癌症治疗中变得可行。个性化mRNA疫苗与其他抗癌方法相结合，可能为黑色素瘤的治疗铺平道路。多种mRNA疫苗已被开发用于治疗黑色素瘤，在临床研究中显示出潜在的治疗效果。然而，目前还没有mRNA疫苗被正式批准用于治疗黑色素瘤,mRNA疫苗与其他治疗策略的结合可能进一步提高其有效性并促进其获得批准的潜力。脑癌mRNA疫苗原发性脑癌在成人中较少见，占全世界所有癌症类型的1-2%。恶性胶质瘤是脑癌中最常见的亚型，胶质母细胞瘤是最具侵袭性的亚型脑癌。在美国，恶性胶质瘤的5年生存率约为32%，胶质母细胞瘤的5年生存率约为5%。DC脉冲肿瘤mRNA疫苗是最早应用于人类恶性胶质瘤的mRNA形式之一。两项研究涉及到自体肿瘤mRNA负载DC的应用。两项临床试验正在招募患者，以研究人类CMV pp65-LAMP在胶质母细胞瘤中的有效性，结果尚未披露。此外，一种装载pp65-LAMP mRNA的1,2-二油基-3-三甲基丙烷(DOTAP)脂质体疫苗正在高级别胶质瘤和胶质母细胞瘤的I期研究中进行测试，结果尚未公布。值得注意的是，恶性胶质瘤的mRNA疫苗主要编码TAAs，基于新抗原的mRNA疫苗与免疫检查点抑制剂是否在胶质瘤中表现出更好的疗效还有待研究。非小细胞肺癌mRNA疫苗肺癌是世界上第二常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%,可切除疾病的5年生存率约为60%，不能切除的局部疾病的5年生存率约为33%，扩展性疾病伴转移的5年生存率为6.3%。CV9201和BI1361849 (CV9202)是在nsclc中进行临床试验的两种基于mRNA的疫苗。尽管一小部分NSCLC患者从mRNA疫苗治疗中获益，但据已发表的研究报道，总体生存率仍然有限。需要进一步优化mRNA疫苗，选择合适的联合治疗方案，以提高其疗效。此外，目前仅有少数研究完成并发表研究结果，未来mRNA疫苗在NSCLC中的应用还需要更多的临床试验。抗卵巢癌mRNA疫苗卵巢癌是最危险的妇科癌症之一，2020年全球约有31.4万例新病例和20.7万例死亡,它占女性癌症相关死亡的约5%，已成为全球女性癌症相关死亡的第五大原因。目前，一项首次人体开放标签I期研究正在招募卵巢癌患者，接受脂质聚合物配制的mRNA疫苗和neo辅助化疗。遗憾的是，在复发的敏感上皮性卵巢癌患者中使用装载扩增卵巢癌干细胞mRNA、hTERT和survivin的自体DC的I/II期试验于2021年终止，没有显示结果。mRNA疫苗在卵巢癌中的应用仍处于早期阶段，参加临床试验的患者数量仍然有限。mRNA疫苗对卵巢癌的疗效有待于在更多的患者中进一步探索，以更好地评价其疗效。抗前列腺癌mRNA疫苗前列腺癌是全球男性癌症相关死亡的第二大常见癌症和第五大原因，约有1000万男性被诊断出患有前列腺癌。每年在全世界造成40多万人死亡，预计到2040年每年死亡人数将达到80多万人。开发了一种佐剂脉冲mRNA疫苗纳米颗粒，其中含有OVA编码的mRNA和棕榈酸修饰的TLR7/8激动剂R848 (C16-R848)，并包裹在脂质-聚乙二醇外壳中该疫苗成功地保留了包封C16-R848的佐剂活性，且mRNA转染效率显著提高，转染率超过95%。这种高转染效率导致OVA mRNA衍生抗原在抗原呈递细胞的MHC I类分子上的呈递增强。通过改善OVA特异性CD8+ T细胞在表达OVA的同种异体前列腺癌小鼠模型中的延伸和浸润，疫苗接种引发了有效的适应性免疫反应，并在移植后抑制肿瘤生长(与对照组相比减少60%)。然而，到目前为止还没有提供临床治疗结果。总之，针对前列腺癌的mRNA疫苗大多处于尝试阶段，对生存的潜在价值需要临床结果的更多支持。抗血液系统癌mRNA疫苗血液恶性肿瘤包括一系列与造血干细胞异常增殖有关的疾病，包括白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。根据国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症统计数据，白血病是血液病中癌症死亡的第一大原因，也是全球癌症死亡的第十大原因。常见的白血病类型包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病、慢性髓单核细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病和非典型慢性髓性白血病。迄今为止，mRNA疫苗主要应用于血液系统肿瘤的AML。总体而言，mRNA疫苗在临床试验中显示出对AML有希望的效果，尽管尚未被批准作为其标准治疗。除AML外，其他人类血液系统癌症的mRNA疫苗主要处于临床前阶段，需要更多的临床试验来研究其疗效。抗血液系统癌mRNA疫苗癌症可发生在胃肠道的任何组织，包括结肠、胃、食道、肝脏和胰腺。消化系统癌症是全世界癌症发病和死亡的主要原因，每年有300万新发病例和200万人死于胃肠道癌症。基于mRNA的疫苗mRNA 4650已被临床评估用于治疗各种消化系统癌症，包括胃肠道癌症和肝癌。接受肌肉注射mRNA 4650治疗的胃肠道癌症患者出现了针对肿瘤新抗原的CD4+和CD8+ t细胞反应。mRNA 4157被设计用于编码34种独特的新抗原，在结直肠癌和其他实体肿瘤患者中进行的I期临床研究正在进行中它诱导抗原特异性T细胞，当作为单一疗法或与派姆单抗联合使用时，耐受性良好，可导致完全或部分反应。在肿瘤浸润淋巴细胞中发现了作为mRNA疫苗靶点的特异性免疫原性突变。疫苗接种引发了针对预测的新表位的突变特异性T细胞反应，但在本试验中接受治疗的4名患者中没有发现客观的临床反应。总之，尽管使用mRNA疫苗对抗消化系统癌症的临床试验有限，但在一小部分患者中显示出一些有效性，为进一步开发有效的消化系统癌症治疗方法提供了基础。抗乳腺癌mRNA疫苗乳腺癌是妇女中最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的主要原因。《2020年全球癌症统计》报告称，女性乳腺癌已经超过肺癌，成为最常被诊断的癌症。乳腺癌包括三种主要亚型:ER+、HER2+和三阴性乳腺癌(TNBC)。与其他亚型相比，传统的内分泌或靶向药物对TNBC无效，超过50%的患者在诊断后的最初3至5年内复发，中位总生存期为10.2个月。尽管疫苗接种诱导了特异性T细胞应答，但存活数据仍未公布，mRNA疫苗的疗效尚不清楚。此外，只有一篇研究mRNA疫苗在疾病预防和治疗中的作用，需要更多的试验来促进其在临床实践中的应用。免疫疾病中的mRNA疫苗自身免疫性疾病的特点是由于对自身抗原的免疫反应失调而引起的慢性炎症。许多使用mRNA疫苗对抗癌症或传染病的临床研究表明，它们有可能引发自身免疫性疾病。然而，小鼠模型显示其治疗自身免疫性疾病的能力，尽管尚未进行临床应用。外周耐受性的生理诱导和维持主要是由抗原呈递细胞(APCs)呈递自身抗原决定的，其表面共刺激分子(如DC86)的表达减少。传统的mRNA疫苗通常会引起由TLR信号驱动的强I型T辅助细胞反应。疫苗接种不影响对不相关抗原的免疫应答，该方法在不同抗原(PLP、MBP和MOBP)诱导的模型中有效，这表明了该方法的重要方面，如优化mRNA疫苗以引发针对特定病理的保护性免疫应答和维持抗原特异性免疫耐受以治疗自身免疫性疾病的可能性。过敏是免疫系统对外来物质的超敏反应，通常对大多数人无害。这种被称为过敏原的外来物质会引发免疫反应，导致各种症状，如瘙痒、打喷嚏、流眼泪和皮疹。常见的过敏原包括花粉、尘螨、某些食物、药物和昆虫毒液。过敏可以从轻微到严重，在某些情况下，可能危及生命。与传统的过敏原提取物相比，mRNA疫苗通过编码过敏原和提供更纯净的免疫抗原，也提供了一种更安全的方法来预防过敏状况。在小鼠中，编码过敏原的mRNA疫苗已被发现通过激活Th1细胞反应有效地预防I型过敏免疫后，小鼠暴露于相应的过敏原，由此产生的炎症特征(如嗜酸性粒细胞，IL-4和IL-5)减少，而抗炎反应增强。更重要的是，mRNA疫苗在小鼠中产生长期记忆反应，在再次暴露于过敏原时导致有效的抗炎反应这些发现说明了mRNA疫苗在不需要加强疫苗接种的情况下靶向过敏的潜力。mRNA疫苗在组织损伤中的应用组织损伤是指发生在身体组织上的任何物理损伤或伤害。这可能是由多种因素造成的，如创伤、感染、炎症和暴露于有害物质或辐射。组织损伤可以影响身体的任何部位，包括皮肤、肌肉、骨骼、器官和神经。心血管疾病是世界范围内对人类健康的主要威胁它们包括但不限于冠心病、高血压、心力衰竭、血管钙化和心脏纤维化心血管损伤大多是不可逆的，只能控制。除心血管疾病外，mRNA疫苗已显示对多种软组织损伤有效。研究发现，含有核苷修饰的编码HGF和EGF的mRNA的mRNA- lnps可以刺激慢性胆碱缺乏的乙氨酸介导的肝损伤和急性对乙酰氨基酚诱导的肝毒性小鼠的肝脏再生。在糖尿病小鼠模型中，通过矿物包被微颗粒递送核苷修饰的编码FGF-2的mRNA，通过加速伤口完全愈合的过程，改善了皮肤伤口的愈合。mRNA疫苗在促进组织生成方面显示出很大的潜力。除了上述损伤外，mRNA疫苗还可能促进其他组织的生成。罕见疾病的mRNA疫苗罕见病被定义为影响一小部分人口的医疗状况，其特点是患病率低，而且由于罕见，对其的了解往往有限。患者可能难以找到适当的医疗护理和治疗。据报道，mRNA疫苗具有治疗多种罕见疾病的潜力。囊性纤维化是一种遗传性疾病，主要影响肺、胰腺和其他器官。它是由CFTR基因突变引起的，导致肺部和其他器官产生粘稠的粘液，这种粘液会堵塞气道，使呼吸困难，导致慢性肺部感染、肺损伤和呼吸衰竭。囊性纤维化还会影响胰腺，导致消化问题和营养不良，并可能导致其他并发症，如肝病、糖尿病和不孕症。囊性纤维化是一种目前无法治愈的终身疾病，而治疗有助于症状控制以及提高生活质量。2018年，Robinson等人报道了一种临床相关的脂质纳米颗粒填充化学修饰的编码CFTR的mRNA增加了CFTR的膜定位，并恢复了其在患者来源的支气管上皮细胞中作为氯离子通道的作用。一项I/II期临床研究目前正在进行中，该试验旨在评估MRT5005雾化治疗囊性纤维化成人患者的安全性、耐受性和生物活性。遗传性代谢紊乱是儿童疾病和死亡的重要原因这些疾病约占活产婴儿的1 / 800，通常源于常染色体隐性模式遗传的单个基因突变遗传性代谢性疾病占儿科急性肝衰竭病例的10-15%，死亡率在22-65%之间。mRNA疫苗已经在几种罕见的遗传性疾病中进行了测试，如遗传性酪氨酸血症1型、苯丙酮尿症(PKU)、甲基丙二酸血症(MMA)、丙酸血症(PA)、糖原储存病1a型(GSD1a)和鸟氨酸转氨基甲酰基酶(OTC)缺乏症。PKU是一种遗传性代谢疾病，由苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性不足引起，导致患者血液和器官中苯丙氨酸(Phe)的积累。如果不进行治疗，患者会遭受严重的神经损伤。通过反复静脉注射PKU (Pahenu2)小鼠模型，给药LNPs包装的小鼠Pah mRNA产生治疗性Pah蛋白，降低肝脏、血清和脑中的Phe水平，逆转疾病进展。这些发现表明，LNPs中形成的Pah mRNA为PKU患者提供了一种替代治疗选择，无需终生限制Pah饮食。基于这种可能性，ModernaTx, Inc. (Cambridge, MA, USA)已将PAH PKU mRNA-3283纳入其产品开发管线。MMA是一种有机酸血症，具有很高的发病和死亡风险，目前还没有批准的治疗方法来解决其根本原因这种常染色体隐性遗传病阻碍了丙酸源自某些蛋白质和脂肪的代谢因此，甲基丙二酸在体液和组织中有显著的积累。这种疾病的主要原因通常归因于线粒体酶甲基丙二酰辅酶a (CoA)变异酶(MUT)的缺乏。将lnp包封的MUT mRNA反复静脉注射到小鼠中，可降低血浆MMA浓度，提高存活率。目前正在进行一项I/II期临床试验，以评估mRNA疫苗在疾病预防和治疗中的作用LNP包封的人MUT mRNA (mRNA-3705)用于诊断为分离性甲基丙二酸血的个体的安全性、药代动力学和药效学。总之，缺乏能够治愈这些罕见疾病的治疗药物。mRNA疫苗使长期控制这些疾病成为可能，尽管仍处于尝试阶段。需要更多的研究来证实它们对罕见疾病的疗效。mRNA疫苗已成为疾病预防和治疗的热点，在临床前和临床试验中占据主导地位，特别是在传染病和癌症方面。然而，迄今为止，除了抗新冠病毒mRNA疫苗外，很少有疫苗被批准用于疾病治疗。一些可能限制mRNA疫苗应用的挑战尚未完全解决。在实现最佳抗原生产和确保充分的佐剂效果之间取得平衡是一项重大挑战。mRNA疫苗的佐剂作用促进先天免疫和适应性免疫，但过度的先天免疫抑制mRNA的翻译。此外，疫苗可能无法对某些人群(如免疫功能低下的个体或老年人)提供强有力或持久的保护。有几种方法可以提高疫苗的整体有效性并延长其持续时间，包括按特定时间间隔对mRNA疫苗进行加强注射，使用不同类型的疫苗(例如mRNA和传统疫苗的组合)，以及优化mRNA疫苗的储存和运输条件。总之，mRNA疫苗的制备和应用技术尚不完善，有待进一步改进。除了mRNA疫苗潜在的这些普遍问题之外，在不同的疾病中还存在特定的挑战。鉴于mRNA疫苗在免疫性疾病、罕见病和组织损伤方面的应用仍处于早期阶段，在这些疾病背景下评估其疗效和挑战的研究仍然存在不足。文献来源：mRNA vaccines in disease prevention and treatment识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。
信使RNA疫苗寡核苷酸
2023-08-29
摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.
信使RNA疫苗上市批准紧急使用授权加速审批
2023-08-29
摘要患者对信使核糖核酸(mRNA)疫苗表现出良好的耐受性，编码分子的选择是灵活多样的。这些疫苗可以被设计成表达包含多个表位的全长抗原，而不受主要组织相容性复合体(MHC)的限制，相对容易控制，并且可以快速批量生产。美国食品药品监督管理局(FDA)于2021年批准了辉瑞和BioNTech生产的首个基于mRNA的新型冠状病毒病(COVID-19)疫苗，引发了mRNA疫苗研发热潮。基于上述特点和mRNA疫苗的发展，尤其是近五年来，mRNA肿瘤疫苗已成为研究热点，发展迅速。本文从抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用、不同给药途径和临床前评价等方面对mRNA肿瘤疫苗的研究进展进行了分析，以反映mRNA肿瘤疫苗的发展趋势和面临的挑战。关键词：mRNA，癌症疫苗，肿瘤相关抗原，新抗原，mRNA递送载体，佐剂，给药途径。1.mRNA疫苗和mRNA癌症疫苗1961年，Brenner等人首次发现mRNA，它是基因作为蛋白质表达所必需的关键中间分子，含有与氨基酸(蛋白质的基本单位)相对应的密码子信息。1990年，Wolff等人首次证明，通过肌肉注射编码相应蛋白的纯RNA，可以在小鼠体内有效表达特定蛋白[如氯霉素乙酰转移酶和荧光素酶(Luc)]；具体来说，βgLucβgAn RNA的蛋白表达以剂量依赖性和时间依赖性的方式发生；这项工作还提出了mRNA疫苗的概念。2020年，美国食品和药物管理局(FDA)紧急批准了Pfizer--BioNTech/BNT162b2和Moderna/mRNA-1273生产的两种基于mRNA的疫苗，用于预防2019年冠状病毒病(COVID - 19)。2021年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Pfizer-BioNTech(上市名称为Comirnaty)生产的首个COVID-19疫苗，激发了mRNA疫苗的研发热情，并对mRNA癌症疫苗的突破产生了期待。迄今为止，研究人员已将mRNA用作疫苗平台[例如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、冠状病毒、病毒抗原(狂犬病病毒糖蛋白、寨卡病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的蛋白质)，细菌病原体(结核分枝杆菌)和癌症]和蛋白质替代平台(例如factor IX、卵泡抑素、鸟氨酸经甲氨基甲酰基酶和促红细胞生成素)，用于疾病的预防和治疗。mRNA疫苗具有许多共同特征。与质粒脱氧核糖核酸(DNA)和病毒载体存在因基因插入和/或感染而导致突变的风险不同，mRNA进入细胞质后可直接翻译成蛋白质；因此，mRNA疫苗是非整合的、非传染性的、耐受性良好的。mRNA也在细胞中短暂表达，允许重复接种。mRNA转录物中编码单位的选择是灵活多样的，允许编码抗原和免疫调节分子来诱导和调节适应性和先天免疫应答，并且含有多个表位的编码全长抗原可以由MHC Ⅰ类(MHC-Ⅰ)和Ⅱ类(MHC-Ⅱ)分子呈现，而不受MHC限制。体外转录(IVT) mRNA的生产不需要细胞，防止了蛋白质或病毒的污染，并允许快速、经济和容易的大规模生产。mRNA癌症疫苗利用编码肿瘤抗原或免疫调节分子的mRNA递送相应的蛋白，结合相关的递送载体和佐剂，诱导抗肿瘤应答。图1显示了mRNA癌症疫苗的发展时间表。抗肿瘤T细胞是介导这些疫苗治疗效果的主要预期效应细胞，图2总结了抗肿瘤T细胞产生和作用的机制。RNA在疫苗位点被DCs摄取，翻译并加工成抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物并呈递到细胞表面。活化的DCs到达引流淋巴结，呈递的抗原MHC Ⅰ/Ⅱ复合物与淋巴结内分化簇8 (CD8)+/CD4+ T细胞(第一信号)表面的T细胞受体(TCR)结合，导致T细胞活化和增殖，共刺激信号分子[如CD80/CD86, OX40配体(OX40L)]与受体(如CD28, OX40)在T细胞(第二信号)和细胞因子[如干扰素(IFN) I，白细胞介素12 (IL-12)， IL-1]与T细胞上的细胞因子受体结合(第三信号)。此外，CD4+ T细胞分泌的IL-2可促进CD8+ T细胞扩增。活化的T细胞在趋化因子[如CC -趋化因子受体7，CC -趋化因子配体(CCL) 5，CXC -趋化因子配体9/10]的作用下向肿瘤组织迁移并浸润，最大限度地发挥其分泌的效应器[如IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、穿孔素、颗粒酶]的抗肿瘤作用。内源性抗原主要通过MHC-Ⅰ分子呈递激活细胞毒性CD8+ T细胞，外源性抗原主要通过MHC-Ⅱ分子呈递激活辅助CD4+ T细胞。细胞毒CD8+ T细胞通常对靶细胞具有很强的直接杀伤作用，这些细胞是癌症疫苗预期诱导的主要效应细胞。2.mRNA癌症疫苗在临床前和临床研究中的进展疫苗的核心作用是提供能被人体免疫细胞识别的抗原，从而引发免疫反应。抗原/靶点的选择和表达、载体和佐剂的应用以及给药途径是疫苗设计中需要考虑的关键因素。表1总结了这些因素的进展在临床前和临床设置。表2总结了2016年至2021年期间使用基于mRNA的癌症疫苗的临床试验。2.1.选定抗原或靶标2.1.1.肿瘤相关抗原研制肿瘤疫苗的第一步是抗原的选择，抗原应具有较高的肿瘤特异性，并能诱导强而可控的抗肿瘤T细胞反应。肿瘤抗原根据其组织分布、表达水平和中枢耐受状态可分为TAAs和TSAs。TAAs在肿瘤中普遍过表达，在正常组织中也有表达，肿瘤特异性弱，中枢耐受性强，免疫原性弱，主要包括组织分化抗原和癌胚抗原。TAAs的中枢免疫耐受是利用这些抗原开发癌症疫苗的主要挑战。使用多个(如2-6个)共享TAAs的组合已成为临床开发靶向mRNA癌症疫苗的趋势。所选择的TAAs通常在相关肿瘤中广泛表达，当与不同的载体或佐剂结合时，可以诱导抗肿瘤免疫反应。2009年，Weide等人对鱼精蛋白(RNActive®)保护mRNA癌症疫苗进行了1/2期临床研究，采用GM-CSF作为佐剂，编码6种TAAs (Melan-A、酪氨酸酶、gp100、MAGE-A1、MAGE-A3和生存素)。这种疫苗是皮内注射。该疫苗显著降低了免疫抑制细胞(如外周血中的Foxp3+/CD4+调节性T细胞(Tregs)和骨髓抑制细胞)，并增加了一部分患者的特异性T细胞。1例接受治疗的患者完全缓解，未发生大于Ⅱ级的不良反应(NCTO0204607)。2011年，Fotin-Mleczek等人对编码卵白蛋白(OVA)/PSMA/STEAP和PSMA的蛋白蛋白复合物mRNA癌症疫苗进行了临床前研究。结果表明，双组分mRNA肿瘤疫苗可通过TLR7诱导自佐剂作用，平衡适应性免疫反应，并具有持续的抗肿瘤作用(NCT00831467,NCT00923312)。2014年，Fotin-Mleczek 等人研究表明，蛋白复合OVA -编码mRNA的癌症疫苗与临床前放疗联合使用具有较强的协同抗肿瘤作用。编码4-5种前列腺特异性抗原[如CV9103 (NCT00831467)和CV9104 (NCT01817738)]或5-6种黑色素瘤和非小细胞肺癌TAAs[如CV9201 (NCT00923312)和CV9202 (NCT03164772)]的蛋白复合物肿瘤疫苗正在临床试验中。BN111是一种mRNA癌症候选疫苗，编码4种TAAs (NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE)的固定组合，这些TAAs在黑色素瘤中普遍存在，并作为RNA -脂质复合物制剂(Lipo - MERIT)递送。BNT111单独或联合免疫检查点PD-1抑制剂可诱导不可切除黑色素瘤患者持续和强抗原特异性CD4+ / CD8+ T细胞反应和客观反应。超过5%的患者发生了相关不良事件，大多数不良反应为1-2级(NCT02410733)。基于这些结果，BNT111已获得FDA快速通道指定用于临床转化治疗晚期黑色素瘤(NCT04526899)。Lipo-MERIT mRNA癌症疫苗编码3个针对OC的TAAs (NCT04163094)， 5个针对PC的TAAs[如BNT112 (NCT04382898)]，或针对HNSCC和HNC的共享癌症抗原的固定组合[BNT113 (NCT04534205)]，目前正在临床试验中。AML和骨髓瘤mRNA肿瘤疫苗的临床翻译也呈现出从单一TAA的应用[如WT1 (NCTO0834002、NCT00965224、NCTO1291420)]到多个TAA的联合应用[如WT1、PRAME、CMV pp65、癌睾丸抗原7、MAGE-A3 (NCTO1734304、NCT02405338、NCT01995708)]的趋势。研究发现，在43%的化疗后缓解的AML患者中，经WT1 mRNA电穿孔的DCs可预防或延迟复发(NCT00965224)，改善的总生存率(OS)率或临床反应与诱导WT1特异性CD8+ T细胞反应(NCTO0965224, NCTO1291420)相关。TLR7 /8成熟DCs转染编码WT1、PRAME和CMV pp65的RNA可防止在完全缓解的AML患者亚群中复发(NCTO1734304)。mRNA肿瘤疫苗也在朝着个体化和精确化方向发展，初步趋势是从应用自体肿瘤[如AML (NCT00514189-已终止)、前列腺癌(NCT01197625)、NCT01278940、NCT008464562、NCT00961844-已终止]或肿瘤干细胞[如OC (NCT01334047-已终止)]衍生mRNA向采用个体化TAA 面板 (NCT01334047、NCT02709616、NCT02808364、NCT02808416)发展。负载完整肿瘤mRNA的DCs可以诱导针对肿瘤内广泛抗原的T细胞反应，甚至是患者独有的抗原(NCT01278940)。研究发现，用癌症干细胞衍生mRNA转染的树突状细胞可诱导患者产生免疫应答，并显示出有希望的初步安全性结果(NCT00846456)。含有3-13种不同TAA mRNA的个性化TAA面板脉冲DCs与良好的OS相关，并且治疗的患者没有出现Ⅲ/Ⅳ级不良事件(NCT02709616, NCT02808364, NCT02808416)。来源于自体肿瘤细胞或肿瘤干细胞的mRNA包含肿瘤细胞中的所有蛋白。这个策略简单可行，但其靶向性和有效性有待提高，同时也要考虑安全性。图1 mRNA癌症疫苗发展的时间轴。缩写：CART，电荷改变可释放转运体；CLAN，阳离子脂质辅助纳米颗粒；DCs,树突状细胞；DOTAP/DP7-C，1,2-二醇-3-三甲基丙烷氯/胆固醇改性阳离子肽DP7；LCP NPs，脂质/钙/磷酸（LCP）纳米颗粒；LPC，阳离子脂质体/鱼精蛋白复合物；LNPs，脂质纳米颗粒；Mann,甘露聚糖；PGCP NPs，聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA）/G0-C14/神经酰胺聚（乙二醇）（PEG）(PGCP) NPs；PSA，前列腺特异性抗原；ssPAlmE-PALA，脂质纳米颗粒和a-螺旋阳离子肽“KALA”；triMN-LPR，阳离子脂质体(L)-一种阳离子聚合物(P)-mRNA (R)，称为脂多聚体（LPR），通过A-D-甘露聚糖苷（triMN）的三天线功能化。2.1.2.肿瘤特异性抗原TSAs通常是由肿瘤细胞基因组中的非同义突变形成的肿瘤新抗原；这些抗原在正常细胞中不表达，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，中枢耐受性较弱。TSAs与抗肿瘤免疫反应之间的相关性已在多项研究中得到证实。对来自癌症基因组图谱的18个实体肿瘤数据中的数千个RNA序列的分析显示，每个肿瘤中新抗原的数量与T细胞细胞毒性活性相关基因的表达呈正相关。对来自癌症基因组图谱的515例患者的6个位点的RNA-seq数据分析表明，高水平的免疫原性突变表位与患者生存率的提高有关。具有高水平免疫原性突变的肿瘤具有更高水平的CD8A、PD-1和CTLA4。对619例结-直肠癌样本的全外显子序列分析表明，肿瘤中高水平的新抗原与肿瘤浸润淋巴细胞的增加和生存率的提高相关。在子宫内膜癌中也证实了新抗原水平与肿瘤浸润淋巴细胞数量之间的关系。此外，发现具有高水平新抗原的肿瘤比具有低水平新抗原的肿瘤具有明显的同质性。突变负荷大于每百万碱基10个体细胞突变的肿瘤(相当于表达基因中150个非同义突变)更容易形成免疫原性新抗原，而突变负荷小于每百万碱基1个体细胞突变的肿瘤不太可能形成免疫原性新抗原。大多数肿瘤的突变负荷为每百万碱基1-10个体细胞突变，通常可以形成T细胞识别的新抗原。Rajasagi等人利用全外显子测序和HLA -肽预测结合算法(即NetMHCpan)分析了13种不同肿瘤(2488个样本)的预测突变HLA-结合肽，结果表明每个肿瘤都可以产生数万到数千个新抗原，这表明新抗原在大多数肿瘤中是常见的。图2 mRNA癌症疫苗的作用机制图mRNA癌症疫苗的流行趋势是向个体化和精密度发展，旨在开发使用多种(20种)新抗原的mRNA癌症疫苗[如，IVAC MUTANOME (NCTO2035956)、IVAC_W_brel_uID和IVAC_W_brel_uID/IVAC_M_uID (NCT02316457)、RO7198457(NCT03289962、NCT04161755、NCT03815058、NCT04486378)、mRNA-4157 (NCT03313778、NCT03897881)、NCI4650/mRNA4650 (NCT03480152)、NCT03468244、NCT03908671]。2015年，Kreiter等人通过外显子组测序和MHC-Ⅱ表位预测结合算法分析了小鼠肿瘤细胞(如黑色素瘤细胞系B16F10、结肠癌细胞系CT26和乳腺癌细胞系4T1)中的突变肽，并制备了编码这些突变肽的RNA疫苗，在临床前评估它们的抗肿瘤作用。多新表位RNA在体内有效诱导T细胞应答，抑制小鼠肿瘤的生长和转移，大部分免疫原性突变体被CD4+ T细胞识别；即使RNA只编码一个新表位(如B16-M30)，也能诱导更强的T细胞反应，并控制小鼠B16F10黑色素瘤的生长。Zhang等人对DOTAP/DP7-C脂质体进行了临床前研究，DOTAP/DP7-C脂质体作为载体和佐剂，装载了编码小鼠LLC细胞系LL2 (DOTAP/DP7-C/LL2)五种肿瘤新抗原的mRNA。DOTAP/DP7-C/LL2显著抑制原位和皮下LL2肿瘤的生长，刺激抗原特异性淋巴细胞反应。2017年，Sahin 等人发现基于RNA的多重新表位疫苗可诱导黑色素瘤患者的抗原特异性多克隆T细胞免疫反应；选择的新表位中有60%具有免疫原性，这些新表位诱导的主要T细胞反应是CD4+ T细胞反应，肿瘤转移明显减少，约75%的患者无进展生存期为27个月(NCT02035956)。2020年，Cafri等人发现编码20种新抗原的NCI4650/mRNA-4650可在胃肠道肿瘤患者中诱导新抗原特异性T细胞反应；选择的新抗原中有21%是免疫原性的，来自患者的新抗原特异性T细胞中有59%是CD4+ T细胞(NCT03480152)。虽然mRNA的制备是快速和经济的(良好生产规范级RNA可在3周内制备)，但肿瘤新抗原的筛选和鉴定可能需要很长时间和昂贵，并且在疫苗制备过程中患者的病情可能发生变化，导致研究人员错过了患者的最佳治疗机会。基于高通量和生物信息学技术对基因深度测序和大数据集蛋白质组学分析的参数，治疗性肿瘤新抗原肽疫苗、RNA疫苗和融合DC -肿瘤细胞疫苗的制备时间分别约为160天、114天、103(89-160)天和10天。新抗原的筛选和鉴定速度直接影响mRNA新抗原疫苗的临床疗效，是mRNA新抗原疫苗面临的一大挑战。同时，肿瘤新抗原预测的准确性有待提高。表1 mRNA癌症疫苗在临床前和临床设置的概述2.1.3.免疫调节分子与肿瘤抑制基因编码CD70、CD40配体和组成活性TLR4的mRNA(命名为TriMix, NCT03788083)；编码人OX40L、IL-23和IL-36γ的mRNA(命名为mRNA-2752, NCT02872025，NCTO3739931)；和编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA(命名为SAR441000/BNT131、NCT03871348)是编码免疫调节分子的三种具有代表性的mRNA癌症疫苗，这类疫苗还包括编码TLR7/8激动剂和RIG-1激动剂的mRNA疫苗(CV8102/ RNA佐剂®、NCT03291002、NCT03203005)；mRNA编码OX40L [mRNA-2416 (NCT03323398)]；mRNA编码IL-12[MEDI1191 (NCT03946800)， BNT151 (NCT04455620)]；mRNA编码IL-12和IL-7 (BNT152, BNT153，NCT04710043)；和编码BisCCL2/5i的mRNA。一些研究表明，编码免疫调节分子(如TriMix，mRNA-2752，BNT131和mRNA编码BisCCL2/5i)和肿瘤抑制基因(如PTEN或p53编码mRNA)的mRNA癌症疫苗作为单一疗法也具有抗肿瘤作用，通常与多种肿瘤抗原(如MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶、gp100、生存素、hTERT和新抗原)和免疫检查点抑制剂(如抗PD-1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合用作辅助治疗。2012年，Van Lint等人发现，结节内注射TriMix和TAA(如TRP2/WT1/P1A) mRNA可诱导DCs成熟并原位启动抗原特异性T细胞。与不加佐剂的荧光素酶(FLuc) mRNA脉冲DCs相比，TriMix显著降低了DCs中FLuc的表达，且LPS、单磷酰脂质A、聚(I:C)诱导的降低作用更强；而TriMix可以产生免疫刺激环境来改善T细胞反应，优于LPS。2016年Bialkowski等人发现HPV16-E7-TriMix mRNA可诱导CD8+ T淋巴细胞向肿瘤粘膜迁移，控制肿瘤生长。当与顺铂联合使用时，HPV16-E7-TriMix mRNA通过下调髓源性抑制细胞(MDSCs)和Tregs的数量来抵抗免疫抑制微环境，导致生殖道肿瘤完全消退。在多种小鼠肿瘤模型中，瘤内注射TriMix已被肿瘤浸润的树突状细胞吸收，然后呈交给肿瘤引流淋巴结的T细胞，诱导抗肿瘤T细胞反应和抗肿瘤作用。2013年和2016年，Wilgenhof等人发现，与TriMix共电孔的DCs和编码四种与HLA Ⅱ靶向信号(DCLAMP)(命名为TriMixDC-MEL)相关的黑色素瘤相关抗原(MAGE-A3、MAGE-C2、酪氨酸酶或gp100)之一的mRNA，在预处理的晚期黑色素瘤患者中具有良好的耐受性，并在两名患者(NCT01066390)中引起完全缓解和部分缓解。TriMixDC-MEL联合免疫检查点抑制剂(ipilimumab)在预先治疗的晚期黑色素瘤患者(NCTO1302496)中耐受并诱导高度持久的肿瘤反应。2020年，De Keersmaecker等人研究表明，在相当一部分晚期黑色素瘤患者中，TriMixDC-MEL和ipilimumab联合使用可诱导有效的CD8+ T细胞反应，并与患者的临床反应相关(NCTO1302496)。2019年Hewitt发现，在瘤内注射包裹在LNPs中的编码IL- 23、IL-36γ和OX40L的三联体mRNA，可以激活并招募多种免疫细胞(例如DCs和T细胞)进入肿瘤，从而诱导依赖于Batf3的交叉呈递DCs和细胞毒性CD8+ T细胞的持久抗肿瘤免疫。该疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用，在体内抗免疫检查点抑制剂模型中具有强大的抗肿瘤作用。2021年，Hotz等人发现BNT131联合抗PD -1抗体可显著提高荷瘤小鼠(如B16和MC38荷瘤小鼠)的生存率。2021年，Wang等人发现编码BisCCL2/5i LNPs的mRNA与编码PD-1配体抑制剂LNPs的mRNA联合可显著延长荷瘤(如原发性肝癌、结直肠癌和胰腺癌的肝转移)小鼠的生存期，且BisCCL2/5i可促进这些肿瘤对PD-1配体抑制剂的敏感性。表2 2016-2021年期间关于mRNA癌症疫苗的临床试验一些临床前研究表明，使用编码肿瘤抑制基因(如PTEN和p53)的mRNA治疗肿瘤是可行的。2018年，Islam等人研究发现，负载抑癌基因PTEN编码mRNA的聚脂包被多聚脂杂交NPs(如mRNA- pgcp NPs)可在体外和体内有效转染PTEN基因缺失的前列腺癌细胞，并通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶Akt通路促进癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长。2021年，Lin等人发现肿瘤抑制基因PTEN编码mRNA NPs可诱导PTEN突变的黑色素瘤细胞和PTEN缺失的前列腺癌细胞自噬和死亡。PTEN-mRNA NPs上调免疫抑制TME中的CD8+ T细胞和促炎细胞因子(如IL-12、TNF-α和IFN-γ)，下调Tregs和MDSCs，并与抗PD -1抗体联合对这些肿瘤产生有效的抗肿瘤作用。2019年，Kong 等人研究发现肿瘤抑制基因p53-编码mRNA NPs可促进p53缺失型肝细胞和NSCLC细胞对哺乳动物雷帕霉素抑制剂靶点(依维莫司)的敏感性，且p53-mRNA NPs与依维莫司联用在体外和体内肝癌和NSCLC模型中具有显著的协同抗肿瘤作用。编码p53和肿瘤抗原(如生存素、hTERT、新抗原)的mRNA癌症疫苗目前正处于临床试验阶段(NCTO0978913、NCT02316457)。2.1.4. mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂的联合研究肿瘤发展过程中对TAAs的中枢免疫耐受和外周免疫耐受(如免疫检查点通路，TME)是癌症疫苗面临的两大挑战。两者都会影响癌症疫苗的效力和持续时间。为了靶向中枢免疫耐受，多个TAAs或多个TSAs的组合是mRNA癌症疫苗发展的主要趋势。为了靶向外周免疫耐受，将mRNA癌症疫苗与免疫检查点抑制剂(如抗PD -1、抗CTLA -4和抗PD - L1抗体)联合使用是mRNA癌症疫苗应用的另一个主要趋势。2018年，Liu等人对负载MUCI mRNA的LCP NPs联合抗-CTLA-4抗体治疗TNBC进行了临床前评估，结果表明LCP-mRNA NPs作为单一疗法或联合治疗的一部分(LCP-mRNA NPs + 抗-CTLA-4)可显著抑制肿瘤生长，且联合治疗的抑制效果明显强于LCP-mRNA NP单疗法。Wang等人研究表明，同时装载编码黑色素瘤相关抗原TRP2的mRNA和靶向PD-L1的小干扰RNA的LCP NPs可以在体外和体内有效地将mRNA传递到DCs中，并促进DCs的成熟。靶向PD-L1的小干扰RNA下调DCs中PD-L1的表达，增强抗肿瘤免疫和抗肿瘤作用，疫苗有效抑制肿瘤生长。2019年，Verbeke等人研究表明，单独使用Galsomes mRNA的体内抗肿瘤作用不明显，这种治疗可以增加免疫微环境中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、不变性NKT (iNKT)、NK和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的数量；这些作者还发现，治疗对PD-1/PD-L1通路的负调控可能会限制其抗肿瘤作用。与单独接种疫苗相比，结合OVA mRNA Galsomes和抗PD-L1抗体显著增加脾脏iNKT细胞数量，降低脾脏DC细胞上PD-L1水平和脾脏增生iNKT细胞上PD-1水平，显著提高抗肿瘤效果。此外，Oberli等人表明，含有编码单一肿瘤抗原(例如gp100或TRP2)的mRNA的lnp和使用这两种抗原的序贯治疗在体内均具有显著的抗肿瘤作用；但两种方法的抗肿瘤作用无显著性差异。2.2.抗原或目标的表达2.2.1. mRNA分子的药效学用于制备疫苗的mRNA主要包括常规的非复制mRNA和病毒衍生的自扩增mRNA。mRNA的IVT是制备分子的主要技术，利用噬菌体RNA聚合酶(如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)和含有目标抗原序列的线性化DNA模板。非复制性IVT mRNA的基本结构包括一个编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)、一个位于5'和3'非翻译区(UTRs)两侧的7-methylgaunosine 5'帽和一个3' poly(A) 尾。5'帽和3'poly(A)可以在IVT过程中添加，也可以在初始IVT后酶促添加。自我扩增的mRNA包含两个ORFs，一个编码目标抗原序列，另一个编码病毒复制机制，从而实现持久的细胞内RNA扩增。一种由编码CEA的甲病毒复制子组成的mRNA疫苗(称为AVX701)正在临床试验中(NCTO0529984, NCTO1890213)。与蛋白质或肽疫苗不同，mRNA癌症疫苗产生效果的第一步是编码蛋白的序列信息可以翻译成功能蛋白。影响翻译过程的因素包括正调节因素、负调节因素和双向调节因素。正调控因子总结如下:①5′帽及其修饰物[如抗反向帽类似物CleanCap]可招募真核翻译起始因子4E，促进核糖体识别和翻译起始，消除mRNA序列中的游离磷酸基团，显著增强mRNA的稳定性。②poly(A)序列及其修饰(如长度’)可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而增加稳定性，延长体内半衰期，提高mRNA的翻译效率。③UTR优化[例如，由a-珠蛋白和β-珠蛋白衍生的3' UTR序列，AU和GU-富集序列；3' UTR中的稳定元素；5' UTR中的GCC-(A/G)- CCAUGG，短而松散的5' UTR135]和ORF的密码子优化(如尿苷的缺失，G:C含量的富集，同义频繁密码子，具有较高转移RNA丰度的密码子)可以提高mRNA的稳定性和蛋白质翻译。表达载体中的表位通过不同的序列和信号肽(例如，内核/溶酶体信号分选片段和跨膜-细胞质结构域)连接，以增加IVT，提高抗原在细胞内加工和呈递的靶向性。④核苷修饰[如假尿嘧啶(Ψ)、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基胞苷(5meC)和n -乙酰胞苷修饰转录后RNA]和纯化IVT-mRNA(如Mg2+31、温度、高压液相色谱和快速蛋白液相色谱)以减少双链RNA的污染，可以降低分子的先天免疫激活，增加蛋白质翻译。与未修饰的mRNA相比，核苷修饰的mRNA (5meC, Ψ)可显著促进小鼠FLuc的表达。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用明显强于LCP(未修饰mRNA)。负调控因素包括:①细胞外RNases酶能快速降解裸mRNA。②IVT产生的双链RNA杂质可以结合细胞质中的模式识别受体(PRRs)[如RIG - Ⅰ，黑色素瘤分化相关蛋白5 (一种RIG -Ⅰ受体)，蛋白激酶RNA激活(也称为真核翻译起始因子2 alpha激酶2)，2'-5'-寡腺苷酸合成酶]和内体(如TLR3)来激活特定途径[如RIG -Ⅰ /MAD5→线粒体抗病毒信号蛋白→IFN Ⅰ，(IFN Ⅰ→)蛋白激酶RNA激活→真核翻译起始因子2alpha， (IFN Ⅰ→)2′5′-寡聚腺苷酸合成酶→核糖核酸酶L, TLR3→含有Toll/IL-1受体结构域的适配器诱导IFN-β→IFN Ⅰ]，可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解。双向调节因子包括未修饰的单链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)，它可以结合内体中的PRRs[如TLR7, TLR8]来激活特定途径(TLR8→髓样分化因子88→促炎细胞因子；TLR7→骨髓分化因子88→干扰素调节因子7→IFN Ⅰ)。一方面，mRNA可以激活先天免疫反应(DC成熟和激活)，进而激活适应性免疫反应(T和B细胞免疫反应);另一方面，过早和过度激活IFN Ⅰ可抑制mRNA翻译，促进mRNA酶解，促进DC和T细胞凋亡。过度强烈的炎症反应也会引起毒副作用。在T细胞中，Ⅰ型IFN受体信号的激活先于TCR信号的激活，可作为促进免疫应答的真正第三信号。Udhayakumar等人表明，与含有未修饰mRNA的RALA mRNA纳米复合物相比，含有Ψ-和 5meC-修饰mRNA的mRNA纳米复合物诱导了有效的抗原特异性细胞毒性T细胞反应，并且具有优越的疗效，修饰的(5meC，Ψ) mRNA纳米复合物通过抑制IFN-β活化显著降低了Ⅰ型IFNs对CTLs的抑制作用，并有效诱导了CTLs。相比之下，Oberli等人表明，未修饰mRNA LNP疫苗在外周血中诱导的CD8 T细胞应答(7.8%)比核苷修饰mRNA (5meC，Ψ) LNP疫苗(1.0%)强得多，并表明Ⅰ型干扰素是保护性CD8 T细胞应答所必需的。这些相互矛盾的结果可能与双向调节因素有关。2.2.2.疫苗抗原表达方法根据抗原的表达，疫苗可分为多肽或蛋白质疫苗、细胞疫苗(如肿瘤细胞疫苗、DC疫苗和工程细胞疫苗)、核酸疫苗(如DNA和RNA疫苗)和病毒载体疫苗。肽或蛋白疫苗是广泛使用的疫苗类型。抗原肽的序列定义明确，易于控制。肽疫苗包括短肽疫苗和长肽疫苗。短肽疫苗有一些缺点，包括蛋白质水解导致抗原降解和免疫反应持续时间较短，短肽可以结合许多核细胞表面的MHC Ⅰ分子，这些核细胞作为非专业抗原呈递细胞APCs)，通常不含共刺激信号，导致抗原耐受和T细胞功能障碍。长肽疫苗通常含有20-30个氨基酸，可激活CD4+和CD8+ T细胞。蛋白质疫苗也能诱导T细胞反应；然而，长肽通常比蛋白质更有效地被APCs内化和加工。长肽疫苗的缺点包括对酶降解的敏感性、快速清除和注射部位吸收不足。细胞疫苗主要包括癌细胞疫苗和DC疫苗。癌细胞疫苗是用自体或异体灭活的全细胞及其衍生物(如细胞裂解物、DC融合衍生物、表达TSAs或免疫增强因子的修饰全细胞和肿瘤衍生mRNAs)，它们通常包含细胞的所有抗原，在疫苗设计和生产之前不需要费力地鉴定，从而导致相对快速的制备和某些个性化特征。然而，使用癌细胞的方法不能准确地测定和控制相应的肿瘤抗原，质量控制困难，而且癌细胞往往含有较少的特异性抗原，导致免疫原性较弱和潜在的致癌性。DCs是最有效的APCs，在连接先天和适应性免疫反应中起着核心作用。DC疫苗一般使用自体DC作为载体来表达和呈递抗原。1996年，Boczkowski等人证明了使用肿瘤来源的mRNA癌细胞脉冲DCs的可行性。2017年之前，在大约24项临床试验中，mRNA癌症疫苗使用DCs作为载体。然而，DC疫苗的制备工艺复杂，生产昂贵，质量控制困难。此外，患者必须具有相对正常的免疫功能，没有化疗或其他治疗引起的骨髓抑制，并提供大量功能性DCs，导致可用疫苗数量有限。核酸疫苗是用编码抗原的核酸(如DNA、RNA)制备的。mRNA疫苗的特点已在本文第1部分进行了描述。与mRNA相比，DNA必须进入细胞核才能翻译成相应的抗原，这有插入突变引起的潜在风险，可能比mRNA更不安全。总的来说，核酸对降解敏感，不稳定，半衰期短，导致裸核酸被APCs吸收的效率较低。新的载体和给药途径。用于提高核酸的吸收和呈递效率(下文讨论)。有限的研究表明mRNA癌症疫苗与肽或蛋白癌症疫苗相比具有抗肿瘤优势。用体外合成的鸡OVA RNA脉冲的DCs比用OVA肽脉冲的DCs在体外刺激OVA特异性的初级CTL反应更有效。在原位治疗性肿瘤模型中，DOTAP/DP-C/mRNA编码5种新抗原在诱导脾脏产生活化T细胞(CD3+ CD8+ IFN-γ+)方面明显强于DOTAP/DP-C/突变肽。LCP(修饰mRNA)的体内抗肿瘤作用显著强于LCP (TRP2肽/CpG)。编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs提高MC38-S荷瘤小鼠存活率的能力明显强于相应的蛋白处理。肽抗原通常只含有一个表位，而mRNAs编码的全长抗原含有多个表位，可以诱导T细胞靶向这些表位，产生更强的抗肿瘤作用。病毒载体疫苗是利用病毒作为表达或呈递抗原的载体制备的。目前，被广泛研究的病毒载体包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒。出于安全考虑，采用复制缺陷病毒或减毒病毒。痘病毒可包含多个基因，复制和转录仅限于细胞质，插入突变的风险较低，表达产物可呈现MHC Ⅰ和Ⅱ。非禽类痘病毒可以诱导宿主产生免疫反应，从而使其只能使用一种或最多两种疫苗。重组鸟痘病毒可以多次接种，其病毒外壳蛋白不能在哺乳动物细胞中产生，并且病毒不能诱导宿主产生免疫反应来中和病毒。重组腺病毒载体易于设计，作为疫苗和基因治疗药物的载体已显示出实用性；然而，它们的免疫原性会影响疫苗的效果。疱疹病毒有广泛的宿主范围；可感染神经细胞、外周血单核细胞和DCs；并且具有复制周期短、容量大、安全性相对较好的特点。此外，其他载体，如细菌和酵母，在临床前研究中显示出作为疫苗载体的潜力。总的来说，免疫原性、致癌性、传染性、包装能力有限和病毒载体生产困难是广泛应用的挑战。2.3.mRNA癌症疫苗的载体开发具有良好的安全性、靶向性、稳定性、自佐剂效应、负载能力和通用性的mRNA递送载体，能够高效、持续地递送和呈递抗原，激活APCs，是mRNA肿瘤疫苗领域的一个基本方向。mRNA肿瘤疫苗在临床前采用的载体如表3所示。mRNA癌症疫苗中使用的主要载体之一是脂质体及其衍生物。1995年，Conry等人显示了编码人CEA复合物的脂质体mRNA的体液免疫原性，首次在临床前研究中证实了mRNA癌症疫苗的概念验证。甘露糖可以与DCs表面表达的甘露糖受体结合，利用靶向DCs的载体促进mRNA的高效传递和转染。2011年，Perche等人研究表明，携带mRNA的Man11-LPR100转染DCs的效率是无糖LPR100的4倍，并且在体内具有更好的抗肿瘤作用。由于甘露糖与其受体之间的结合力较弱，增加载体表面甘露糖的密度可能是提高甘露糖修饰LPR递送效率的有效途径。2018年，Le Moignic 等人研究表明，与单甘油三酯- LPR相比，三甘油三酯- LPR可以更有效地诱导抗原转染，通过在注射部位诱导局部炎症反应，将更多的DCs招募到引流淋巴结，并更有效地诱导抗原特异性免疫反应。2018年，Wang 等人利用甘糖醇偶联物(MPn-CHs)制备了DCs靶向脂质体(MPn-LPs)作为mRNA载体，结果表明MP1000-LPs负载mRNA (MP1000-LPX)具有良好的转染效率，MP1000-LPX主要通过增强DCs上甘糖受体(如CD206)的表达来增强mRNA的表达。2020年，Son等人研究表明，采用多糖包被二氧化硅纳米颗粒制备的Mann -capsules可以通过Dectin-2或TLR-4激活骨髓源性树突状细胞(BMDC)，且Mann -capsules促进BMDC分化和成熟的能力明显强于PEI或脂质体；此外，PEI和脂质体具有高毒性。LNPs似乎是一种很有前途的mRNA癌症疫苗载体。LNPs的成分主要包括可电离脂质，促进mRNA的自组装和内体释放；磷脂，支持脂质双层结构；胆固醇，一种稳定剂；脂质锚定聚乙二醇，延长配方的半衰期。还考虑了筛选和鉴定这些媒介的高通量技术。2017年，Oberli 等人构建并优化了LNP库，发现含有编码肿瘤抗原的mRNAs(如gp100和TRP2)与LNPs作为佐剂结合，可有效诱导抗原特异性CD8+ T细胞，抑制肿瘤生长，延长小鼠OS。2018年，McKinlay等人对基于两亲性CARTs的mRNA载体库进行了高通量筛选研究，结果表明，与单一CART或脂质体 2000相比，双CART可将体外淋巴细胞mRNA转染效率提高9倍；体外mRNA转染效率为80%，小鼠淋巴细胞mRNA转染效率为1.5%。2019年，Miao等人建立了一种高通量的可电离类脂质构建技术，可在一天内合成数千种脂质制剂，并使用DCs(如HeLa细胞、BMDCs或骨髓源性巨噬细胞)高通量评估LNPs的转染效率。结果表明，mRNA LNPs通过干扰素基因通路的胞内刺激物诱导APC成熟，增强抗肿瘤作用。2021年，Meng等人发现含有CpG核心的VLVPs可以促进DC成熟和抗原呈递、抗原特异性CD8+ T细胞在淋巴器官中的增殖和肿瘤中的T细胞浸润，并减少免疫抑制细胞(如肿瘤相关骨髓源性抑制细胞和表达精氨酸酶1的抑制性DCs)。以LNPs为载体的mRNA癌症疫苗[如编码新抗原的mRNA-4157 (NCTO3313778、NCTO3897881)和编码突变蛋白的V941 (NCT03948763)]目前正处于临床试验阶段。多阳离子肽鱼精蛋白和DCs是mRNA癌症疫苗中采用的另外两种主要载体。鱼精蛋白和DCs的特点及其作为mRNA癌症疫苗载体的研究进展分别见第2.1.1节和2.2.2节。鱼精蛋白可以保护mRNA不被血清RNA酶降解，促进mRNA的传递。此外，鱼精蛋白可与脂质体联合使用(例如，阳离子脂质体-鱼精蛋白，LPC和VLVP)。2000年，Hoerr等人发现脂质体包裹的浓缩RNA-肽复合物可诱导抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，裸RNA和蛋白蛋白保护的RNA在体内均可诱导特异性免疫反应，而受保护的RNA在体外稳定时间较长。Mai等人的研究表明，携带细胞角蛋白19编码mRNA的LPC经鼻递送可诱导小鼠APC成熟和强烈的细胞免疫反应，并降低肿瘤的生长。载体对疫苗的效力有关键影响。Phua等人表明，在没有NP载体的情况下，鼻内接种裸mRNA不能诱导抗肿瘤免疫反应。然而，临床前和临床研究都在综合考虑所选靶点、佐剂和递送方法的基础上证明了裸mRNA的可行性和有效性。发现FLT3可增强结内裸RNA的抗肿瘤作用。结内HPV16-E7-TriMix裸mRNA和瘤内TriMix裸mRNA均可诱导有效的抗肿瘤T细胞反应。结节内裸mRNA多重新表位疫苗诱导有效的抗原特异性T细胞免疫应答(NCT02035956)。2.4.佐剂在mRNA癌症疫苗的临床前研究中开发的一类主要佐剂[如LPS73, poly(I:C), Td, CpG]是PAMPs，它通过PAMP-PRR途径激活DCs，然后调节先天和适应性免疫反应。作为一种强效的回忆抗原，Td可通过CCL3106促进DC迁移，提高抗肿瘤作用。LPS辅助处理进一步提高了CD8+ T细胞水平和LNP mRNA诱导细胞的抗肿瘤活性。mRNA- CART联合CpG的体内抗肿瘤作用明显强于mRNA-CART和裸mRNA与CpG的联合，也强于mRNA-CART与TLR7配体或CD80 /86 mRNA的联合。大多数新型载体(如脂质样材料C1、DOTAP/ DP7-C、Mann-capsule、LNPs)兼具载体和佐剂的特性，其中一些载体具有佐剂的功能，类似于PAMPs。Mann -capsule通过Dectin-2或TLR-4激活BMDCs，葡聚糖-capsule通过CD206、CD209或巨噬细胞诱导的C型凝集素激活BMDCs。DP7-C、DOTAP和mRNA分别通过TLR2、TLR4和TLR7激活DCs。DOTAP/DP7C诱导DC成熟和抗原呈递的能力明显强于DOTAP、poly(I:C)和CpG。Cl或C1 mRNA可通过TLR4依赖的核因子κB信号通路促进BMDC活化，C1- OVA mRNA的体内抗肿瘤作用是TLR4依赖的CpG，因为VLVP中含有的佐剂，可以提高疫苗的效果，阻止PD-1在T细胞中的表达。然而，这些类PAMP佐剂可能影响mRNAs的翻译效率和降解，并具有潜在的毒性，如2.2.1节所述。开发既不影响mRNA翻译效率，又能积极调节多种先天和适应性免疫反应，促炎作用相对温和，毒性较低的新型佐剂已成为重要方向。TAA mRNA的免疫原性可以通过GM-CSF mRNA的共递送而增强。FLT3配体可促进浆细胞样DCs、经典DCs和NK细胞的扩增；诱导T辅助1型微环境；增强肿瘤内T细胞浸润及裸RNA的抗肿瘤作用。mRNA LNPs可通过刺激干扰素基因依赖性激活Ⅰ型IFN，诱导APC成熟，限制全身细胞因子表达，增强抗肿瘤作用。用于mRNA Galsomes的佐剂α-GC可通过DCs呈递激活iNKT细胞。活化的iNKT细胞可与DCs发生双向正调节作用，可正向调节NK细胞和免疫抑制细胞(如MDSCs和M1 TAMs)，不影响mRNA翻译效率，促进直接和间接的抗肿瘤作用。编码免疫共刺激分子的mRNA可用作佐剂(见2.1.3节)。TriMix (NCT01066390, NCTO1302496)；mRNA-2752 (NCT02872025)；mRNA编码人OX40L (mRNA-2416, NCT03323398)；编码IL-12、IL-15、GM-CSF和IFN-α的mRNA (BNT131，NCTO3871348)；编码IL-12的mRNA (MEDI1191，NCT03946800)；和mRNA编码的TLR7 /8激动剂和RIG-1-兴奋剂(RNA佐剂®)，NCT03291002，NCT03203005]正在临床试验中作为辅助治疗与免疫检查点抑制剂联合使用。表3 在临床前环境中用于mRNA癌症疫苗的递送系统概述2.5.给药途径给药途径直接影响疫苗的效力，mRNA癌症疫苗通常采用的给药途径包括静脉注射、皮内、皮下、肌肉注射、结内和肿瘤内给药。静脉注射允许更大的疫苗量和直接将疫苗输送到淋巴器官，但也有更大的系统性毒性风险。皮下注射疫苗的真皮含有APCs(如，DCs和巨噬细胞)以及血管和淋巴血管，但主要由致密结缔组织组成，导致通过皮内途径给药时疫苗量很小。皮内给药也可导致注射部位的不良反应(例如，肿胀、疼痛、红斑和瘙痒)。皮下注射疫苗的皮下区域含有比真皮更少的APCs；然而，它主要由脂肪组织的松散网络组成，允许通过皮下途径注射更大的注射量，从而引起更少的局部副作用(如疼痛)。肌肉注射疫苗的肌肉含有致密的血液网络，可以帮助招募和再循环不同类型的免疫细胞(如，浸润性APCs)到注射部位。肌内给药比皮内给药的注射量大，局部副作用也比皮内和皮下给药轻。结内注射疫苗的淋巴结含有多个APCs，结内给药具有较高的递送效率，允许小剂量的疫苗，但涉及复杂的程瘤内给药主要用于编码免疫共刺激分子的mRNA疫苗(例如TriMix, CV8102, mRNA-2752, mRNA-2416, BNT131和MEDI1191)作为免疫辅助治疗，也允许小剂量的疫苗，涉及复杂的程序。准确预测特定疫苗的最佳给药途径是困难的，建议通过直接比较研究来选择疫苗的最佳给药途径。结内注射的Luc-RNA在体内的转染效率优于皮内或皮下注射。经静脉注射OVA RNA复合DOTAP-DOPE诱导的CTLs杀伤作用优于皮内或皮下注射(静脉注射＞皮内注射＞皮下注射)。结内递送OVA mRNA联合TriMix诱导的抗原特异性T细胞的体内细胞毒性明显强于皮内递送疫苗。皮内接种E7 mRNA单糖化-LPR诱导的抗原特异性T细胞应答明显强于皮下接种。通过CART有效地将mRNA传递到APCs中(次要淋巴细胞APCs优先通过静脉注射靶向，而局部APCs通过皮下注射靶向)。肿瘤内三次给药的编码IL-23、IL-36和OX40L的三联体mRNAs的抗肿瘤作用显著优于同种药物的皮内或皮下给药；然而，在同一剂量下，通过这些途径的抗肿瘤效果没有显著差异，这表明对肿瘤疫苗的给药效果也与给药频率有关。鼻黏膜富含APCs和免疫细胞，临床前研究表明经鼻内注射的mRNA癌疫苗初步有效。鼻内接种mRNA纳米颗粒和鼻内递送LPC mRNA均可诱导抗肿瘤免疫应答。3.mRNA癌症疫苗的挑战和趋势迄今为止，已有数百种癌症疫苗进行了临床评估，美国食品和药物管理局(FDA)批准了三种治疗性癌症疫苗[卡介苗 (TheraCys®)，一种牛分支杆菌减毒活株，用于治疗非肌肉浸润性膀胱癌；Sipuleucel-T (Provenge®)，一种用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的DC疫苗；以及用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤性疱疹病毒疫苗(talimogene laherparepvec, T-VEC) (Imlygic®)和两种预防性癌症疫苗(HPV疫苗和乙型肝炎病毒疫苗)。影响mRNA肿瘤疫苗研制的因素主要包括分子本身的内在因素和外部因素[如对肿瘤抗原的中枢耐受性(见第2.1.1节)、肿瘤和HLA的异质性以及肿瘤免疫微环境]。这些因素深刻地影响了mRNA癌症疫苗的发展。从内在因素来看，研究人员通过改进mRNA的结构和序列，改进mRNA的制备和纯化技术(见第2.2.1节)，开发新的传递载体(见第2.3节)，在一定程度上提高了mRNA癌症疫苗的有效性。肿瘤异质性的本质是肿瘤细胞的基因组异质性，导致抗原异质性，这是影响抗肿瘤T细胞反应产生的关键因素，也是开发个性化癌症疫苗的主要原因。HLA异质性主要是指个体间HLA分子类型的不同，导致个体间这些分子对肿瘤抗原的结合区域或结合亲和力存在差异，从而影响抗肿瘤T细胞反应的产生和强度。HLA异质性是由HLA等位基因在不同民族和地区人群中的多态性引起的。HLA Ⅰ等位基因包括9-11个常见超型，其覆盖率为90%。HLA-A loci (HLA-A等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101和A*2402)占HLA-Ⅰ等位基因的60%，HLA-B loci (HLA-B等位基因：B*0702、B*0801、B*2705、B*3501和B*5701)占这些等位基因的35%以上。TME由免疫细胞、间充质细胞以及多种细胞因子和组织因子组成，在肿瘤发生和免疫逃逸中起重要作用。大质量内的间质压力可减少大分子(如抗体)和效应细胞(如T细胞)的扩散。大多数实体瘤也缺乏T细胞共刺激分子。TME通常含有免疫抑制细胞，包括CD4+Tregs, MDSCs，抑制性CD8+T细胞，M2 TAMs和调节性NK/NKT细胞。这些免疫抑制细胞和TME中的肿瘤细胞可以释放大量可溶性的免疫抑制因子，包括转化生长因子β、IL-10、PD-L1、吲哚胺2,3-双加氧酶和血管内皮生长因子等，进入微环境。考虑到肿瘤和HLA的异质性，肿瘤新抗原疫苗的开发在理论上比TAA定向疫苗具有更强的特异性抗肿瘤作用和更弱的毒副作用，一直是癌症疫苗研究的主要热点(见2.1.2节)。鉴于肿瘤免疫微环境，开发基于免疫的联合疗法(例如，与佐剂或免疫检查点抑制剂联合)已成为癌症疫苗应用的一个关键趋势(见第2.1.4和2.4节)。4.讨论产品的临床前评价是进入临床转化的前提，合理的评价可以提高预测临床结果的可靠性。临床前评价所采用的参数、技术和方法是疫苗质量标准的重要组成部分。疫苗的临床前评价应充分阐明疫苗的作用和机制，而mRNA肿瘤疫苗临床前评价的重点是确定抗原特异性T细胞反应的产生(如T细胞的数量和活化)和效果(如T细胞的杀伤作用和抗原亲和力)。一般来说，在临床前评估中，定量的体外和体内试验用于评估mRNA癌症疫苗的效果和机制。根据目前对抗原特异性T细胞免疫应答的认识，评价参数主要包括①鉴定疫苗的理化特性；②mRNA转染APC的效率(如结合与摄取、内化与转运、表达与分布)；③APCs的分化、成熟和抗原提呈；④疫苗免疫刺激；⑤细胞免疫原性(如CTL的产生、增殖和靶细胞杀伤)；⑥体液免疫原性；⑦抗肿瘤作用及相关机制；⑧初步毒性（如细胞毒性、内脏毒性和溶血）。诸如颗粒大小、电荷、对mRNA的结合能力和负载率、稳定性(如时间、温度和血清稳定性)、聚乙二醇化和硬度等因素可影响抗原递送(如淋巴引流)。Son等人研究表明，尺寸为~220 nm的Mann-capsules具有良好的变形能力，通过50 nm孔膜后的回复率约为30%。与基于蛋白质或肽的疫苗不同，mRNA疫苗开发的第一步是确保mRNA序列中编码的信息能够有效地翻译成相应的蛋白质或肽。mRNA的体外和体内转染效率是mRNA疫苗临床前评价的重要参数，提高mRNA的转染效率是提高mRNA疫苗药效学的关键途径。然而，APCs的体外转染效率可能存在差异，DOTAP/ DP7 - 增加了绿色荧光蛋白mRNA在APCs(包括293T、JAWSII、DC2.4和BMDCs)中的体外转染效率分别为84.87±3.21%、12.23±1.35%、28.49±2.46%和14.51±2.35%。为了验证mRNA在体外和体内的转染效率，我们以多种APCs作为体外转染模型，在体内检测不同器官的多种APCs的mRNA转染效率。增强绿色荧光蛋白(FLuc)是实验中常用的转染蛋白。染料标记的mRNA或疫苗载体已广泛用于转染研究。共聚焦显微镜和流式细胞术常用于评估细胞内微转染(如递送、摄取和翻译)，共聚焦显微镜可更直观、准确地评估mRNA的翻译效率，交互式视频信息系统可用于评估全身或局部大转染(如分布、淋巴引流)。用于体内抗肿瘤活性评价的肿瘤模型主要包括治疗性或预防性皮下、原位和肺转移肿瘤模型，所建立的体内肿瘤模型应准确模拟人体病理。Bialkowski等人的研究表明TC-1肿瘤的TME可因肿瘤接种部位(即皮下、肺部和生殖道)的不同而有显著差异，这直接影响了E7-TriMix mRNA疫苗的抗肿瘤效果。在选择用于临床前评估的细胞或动物模型时，物种特异性是需要考虑的重要因素。为了获得更准确的评价信息，可以建立人源化动物模型。通过静脉注射人外周血单个核细胞(HLA-A2型)的CD34+造血干细胞建立的人源化小鼠，进入免疫缺陷NOD/ shi-scid IL-2Rγnull小鼠或C57BL/6小鼠，建立体内肿瘤模型(如结果表明，转染修饰的人CD133 mRNA的DCs处理人源化小鼠模型的中位生存期大于60天，转染修饰的小鼠CD133 mRNA的DCs处理同源小鼠肿瘤模型的中位生存期为38天。肿瘤疫苗理论上具有抗肿瘤复发和转移的作用，可以建立多种体内肿瘤模型进行评价，阐明这些疫苗在预防或治疗肿瘤转移或复发方面的优势。有效的抗肿瘤反应需要多个免疫细胞的协同作用，而不是单个细胞的作用。目前，大多数肿瘤疫苗的重点是诱导CD8+T细胞，但CD4+T细胞等免疫细胞在诱导和维持免疫记忆、增强CTLs的肿瘤杀伤作用中也发挥着重要作用。采用NKT配体(如α-GC)作为佐剂的mRNA Galsomes通过iNKT细胞诱导抗肿瘤作用。在含有CD4+和CD8+T细胞的培养系统中转染CD133 mRNA的DCs比仅含有CD4+或CD8+T细胞的培养系统中的DCs更有效地激活T细胞并杀死肿瘤靶细胞。也有人担心mRNA癌症疫苗的安全性和副作用。修饰后的mRNA可与血清蛋白结合形成血管闭塞，具有潜在的毒性。DOTAP/DP7-C mRNA具有良好的血清稳定性和较低的细胞毒性；然而，Lipo2000和PEI25K具有很强的细胞毒性。最后，我们期待mRNA癌症疫苗的成功临床转化。参考资料：He Q, Gao H, Tan D, Zhang H, Wang JZ. mRNA cancer vaccines: Advances, trends and challenges. Acta Pharm Sin B. 2022 Jul;12(7):2969-2989. doi: 10.1016/j.apsb.2022.03.011. Epub 2022 Mar 23. PMID: 35345451; PMCID: PMC8942458.
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| 适应症 | 最高研发状态 | 国家/地区 | 公司 | 日期 |
|---|---|---|---|---|
| 肝癌 | 临床2期 | 美国 | 2018-05-18 | |
| 结直肠癌 | 临床2期 | 美国 | 2018-05-10 | |
| 黑色素瘤 | 临床2期 | 美国 | 2018-05-03 | |
| 泌尿生殖系统肿瘤 | 临床2期 | 美国 | 2018-04-29 |
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| 研究 | 分期 | 人群特征 | 评价人数 | 分组 | 结果 | 评价 | 发布日期 |
|---|
临床1/2期 | 5 | messenger ribonucleic acid (mRNA) vaccine (Cohort 1, Arm 1, Phase I - Dose Level 2 - 0.13mg) | 窪獵鑰餘壓糧醖夢膚鬱(遞簾積獵鑰選願齋觸鏇) = 鹹壓窪醖艱遞遞醖淵簾 鏇選襯獵鏇網製蓋鬱繭 (選壓繭遞製齋顧獵壓願, 網遞窪網廠夢糧鹹遞積 ~ 觸膚範鏇蓋鹽糧選製鏇) 更多 | - | 2020-04-24 | ||
messenger ribonucleic acid (mRNA) vaccine (Cohort 1, Arm 1, Phase I - Dose Level 3 - 0.39mg) | 窪獵鑰餘壓糧醖夢膚鬱(遞簾積獵鑰選願齋觸鏇) = 鹽鑰製鬱艱顧製顧鹹鏇 鏇選襯獵鏇網製蓋鬱繭 (選壓繭遞製齋顧獵壓願, 衊鑰鹹積獵衊鹽獵鏇壓 ~ 淵網鑰襯繭醖鹹選鏇艱) 更多 |
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